Summary
Um método é descrito para a análise de degradação de proteínas utilizando radiolabeled e proteínas luciferase de fusão em Xenopus extrato do ovo e sua adaptação para high-throughput screening para modulares de degradação de proteínas.
Abstract
Xenopus laevis extracto de ovo é, um sistema robusto bem caracterizado para estudar a bioquímica de diversos processos celulares. Xenopus extracto de ovo foi utilizada para estudar a rotatividade de proteínas, em muitos contextos celulares, incluindo o ciclo de célula e de transdução de sinal de caminhos 1-3. Aqui, é descrito um método para o isolamento de Xenopus extracto de ovo que foi optimizada para promover a degradação do componente da via Wnt crítico, β-catenina. Dois métodos diferentes são descritas para avaliar a degradação das proteínas β-catenina no Xenopus extracto de ovo. Um método é visualmente informativo ([35 S]-radiomarcado proteínas), enquanto o outro é mais facilmente dimensionado para ensaios de elevado rendimento (firefly proteínas de fusão de luciferase-marcada). As técnicas descritas podem ser utilizadas para, mas não estão limitados a, avaliar retorno da proteína β-catenina e identificar componentes moleculares que contribuem para a sua rotação. Além disso, a capacidade para purificar grandes quantidades de extracto de ovo de Xenopus homogénea combinada com a leitura quantitativa e fácil de proteínas marcadas-luciferase permite que este sistema possa ser facilmente adaptado para o rastreio de alto rendimento para moduladores da degradação β-catenina.
Introduction
Xenopus laevis extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar muitos processos biológicos celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, montagem e importação nuclear, apoptose, metabolismo ubiquitina, a progressão do ciclo celular, transdução de sinal, e turnover de proteína 1-17. O sistema de extrato de ovos de Xenopus é passível de análise bioquímica de uma legião de processos celulares porque extrato do ovo representa essencialmente citoplasma não diluído que contém todos os componentes citoplasmáticos essenciais necessários para executar esses processos e permitir investigação. Grandes quantidades de extracto de ovo, podem ser preparados ao mesmo tempo para manipulações bioquímicas que requerem grandes quantidades de material (por exemplo, a purificação de proteínas ou de triagem de alto rendimento) 18-20. Outra vantagem é que a concentração de proteínas específicas em Xenopus extracto de ovo pode ser ajustada com precisão por adição de proteína recombinante e / ou de imunodepleção endogproteínas enous em contraste com a transfecção do plasmídeo de DNA em que a expressão da proteína de interesse é difícil de controlar. Além disso, a ausência de proteínas recombinantes disponíveis pode ser eliminada pela adição de transcritos que codificam a proteína de interesse, tomando vantagem da elevada capacidade do extracto de ovo de Xenopus recentemente preparada para traduzir o mRNA exogenamente adicionado.
A regulação da degradação de proteínas é fundamental para o controle de muitas vias celulares e processa 21. Xenopus extrato do ovo tem sido amplamente utilizado para estudar a degradação de proteínas como o sistema permite várias maneiras de monitorar turnover de proteína, sem influências de confusão de transcrição e tradução. A via de sinalização Wnt é uma via de sinalização altamente conservada, que desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na doença. O volume de negócios de β-catenina, o principal efetor da via Wnt, é altamente regulado, e um aumento do estado de equilíbrio level de β-catenina é fundamental para a ativação de genes alvo de Wnt. A importância da degradação β-catenina é realçada pelo facto de que as mutações na via de Wnt que inibem a degradação β-catenina em ~ 90% de todos os casos esporádicos de cancro colorrectal 22. degradação β-catenina por componentes da via Wnt podem ser fielmente recapitulado em Xenopus extracto de ovo para estudar o mecanismo da sua rotação, assim como para identificar novos moduladores de pequenas molécula do seu degradação 2, 19, 20, 23-29.
Os métodos para a preparação do extracto de ovo de Xenopus para o estudo do ciclo celular têm sido descritos nas publicações anteriores JoVE 30-32. O actual protocolo descreve uma modificação destes métodos e é optimizado para a degradação de [35 S]-radiomarcado β-catenina e marcaram-luciferase β-catenina emExtrato de ovos de Xenopus. O ensaio de degradação radiolabeled permite a visualização direta dos níveis de proteína através de auto-radiografia. [35 S]-metionina incorporada na proteína de interesse, utilizando uma reacção de tradução in vitro, que pode então ser directamente adicionado a uma reacção de degradação. Além disso, o ensaio de retorno da proteína marcada radioactivamente não requer um anticorpo contra a proteína de interesse ou um epitopo marcador, o qual pode influenciar a estabilidade da proteína. Porque até mesmo pequenas mudanças nos níveis de proteína, como reflectida em alterações na intensidade da banda de proteína marcada radioactivamente, são prontamente visualizados por auto-radiografia, o [35 S]-radiomarcado ensaio de degradação representa um método muito útil para a visualização da proteína volume 2.
Fusão de β-catenina a luciferase de vaga-lume (adiante designado simplesmente como "luciferase") permite medições quantitativas precisas e fáceis de níveis de proteína, a fimpara determinar as propriedades cinéticas de rotação β-catenina 19, 20. Uma grande vantagem do ensaio de luciferase é que ela proporciona um sistema forte quantitativa que pode ser facilmente dimensionada para cima. O protocolo seguinte fornece métodos simples para ensaiar a degradação β-catenina e um método robusto e eficiente, e eficaz para o rastreio de alto rendimento de novos moduladores β-catenina.
