Abstract
Möss används ofta som hjärttransplanterade givare och mottagare i studier av transplantationsimmunologi på grund av det stora utbudet av transgena möss och reagenser tillgängliga. En svårighet presenteras på grund av den begränsade storleken på djuret och de stora tekniska utmaningarna i mikrokirurgi deltar i hjärttransplantation. I synnerhet kan en hög frekvens av tekniskt fel tidigt efter transplantation resultat av mottagare död och postoperativa komplikationer såsom bakbensförlamning eller en icke-slående hjärta. Här är den kompletta teknik för heterotopisk mus hjärttransplantation visat inbegriper skörd av donatorhjärtat och dess efterföljande implantation i en mottagande musen. Givaren hjärta skördas omedelbart efter in situ perfusion med kall hepariniserad saltlösning och transection av den uppstigande aorta och lungartären. Mottagaren operation involverar framställningen av den abdominala aortan och vena cava inferior (IVC), följt avände-till-sida anastomos av donatorns aorta med mottagarens aorta med användning av en enda drift 10-0 microsuture och en liknande anastomos av donatorns lungartär med mottagaren IVC. Efter operationen djuret injiceras med 0,6 ml normal koksaltlösning subkutant och fick återhämta sig på ett 37 ° C värmedyna. Resultaten från 227 mus hjärttransplantationer sammanfattas med en framgång på 48 tim på 86,8%. Av de misslyckanden 13,2% inom 48 timmar, 5 (2,2%) fick bakbensförlamning, 10 (4,4%) hade en icke-beating heart grund ympa ischemisk skada och / eller trombos, medan 15 (6,6%) dog inom 48 tim .
Introduction
Djurmodeller av organtransplantation kan ge värdefull information för att förbättra behandling av kliniska transplantationspatienter. Musmodeller är särskilt användbara för att studera immunmekanism av organtransplantatavstötning eller acceptans på grund av det breda spektrum av genetiskt modifierade möss och reagens specifika för möss som inte är tillgängliga för andra djurmodeller 1-3. En utmaning med musmodeller av transplantation är den lilla storleken på givare och mottagare som kräver stor teknisk skicklighet för att uppnå tillfredsställande resultat.
En teknik beskrevs första gången för heterotopisk transplantation av hjärtan hos råttor 4 som sedan anpassade för mus hjärttransplantation från Corry m.fl. 5. Denna teknik inblandade förbereda mottagaren innan givaren drift och ingen perfusion av donatorhjärtat, som båda är kan äventyra överlevnaden av transplanterade hjärtat eller tHan mottagare. Förfarandet har använts i stor omfattning som ursprungligen beskrivits för att undersöka mekanismerna för transplantatavstötning och tolerans 6-8. Andra har anpassat den ursprungliga råtthjärttransplantation förfarande av Ono och Lindsey för hjärttransplantationer i möss 9,10. Mer nyligen har en teknik som publicerats för mus-hjärttransplantation som övervann vissa av de problem som är förknippade med förfarandet enligt Corry et al 11. Protokollet som beskrivs här innehåller våra ändringar, baserat på metoden för Mottram et al 12, som inkluderar: in situ perfusion med kall hepariniserad saltlösning omedelbart efter torakotomi och utföra givar operationen innan mottagaren operation för att minimera mottagare drifttid. Dessutom använder vi små atraumatiska fartygs klämmor istället för 6-0 sidenslipsar. Även fartygs klämmor har nackdelen av att ta mer utrymme de är lättare att kontrollera än banden, som inte bör vara för hårt eller löstoch är mindre lätt att ta bort än klämmor. Vår metod använder en enda löpande sutur för kärlet anastomos, även om i den inledande inlärningsstegen ett alternativ är att använda stay suturer vid de proximala och distala hörnen för att säkerställa jämnheten av suturer och därmed öppenhet hos anastomosen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Före påbörjandet av experiment, få godkännande från den berörda institutionens Animal Care etikkommitté för de planerade försöken. Behåll möss i enlighet med kraven i din institution. Följande protokoll har godkänts av Sydney University och Royal Prince Alfred Hospital kommittéer.
