Abstract
Fareler nedeniyle sık sık mevcut transgenik fareler ve reaktiflerin geniş transplant immünoloji çalışmalarda kalp nakli verici ve alıcı olarak kullanılır. Bir zorluk nedeniyle hayvanın küçük boyutu ve kalp nakli dahil mikrocerrahi önemli teknik sorunlar sunulmaktadır. Özellikle, erken transplantasyon sonrası teknik başarısızlık oranının yüksek alıcı ve ölüm gibi arka ekstremite felci ya da olmayan bir kalpte post-operatif komplikasyonlar oluşabilir. Burada, heterotopik fare kalp nakli için tam teknik bir alıcı fare içine donör kalp ve sonraki implantasyonu hasat içeren gösterilmiştir. Donör kalp derhal çıkan aort ve pulmoner arter soğuk heparinli serum fizyolojik ve kesisi ile in situ perfüzyon takip hasat edilir. Alıcı işlemi takiben, abdominal aorta ve vena kava (IVC) hazırlanmasını gerektirirçalışan tek 10-0 mikrodikiş ve alıcı VKİ ile donör pulmoner arter benzer bir anastomoz kullanarak alıcı aort ile aort donör uç-yan anastomoz. Ameliyattan sonra hayvanlar, 0.6 ml normal tuzlu su, deri altından enjekte edildi ve 37 ° C bir ısıtma pedi üzerine geri bırakılır. 227 fare kalp nakli gelen sonuçlar% 86.8 48 saatte bir başarı oranı ile özetlenmiştir. 15 (% 6.6) 48 saat içinde ölürken, 48 saat içinde% 13.2 arızaları, 5 (% 2.2), iskemik yaralanma ve / veya trombozu greft nedeniyle olmayan bir dayak kalbi vardı arka bacak felci, 10 (% 4.4) deneyimli .
Introduction
Organ nakli hayvan modelleri klinik transplant hastalarının tedavisini geliştirmek için değerli bilgiler sağlayabilir. Fare Modelleri Genetik olarak modifiye edilmiş fareler ve diğer hayvan modelleri 1-3 için geçerli değildir fareler için özel reaktiflerin geniş organ nakli reddi veya kabul bağışıklık mekanizmasını çalışmak için özellikle yararlıdır. Transplantasyonu fare modelleri ile bir meydan okuma tatmin edici sonuçlara ulaşmak için önemli teknik beceri gerektirir donör ve alıcı küçük boyutudur.
Bir teknik, ilk olarak daha sonra Corry ve arkadaşları tarafından 5 Fare kalp nakli için uyarlanmıştır sıçanlarda 4 kalplerin heterotopik nakli için tarif edilmiştir. Bu teknik, önce verici işlemi için alıcı ve transplante veya t hayatta tehlikeye sokabilecek her ikisi de donör kalbi, hiçbir perfüzyon hazırlanması dahilo alıcı. Ilk olarak transplant reddi ve tolerans 6-8 mekanizmalarını incelemek için anlatılan prosedür, yaygın olarak kullanılmaktadır. Diğerleri farelerde 9,10 kalp nakli için Ono ve Lindsey orijinal sıçan kalp nakli prosedürü adapte var. Daha yakın zamanlarda, bir teknik Corry et al 11'in yöntemi ile ilişkili sorunların üstesinden bir fare kalp nakli için yayınlanmıştır. Protokol, burada tarif edilen dahil Mottram ve ark 12 yöntemine dayalı değişiklikler, içerir: in situ perfüzyon soğuk heparinize tuzlu su ile hemen torakotomi sonra alıcı işlem süresini en aza indirmek için, alıcı işlemi için önce verici işlemi yapılması. Buna ek olarak, biz küçük atravmatik damar kelepçeler yerine 6-0 ipek bağları kullanabilirsiniz. Damar kelepçeler daha fazla yer alma dezavantajı olmasına rağmen onlar çok sıkı veya gevşek olmamalı, hangi bağları daha kontrol etmek daha kolaydırve kelepçeler daha çıkarmak için daha az açıktır. İlk öğrenme alternatif bir sütür düzgünlüğü sağlamak ve böylece anastomoz açıklığı için yakın ve uzak köşelerinde kalmak sütür kullanmak için sahneliyor rağmen bizim yöntem, damar anastomoz için çalışan tek bir dikiş kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Önceki deneyler başlamadan, planlanan deneyler için ilgili kurum Hayvan Bakım Etik Kurul onayı almak. Kurumunuzun gereklerine uygun olarak fareler koruyun. Aşağıdaki protokol Sydney Üniversitesi ve Kraliyet Prens Alfred Hastanesi komiteleri tarafından onaylandı.