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Protocol
1. Preparação do extrato do ovo Xenopus
NOTA: Cada sapo produz cerca de 1 ml de extrato de ovo utilizável. Extratos de 10 rãs são normalmente preparados ao mesmo tempo, eo volume de tampão descrito abaixo é para realizar a 10 sapo Xenopus extrato do ovo de preparação. O volume do tampão pode ser ajustada em conformidade, para preparações maiores ou mais pequenas de extracto de ovo. Preps gerados desta maneira consistente originar concentrações de proteína ≥ 50 mg / ml. O processo de coleta de ovos e transformá-los em extrato é mais eficiente quando realizada por duas pessoas. (Para técnicas básicas de criação de sapo, ver Sive et al. 33).
- Coleção do ovo
- Para preparar os sapos, injetar cada sapo fêmea com 100 U de grávida Mare Serum gonadotrofina (PMSG) de um recém-feitos 250 estoque U / ml. Use uma seringa de 3 ml de tuberculina com uma agulha G 27 para injectar por via subcutânea, com o bisel daa agulha para cima, para dentro do saco de linfa dorsal, que está localizado a aproximadamente 1 cm de distância da linha média das descolorações dentada ao longo do comprimento das pernas de rã.
- Armazene rãs condicionadas em água (além de NaCl 20 mM, consulte Sive et al. 33) a 18 ° C durante 5-10 dias. Para pé sistemas de tanques de água, a densidade animal é de aproximadamente 4 L de água por sapo fêmea. NOTA: O tempo mínimo necessário para aprontar para entrar em vigor é de 5 dias, e os efeitos de priming desgastar depois de 10 dias.
- Solução 0,5 x de Marc Modificado Ringer (MMR) a partir de um estoque de 20x MMR preparar. 20x MMR consiste de cloreto de sódio 2 M, cloreto de potássio 40 mM, cloreto de cálcio 40 mM, cloreto de magnésio 20 mM, e 100 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico ácido (HEPES), pH 7,4.
- Configure baldes para todos os sapos injetados (um sapo por 4 L balde). NOTA: Apesar de mais de uma rã pode ser colocado no mesmo depósito de recolha de ovos, se um dos sapospõe ovos predominantemente de baixa qualidade, uma quantidade substancial de esforço será necessário para separar os ovos de má qualidade daqueles que são adequados para a tomada de extrato. Assim, maximizar o número de rãs no mesmo tanque para minimizar a quantidade de tampão usado para coletar ovos não vale a pena o risco.
- Injetar 750 U gonadotrofina coriônica humana (HCG) no saco linfático dorsal de cada sapo usando uma agulha 27 G, conforme descrito em 1.1.1.
- Coloque cada um dos sapos com injecção de HCG em baldes de 4 L individuais contendo 0,5 x MMR arrefecido a 16 ° C.
- Coloque os contentores com as rãs em uma incubadora de 16 ° C para coletar ovos O / N (15-16 h). NOTA: Manter a temperatura adequada é fundamental para todo o processo, desde a coleta de ovos para preparar o extrato do ovo.
- Dejellying Eggs
NOTA: Os ovos são cobertos com um revestimento de gelatina que tem de ser removido antes de fazer extracto. A probabilidade de lise espontânea dos ovos aumenta à medida que o tempo between postura de ovos e extrair preparação aumenta. Assim, é importante levar a cabo através dos seguintes passos, tão rapidamente quanto possível.- Prepare a 4 L de 1x MMR, 50 ml de 0,1 x MMR, e 400 ml de 2% de cisteína, pH 7,7, feita em água destilada. Manter todas as soluções a 16 ° C.
- Para expelir ovos adicionais, esprema delicadamente o lombar e abdômen do sapo.
- Retire os sapos e a maior parte do MMR, para deixar os ovos em cerca de 1-200 ml de MMR em cada balde.
- Retire os resíduos com uma pipeta de transferência, e avaliar a qualidade dos ovos: ovos de alta qualidade são geralmente marcadas por uma clara separação entre o hemisfério animais mais pigmentadas eo hemisfério vegetal levemente colorido e tem o maior contraste-escuro a luz. Descarte com uma pipeta de transferência de todos os ovos que aparecem pegajoso, malhada, ou lise (branco e inchado) como eles vão diminuir a qualidade global do extrato. Se> 10% dos ovos, são de fraca qualidade, a todalote deve ser descartada.
- Misture os ovos em um copo de vidro de 500 ml e derramar tanto MMR quanto possível, mantendo os ovos submersos.
- Lave os ovos, mexendo suavemente com o dobro do volume dos ovos de MMR. Repita duas vezes, e remover quaisquer detritos ou ovos obviamente de má qualidade.
- Adicionar cerca de 100 ml de 2% de cisteína para o recipiente de vidro, agite a mistura, e permitir que os ovos que se contentar com 5 min a 16 ° C. Decantar a cisteína. NOTA: Dejellying é marcado pelo aparecimento gradual de camadas de geléia flutuam acima dos ovos e embalagem mais compacta dos ovos como eles agora ocupam um volume menor, sem o casaco de geléia.
- Adicionar mais 100 ml de 2% cisteína, agite bem, espere 5 minutos, e em seguida despeje lentamente ao largo da cisteína. Repetir até que os ovos tornaram-se bem compactado (usualmente por tratamento terceira cisteína). Nota: Se os ovos são deixados demasiado tempo em cisteína, que são propensos a lise. Da mesma forma, os ovos dejellied são frágeis e propensos a lise mecânica sesão rodadas com muita força ou se eles são expostos ao ar. Uma vez que os ovos foram dejellied, é importante que prossiga rapidamente para os passos de centrifugação.
