Abstract
Мыши часто используются в качестве пересадки сердца доноров и реципиентов в исследованиях по пересадке иммунологии в связи с широким диапазоном трансгенных мышей и реагентов доступных. Трудность представляет из-за небольшого размера животного и на значительные технические вызовы микрохирургии, участвующих в трансплантации сердца. В частности, высокий уровень технического сбоя в ранние сроки после трансплантации может быть результатом смерти получателя и послеоперационных осложнений, таких как паралич задних конечностей или не-бьющегося сердца. Здесь полный техника для сердца трансплантации гетеротопическая мыши демонстрируется участием уборки сердце доноров и ее последующей имплантации в мышь-реципиента. Донорское сердце собирают сразу же после на месте перфузии с холодной гепаринизированным физиологическим раствором и перерезки восходящей аорты и легочной артерии. Операция получатель включает получение брюшной аорты и нижней полой вены (НПВ), а затемконца в сторону анастомоза донора аорты с аорты реципиента с помощью одного хода 10-0 microsuture и аналогичный анастомоза в легочной артерии донора с реципиентом IVC. После операции животных вводили 0,6 мл физиологического раствора подкожно и оставляли для восстановления на 37 ° C грелку. Результаты 227 мыши пересадок сердца суммируются с вероятностью успеха в 48 часов в 86,8%. Из 13,2% отказов в течение 48 часов, 5 (2,2%) испытали паралич задних конечностей, 10 (4,4%) имели не-бьющееся сердце из-за привить ишемического повреждения и / или тромбоза, а 15 (6,6%) умерли в течение 48 часов .
Introduction
Животные модели трансплантации органов может дать ценную информацию для улучшения лечения клинических пациентов после трансплантации. Мышиные модели особенно полезны для изучения иммунной механизм отторжения трансплантата орган или принятии в связи с широким диапазоном генетически модифицированных мышей и реагентов, специфичных для мышей, которые не доступны для других животных моделях 1-3. Проблема с мышиных моделях трансплантации является небольшой размер доноров и реципиентов, которая требует значительных технических навыков для достижения удовлетворительных результатов.
Методика была впервые описана для гетеротопической трансплантации сердца у крыс 4, который впоследствии был адаптированных для сердца трансплантации мыши на Корри и др. 5. Эта техника связана с подготовкой проекта получателя до операции донора и не перфузии донорского сердца, оба из которых, вероятно, компромисс выживание пересаженного сердца или тполучатель он. Процедура была широко используются в качестве первоначально описано изучить механизмы отторжения трансплантата и толерантности 6-8. Другие приспособились оригинальный крысы процедуру по пересадке сердца в Оно и Линдси для пересадки сердца у мышей 9,10. Совсем недавно, методика была опубликована для трансплантации сердца мыши, что преодолел некоторые из проблем, связанных с методом Корри и др. 11. Протокол, описанный здесь включает в себя наши модификации, основанные на методе Mottram и др. 12, которые включают: перфузии на месте с холодной гепаринизированной физиологического раствора сразу же после торакотомии и выполнения операции доноров до операции получателя, чтобы минимизировать время работы получателя. Кроме того, мы используем небольшие атравматичные зажимы сосудов вместо 6-0 шелковые галстуки. Хотя зажимы судов имеют тот недостаток, принимая больше места они легче контролировать, чем связей, которые не должны быть слишком туго или свободнои менее проста удалить, чем зажимов. Наша методика использует один ходовой шва для анастомоза сосудов, хотя в начальной ступени обучения альтернативы можно использовать пребывание швов на проксимальной и дистальной углах, чтобы обеспечить равномерность швов и, таким образом проходимость анастомоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
До начала экспериментов, получить одобрение Комитета по этике по уходу за животными соответствующего учреждения на планируемый экспериментов. Поддерживать мышей в соответствии с требованиями вашей организации. Следующий протокол был одобрен Сиднейского университета и Королевского больница Принца Альфреда комитетов.
Перед началом операции, все инструменты должны быть тщательно вымыть и стерилизовать путем замачивания в 80%-ном этаноле. Некоторые учебные заведения предусматривают автоклавирование однако это может привести к повреждению мелких микрохирургических инструментов в долгосрочной перспективе. Где можно использовать стерильные одноразовые оборудование.
