Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Reconstitutie van β-catenine afbraak in Published: June 17, 2014 doi: 10.3791/51425
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Cell and Developmental Biology and Program in Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Division of Gastroenterology, Hepatology & Nutrition and Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Vanderbilt Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Een werkwijze wordt beschreven voor het analyseren eiwitafbraak met radioactief gemerkt en luciferase-fusie-eiwitten in Xenopus ei extract en de aanpassing voor high-throughput screening kleinmoleculige modulatoren van eiwitafbraak.

Abstract

Xenopus laevis ei extract is een goed gekarakteriseerd, robuust systeem voor het bestuderen van de biochemie van diverse cellulaire processen. Xenopus ei extract gebruikt om eiwitturover studeren in vele cellulaire contexten, zoals de celcyclus en signaaltransductie 1-3. Hierin wordt een werkwijze beschreven voor het isoleren Xenopus ei extract die is geoptimaliseerd om de afbraak van de kritische Wnt component, β-catenine bevorderen. Twee verschillende methoden beschreven β-catenine eiwitafbraak beoordelen Xenopus ei extract. Een methode is visueel informatief ([35 S]-radioactief gemerkte eiwitten), terwijl de andere gemakkelijker geschaald voor high-throughput assays (vuurvlieg luciferase-gemerkte fusie-eiwitten). De beschreven technieken kunnen worden gebruikt, maar zijn niet beperkt tot, beoordelen β-catenine eiwit omzet en identificeren van moleculaire componenten die bijdragen aan de omzet. Bovendien, de Abilheid om grote hoeveelheden homogene Xenopus ei extract gecombineerd met kwantitatieve en gemakkelijke uitlezing van luciferase-gemerkte eiwitten te zuiveren kan dit systeem eenvoudig worden aangepast voor high-throughput screening op modulators van β-catenine afbraak.

Introduction

Xenopus laevis ei extract is uitgebreid gebruikt om vele celbiologische processen, waaronder het cytoskelet dynamiek, nucleair geheel en import, apoptose, ubiquitine metabolisme, voortgang van de celcyclus, signaaltransductie en proteïne omzet 1-17 bestuderen. De Xenopus ei extract systeem vatbaar is voor de biochemische analyse van een legioen van cellulaire processen, omdat ei extract vertegenwoordigt in wezen onverdund cytoplasma dat alle essentiële cytoplasmatische componenten die nodig zijn om deze processen uit te voeren en in staat onderzoek bevat. Grote hoeveelheden ei extract kan worden bereid in een keer voor biochemische manipulaties die grote hoeveelheden materiaal (bijvoorbeeld eiwitzuivering of high-throughput screening) 18-20 vereisen. Een ander voordeel is dat de concentratie van specifieke eiwitten in Xenopus ei extract nauwkeurig kan worden ingesteld door toevoeging van recombinant eiwit en / of immunodepletie van endogenous eiwitten in tegenstelling tot transfectie van plasmide-DNA waarbij expressie van het eiwit van interesse is moeilijk te controleren. Bovendien kan het gebrek aan recombinante eiwitten worden overwonnen door de toevoeging van transcripten coderend voor het eiwit van belang te maken van hoge capaciteit de vers bereide Xenopus ei extract aan toegevoegd exogeen mRNA te vertalen.

De regulering van eiwitafbraak is van cruciaal belang voor de bestrijding van vele cellulaire mechanismen en processen 21. Xenopus ei extract is uitgebreid gebruikt om afbraak van eiwitten te bestuderen als het systeem maakt het mogelijk voor meerdere manieren om eiwitturover controleren zonder verstorende invloeden van transcriptie en vertaling. De Wnt signaleringsroute is een sterk geconserveerd signaalweg dat cruciale rol bij ontwikkeling en ziekte speelt. De omzet van β-catenine, de belangrijkste effector van de Wnt-route, is sterk gereguleerd, en een verhoogde steady-state lEvel van β-catenine is essentieel voor de activatie van de Wnt doelgenen. Het belang van β-catenine afbraak wordt benadrukt door het feit dat mutaties in de Wnt route die β-catenine afbraak remmen in ~ 90% van sporadische colorectale kanker 22. β-catenine afbraak door componenten van de Wnt-route kan getrouw worden samengevat in Xenopus ei extract om het mechanisme van de omzet bestuderen en om nieuwe kleine molecuul modulatoren afbraakproducten 2, 19, 20, 23-29 identificeren.