- Deitar fora cisteína, e enxaguar o casaco geléia e outros detritos, lavando suavemente ovos em 1x MMR. Decantar cuidadosamente tampão ao longo do lado do recipiente. Repita duas vezes ou até que a solução MMR não é mais nublado. Ao lavar com MMR 1x continuar a remover os ovos más usando uma pipeta de transferência.
- Realizar um enxágüe final suave com 30 ml 0,1 x MMR, e gentilmente despeje o máximo de buffer possível. Mais uma vez, retire todos os ovos obviamente ruins.
- Embalagem e Crushing ovos por centrifugação
NOTA: O extracto descrito abaixo, que é usada para a degradação β-catenina é uma variante do factor de extracto citostático (metafase II-presos). Em contraste com o extracto de baixa velocidade e alta velocidade usada para estudos do ciclo celular, extracto de velocidade intermédia funciona melhor para a degradação β-catenina. Euextrato nterphase promove semelhante degradação β-catenina robusto, embora seja mais trabalhoso para se preparar.- Adicionar leupeptina, pepstatina, aprotinina mistura (LPA, um inibidor da protease) a 10 ug / ml (diluído a partir de uma solução 10 mg / ml em DMSO) e citocalasina D em 20 ug / ml (diluído a partir de uma solução estoque de 10 mg / ml em DMSO) para os restantes 20 ml de 0,1 x MMR.
- Adicionar a 0. X MMR contendo LPA e citocalasina D para os ovos lavados, agite bem, e incubar por 5 min a 16 ° C.
- Transferir os ovos para 16 ° C previamente arrefecidos 50 ml de tubos de centrífuga, permita que os ovos de resolver, e remover o tampão residual a partir do topo. Para evitar a exposição ao ar, retiram uma pequena quantidade de solução tampão para a pipeta de transferência antes de retirar os ovos para transferência. Continuar a transferir os ovos adicionais para os tubos de centrifugação e remover o tampão residual a partir do topo do tubo até que os ovos de encher o tubo da centrífuga para o topo, o que vai maximizar o rendimento deextrair.
- Para embalar os ovos, tubos de centrifugação de centrifugação a 400 xg durante 60 seg a 4 ° C utilizando um rotor de ângulo fixo. Remover o tampão residual a partir do topo dos tubos de centrífuga.
- Para a rotação de esmagamento, girar tubos a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Coleta camada citoplasmática de Extrato
NOTA: O método descrito abaixo difere do método clássico de perfurar a parede do tubo da centrífuga de forma a recolher o citoplasma. Este protocolo foi adaptado para a simplificação e para utilização com determinados tubos de centrifugação, que são reutilizáveis. Não houve diferenças perceptíveis na cinética de degradação β-catenina encontram-se com qualquer um dos métodos. Neste ponto extracto deve ser mantido frio durante todo o processo, e todos os passos devem ser realizados a 4 ° C.- Limpar um buraco na camada lipídica utilizando P1000 ponta da pipeta.
- Recolher a fase citoplasmática (entre a camada pigmentada escura ea light camada lipídica), utilizando uma nova ponta de pipeta P1000 em tubos de centrífuga limpas pré-refrigeradas (Figura 1). Para o extrato de alta qualidade que robustamente degrada β-catenina, minimizar a quantidade de camada pigmentada e lipídica que é retirado com a camada citoplasmática.
- Rotação extraída citoplasma a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C e novamente recolher o citoplasma. Repita a rotação e extração 1X. NOTA: O extrato deve ser "cor de palha". Se há contaminação substancial com as camadas pigmentadas e lipídicas, neste ponto, pode-se repetir a rotação mais uma vez, embora rotações excessivo irá diminuir a capacidade do extracto para degradar β-catenina.
- Adicionar LPA e citocalasina D para o extracto a concentrações finais de 10 ug / ml cada. NOTA: Usando o método descrito proporciona uma concentração razoavelmente consistente de proteína total de cerca de 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3), em preparações separadas, por exemplo Xenopusextractos de g.
- (Opcional) para ensaios de tradução, adicionar tampado mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), e mix de regeneração de energia (2.2.1) e incubar a reação à temperatura ambiente por 2 horas (para mais informações consulte sálica et ai. 2 e Sive et ai. 33). Use extrato traduzido imediatamente para ensaios de degradação β-catenina ou snap-congelamento em nitrogênio líquido para uso posterior. NOTA: extrato recentemente preparado tem uma alta capacidade de traduzir mRNA adicionado exogenamente, mas, infelizmente, essa capacidade se perde uma vez que o extrato é congelado. Tampado ARNm podem ser facilmente preparados utilizando kits disponíveis comercialmente.
- Extrato Snap-congelamento em nitrogênio líquido. NOTA: Os extratos são armazenados em pequenas (200 mL) alíquotas para uso único, porque eles perdem rapidamente sua capacidade de degradar β-catenina se novamente congelados. Para armazenamento a longo prazo, o extracto pode ser armazenado em azoto líquido. Para armazenagem a curto prazo, o extracto pode ser armazenada a -80 ° C, embora a capacidade de of extracto de degradar β-catenina pode ser reduzido drasticamente com o armazenamento prolongado à temperatura de -80 ° C (mais de 2 meses).