1. Обезболивание
- Обезболить мышь изофлураном в герметичном контейнере затем поместить его на спине на операционном борту, быстро подключения обезболивающий носовой обтекатель. Достаточность Тест анестезии, зажимая заднюю ногу, чтобы обеспечить нет рефлекс.
- Бритье кожи с хирургическим скальпелем истерилизовать с помощью 80% этанола. Кроме того, 2% раствор хлоргексидина в 70% изопропилового спирта может быть использован для стерилизации кожи. Во время вводного наркоза изофлюран концентрация составляет 3%, но уменьшить это до 1-1,5% на техническое обслуживание. Внести незначительные коррективы в этой концентрации поддерживать регулярные дыхание и сердечный ритм. Поддерживать температуру животного на грелку.
2. Эксплуатация Донор
- Сделать торакотомии подвергать сердца и сосудов путем разрезания грудной клетки через обеих сторон грудной клетки грудной от края до подмышечной впадины с последующим поперечным разрезом на уровне мечевидного отростка с образованием стенки клапан груди. Поднимите этот лоскут до около голову и прикрепите его к операционной борту. Оторвите перикарда подвергать сердце и сосуды.
- Поднимите нижнюю полую вену пинцетом в одной руке и с другой Inject 1 мл холодной гепаринизированная солевой проксимального к сердцу через IVC, затем положить зажим небольшой артерии на ВАХ для профилактикит поток перфузии раствора обратно через игольное отверстие.
- Использование марлю и ватным тампоном, убрать сердце вниз, чтобы разоблачить восходящей аорты и легочной артерии. Передайте одно лезвие из пары microscissors через канал (поперечная пазухи) задней к расслоению аорты и легочной артерии и сократить аорту и легочную артерию вместе насколько дистально, насколько это возможно, чтобы обеспечить достаточную длину для анастомоза.
- Галстук и разделить IVC, прямо верхней полой вены (ВПВ), слева SVC и легочные вены с помощью 6-0 шелковой нити. Свяжите IVC и правую SVC отдельно затем поместить в одном потоке кзади от сердца, чтобы окружить левую SVC вместе с легочных вен и связать его. Урожай сердце от донорской путем разрезания сосудов дистальнее связей, а затем сохранить его в холодном стерильном физиологическом растворе при 4 ° С до трансплантации. Это приводит к смерти донора путем обескровливания.
3. Получатель Операция
- Обезболитьполучатель, как указано выше (раздел 1). Тщательно брить живот, чтобы избежать раздражения, а затем сделать лапаротомии путем срединный разрез от лобка к мечевидного отростка и убрать с помощью скрепки наклонился, чтобы сформировать преднатяжителями. Оберните кишечника в теплой стерильного физиологического раствора пропитанной марли и убрать в верхнем правом углу живота.
- Чтобы разоблачить инфра-почечные аорты и IVC, освободить комплекте сегменты аорты и нижней полой вены с левой почечной артерии и вены до подвздошной бифуркации путем деления их от поясничных сосудов с помощью прижигания устройства. Следите за тем, прижигание является при правильной температуре и использовать в течение достаточного времени, чтобы разделить и запечатать концы сосудов.
- Применить небольшие атравматичные зажимы сосудов к аорте и сегментов IVC дистально и проксимально. Сделайте надрез в передней стенке аорты, сначала проколов отверстие с 30 G иглы; затем вырезать надрез вертикально microscissors в соответствии с размером донорской аорты. Промойте аорты просвет с гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы удалить блOOD сгустки.
- Доведите донорского сердца к месту получателя, покрытой марлей, смоченной в холодной солевой раствор и поместить его с правой стороны живота. Убедитесь, что донор аорта расположена рядом с разреза на аорте получателя и донорского легочной артерии, расположенной рядом с получателя IVC.
- не анастомозируют с конца в сторону донора аорты к аорте получателя требует запуска 10-0 нейлоновые швы, начиная от проксимального углу и наложения швов вдоль левой стороны сначала до достижения дистального угол, на какой стадии животное поворачивается на 180 °. Осторожно переместить донорского сердца в левой части брюшной полости, чтобы обнажить правую сторону аорты и продолжают наложения швов через правую сторону стенки аорты от дистального конца до проксимального конца. Перед закрытием аортального анастомоза, мягко очистить полость с гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы удалить сгусток и воздуха.
