Abstract
Ratos são muitas vezes utilizados como doadores de transplante de coração e receptores em estudos de imunologia do transplante devido à ampla gama de camundongos transgênicos e reagentes disponíveis. A dificuldade é apresentada devido ao pequeno tamanho do animal e os desafios técnicos consideráveis da microcirurgia envolvidos no transplante de coração. Em particular, uma alta taxa de falha técnica logo após o transplante pode resultar da morte do destinatário e complicações pós-operatórias, como a paralisia dos membros posteriores ou um coração sem bater. Aqui, a técnica completa para o coração transplante heterotópico rato é demonstrado, envolvendo a colheita do coração do doador e sua posterior implantação em um rato destinatário. O coração de dador é colhido imediatamente após perfusão in situ com solução salina heparinizada a frio e a transecção da aorta ascendente e da artéria pulmonar. A operação envolve a preparação de receptor a aorta abdominal e veia cava inferior (IVC), seguido pelaanastomose término-lateral da aorta do doador com a aorta do receptor através de um único corredor 10-0 microsuture e uma anastomose semelhante da artéria pulmonar do dador com o destinatário da VCI. Na sequência da operação, o animal é injectado com 0,6 ml de solução salina normal subcutaneamente e deixados a recuperar numa almofada de aquecimento de 37 ° C. Os resultados de 227 transplantes de coração do rato são resumidas com uma taxa de sucesso de 48 horas de 86,8%. Das falhas 13,2% dentro de 48 horas, 5 (2,2%) apresentaram paralisia dos membros posteriores, 10 (4,4%) tinha um coração não bater devido ao enxertar lesão isquêmica e / ou trombose, enquanto 15 (6,6%) morreram dentro de 48 horas .
Introduction
Os modelos animais de transplante de órgãos pode fornecer informações valiosas para melhorar o tratamento de pacientes transplantados clínicos. Modelos de mouse são particularmente úteis para o estudo do mecanismo imunológico da rejeição de transplantes de órgãos ou de aceitação, devido à ampla gama de ratos e reagentes específicos para os ratos que não estão disponíveis para outros modelos animais geneticamente modificados 1-3. Um desafio com modelos do rato do transplante é a pequena dimensão dos doadores e receptores que requer habilidade técnica considerável para alcançar resultados satisfatórios.
A técnica foi descrita pela primeira vez para o transplante heterotópico de coração de ratos 4, que foi posteriormente adaptado para transplante cardíaco do rato por Corry et al 5. Esta técnica envolveu a preparação do receptor antes da operação de dador e sem perfusão do coração de dador, ambos os quais são de natureza a comprometer a sobrevivência do transplante cardíaco ou tele destinatário. O procedimento tem sido amplamente utilizado como descrito originalmente para examinar os mecanismos de rejeição de transplantes e de tolerância de 6-8. Outros têm adaptado o procedimento original coração de rato transplante de Ono e Lindsey para transplantes cardíacos em ratos 9,10. Mais recentemente, uma técnica foi publicada por transplante de coração rato que superou alguns dos problemas associados com o método de Corry et al 11. O protocolo aqui descrito incorpora nossas modificações, com base no método de Mottram et al, 12, os quais incluem: perfusão in situ com solução salina heparinizada a frio imediatamente após toracotomia e realizar a operação de dador antes da operação de receptor para receptor minimizar o tempo de operação. Além disso, podemos usar grampos embarcação atraumáticas pequenas em vez de gravatas de seda 6-0. Embora grampos vasos têm a desvantagem de tomar mais espaço que eles são mais fáceis de controlar do que os laços, que não deve ser muito apertado ou soltoe são menos fáceis de remover do que as braçadeiras. O nosso método utiliza um único fio de sutura de corrida para a anastomose navio, embora na aprendizagem inicial estágios uma alternativa é a utilização de suturas de ancoragem na extremidade proximal e cantos distais para assegurar uniformidade de suturas e, portanto, a permeabilidade da anastomose.
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Protocol
Antes do início das experiências, obter aprovação do Comitê de Ética Animal Care da instituição relevante para os experimentos planejados. Manter os ratos na conformidade com os requisitos da sua instituição. O protocolo a seguir foi aprovado pelos comitês Universidade de Sydney e Royal Prince Alfred Hospital.