2. Preparando Extrato para β-catenina Degradação Assay
- Esgotamento de Extrato Xenopus
Observação: Uma grande vantagem do extracto de Xenopus é a capacidade para esgotar rapidamente os componentes de uma via e precisamente adicionar novamente uma quantidade definida de uma proteína, a fim de determinar os seus efeitos dependentes da dose.- Use preparada na hora extrato do ovo de Xenopus ou rapidamente descongelar extrato congelado e colocar no gelo. Realize todas as manipulações no frio.
- Adicionar extracto para 1/10 do volume de anticorpo peletizada ou grânulos de afinidade (por exemplo, 20 ml de esferas sedimentadas a 200 ml de extracto). De modo a minimizar a diluição do extracto, retirar o máximo de líquido a partir das esferas quanto possível, antes da adição do extracto usando pontas de carregamento de gel, com pontas afiladas longos.
- Gire extrato-mistura de esferas, a 4 ° C durante 1 hora.
- Rotação mistura-extracto de talão em 12.600 xg em microcentrifuga a 4 ° C durante 30 seg. Alternativamente, se as esferas magnéticas são utilizadas, aplicam-se o campo magnético para recolher as esferas.
- Transferência esgotados extrato para um tubo de microcentrífuga fresco no gelo. Tenha cuidado para não transferir quaisquer contas com o extrato.
- Confirme eficiência de esgotamento por immunoblotting tanto extrato empobrecido e miçangas.
- Prepare extrato para ensaio de degradação β-catenina, como descrito em 2.2.
- Otimizando Xenopus Extrato para β-catenina Degradação
NOTA: degradação β-catenina em Xenopus extrato do ovo é um processo dependente de energia que se esgota rapidamente os estoques de ATP endógenos. Consequentemente, um sistema de regeneração de energia é necessária para manter a degradação β-catenina robusta.- Prepare uma mistura de 20x de regeneração de energia (ER), constituído por 150 mM fosfato de creatina, ATP 20 mM, 600 mg / ml creatinofosfoquinase,e 20 mM MgCl2. ER devem ser divididos em alíquotas e armazenado a -80 ° C. Evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos usando pequenas alíquotas congeladas.
- Descongelar rapidamente Xenopus extrato do ovo, esfregando o tubo congelado entre as mãos. Colocar o tubo em gelo imediatamente antes de todo o extracto tenha derretido.
- Adicionar 10 ml de mistura de regeneração de energia (20x ER) em uma alíquota (200 mL) de Xenopus extrato do ovo. Misture bem por rapidamente sacudindo o tubo e pulso vórtex. Pulso-spin e coloque imediatamente em gelo.
- (Opcional) O volume de β-catenina pode ser ligeiramente aumentada no extracto de ovo de Xenopus, por adição de ubiquitina (1,25 mg / ml final). Cicloheximida (0,1 mg / ml final), também pode ser adicionado para minimizar a tradução dos transcritos endógenos.
- Alíquota os volumes apropriados para o ensaio de degradação em tubos de microcentrífuga de pré-arrefecidas em gelo. Para os ensaios de degradação radiomarcados β-catenina, retirar 2-5 extrair ml para cada ponto de tempo. </ Li>
3. Radiolabeled ensaio de degradação β-catenina em Xenopus extrato do ovo
Nota: Todos os passos devem ser executados em gelo, a menos que indicado de outra forma.
- Preparando Radiolabeled β-catenina
- Preparar mesmo em sintetizado in vitro [35 S] metionina-proteína radiomarcada utilizando kits disponíveis comercialmente. NOTA: A geração de 35 S-marcado (semi-vida de 87 dias) as proteínas são facilmente e eficientemente produzido usando disponíveis comercialmente em kits acoplada in vitro de transcrição-tradução. É importante que a proteína traduzida é suficientemente marcado de modo que alterações no volume de proteína pode ser facilmente visualizada.
- Para confirmar a marcação radioactiva bem sucedida, realizar SDS-PAGE/autoradiography com 0,5 mL da proteína traduzida. Quantificar a intensidade da banda de β-catenina radiomarcado utilizando o ImageJ, ImageQuant, ou um progr software quantitativa alternativasou. NOTA: A banda radiolabeled proteína β-catenina deve ser claramente visível no filme dentro de algumas horas (4-6 horas).
- Encaixe-congelar a proteína radiomarcada em nitrogênio líquido para o armazenamento até o uso. Nota: O armazenamento prolongado (> 2 meses) e múltiplos de congelação / descongelação (maior que 2) pode impactar severamente a capacidade do radiomarcado β-catenina para degradar de forma robusta em Xenopus extracto de ovo. Tipicamente, a estabilidade das proteínas radiomarcadas diminui significativamente depois de 1 mês de armazenamento à temperatura de -80 ° C; assim, relativamente recentemente preparada radiomarcado β-catenina dá melhores resultados obtidos nestes ensaios de degradação.
- Realizando β-catenina Degradação Assay
- Adicionar 1-3 ul (dependendo da potência do sinal de banda radiomarcada) in vitro traduzida β-catenina (e outras proteínas, moléculas pequenas, etc, que estão a ser testados) em 20 ul de mistura de reacção em gelo de Xenopus. Misture bem por quickly sacudindo o tubo e um curto pulso de centrifugação; este é um passo importante como Xenopus extrato do ovo é muito viscoso e mistura incompleta irá afetar a consistência dos resultados. Rotação do pulso e colocar no gelo.
- Inicie o β-catenina reacção de degradação, deslocando os tubos à temperatura ambiente.
- No ponto de tempo designado, remover 1-5 ml de amostra e misturar imediatamente com tampão de amostra de SDS (volume de 5x) para parar a reacção. Para garantir que a reação de degradação está completamente terminado, o tubo de filme várias vezes e vortex vigorosamente.