Innan påbörjas operation, bör alla instrument rengöras grundligt och steriliseras genom blötläggning i 80% etanol. Vissa institutioner föreskriver autoklavering men det kan skada fina mikroinstrument på lång sikt. Om möjligt används sterila engångsutrustning.
1. Anestesi
- Söva musen med isofluran i en sluten behållare och placera den på rygg på en operativ styrelse, snabbt ansluta bedövningsmedel noskon. Test tillräckliga anestesi genom att klämma den bakfoten att se till att det inte finns någon reflex.
- Raka huden med ett kirurgiskt blad ochsterilisera med 80% etanol. Dessutom kan 2% klorhexidin i 70% isopropylalkohol användas för hud sterilisering. Under induktion av anestesi med isofluran koncentrationen är 3%, men minska detta till 1-1,5% för underhåll. Göra mindre justeringar av denna koncentration för att hålla regelbunden andning och puls. Upprätthåll temperaturen hos djuret på en värmedyna.
2. Donator Drift
- Gör en torakotomi för att frilägga hjärtat och fartyg genom att skära bröstkorgen genom båda sidor av bröstkorgen från revbenskanten upp till armhålan följt med ett tvärsnitt på nivån för den xiphisternum för bildning av en bröstvägg klaff. Lyft denna flik upp bredvid huvudet och fästa den på driftkortet. Riv hjärtsäcken för att exponera hjärta och kärl.
- Lyft nedre hålvenen med pincett i ena handen och med den andra injicera 1 ml kall hepariniserad koksalt proximal till hjärtat genom IVC, sedan sätta en liten artär klämma på IVC till förebyggandet flöde av perfusion lösningen tillbaka genom nålen hålet.
- Med hjälp av gasväv och en bomullspinne, dra hjärtat nedåt för att exponera stigande aorta och lungartären. Pass ett blad av ett par microscissors genom kanalen (tvärgående sinus) posterior till bunten av aorta och lungartären och skär kroppspulsådern och lungpulsådern tillsammans så långt distalt som möjligt för att säkerställa tillräcklig längd för anastomos.
- Slips och dela IVC, höger vena cava superior (SVC), lämnade SVC och pulmonell vener använda 6-0 silkestråd. Knyt IVC och höger SVC sig sedan placera en enda tråd posterior till hjärtat för att omringa den vänstra SVC tillsammans med pulmonell vener och knyta den. Skörda hjärtat från givarstället genom att skära kärlen distalt om banden och sedan lagra den i kall steril saltlösning vid 4 ° C fram till transplantation. Detta resulterar i döden av givaren genom avblodning.
3. Mottagare Drift
- Bedövamottagare som ovan (avsnitt 1). Försiktigt raka magen för att undvika irritation, sedan göra en laparotomi genom mittlinjen snitt från pubis till xiphisternum och dra med hjälp av gem böjd att bilda upprullningsdon. Linda tarmen i varmt steril koksaltlösning indränkt gasbinda och tillbaka till den övre högra delen av buken.
- För att avslöja den infranjur aorta och IVC, befria kombinerade segmenten aorta och IVC från den vänstra njurartären och ven till höftbifurkationen genom att dividera dem från ländryggen fartyg som använder en diatermi enhet. Se till att det diatermi är vid rätt temperatur och används för tillräcklig tid för att dela upp och försegla kärländarna.
- Applicera små atraumatiska klämmor fartyg till aorta och IVC segment distalt och proximalt. Gör ett snitt i den främre väggen av aortan genom att först punktera ett hål med en 30 G-nål; sedan skära ett snitt vertikalt med microscissors att matcha storleken på donator aorta. Spola aortalumen med hepariniserad saltlösning för avlägsnande av eventuellt blood proppar.
- Bring donatorhjärtat till mottagarens platsen täckt med gasväv indränkt i kall saltlösning och placera den till den högra sidan av buken. Se till att givaren aorta placeras intill snittet på mottagarens aorta och donatorns lungartären placerad bredvid mottagaren IVC.
- Anastomos givar aorta end-till-sida till mottagaren aorta med hjälp av rinnande 10-0 nylon suturer början från den proximala hörnet och suturering på vänster sida först tills de når den bortre hörnet, i vilket skede djuret roteras 180 °. Rör försiktigt donatorhjärtat till den vänstra sidan av buken för att exponera den högra sidan av aorta och fortsätta suturering genom den högra sidan av aortaväggen från den distala änden till den proximala änden. Innan du stänger aorta anastomos, spola försiktigt lumen med hepariniserad saltlösning för att avlägsna eventuell koagel och luft.