Antes de iniciar a cirurgia, todos os instrumentos devem ser cuidadosamente limpos e esterilizados por imersão em etanol 80%. Algumas instituições estipular autoclavagem no entanto isso pode danificar os instrumentos de microcirurgia multa no longo prazo. Sempre que possível o uso do equipamento descartável estéril.
1. Anestesia
- Anestesiar rato com isoflurano em um recipiente fechado, em seguida, colocá-lo em decúbito dorsal em uma placa de funcionamento, de forma rápida conexão anestésico cone do nariz. Teste de adequação da anestesia por beliscar a pata traseira para garantir que não haja reflexo.
- Raspar a pele com uma lâmina cirúrgica eesterilizar com etanol a 80%. Além disso, os 2% de clorexidina em 70% de álcool isopropílico pode ser utilizado para a esterilização da pele. Durante a indução da anestesia isoflurano a concentração é de 3%, mas reduzir isso para 1-1,5% para a manutenção. Faça pequenos ajustes para esta concentração para manter a respiração regular e freqüência cardíaca. Mantenha a temperatura do animal em uma almofada de aquecimento.
2. Operação Donor
- Fazer uma toracotomia para expor o coração e os vasos cortando o peito por meio de ambos os lados da caixa torácica a partir da borda nervura até à axila seguido de um corte transversal ao nível do processo xifóide, para formar uma aba da parede torácica. Levante essa aba para cima ao lado da cabeça e fixá-lo ao conselho operacional. Rasgue pericárdio para expor o coração e os vasos.
- Levante a veia cava inferior com uma pinça em uma mão e com a outra injetar 1 ml proximal salina heparinizada frio ao coração através da veia cava inferior, em seguida, colocar uma braçadeira pequena artéria no IVC para prevençãofluxo t de solução de perfusão de volta pelo buraco da agulha.
- Usando gaze e um cotonete, retirar o coração para baixo para expor a aorta ascendente e artéria pulmonar. Passe uma lâmina de um par de microtesoura através do (seio transverso) posterior canal para o pacote de aorta e da artéria pulmonar e cortou a aorta ea artéria pulmonar em conjunto, tanto distal quanto possível para garantir comprimento suficiente para anastomose.
- Laço e dividir o IVC, veia cava superior direita (SVC), deixou SVC e veias pulmonares utilizando 6-0 fio de seda. Amarre o IVC e SVC direito separadamente, em seguida, colocar uma única linha posterior ao coração para cercar o SVC esquerda junto com veias pulmonares e amarrá-lo. Colha o coração da área doadora, cortando os vasos distal para os laços, em seguida, armazená-lo em solução salina estéril fria a 4 ° C até o transplante. Isso resulta em morte do doador por sangria.
3. Operação Destinatário
- Anestesiar odestinatário como acima (seção 1). Raspar cuidadosamente abdômen para evitar a irritação, em seguida, fazer uma laparotomia por incisão mediana do púbis ao processo xifóide e retrair usar clipes de papel dobrado para formar retratores. Enrole o intestino em solução salina estéril gaze embebida quente e retrair a parte superior direita do abdômen.
- Para expor a aorta infra-renal e IVC, libertar os segmentos agrupados de aorta e veia cava inferior da artéria renal esquerda e veia para a bifurcação ilíaca, dividindo-as dos vasos lombares usando um cautério. Tome cuidado para que o cautério está na temperatura correta e usada por um período suficiente para dividir e selar as pontas dos vasos.
- Aplicar pequenas pinças atraumáticas embarcação para a aorta e segmentos VCI distal e proximal. Fazer uma incisão na parede frontal da aorta pelo primeiro perfurar um furo com uma agulha 30 G; em seguida, cortado de uma incisão vertical com microtesouras para coincidir com o tamanho da aorta do doador. Lave o lúmen da aorta com solução salina heparinizada para remover qualquer blcoágulos ood.
- Traga o coração do doador para o site receptor coberto com gaze embebida em solução salina fria e coloque-o para o lado direito do abdômen. Certifique-se a aorta do doador é posicionado ao lado da incisão sobre a aorta do receptor e a artéria pulmonar do doador posicionado ao lado do receptor da VCI.
- Anastomose lado end-to-the aorta do doador para a aorta destinatário usando execução 10-0 suturas de nylon a partir do canto proximal e sutura no lado esquerdo até chegar ao primeiro canto distal, em que fase o animal é girada em 180 °. Suavemente mover o coração de dador para o lado esquerdo do abdómen para expor o lado direito da aorta e continuar a sutura através do lado direito da parede da aorta a partir da extremidade distal para a extremidade proximal. Antes de fechar a anastomose da aorta, lave delicadamente o lúmen com solução salina heparinizada para remover qualquer coágulo e do ar.