- Realize SDS-PAGE/autoradiography. Executar 1 ml equivalentes (~ 50 mg de proteína) do extrato para cada ponto de tempo / pista. Degradação de β-catenina em Xenopus extracto de ovo deve ser evidenciado pela diminuição dependente do tempo na intensidade da radiomarcado β-catenina banda Figura 2. Quantificar os resultados utilizando o ImageJ, ImageQuant, ou outro software de imagem preferido, se necessário.
- (Optional) Soak gel de SDS-poliacrilamida em solução (ácido acético a 10% e 30% de metanol, que fixa em água destilada) antes de secagem para reduzir o fundo de radioactividade e aumentar a qualidade da imagem.
4. Β-catenina-luciferase Degradação Ensaio no extrato do ovo Xenopus
Execute todas as etapas no gelo, salvo indicação em contrário.
- Preparação β-catenina-luciferase
- Sintetizar não-radioactivamente, marcado com luciferase β-catenina utilizando o sistema acoplado de transcrição-tradução com uma mistura de aminoácidos completa.
- Confirmar produção do marcado com luciferase β-catenina pela medição da actividade da luciferase 0,5-1 ul de reacção. Avaliar fundo luminescência através da medição da luminescência de uma mistura de reacção não traduzida. NOTA: Vários kits comerciais estão disponíveis para medir a atividade de luciferase. Luminescência de longa duração, no entanto, funciona particularmente bem para o assa degradaçãoy.
- Realizando β-catenina-luciferase Degradação Ensaio
- Descongele e prepare Xenopus extrato do ovo como em 2.2.
- Adicionar em traduziu-vitro fusão β-catenina-luciferase (de 4.1) para preparar mistura de reacção Xenopus (de 2,2) em gelo e misture bem como em 3.2.1. NOTA: A actividade da luciferase β-catenina, que é adicionado ao extracto é tipicamente entre 20 - 50.000 unidades de luminescência relativa (RLU) / ml de extracto (com base em medições obtidas a partir de 4.1.2). Sinal de partida deve ser de aproximadamente 100.000 RLU (2-5 ml da β-catenina-luciferase fusão in vitro-traduzido).
- Deslocar o extrato de RT para iniciar a reacção de degradação.
- Retirar uma aliquota da reacção no momento indicado e encaixe por congelação em azoto líquido. NOTA: As amostras triplicadas são normalmente removidas para análise em cada ponto de tempo. Extracto congelado pode ser armazenado a -80 ° C until eles estão prontos para serem analisados.
- Descongelar as amostras em gelo, as amostras de transferência para placas de 96 poços brancos padrão sobre gelo, e processo para a actividade da luciferase.
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Representative Results
Um esquema de degradação β-catenina no Xenopus extracto de ovo é mostrado na Figura 2A. 35S-marcado β-catenina foi incubada em Xenopus extracto de ovo, aliquotas (1 ml de extracto equivalente) foram removidos em tempos apropriados, e as amostras foram submetidas a SDS-PAGE seguido por autorradiografia. degradação β-catenina por componentes da via Wnt é mediada pelo sistema de ubiquitina-proteassoma 2, e a degradação de [35 S]-radiomarcado β-catenina em extractos de Xenopus é inibida pela adição do inibidor de proteassoma MG132 Figura 2B. Degradação de β-catenina por componentes da via Wnt é dependente da sua fosforilação pela GSK3 34. Degradação dependente de GSK3 pode ser rapidamente demonstrada de várias maneiras, usando extracto de ovo de Xenopus: 1) A β-catenina (SA) mutante (os locais de fosforilação da GSK3 mutado para alaninas) está estabilizada em Xenoextracto pus ovo relativamente ao tipo selvagem Figura proteína β-catenina 2B. 2) inibidores de moléculas pequenas de GSK3 (LiCl) similarmente inibir a degradação de β-catenina (Figura 2C). 3) Finalmente, a depleção de GSK3 de Xenopus extracto de ovo inibe a degradação da β-catenina; degradação pode ser resgatado por adição de exógena GSK3 Figuras 2D-E.
O ensaio de degradação de β-catenina radiomarcado proporciona uma avaliação visual particularmente informativa do seu modo de degradação (por exemplo, a degradação mediada por ubiquitina contra clivagem apoptótica). A auto-radiografia, no entanto, é um trabalho intensivo, e, para a maior parte, limitado para a análise de alto rendimento do caminho (por exemplo, o rastreio de modulares da via Wnt). O ensaio de degradação de β-catenina, a luciferase é mais facilmente e rapidamente quantificável como a quantidade de luminescência emitida é directamente proporcional à amontante de proteína β-catenina-luciferase. Esta característica faz com que o ensaio de luciferase simples e facilmente adaptável para ensaios de alto rendimento.
É importante para determinar que a fusão de luciferase tem propriedades semelhantes às da proteína nonfusion. Esta pode ser determinada empiricamente através da fusão da proteína de luciferase para a N-terminal, C-terminal, ou internamente. Fusão de luciferase para a N-ou C-terminal de β-catenina não afecta a sua capacidade para activar os genes alvo de Wnt inculturada células de mamíferos ou a sua taxa de renovação em Xenopus extracto de ovo de 2, 19, 20.