Önce ameliyat başlamadan, tüm araçlar iyice temizlenmeli ve% 80 etanol içinde iliklerine tarafından sterilize. Bazı kurumlar ancak bu uzun vadede ince mikrocerrahi aletleri zarar verebilir otoklavlanmayı şart. Mümkün kullanımlık steril tek kullanımlık ekipman.
1.. Anestezi
- Kapalı bir kapta izofluran ile fare anestezisi sonra hızlı anestezi burun konisi bağlayan bir işletim gemide onu sırtüstü yerleştirin. Hiçbir refleks olmadığından emin olmak için arka ayak kısma anestezi testi yeterliliği.
- Bir cerrahi bıçak ile cilt ve tıraş% 80 etanol ile sterilize. Buna ek olarak,% 70 izopropil alkol içerisinde% 2 klorheksidin cilt sterilizasyon için kullanılabilir. Anestezi indüksiyonu sırasında izofluran konsantrasyonu% 3 olduğunu, ancak bakım için% 1-1,5 'bu azaltabilir. Düzenli nefes alma ve kalp hızını korumak için bu konsantrasyon için küçük ayarlamalar yapın. Bir ısıtma pedi üzerinde hayvanın ısısını korumak.
2.. Donör Operasyonu
- Bir göğüs duvarı kanat oluşturması için xiphisternum seviyesinde enine bir kesik ile ve ardından koltuk altına nervür kenarından göğüs kafesinin her iki göğsü ile keserek ve kalp damarları ortaya çıkarmak için bir torakotomi yapın. Başın yanında bu kapağını kaldırın ve işletme kuruluna için pin. Kalp ve damarları maruz perikard yırttınız.
- Bir elinde ve IVC'da yoluyla kalbe diğer inject 1 ml soğuk heparinize tuzlu proksimal ile forseps ile inferior vena kava kaldırın, sonra önleme için IVC'da küçük arter kelepçe koymakgeri iğne deliğinden perfüzyon çözümü t akışı.
- Gazlı bez ve pamuk kullanarak, aorta ve pulmoner arter maruz aşağı kalp çekin. Aorta ve pulmoner arter demetine kanalı (enine sinüs) posterior aracılığıyla microscissors bir çiftin bir bıçak geçmek ve anastomoz için yeterli uzunluğa sağlayacak kadar distale mümkün olduğunca bir araya aorta ve pulmoner arter kesti.
- Kravat ve IVC, sağ superior vena kava (SVK) bölün, 6-0 ipek iplik kullanılarak SVC ve pulmoner venlerin sol. Ayrı ayrı IVC ve sağ SVC kravat sonra pulmoner venler ile birlikte sol SVC kuşatmak ve onu bağlamak için kalbine bir tek iplik posterior yerleştirin. Transplantasyon kadar 4 ° C 'de soğuk bir steril tuzlu su içinde saklayın, sonra bağları uzak damarları keserek verici sitesinden kalp hasat. Bu kesilmesi ile donör ölümü ile sonuçlanır.