- Анастомозирует донорской легочной артерии (ПА) из конца в сторону с получателем IVC. Сделайте надрез верски с microscissors в передней стенке нижней полой вены на узле в соответствии с анастомоза артерии. Анастомозировать донора Па до получателя IVC с проточной 10-0 нейлоновые швы, начиная с дистального конца левой стенке внутри просвета полой вены. После достижения проксимальный конец, по-прежнему швов вдоль передней правой боковой стенки до дистального конца для завершения анастомоза. Перед закрытием анастомоза, мягко очистить полость для удаления сгустков и воздух.
- Перед выпуском зажимы сосуда, место куски Gelfoam вокруг анастомоза сайтов и нежный давление ватным аппликатором, пока гемостаз не будет достигнута. В момент реваскуляризации, выпуск дистальный зажим сначала, а затем проксимального зажима.
- После реваскуляризации, нанесите теплый солевой раствор при температуре 37 ° С до трансплантата внешне, чтобы помочь ее восстановлению. Трансплантат обычно начинается немедленно фибрилляции и возвращается спонтанно синусового ритма в течение нескольких минут. Введите 0,6 мл теплойсолевой подкожно для поддержания гидратации получателя. Введите бупренорфин подкожно для обезболивания до завершения операции
- Закройте брюшную рану с одним 5-0 рассасывающиеся проточной шва для обоих слоев. Начните, заполнив внутренний слой и продолжать идти по коже.
4. Восстановление и трансплантата Мониторинг
- Введите ампициллин для профилактики инфекции и поместите получателя на грелку при 37 ° С для восстановления. Большинство животных быстро восстановиться и, как правило, пить и часто едят в пределах 3 часов. Если мышь показывает признаки бедствия, внимательно изучать, чтобы определить причину. Если нет очевидной причины, лечения с бупренорфина и внимательно следить. Проконсультируйтесь с ветеринаром, если симптомы тяжелые или сохраняются более 8 часов и рассмотреть эвтаназию. Если необходимо, укажите продолжая 12 почасовые инъекции бупренорфина до исчезновения симптомов. Если мышь показывает признаки бедствия после 8 часов, дать Продолжая 12почасовые инъекции бупренорфина, пока они не решить. Обратитесь к ветеринару, если симптомы не проходят в течение более чем 48 часов и усыпить, если это необходимо.
- Монитор трансплантата сердцебиение прямым пальпации живота и записывать на прочность ударом как + + + + для здорового трансплантата к + для слабой доли в связи с передовой отторжения и - как не избиение из-за полного отказа от трансплантата. Монитор мышей ежедневно в течение первых 10 дней, затем 3 раза в неделю в течение всего срока эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После начального периода обучения, были проанализированы 227 случаев мыши гетеротопической трансплантации сердца в нашей группе. Шанс успеха в первые 24 часа было 90,3% и на 48 часов это было 86,8%. Из 30 (13,2%) отказов в течение 48 часов, 5 (2,2%) испытали паралич задних конечностей и должен был быть умерщвлены, 10 (4,4%) имели не-бьющееся сердце из-за травмы трансплантат ишемии и / или тромбоза, а 15 (6,6%) умерли в течение 48 часов. Некоторые экспериментальные привитые остатки показаны в таблице 1 с различными комбинациями деформации. Сердце трансплантации между того же донора и напряжения получателя были приняты долгосрочные а пересадки между нетождественных штаммов были отклонены.
Появление пересаженных сердец показано на рисунке 1. Причиной отказа трансплантата сердца, как правило, определяется временем после трансплантации, когда сердце перестало биться в сочетании с появлением сердца. Если необходимо, то причинаиз прекращения такт должен быть подтвержден гистологическим анализом сердца. Например, в штамм получателя пересадки DBA / 2 донором сердца C57BL / 6, сердце перестало биться на 2 день, который является самым необычным, как отказ в несенсибилизированной получателей обычно занимает по крайней мере неделю. Рис. 1А показывает сердце от этого получатель с признаками тромбоза и инфаркта сердечной ткани. В штамма комбинации C57BL / 6 донора C57BL / 6 получателя, сердце не было отклонено, и выжили в течение> 100 дней (рис. 1б). В этом случае сердце было немного уменьшен в размерах из-за атрофии мышц, вторичной к его жизни, не поддерживая состояние. В противоположность этому, в отклонении от натяжения комбинации DBA / 2 донора к C57BL / 6 получателю, пересаженного сердца перестал бить по 7-й день и показали доказательство отторжения (рис. 1с). Это было совершенно фиброзных и сморщенное днем 100 (рис. 1D).