- Anastomosar a artéria pulmonar do doador (PA) de ponta-a-lado com o destinatário da VCI. Faça uma incisão vercamente com microtesouras na parede frontal da VCI em um local, em conformidade com a anastomose arterial. Anastomosar dador PA aos receptores com CIV executando 10-0 suturas de nylon a partir da extremidade distal da parede esquerda dentro do lúmen da veia cava inferior. Depois de atingir a extremidade proximal, suturas continuar ao longo da parede lateral direita da frente até a extremidade distal para completar a anastomose. Antes de fechar a anastomose, lave delicadamente a luz para remover quaisquer coágulos e ar.
- Antes de liberar a embarcação grampos, coloque pedaços de Gelfoam em torno dos locais de anastomose, e aplicar uma leve pressão com um aplicador de algodão até que a hemostasia seja alcançado. No momento da revascularização, libertar a pinça distal em primeiro lugar, seguido pela braçadeira proximal.
- Após a revascularização, aplicar soro fisiológico quente a 37 ° C ao enxerto externamente para ajudar na sua recuperação. O enxerto geralmente começa imediatamente atrial e reverte espontaneamente para o ritmo sinusal em poucos minutos. Injetar 0,6 ml quentessubcutaneamente salina para manter a hidratação do destinatário. Injetar buprenorfina subcutânea para analgesia antes da conclusão da cirurgia
- Feche a ferida abdominal com um 5-0 sutura contínua absorvível para ambas as camadas. Comece por completar a camada interna e continuar ao longo da pele.
4. Recuperação e Monitorização do Enxerto
- Injectar a ampicilina para a profilaxia da infecção e colocar o recipiente em um bloco de aquecimento a 37 ° C durante a recuperação. A maioria dos animais recuperar-se rapidamente e são geralmente beber e comer muitas vezes dentro de 3 horas. Se o mouse mostra sinais de angústia, examinar de perto para determinar a causa. Se nenhuma causa óbvia, tratar com buprenorfina e acompanhar de perto. Consulte um veterinário se os sintomas forem graves ou persistir mais de 8 horas e considerar a eutanásia. Se necessário, dar continuidade 12 injeções por hora de buprenorfina até os sintomas desaparecerem. Se o mouse mostra sinais de angústia após 8 horas, dar continuidade 12injecções horárias de buprenorfina até que resolver. Consulte o veterinário se os sintomas persistirem por mais de 48 horas e sacrificar, se necessário.
- Monitorar enxerto batimento cardíaco por palpação abdominal direto e registrar a força da batida como + + + + para um enxerto saudável + para fraco batimento devido à rejeição avançada e - como não bater devido à completa rejeição do enxerto. Monitorar ratinhos diariamente para os primeiros 10 dias, depois 3x por semana durante a duração da experiência.
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Representative Results
Depois de um período de formação inicial, foram analisados 227 casos de rato transplante cardíaco heterotópico em nosso grupo. A taxa de sucesso nas primeiras 24 horas foi de 90,3% e em 48 horas foi de 86,8%. Dos 30 (13,2%) falhas dentro de 48 horas, 5 (2,2%) apresentaram paralisia dos membros posteriores e teve que ser sacrificado, 10 (4,4%) tinha um coração não bater devido a lesão de isquemia do enxerto e / ou trombose, enquanto 15 (6,6%) morreram dentro de 48 horas. Alguns sobreviventes de enxertos experimentais são mostrados na Tabela 1 com uma variedade de combinações de deformação. Transplantes de coração entre o mesmo doador e receptor tensão foram aceitas longo prazo, enquanto os transplantes entre cepas não-idênticos foram rejeitadas.