3.. Alıcı Operasyonu
- Uyutmak(Bölüm 1) yukarıdaki gibi alıcı. Dikkatle Ekartörleri şeklinde bükülmüş xiphisternum ve ataç kullanarak geri çekilmesi için pubis orta hat kesi ile laparotomi yapmak sonra, tahrişi önlemek için karın tıraş. Sıcak steril serum fizyolojik emdirilmiş gazlı bez bağırsak sarın ve karın sağ üst çekin.
- Infra-renal aorta ve IVC göstermek için, koter cihazı kullanılarak lomber gemilerin onları bölerek iliak bifurkasyon sol renal arter ve ven aorta ve IVC birlikte kesimleri özgür. Koter doğru sıcaklıkta ve damar uçları bölmek ve mühür yeterli bir süre için kullanılan ilgilenir.
- Aorta ve proksimalde VKİ bölümlerine küçük atravmatik damar kelepçeleri uygulayın. Önce bir 30 G iğne ile bir delik delinmesi ile aort ön duvarında bir insizyon yapın; sonra donör aort boyutuna uyacak microscissors dikey bir kesi kesti. Herhangi bir bl kaldırmak için heparinli serum fizyolojik ile aorta lümen yıkayınood pıhtıları.
- Soğuk tuzlu su ile ıslatılmış gazlı bez ile kaplı alıcı siteye donör kalbi getirin ve karnın sağ tarafına yerleştirin. Donör aort alıcı aort ve sonraki alıcıya IVC konumlandırılmış donör pulmoner arter üzerinde yanındaki kesi yerleştirildiğinden emin olun.
- Hayvan 180 ° döndürülür sahne hangi uzak köşesine ulaşarak kadar önce sol tarafında yakın köşe ve sütür başlayarak 10-0 naylon sütürlerinin kullanarak alıcı aorta donör aorta uç-yan anastomoz. Yavaşça aort sağ tarafını ortaya çıkarmak ve yakın ucuna en uzak ucundan itibaren aort çeperinin sağ tarafı boyunca dikilmesi devam karnın sol tarafına donör kalbi hareket ettirin. Aort anastomoz kapatmadan önce, yavaşça herhangi bir pıhtı ve havayı çıkarmak için heparinli serum fizyolojik ile lümen yıkayın.
- Alıcı IVC ile donör pulmoner arter (PA) uç-yan anastomoz. Bir kesi ver olunolarak yanmalıdır arter anastomoz uygun bir yerinde IVC ön duvarında microscissors. IVC lümeni içinde sol duvarının uzak ucundan başlayarak 10-0 naylon dikiş çalışan alıcı IVC için donör PA anastomoz. Proksimal ucu ulaştıktan sonra, anastomoz tamamlamak için uzak ucuna kadar ön sağ yan duvar boyunca dikiş devam etmektedir. Anastomoz kapatmadan önce, yavaşça pıhtılar ve havayı çıkarmak için lümen yıkayın.
- Hemostaz elde edilene kadar bir pamuk aplikatör ile gemi kelepçeler, anastomoz siteleri etrafında Gelfoam yeri parçaları ve uygulamak hafif bir baskı bırakmadan önce. Revaskülarizasyon zamanda, yakın kelepçe ardından, ilk olarak uzak kelepçe bırakın.
- Revaskülarizasyon sonra da iyileşme yardımcı olmak için harici olarak greft 37 ° C'de sıcak bir tuzlu su uygulanır. Greft genellikle hemen fibrilasyon başlar ve birkaç dakika içinde sinüs ritmine kendiliğinden döner. Sıcak 0.6 ml enjektealıcının hidrasyon korumak için tuzlu su deri altından. Ameliyat öncesinde tamamlanması için analjezi için buprenorfin deri altına enjekte
- Her iki tabaka için, bir 5-0 emilebilen sütür ile çalışan karın yara kapatın. Iç tabaka tamamlayarak başlatın ve cilt boyunca devam eder.