Werkwijzen voor de bereiding van Xenopus ei extract voor het bestuderen van de celcyclus zijn beschreven in eerdere publicaties Jupiter 30-32. Het huidige protocol beschrijft een aanpassing van deze werkwijzen en geoptimaliseerd voor de afbraak van [35 S]-radioactief gemerkt β-catenine en luciferase gelabeld β-catenine inXenopus ei extract. De radiogelabelde degradatie assay maakt directe visualisatie van eiwitniveaus via autoradiografie. [35 S] methionine wordt opgenomen in het eiwit van interesse met een in vitro translatiereactie die dan direct worden toegevoegd aan een afbraakreactie. Bovendien is het radioactief gemerkte eiwit omzet assay geen antilichaam tegen het eiwit van belang of een epitoop-tag die eiwitstabiliteit beïnvloeden vereisen. Omdat zelfs kleine veranderingen in eiwitniveaus, zoals blijkt uit veranderingen in de intensiteit van het radioactief gemerkte eiwit band, worden gemakkelijk gevisualiseerd door autoradiografie, de [35S]-radioactief degradatie assay is een zeer bruikbare werkwijze voor visualisatie eiwit omzet 2.

Fusie van β-catenine om vuurvlieg luciferase (hierna eenvoudig "luciferase") maakt nauwkeurige en gemakkelijke kwantitatieve metingen van eiwitniveaus, teneindede kinetische eigenschappen van β-catenine omzet 19, 20 bepalen. Een groot voordeel van de luciferase assay is dat het een krachtig kwantitatief systeem dat gemakkelijk opgeschaald. Het volgende protocol voorziet in eenvoudige werkwijzen voor het testen β-catenine afbraak en een robuuste, efficiënte en effectieve methode voor high-throughput screening van nieuwe β-catenine modulatoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van Xenopus Egg Extract

OPMERKING: Elke kikker levert ongeveer 1 ml bruikbare ei-extract. Uittreksels van 10 kikkers worden typisch bereid in een keer, en het volume buffer hieronder beschreven is voor het uitvoeren van een 10 kikker Xenopus ei extract prep. De buffer volume dienovereenkomstig kunnen hogere of lagere preparaten ei extract aangepast. Preps gegenereerd op deze wijze verkregen vaste eiwitconcentraties ≥ 50 mg / ml. Het proces van het verzamelen van eieren en de verwerking daarvan tot extract is het meest efficiënt wanneer uitgevoerd door twee personen. (Voor basis kikker veeteelt technieken, zie Sive et al.. 33).