O aspecto de corações transplantados é mostrado na Figura 1. A causa de falha do transplante do coração é geralmente determinado pelo tempo após o transplante, quando o coração parar de bater em combinação com o aspecto do coração. Se necessário, a causade cessação de batimento deve ser confirmada através de análise histológica do coração. Por exemplo, em um C57BL / 6 receptor de um transplante de estirpe DBA / 2 coração de dador, o coração bater cessado no dia 2, o qual é mais invulgar como a rejeição em receptores não sensibilizados que geralmente leva pelo menos uma semana. Figura 1A mostra o coração desta recipiente com evidência de trombose e enfarte do tecido do coração. Na combinação da estirpe C57BL / 6 doadores de C57BL / 6 destinatário, o coração não foi rejeitado e sobreviveram durante> 100 dias (Figura 1B). Neste caso, o coração tinha reduzido ligeiramente em tamanho, devido à atrofia muscular secundária a sua condição de não sustentar a vida. Em contraste, a combinação de estirpe rejeitando de DBA / 2 doador de C57BL / 6 destinatário, o coração transplantado tinha deixado de bater por dia 7 e mostraram evidências de rejeição (Figura 1C). Foi completamente fibrótica e encolhido por dia 100 (Figura 1D).
Figura 1. Aparecimento de thrombosed, rejeitando e não rejeitando corações transplantados. (A) DBA / 2 coração transplantado para C57BL / 6 destinatário mostrando trombose e coração infartado 7 dias após o transplante. (B) C57BL / 6 coração transplantado para C57BL / 6 destinatário mostrando um bem perfundidos e coração batendo 100 dias após o transplante. (C ) DBA / 2 coração transplantado para C57BL / 6 destinatário que mostra o coração rejeitou 7 dias após o transplante. (D) DBA / 2 coração transplantado para C57BL / 6 destinatário que mostra o coração rejeitado 100 dias após o transplante. As setas indicam o coração transplantado.
| Combinações | Sobrevivências (dias) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | 8 x2, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178,3 → B10.BR | 7 x2, 8 x2, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x 4, 9 x 2, 10 x 5, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Sobrevida do enxerto Tabela 1. Coração em diferentes combinações doador / receptor.
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Discussion
Transplante cardíaco Mouse é um método de microcirurgia exigente, que requer habilidade cirúrgica considerável para dominar. O aspecto mais difícil é o pequeno diâmetro dos vasos. Além disso, é necessário limitar o tempo de funcionamento do destinatário e sangramento. A técnica de transplante cardíaco do rato foi primeiramente descrita por Corry et al. em 1973 e, posteriormente, por Mottram et al 12. Nossos modificações incluem os seguintes pontos. Em primeiro lugar, a perfusão imediata do coração doador com solução salina heparinizada frio após toracotomia e transecção de aorta e da artéria pulmonar pacote logo após perfusão impede isquemia quente durante a colheita. Em segundo lugar, a partir da preparação de receptor logo após a realização da colheita de doador, em vez de preparar o recipiente antes do doador, reduz o tempo de exposição abdominal do receptor, com a consequente melhoria na sobrevivência. Finalmente, o uso de embarcação pequena atraumática grampos para bbloquear o fluxo de sangue, em vez de laços para o destinatário da aorta / VCI feixe, geralmente resulta em menos danos aos vasos e pode reduzir a incidência de paralisia dos membros posteriores.
Além disso, os seguintes pontos são importantes para o sucesso. O tamanho ideal de doadores e receptores é em torno de 23 a 26 g e idade ideal é de 10 a 12 semanas. Animais mais velhos não têm navios de maior porte e seu aumento de gordura faz com que a exposição da aorta e IVC mais difícil. A desidratação e hipotermia do destinatário durante a cirurgia deve ser evitada. Destinatário intestino precisa ser bem protegidos contra a desidratação usando soro fisiológico morno gaze embebida eo destinatário pode ser mantida em uma esteira de aquecimento a 37 ° C. A gaze deve ser mantido úmido por aplicação regular de produtos frescos, salina quente durante a operação. Para minimizar a formação de coágulos sanguíneos e êmbolos de ar que pode levar a paralisia dos membros posteriores, os locais de anastomose dos vasos precisam ser bem lavada antes de fechar. Bowel deve ser cuidadosamente substituído pelo completina de transplante para prevenir qualquer torção do mesentério. A injecção subcutânea de 0,6 ml de solução salina morna auxilia recuperação de animais enquanto que um volume maior de líquido intravenoso logo após a cirurgia pode causar hipertensão e sangramento das anastomoses. Limitando o tempo que a aorta do receptor e veia cava inferior estão transversal apertada para menos de 30 minutos irá melhorar a taxa de sucesso.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) da Austrália Projeto Grant 1029205, pela Fundação Microsearch da Austrália, e pela Fundação Myee Codrington Pesquisa Médica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
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