Um ensaio representativo degradação β-catenina-luciferase em Xenopus extracto de ovo é mostrado na Figura 3A, em que ocorre a degradação de β-catenina-luciferase foi avaliada por SDS-PAGE/autoradiography da actividade de proteína e luciferase radiomarcado da fusão. A taxa de degradation do β-catenina, a luciferase é semelhante à proteína não marcada β-catenina. A regulação de degradação para a fusão β-catenina, a luciferase é essencialmente idêntica à proteína nonfusion como a adição de LiCl ou o esgotamento da GSK3 resultou na inibição de-catenina-luciferase β rotatividade. Como mostrado nas figuras 3B-C, alterações no sinal radioactivo da proteína β-catenina-luciferase é paralela as mudanças na actividade enzimática de luciferase ao longo do tempo. Um problema que surge da utilização β-catenina-luciferase (especialmente proteína de fusão gerada a partir do sistema de transcrição-tradução in vitro) é o sinal de luciferase de fundo causado pela utilização de locais de iniciação da tradução internos ou de terminação da tradução prematura Figura 3D. Este problema pode ser superado por vezes através da optimização da concentração de DNA usado na reacção IVT. Nós não, no entanto, observar uma diminuição no fundo atividade luciferase quando variamosa concentração de DNA plasmídico para a construção especial β-catenina-luciferase. É provável que se precisa para reestruturar a proteína de fusão através de mutagénese de forma a minimizar ainda mais os locais de início de tradução internos e / ou de terminação prematura da tradução da proteína de fusão β-catenina-luciferase. Porque a proteína luciferase é relativamente estável ao longo do tempo da reacção de degradação em Xenopus egg extracto Figura 3A, no entanto, este sinal de fundo pode ser simplesmente subtraído se a razão entre a proteína da luciferase truncado para o comprimento total β-catenina fusão é conhecida .
Uma força de ensaio de luciferase é a capacidade para adaptar-se a um formato de multi-cavidades que permite realizar a triagem de alto rendimento para moduladores da degradação β-catenina. Na Figura 4, a análise de tabuleiro de damas representativo é mostrado utilizando um inibidor da degradação β-catenina, MG132, que inibe o proteassoma. O resultado da experiência quadriculado indica que o ensaio é uniforme e reprodutível num formato de 96 poços e demonstra a sua adequação para o rastreio de alto rendimento.
Figura 1. Uma representação esquemática da preparação do concentrado extrato do ovo de Xenopus. Ovos são coletados a partir de injeção de HCG Xenopus laevis fêmeas, compactados com uma rotação baixa velocidade (400 xg) e esmagadas e separadas com uma velocidade média (15.000 xg ) rodada. Tome cuidado para injetar por via subcutânea no saco linfático dorsal, retire os ovos ruins com cuidado, e separe cuidadosamente o extrato citoplasmático de alta qualidade a partir da menor qualidade extrato mais escuro como observado no texto.
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Figura 2. Β-catenina degrada robusta quando incubados em extractos de ovos de Xenopus. A) Um esquema de um ensaio de degradação. B) [35 S]-rotulado β-catenina preparado por uma reacção de IVT degrada enérgica quando incubadas no extracto de ovo de Xenopus. A adição de MG132 (200 uM) de extracto de ovo de Xenopus inibe a degradação β-catenina. Mutação de alaninas das phosphosites GSK3 dentro β-catenina (β-catenina SA) ou adição de LiCl (25 mM) C) inibe a degradação β-catenina. D) O sítio de ligação de GSK3 Axin (aminoácidos 506-560) esgota eficientemente GSK3 de Xenopus extrato do ovo. E) Xenopus extrato do ovo depleção de GSK3 inibe a degradação β-catenina e pode ser resgatado por outro lado of GSK3 recombinante (0,1 mg / ml). A adição de LiCl (25 mm) bloqueia a capacidade de GSK3 recombinante para resgatar degradação β-catenina no extrato de depleção de GSK3. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Marcaram-luciferase β-catenina degrada quando incubadas em Xenopus extracto de ovo. UM) radiomarcado β-catenina-luciferase degrada a uma taxa semelhante à de proteína não marcada β-catenina. Tal como acontece com a proteína de tipo selvagem, a adição de LiCl (25 mM) inibe a degradação de-catenina-β luciferase. Luciferase sozinha não transformar visivelmente mais em Xenopus extrato do ovo. Alterações na actividade da luciferase do β-catenina luciferfusão ase as alterações nos seus níveis de proteína em paralelo. B) Adição de LiCl (25 mM) ou o esgotamento da GSK3 C) inibe-catenina-luciferase β volume, tal como avaliado por medição da actividade da luciferase. D) Imunotransferência para traduzida in vitro β-catenina luciferase (utilizando um anticorpo anti-luciferase) revelou quantidades significativas de proteínas da luciferase livre em certas preparações que provavelmente contribui para o elevado fundo quando comparado com o ensaio de degradação radiomarcado. clique aqui para ampliar.
Figura 4. Regulada degradação de β-catenina-luciferase em extractos de Xenopus pode ser adaptado paraum formato de alto rendimento. uma análise representativa quadriculado para β-catenina-luciferase utilizando MG132 (450 mM) como inibidor de degradação β-catenina. Colunas sombreadas indicam poços tratados com MG132, e as colunas mais leves representam veículo poços (DMSO) tratados. Quantificação e resultado do cálculo Z-fator em uma pontuação de 0,3, indicando um ensaio aceitável para uso potencial em high-throughput screening.