  1. Ei Collection
    1. Aan premier de kikkers, injecteren elk vrouwtje kikker met 100 E van Zwangere Mare Serum Gonadotropin (PMSG) van een vers bereide 250 U / ml bouillon. Gebruik een 3 ml tuberculine spuit met een 27 G naald subcutaan injecteren, met de schuine kant van dede naald naar boven in de dorsale lymfe zak, die is gelegen op ongeveer 1 cm van de middellijn van de inkeping verkleuringen langs de lengte van de poten van de kikker.
    2. Store gegrond kikkers in het water (plus 20 mM NaCl, zie Sive et al.. 33) bij 18 ° C gedurende 5-10 dagen. Voor stilstaand water tank systemen, de veedichtheid is ongeveer 4 liter water per vrouwelijke kikker. OPMERKING: De minimale tijd die nodig is voor priming van kracht is 5 dagen, en de effecten van priming slijten na 10 dagen.
    3. Bereid 0.5x Marc's Modified Ringers (MMR)-oplossing van een 20x MMR voorraad. 20x MMR bestaat uit 2 M natriumchloride, 40 mM kaliumchloride, 40 mM calciumchloride, 20 mM magnesiumchloride en 100 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), pH 7,4.
    4. Opgezet emmers voor alle geïnjecteerd kikkers (een kikker per 4 L bak). OPMERKING: Hoewel meer dan een kikker kan worden geplaatst in dezelfde emmer voor eieren ophalen, als een van de kikkersbevat overwegend slechte kwaliteit eieren, zal een aanzienlijke hoeveelheid inspanning die nodig zijn om de slechte kwaliteit eieren gescheiden van die die geschikt zijn voor het maken extract zijn. Derhalve maximaliseren van het aantal kikkers in hetzelfde reservoir om de hoeveelheid buffer voor eieren minimaliseren verzamelen is het risico niet waard.
    5. Injecteer 750 U menselijk choriongonadotrofine (HCG) in de dorsale lymfe zak van elke kikker met behulp van een 27 G naald, zoals beschreven in 1.1.1.
    6. Plaats elk van de HCG-injectie in individuele kikkers 4 L emmers met 0,5 x MMR afgekoeld tot 16 ° C.
    7. Plaats de containers met de kikkers in een 16 ° C incubator om eieren te verzamelen O / N (15-16 uur). OPMERKING: Het handhaven van de juiste temperatuur is van cruciaal belang voor de gehele procedure, van het verzamelen van eieren aan de voorbereiding van ei-extract.
  2. Dejellying Eieren
    OPMERKING: Eieren zijn bedekt met een laag gelei dat voorafgaand aan het maken van stof moet worden verwijderd. De waarschijnlijkheid van spontane lysis van de eieren toe naarmate de tijd between eileg en extract voorbereiding toeneemt. Daarom is het belangrijk om zo snel mogelijk verder door de volgende stappen.
    1. Bereid 4 L van 1x MMR, 50 ml van 0,1 x MMR, en 400 ml van 2% cysteïne, pH 7,7, gemaakt in gedestilleerd water. Handhaaf alle oplossingen bij 16 ° C.
    2. Om extra eieren te verdrijven, knijp de onderrug en buik van de kikker.
    3. Verwijder de kikkers en het grootste deel van de MMR, om de eieren te verlaten bij ongeveer 1-200 ml MMR in elke emmer.
    4. Verwijder vuil met een transfer pipet, en de kwaliteit van de eieren te beoordelen: hoge kwaliteit eieren worden over het algemeen gekenmerkt door een duidelijke scheiding tussen de donkergekleurde dier halfrond en de licht gekleurde plantaardige halfrond en hebben de hoogste van donker naar licht contrast. Gooi met een transfer pipet elke eieren die vezelig, gevlekt, of gelyseerd (wit en gezwollen) verschijnen als ze de algehele kwaliteit van het extract zal afnemen. Bij> 10% van de eieren van slechte kwaliteit, de gehelebatch moeten worden weggegooid.
    5. Combineer eieren in een 500 ml bekerglas en giet zoveel MMR mogelijk terwijl eieren ondergedompeld.
    6. Spoel de eieren door voorzichtig om te zwenken met tweemaal het ei volume van MMR. Tweemaal herhalen, en verwijder eventueel vuil of duidelijk slechte kwaliteit eieren.
    7. Voeg ongeveer 100 ml van 2% cysteïne om de glazen beker, schud zachtjes te mengen, en laat de eieren te regelen voor 5 min bij 16 ° C. Giet het cysteïne. OPMERKING: Dejellying wordt gekenmerkt door de geleidelijke verschijning van gelei jassen zwevend boven de eieren en de meer compacte verpakking van de eieren als ze nu een kleiner volume innemen zonder de gelei vacht.
    8. Voeg nog een 100 ml van 2% cysteïne, voorzichtig zwenken, wacht 5 min, en dan langzaam giet de cysteïne. Herhaal dit tot de eieren stevig verdichte (meestal door de derde cysteïne behandeling) zijn geworden. Opmerking: Als eieren te lang worden achtergelaten in cysteïne, ze zijn gevoelig voor lysis. Ook dejellied eieren zijn kwetsbaar en gevoelig voor mechanische lysis indien zezijn te krachtig gewerveld of als ze worden blootgesteld aan lucht. Nadat de eieren zijn dejellied, is het belangrijk om snel de centrifugatiestappen.
    9. Giet cysteïne, en spoel de gelei jas en ander vuil weg door voorzichtig wassen eieren in 1x MMR. Giet buffer voorzichtig langs de kant van de beker. Herhaal dit twee keer of totdat MMR oplossing is niet meer troebel. Tijdens spoelen met 1x MMR blijven de rotte appels te verwijderen met behulp van een pipet overdracht.