4.. Kurtarma ve Greft İzleme
- Enfeksiyonun önlenmesi için ampisilin enjekte edilir ve geri kazanılması için 37 ° C 'de bir ısıtma pedi üzerine alıcı yerleştirin. Çoğu hayvanlar hızla kurtarmak ve genellikle içme ve genellikle 3 saat içinde yiyorsun. Fare sıkıntı belirtileri gösteriyorsa, nedenini belirlemek için yakından inceleyin. Hiçbir belirgin nedeni ise, buprenorfin ile tedavi ve yakından izlenmesi. Belirtiler şiddetli ya da 8 saatten fazla devam ederse bir veteriner hekimin ve ötenazi düşünün. Gerekirse, belirtileri gidermek kadar Buprenorfinin 12 saatlik enjeksiyonları devam verir. Fare sıkıntı belirtileri gösteriyorsa 8 saat sonra, devam eden 12 verBuprenorfinin saatlik enjeksiyonları onlar çözene kadar. Belirtiler fazla 48 saat boyunca devam eder ve gerekirse euthanize eğer veteriner danışın.
- Direkt batın palpasyonla greft kalp atışlarını izlemek ve + + + + gibi sağlıklı nedeniyle ileri reddedilmesine zayıf dövmek için + 'ya greft ve için beat gücünü kaydetmek - greft reddini tamamlanması nedeniyle sigara dayak gibi. Deneyin süresi boyunca haftada 3x daha sonra ilk 10 gün için, günde fareler izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ilk eğitim döneminden sonra, bizim grup fare heterotopik kalp nakli 227 olgu incelendi. Ilk 24 saat içinde başarı oranı% 90.3 idi ve 48 saat sonra% 86.8 idi. 48 saat içinde 30 (% 13.2) arızaları, 5 (% 2.2) arka bacak felci deneyimli ve ötenazi gerekiyordu, 10 (% 4.4) ise 15, nedeniyle greft iskemi yaralanma ve / veya tromboz olmayan bir dayak kalbi vardı (% 6.6) 48 saat içinde ölmüştür. Bazı deneysel greft sağkalım gerginlik kombinasyonlar çeşitli Tablo 1'de gösterilmiştir. Özdeş olmayan suşları arasındaki nakiller reddedildi iken aynı donör ve alıcı arasındaki gerginlik kalp nakilleri uzun vadeli kabul edildi.
Transplante kalplerin görünümü, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kalp kalbin görünümü ile birlikte dayak durdu kalp nakli yetmezliğinin neden genel olarak nakilden sonra zaman ile tespit edilir. Gerekirse, nedenibeat bırakma kalbin histolojik analizi ile teyit edilmelidir. Örneğin, DBA / 2 donor kalp nakli bir C57BL / 6 streyn alıcıda, kalp, duyarlı duruma getirilmemiş alıcılarda ret genellikle en az bir hafta sürer olarak en ilginç olan, 2 gün dayak durduruldu. Şekil 1A, bu ikinci kalp gösterir tromboz ve kalp dokusunun enfarktüs delil ile alıcı. C57BL / 6 alıcıya C57BL / 6 donör gerginlik birlikte, kalp reddedildi değildi ve> 100 gün (Şekil 1B) için hayatta. Bu durumda kalp nedeniyle hayat dışı sürdürme durumuna ikincil kas atrofiye boyutu biraz azalmıştı. Buna karşılık, C57BL / 6 alıcıya DBA / 2 donörün reddeden suşu birlikte, nakledilen kalp 7. günde yenmek için kesildiği tarih ve ret kanıt (Şekil 1C) gösterdi vardı. Bu gün 100 (Şekil 1D) tamamen fibrotik ve çekmiş oldu.