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Discussion
Xenopus extrato do ovo é um sistema bioquímico robusta para investigar rotatividade β-catenina. A concentração de β-catenina no Xenopus extracto de ovo é de ~ 25 nM 2. Sob condições ideais, o extracto de ovo é capaz de degradar β-catenina, a uma taxa de 50-100 nM / h e é metade do máximo a 200 nm 24. Há vários passos críticos para a reconstituição bem sucedida de degradação β-catenina usando Xenopus extrato do ovo. Estes incluem: 1) a geração de alta qualidade Xenopus extrato do ovo e da maneira pela qual extrato do ovo é preparado, 2) gerando qualidade radiolabeled β-catenina e proteína β-catenina-luciferase, 3) otimização das condições de reação para apoiar a degradação β-catenina, e 4 ) o processamento adequado de pontos no tempo de reacção.
Uma preparação de alta qualidade de Xenopus extracto de ovo, em que β-catenina é robusta degradada depende tanto da qualidade do the ovos, como os ovos são tratados antes da etapa de moagem, bem como o extracto é posteriormente centrifugado para obter o extracto final. Como mencionado no protocolo, é importante para garantir que apenas ovos de alta qualidade (representados pelo forte contraste entre o hemisfério animais escuro e hemisfério vegetal luz) são usados, que os ovos de má qualidade (fibrosas, manchado, ou brancas puffs) são removidos durante todo do processo, que os ovos são mantidos a uma temperatura baixa (16 ° C) ao longo do processo, e que o procedimento seja realizado o mais rápido possível. É importante para não sacrificar a qualidade pela quantidade de extracto. Além disso, como mencionado anteriormente, os ovos de um sapo que põe ovos de má qualidade (> 10%) deve ser totalmente descartada.
O extracto descrito acima é uma modificação da meiose II-11 preso extracto de FCE. A preparação de Xenopus extrato do ovo para β-catenina (extrato de velocidade intermediária) differs de extratos clássicos preparados para o estudo do ciclo celular 30-32, que são de baixa velocidade ou alta velocidade extrai 35. Adaptação Xenopus extrato do ovo para a degradação ideal de outras proteínas pode exigir alteração da velocidade de centrifugação e número de rodadas. Extrato de baixa velocidade contém organelas intactas e outros grandes componentes celulares. Assim, rodadas de velocidade mais elevados irão alterar a composição do extracto e, potencialmente, remova componentes inibitórios e / ou essenciais que afectam a degradação da proteína de interesse. A preparação de extracto de velocidade intermédia aqui descrito é optimizado para a degradação de β-catenina por componentes da via de Wnt. Girar o extracto maior do que 4x pode diminuir significativamente a capacidade do extracto para degradar β-catenina (embora tenha um efeito mínimo sobre a degradação de um outro componente do Wnt, Axin). β-catenina é suscetível à proteólise mediada por caspase no extrato de rotação de baixa velocidade e não noticeably degradar no extrato de rotação de alta velocidade. Assim, é provável que os extractos de velocidade diferentes será óptima para a degradação de componentes de outras vias de sinalização.
A geração de 35 S-β-catenina e β-catenina de luciferase pode ser realizada através de um número de kits disponíveis comercialmente. A produção da proteína utilizando sistemas acoplados de transcrição-tradução é altamente dependente da qualidade do plasmídeo: altamente puros midi-preparações dos plasmídeos funcionam melhor e são mais fiáveis em comparação com ADN de mini-preparações. Para radiomarcação β-catenina, recentemente obtido [35 S] metionina ou Translabel ([35 S] metionina mais [35S] cisteína) é o preferido. Note-se que a metionina e cisteína ambos têm uma tendência para oxidar com o armazenamento prolongado diminuindo assim a sua incorporação em β-catenina na transcrição-tradução in vitro acoplada reacção. Por causa de um armazenamento prolongado e repetido de congelação-descongelaçãociclos pode inibir a degradação, pequenas quantidades do radiomarcado β-catenina são preparados ao mesmo tempo e utilizado em seguida.
A quantidade de proteína traduzida e o número de metioninas na proteína determinar a intensidade do sinal radiomarcado. Para β-catenina, não deve haver problemas para obter fortes sinais radioativos para ensaios de degradação. Para as proteínas com alguns metioninas e / ou que não se traduzem bem, a [35 S] metionina e [35S] cisteína mistura pode ser usada em vez de [35 S] metionina e / ou adicionado um marcador de epitopo (Myc), que contém múltiplos metioninas. Embora o sucesso com diversos plasmídeos de expressão que contêm os promotores do fago apropriados (T7, T3, e SP6) podem ser obtidos por reacções de transcrição in vitro, com a tradução, plasmídeo baseado no pCS2 geralmente proporciona os melhores resultados. Além disso, o sinal da proteína traduzida, por vezes, pode ser aumentada dramaticamente por exclusão do endógena 5UTR. Finalmente, para experiências em grande escala (por exemplo, rastreio de alto rendimento), uma grande quantidade de recombinante β-catenina pela luciferase pode ser necessária. β-catenina-luciferase do / sistema baculovírus Sf9 degrada com cinética semelhantes como o β-catenina do tipo selvagem em extrato e embriões 2 Xenopus. Alternativamente, um alto rendimento no sistema de expressão in vitro (por exemplo, de trigo à base de germe) tem sido utilizado com sucesso para rastreio de alto rendimento 19, 20.