- Anastomos givaren lungartär (PA) end-till-sida med mottagaren IVC. Gör ett snitt vertiskt med microscissors i den främre väggen hos IVC vid ett säte i enlighet med det artär anastomos. Anastomos donatorn PA till mottagare IVC med rinnande 10-0 nylonsuturer med början från den distala änden av den vänstra väggen i lumen av IVC. Efter att ha nått den proximala änden, fortsätter suturer längs fronten högra sidoväggen fram till den distala änden för att fullborda anastomosen. Innan du stänger anastomos, spola försiktigt lumen för att ta bort eventuella klumpar och luft.
- Innan du släpper kärlklämmor, placera bitar av Gelfoam runt anastomosen platser och tryck lätt med en bomulls applikator tills hemostas uppnås. Vid tidpunkten för revaskularisering, släpp den distala klämman först, följt av den proximala klämman.
- Efter revaskularisering, ska varmt koksaltlösning vid 37 ° C till transplantatet externt för att hjälpa återhämtningen. Transplantatet börjar vanligtvis flimmer omedelbart och återgår spontant till sinusrytm inom några minuter. Injicera 0,6 ml varmtkoksaltlösning subkutant för att upprätthålla vätskebalansen hos mottagaren. Injicera buprenorfin subkutant för smärtlindring före avslutad kirurgi
- Stäng buken såret med en 5-0 absorber rinnande sutur för båda lagren. Starta genom att fylla det inre skiktet och fortsätter längs huden.
4. Återvinning och Graft Övervakning
- Injicera ampicillin som profylax mot infektion och placera mottagaren på en värmedyna vid 37 ° C för återvinning. De flesta djuren återhämta sig snabbt och är oftast dricker och ofta äter inom 3 timmar. Om musen visar tecken på ångest, granska noga för att fastställa orsaken. Om ingen uppenbar orsak, behandla med buprenorfin och noga övervaka. Konsultera en veterinär om symtomen är allvarliga eller kvarstår mer än 8 timmar och överväga dödshjälp. Om det behövs, ge fortsatt 12 timme injektioner av buprenorfin tills symtomen försvinner. Om musen visar tecken på ångest efter 8 timmar, ge fortsatt 12timme injektioner av buprenorfin tills de löser. Rådfråga veterinär om symtomen fortsätter i mer än 48 timmar och avliva vid behov.
- Övervaka graft hjärtrytm genom direkt abdominal palpation och registrera styrkan hos kryssen som + + + + för en frisk transplantat till + för svag takt på grund av avancerad avstötning och - som icke stryk pga total avstötning av transplantatet. Övervaka möss dagligen under de första 10 dagarna, sedan 3x i veckan under hela experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter en inledande utbildningsperioden har 227 fall av mus heterotop hjärttransplantation i vår grupp analyseras. Framgången inom de första 24 h var 90,3% och vid 48 h var 86,8%. Av de 30 (13,2%) fel inom 48 timmar, 5 (2,2%) upplevde bakbensförlamning och måste avlivas, 10 (4,4%) hade en icke-bultande hjärta på grund av transplantat ischemi skada och / eller trombos, medan 15 (6,6%) dog inom 48 timmar. Vissa experimentella ymp överlevnadar visas i tabell 1 med en variation av töjnings-kombinationer. Hjärttransplantationer mellan samma donator och mottagare stam godtogs långsiktigt medan transplantationer mellan icke-identiska stammar avvisades.