Tromboze Şekil 1.. Görünüş, nakledilen kalpleri reddeden ve non-reddetme. (A) DBA / 2 kalp nakli sonra tromboze ve enfarktüse kalp 7 günlerini gösteren C57BL / 6 alıcıya nakledilen. (B) iyi perfüze ve 100 gün transplantasyon sonrası kalpte. (C gösteren C57BL / 6 alıcıya nakledilen C57BL / 6 kalp 100 gün transplantasyon sonrası reddedilen kalbi gösteren C57BL / 6 alıcıya nakledilen 7 gün naklinden sonra reddedilen kalbi gösteren C57BL / 6 alıcıya nakledilen) DBA / 2 kalp. (D) DBA / 2 kalp. Oklar nakledilen kalp göstermektedir.
| Birleşmeleri | Sağkalım (gün) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | X2 8, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178.3 → B10.BR | 7 x2, x2 8, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, 9 x2, 10 x5, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Farklı donör / alıcı kombinasyonları Tablo 1.. Kalp greft sağkalım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare kalp nakli master önemli cerrahi beceri gerektiren zorlu bir mikrocerrahi yöntemidir. En zor özelliği, kapların küçük çapıdır. Buna ek olarak, bu işlem zaman alıcı ve kanama sınırlamak için gereklidir. Fare kalp nakli için teknik ilk Corry ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 1973 içinde ve daha sonra Mottram ve ark 12 ile. Bizim modifikasyonlar aşağıdaki noktaları içerir. Öncelikle, kısa bir süre sonra perfüzyon aort ve pulmoner arter demetinin torakotomi ve kesisi sonrası soğuk heparinli serum fizyolojik ile donör kalbin hemen perfüzyon hasat sırasında sıcak iskemi önler. İkinci olarak, bunun yerine daha önce vericinin alıcı hazırlanması için yakında verici hasat tamamlandıktan sonra alıcı hazırlama, başlangıç, hayatta kalma sonucu olarak iyileşme ile alıcıda karın maruz kalma süresini azaltır. Son olarak, küçük atravmatik kabının kullanımı b kelepçeleriAlıcı aort / VKİ paket için yerine bağlar kan akışını, kilit, genellikle gemiler için daha az hasarla sonuçlanır ve arka bacak felç sıklığını azaltabilir.
Buna ek olarak, aşağıdaki noktalar başarı için önemlidir. Donör ve alıcı optimal büyüklüğü 23-26 gr civarındadır ve optimum yaş 10 ila 12 haftadır. Yaşlı hayvanların daha büyük gemilerin yok ve artmış yağ aorta ve IVC poz daha zor hale getirir. , Ameliyat sırasında, alıcının Dehidrasyon ve hipotermi kaçınılmalıdır. Alıcı bağırsak iyi ılık tuzlu su batırılmış gazlı bez ile dehidratasyon korunmak gerekir ve alıcı 37 ° C'de ısıtma mat korunabilir Gazlı bez işlem sırasında taze, sıcak salin normal bir uygulama ile nemli tutulması gerekir. Kan pıhtıları ve arka ekstremite felci neden olabilir hava emboli en aza indirmek için, damar anastomoz siteleri kapatmadan önce yıkanması gerekir. Bağırsak dikkatle sonuçlanmasından değiştirilmesi gerekirmezenterde herhangi bükülmesini önlemek için transplantasyon üzerine. Ameliyattan kısa bir süre sonra intravenöz sıvı daha büyük bir hacim anastomoz hipertansiyon ve kanamaya neden olabilir, oysa 0.6 ml ılık tuzlu deri altına enjeksiyon hayvan kurtarma yardımcı olur. Alıcı aorta ve IVC çapraz az 30 dakika kelepçelenir zaman sınırlandırılması başarı oranını artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Microsearch Avustralya Vakfı ve Myee Codrington Tıbbi Araştırma Vakfı tarafından tarafından, Avustralya Proje Grant 1029205 Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
- Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
- Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
- Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
- Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
- Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
- Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
- Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).