De modo a medir de forma fiável a degradação de β-catenina no sistema de extracção, é importante que o sinal inicial a partir de qualquer β-catenina radiomarcado ou a luciferase β-catenina de fusão é suficientemente robusta. Assim, uma certa quantidade de optimização pelo experimentador no tamanho do ensaio de degradação, o número de pontos de tempo necessário, e a eficiência da reacção de tradução wi in vitrovai ser necessária. Ao montar a reação de degradação, existem vários passos que podemos tomar para aumentar a chance de obter a degradação robusto. Em primeiro lugar, todos os reagentes devem ser descongeladas rapidamente e colocados em gelo, antes da sua descongelação completa. Porque a degradação de β-catenina é altamente dependente de energia, é importante que o ER é relativamente fresco. Em segundo lugar, Xenopus extracto de ovo é viscoso, e é essencial que a reacção é cuidadosamente misturado após a adição de fusão β-catenin/β-catenin-luciferase radiomarcado, ER, proteína, modulares, etc Em terceiro lugar, a pré-incubação da reacção misture por 20-30 min no gelo dá resultados mais reprodutíveis ao testar os efeitos de modulares.
A capacidade de esgotar as proteínas de Xenopus extrato do ovo representa uma poderosa ferramenta para avaliar a função da proteína e os seus efeitos dependentes da concentração. Como exemplo, demonstramos que esgotar GSK3 de Xenopus blocos de extracto de ovo na degradação de β-catenina, o que indica a importância do papel de GSK3 em volume β-catenina. Condições de depleção de diferentes terão de ser determinadas empiricamente para proteínas diferentes. Por exemplo, as proteínas abundantes que exige um aumento na quantidade de anticorpo ou do ligando de afinidade grânulos utilizados para atingir o esgotamento completo. Um bom ponto de partida é a utilização de pérolas empacotadas em 1/10 do volume do extracto, de modo a minimizar a diluição do extracto. Em adição à força de ligação do ligando do anticorpo / afinidade para a proteína alvo, o tipo de grânulos (por exemplo, sefarose, agarose, ou magnético) utilizado pode ter impacto na eficácia da depleção de proteínas de Xenopus extracto de ovo 36. Finalmente, seria ideal para análise do grau de exaustão (tipicamente por imunotransferência). Uma vez que a reacção β-catenina é completada, a maneira pela qual as amostras são processadas podem afectar grandemente os resultados da experiência. A concentração deXenopus egg preps extracto preparado da maneira descrita é 52,41 mg / mL ± 5,40 mg / ml, e é importante para não sobrecarregar a capacidade de o gel de SDS-PAGE; isto não é um problema com o ensaio de luciferase-β-catenina. Assim, para cada ponto de tempo, não mais do que 1 ml de equivalentes de extracto deve ser carregado em cada pista de um gel de SDS-PAGE. Para melhorar ainda mais a qualidade dos resultados, o passo de fixação de gel (opcional) diminuirá radioactividade de fundo e aumenta a relação sinal-para-ruído. Para o ensaio de luciferase, uma diminuição de um sinal inicial de 100.000 RLU em Xenopus extracto de ovo reflecte fielmente a alteração nos níveis de proteína da proteína de fusão β-catenina-luciferase.
O sistema de extrato de ovos de Xenopus representa um sistema atraente para estudar a regulação da degradação do β-catenina. O sistema permite que o extracto de um controlo preciso da concentração de proteínas individuais por meio de exaustão e reconstituição ção. A capacidade de monitorar seus efeitos sobre a cinética de rotação β-catenina ao longo do tempo permite uma melhor compreensão do mecanismo bioquímico de este passo crucial na transdução de sinal Wnt. Tais manipulações forneceram profundo conhecimento sobre as interacções moleculares complexas entre os componentes da via Wnt e eram críticos para o desenvolvimento do primeiro modelo matemático da via Wnt 24. Uma limitação é que as concentrações de componentes da via Wnt em Xenopus extracto de ovo e os lisados de células de mamífero Verificou-se que diferem, reflectindo possivelmente diferenças na forma da via Wnt é regulada durante o desenvolvimento embrionário versus a situação adulto 37. A capacidade de executar, ensaios baseados em luciferase ambos radioativos e enzimáticos usando Xenopus extrato do ovo fornece adicionou ferramentas qualitativas e qualitativas complementares poderosas para estudar a regulação bioquímica da degradação β-catenina.
t "> Além de monitorar o volume de negócios de β-catenina, a degradação do regulador Wnt negativo, Axin, pode ser monitorado em Xenopus extrato do ovo ou como uma proteína radiomarcada ou fusão de luciferase. Usando uma variante da luciferase, Renilla, fundido a axina, foi previamente adaptado para o ensaio de degradação de luciferase em um formato de alto rendimento para rastrear simultaneamente para moduladores de duas proteínas da via Wnt, β-catenina e Axin 19, 20. Essa tela bioquímicas identificaram a droga, pyrvinium aprovado pela FDA, que aumentou e diminuiu a taxa de degradação de β-catenina e Axin, respectivamente, em Xenopus extracto de ovo 19. pyrvinium foi subsequentemente validado em células humanas em cultura e em vários organismos modelo (por exemplo, de Xenopus e C. elegans) como uma pequena molécula inibidora da Wnt canónica caminho. Em resumo, o sistema extrato de ovos de Xenopus é um sistema bioquímico tha versátilt pode ser explorada em uma infinidade de maneiras de estudar o mecanismo de sinalização Wnt, bem como para a identificação de modulares da via Wnt. O método bioquímico aqui descrito pode ser aplicado a outras vias de sinalização em que a degradação de proteínas podem desempenhar um papel crítico.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Laurie Lee para a leitura crítica do manuscrito. TWC é apoiado por um American Heart Association Predoctoral Clube (12PRE6590007). MRB é apoiado por uma bolsa de formação Instituto Nacional do Câncer (T32 CA119925). SSH é suportado pelo National Institutes of Health (R01DK078640). EL é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM081635 e R01GM103926).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
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