    10. Voer een laatste zacht spoelen met 30 ml 0,1 x MMR, en voorzichtig giet af als een groot deel van de buffer mogelijk. Nogmaals, verwijder uiteraard slecht eieren.
  3. Verpakking en Crushing Eieren door centrifugeren
    OPMERKING: De hieronder beschreven extract wordt gebruikt voor β-catenine afbraak is een variant van de cytostatische factor extract (metafase II gearresteerd). In tegenstelling tot de low-speed en high-speed-extract gebruikt voor celcyclus studies, tussentoerentalregeling extract werkt het beste voor β-catenine degradatie. Iknterphase extract evenzo bevordert robuuste β-catenine degradatie maar is arbeidsintensiever te bereiden.
    1. Voeg leupeptine, pepstatine, aprotinine mengsel (LPA, een proteaseremmer) bij 10 ug / ml (verdund uit een 10 mg / ml voorraadoplossing in DMSO) en cytochalasine D bij 20 ug / ml (verdund uit een 10 mg / ml voorraadoplossing in DMSO) in de resterende 20 ml 0,1 x MMR.
    2. Voeg 0. X MMR bevattende LPA en cytochalasine D de gewassen eieren, zacht zwenken en incubeer gedurende 5 minuten bij 16 ° C.
    3. Transfer eieren in 16 ° C pre-gekoelde 50 ml centrifuge buizen, zodat de eieren om zich te vestigen en te verwijderen resterende buffer van de top. Om blootstelling aan de lucht te voorkomen, een kleine hoeveelheid buffer in de transferpipet voorafgaand aan intrekking eieren voor overdracht in te trekken. Blijf bijkomende eieren zetten in de centrifugebuizen en verwijderen resterende buffer van de bovenkant van de buis totdat de eieren vullen de centrifugebuis naar boven, waarbij de opbrengst aan maximaliseertextraheren.
    4. Om de eieren, rotatie centrifugebuizen verpakking bij 400 xg gedurende 60 seconden bij 4 ° C met een vaste hoek rotor. Resten buffer van de bovenkant van de centrifugebuizen.
    5. Voor de verpletterende spin draaien buizen bij 15.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  4. Verzamelen Cytoplasmatische Layer van Extract
    Opmerking: de hieronder beschreven methode verschilt van de klassieke methode aanprikken van de zijde van de centrifugebuis om de cytoplasmatische laag verzamelen. Dit protocol is aangepast voor vereenvoudiging en voor gebruik met bepaalde centrifuge buizen die herbruikbaar zijn. Geen merkbare verschillen in kinetiek van β-catenine afbraak zijn gevonden met beide methoden. Op dit punt extract moeten koud tijdens het hele proces gehouden en alle stappen moeten bij 4 ° C worden uitgevoerd
    1. Duidelijk een gat in de lipide laag met behulp van P1000 pipet tip.
    2. Verzamel de cytoplasmatische laag (tussen de donkere gepigmenteerde laag en de light lipidelaag) met een nieuwe P1000 pipet tip in schone pre-gekoelde centrifuge buizen (Figuur 1). Voor hoogwaardige extract dat robuust degradeert β-catenine, het minimaliseren van de hoeveelheid gepigmenteerde en lipide laag die wordt onttrokken aan de cytoplasmatische laag.
    3. Spin geëxtraheerd cytoplasmatische laag bij 15.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en opnieuw verzamelen van de cytoplasmatische laag. Herhaal de spin en extractie 1X. OPMERKING: Het extract moet "stro gekleurd." Wanneer een belangrijke verontreiniging met de gepigmenteerde en lipide lagen op dit punt, kan men de spin een keer herhalen, hoewel buitensporige spins het vermogen van het extract om β-catenine degraderen afnemen.
    4. LPA en cytochalasine D Naar het extract bij eindconcentraties van 10 ug / ml elk. Opmerking: De beschreven werkwijze levert een tamelijk consistente totale eiwitconcentratie van bij benadering 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 afzonderlijke preps) in Xenopus bv.g extracten.
    5. (Optioneel) Voor vertaling assays, voeg afgetopte mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), en energie regeneratie mix (2.2.1) en incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 2 uur (voor meer informatie zie Salische et al.. 2 en Sive et al.. 33). Gebruik vertaald uittreksel onmiddellijk voor β-catenine degradatie assays of snap-vries in vloeibare stikstof voor later gebruik. OPMERKING: Vers bereide extract heeft een hoge capaciteit om exogeen toegevoegde mRNA vertalen, maar helaas, is dit vermogen verloren zodra het extract wordt bevroren. Capped mRNA kunnen gemakkelijk worden bereid met behulp van commercieel verkrijgbare kits.
    6. Snap-vries-extract in vloeibare stikstof. OPMERKING: Extracten worden opgeslagen in kleine (200 pl) porties voor eenmalig gebruik omdat ze snel verliezen hun vermogen om β-catenine afgebroken als ze ingevroren. Voor langdurige opslag kan extract worden opgeslagen in vloeibare stikstof. Voor opslag op korte termijn, kan extract worden opgeslagen bij -80 ° C, hoewel de capaciteit of extract β-catenine afbreken kan drastisch worden gereduceerd met verlengde opslag bij -80 ° C (langer dan 2 maanden).