Рисунок 1. Внешний вид тромбированных, отвергая и не отрицая пересаженных сердец. (А) DBA / 2 сердце пересаживают в C57BL / 6 получателя с указанием тромбированных и инфаркта сердца 7 дней после трансплантации. (В) C57BL / 6 сердце пересаживают в C57BL / 6 получателя показывая хорошо перфузии и бьющееся сердце через 100 дней после трансплантации. (C ) DBA / 2 сердце пересаживают в C57BL / 6 получателя с указанием отклонил сердце 7 дней после трансплантации. (D) DBA / 2 сердце пересаживают в C57BL / 6 получателя с указанием отклонил сердце через 100 дней после трансплантации. Стрелки указывают пересаженного сердца.
| Комбинации | Пережитки (дней) | н | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 х7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | 8 x2, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178.3 → B10.BR | 7 x2, x2 8, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, x2 9, 10 x5, 11, 12, 14 х2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / C → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Выживание Таблица 1. Сердце трансплантата в различных комбинациях донор / реципиент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Трансплантация сердца мышь является сложной микрохирургической метод, который требует значительного хирургического умение мастера. Наиболее сложным аспектом является малый диаметр сосудов. Кроме того, необходимо, чтобы ограничить время работы получателя и кровотечение. Техника для сердца трансплантации мыши была впервые описана Корри и соавт. в 1973 году и впоследствии Mottram др. 12. Наши модификации включают следующие моменты. Во-первых, непосредственное перфузии донорского сердца с холодной гепаринизированным физиологическим раствором следующее торакотомии и перерезки аорты и расслоения легочной артерии вскоре после перфузии предотвращает теплый ишемии во время сбора урожая. Во-вторых, начиная подготовку получатель вскоре после завершения сбора урожая доноров, вместо подготовки получателя перед донора, снижает животе время экспозиции у реципиента с последующим улучшением выживания. Наконец, использование малых атравматичной судна зажимы бзаблокировать кровоток, вместо связей для получателя аорты / IVC расслоения, как правило, приводит к меньшему повреждению сосудов и может снизить заболеваемость паралич задних конечностей.
Кроме того, следующие пункты важны для успеха. Оптимальный размер доноров и реципиентов составляет около 23 до 26 г и Оптимальный возраст составляет от 10 до 12 недель. Старые животные не имеют более крупные суда и их повышенная жира делает воздействие аорты и нижней полой вены сложнее. Обезвоживание и переохлаждение получателя во время операции следует избегать. Нуждается Получатель кишечника, чтобы быть хорошо защищены от обезвоживания с помощью теплой солевой смоченную марлю и получатель может поддерживаться на нагревательного мата при 37 ° С Марля должна быть влажной на регулярном применении свежего, теплого физиологического раствора во время операции. Чтобы свести к минимуму образование тромбов и воздуха эмболии, что может привести к паралич задних конечностей, анастомоза сайты судов должны быть хорошо промыты перед закрытием. Кишечника следует тщательно заменены на completiна трансплантации, чтобы предотвратить любое скручивание брыжейки. Подкожное введение 0,6 мл теплой солевых помогает восстановление животных в то время как больший объем внутривенной жидкости вскоре после операции может привести к гипертонии и кровотечение анастомозов. Ограничение времени, что аорта получатель и IVC перекрестно зажат до менее чем 30 мин улучшит показатель успеха.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научно-исследовательским советом здравоохранения и медицинской (NHMRC) Австралии Project Grant 1029205, по Microsearch Фонда Австралии, и по медицинским исследованиям Фонда Myee Кодрингтон.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
- Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
- Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
- Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
- Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
- Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
- Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
- Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).