Utseendet på transplanterade hjärtan visas i figur 1. Orsaken till hjärttransplantation misslyckande i allmänhet bestäms av tid efter transplantation när hjärtat slutat slå i kombination med utseendet på hjärtat. Om så är nödvändigt, orsakenupphör att takten bör bekräftas genom histologisk analys av hjärtat. Till exempel i en C57BL / 6 stam mottagare av en DBA / 2 donor hjärttransplantation, upphörde det hjärtat slå på dag 2, vilket är mycket ovanligt som avslag i osensibiliserade mottagare brukar ta minst en vecka. Figur 1A visar hjärtat av detta mottagare med tecken på trombos och infarkt i hjärtvävnaden. I stammen kombinationen av C57BL / 6 givare till C57BL / 6 mottagare, var hjärtat inte avvisas och överlevde för> 100 dagar (Figur 1B). I detta fall hjärtat hade minskat något i storlek på grund av muskelatrofi sekundär till dess icke livsuppehållande status. Däremot i den avvisa stammen kombinationen av DBA / 2 givare till C57BL / 6 mottagare, hade det transplanterade hjärtat upphörde att slå efter dag 7 och visade tecken på avstötning (Figur 1C). Det var helt fibrotiska och krympta dag 100 (figur 1D).
Figur 1. Utseende av thrombosed, avvisa och inte stöter bort transplanterade hjärtan. (A) DBA / 2 hjärta transplanteras till C57BL / 6 mottagare visar thrombosed och infarkt hjärta 7 dagar efter transplantation. (B) C57BL / 6 hjärta transplanteras till C57BL / 6 mottagare visar en väl perfusion och bultande hjärta 100 dagar efter transplantation. (C ) DBA / 2 hjärta transplanteras till C57BL / 6 mottagare visar förkastas hjärta 7 dagar efter transplantationen. (D) DBA / 2 hjärta transplanteras till C57BL / 6 mottagare visar förkastas hjärta 100 dagar efter transplantation. Pilar anger det transplanterade hjärtat.
| Kombinationer | Överlevande (dagar) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | 8 x2, 9, 12 | 4 | 8,5 |
| 178,3 → B10.BR | 7 x2, 8 x2, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8,5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, 9 x2, 10 x5, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c-→ C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Tabell 1. Heart graft överlevnad i olika givare / mottagare kombinationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus hjärttransplantation är en utmanande mikrokirurgisk metod som kräver betydande kirurgisk skicklighet att bemästra. Den mest utmanande aspekt är den lilla diametern hos kärlen. Dessutom är det nödvändigt att begränsa driftstiden och blödning mottagaren. Tekniken för mus-hjärttransplantation beskrevs först av Corry et al. 1973 och därefter av Mottram et al 12. Våra modifieringar omfattar följande punkter. För det första, omedelbara perfusion av hjärtat givaren med kall hepariniserad koksaltlösning efter torakotomi och transection av aorta och lungartären bunt snart efter perfusion förhindrar varm ischemi under skörd. För det andra börjar mottagaren preparatet strax efter avslutad givar skörd, i stället för att förbereda mottagaren innan givaren, minskar buken exponeringstid i recipienten med åtföljande förbättring i överlevnad. Slutligen, användning av små atraumatisk fartyg klämmor till blås blodflöde, i stället för band för mottagaren aorta / IVC bunt, resulterar oftast i mindre skador på fartyg och kan minska förekomsten av bakbensförlamning.
Dessutom följande punkter är viktiga för framgång. Den optimala storleken på givare och mottagare är ca 23-26 g och optimal ålder är 10 till 12 veckor. Äldre djur har inte större fartyg och deras ökade fett gör exponeringen av aorta och IVC svårare. Dehydrering och hypotermi hos mottagaren under operation måste undvikas. Mottagare tarm måste vara väl skyddad från uttorkning med hjälp av varm saltlösning indränkt gasbinda och mottagaren kan upprätthållas på en värmematta vid 37 ° C. Den gasväv måste hållas fuktig genom regelbunden applicering av färsk, varm saltlösning under operationen. För att minimera blodproppar och luft emboli som kan leda till bakbensförlamning, kärl anastomos webbplatser måste vara väl spolas före stängning. Tarm bör noggrant bytas vid completipå av transplantation för att förhindra vridning av krös. Subkutan injektion av 0,6 ml varm koksaltlösning hjälper djur återhämtning, medan en större volym intravenös vätska snart efter operationen kan leda till högt blodtryck och avblodning av anastomoser. Att begränsa den tid som mottagaren aorta och IVC är tvär fastklämmes till mindre än 30 min kommer att förbättra resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Health och medicinska forskningsrådet (NHMRC) Australiens Project Grant 1.029.205, genom Microsearch Foundation i Australien, och av Myee Codrington Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
- Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
- Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
- Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
- Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
- Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
- Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
- Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).