2. Voorbereiden Extract voor β-catenine Degradatie Assay

  1. Uitputting van Xenopus Extract
    OPMERKING: Een groot voordeel van Xenopus extract is het vermogen gemakkelijk componenten van een route afbreken en nauwkeurig een bepaalde hoeveelheid van een eiwit terug voegen teneinde de dosisafhankelijke effecten te bepalen.
    1. Gebruik vers bereide Xenopus ei extract of snel ontdooien bevroren extract en leg ze op ijs. Voer alle manipulaties in de kou.
    2. Naar extract 1/10 volume van gepelleteerde antilichaam of affiniteit kralen (bv. 20 ml gepelletiseerd kralen 200 ml extract). Om verwatering van het extract te minimaliseren, zoveel vloeistof terug te trekken uit de kralen als mogelijk vóór toevoeging van het extract met behulp van gel plaatsen Tips met lange, taps toelopende tips.
    3. Draai extract-kralen mengsel bij 4 ° C gedurende 1 uur.
    4. Spin-extract kralen mengsel bij 12.600 xg in microfuge bij 4 ° C gedurende 30 sec. Of als magnetische kralen worden gebruikt, gelden magnetische veld kralen verzamelen.
    5. Transfer uitgeput extract om een ​​frisse microfugebuis op ijs. Wees voorzichtig en laat geen kralen niet over te dragen met het extract.
    6. Bevestigen de efficiëntie van uitputting door immunoblotting zowel verarmd extract en kralen.
    7. Bereid extract voor β-catenine degradatie assay zoals beschreven in 2.2.
  2. Het optimaliseren van Xenopus Extract voor β-catenine Degradatie
    NB: β-catenine afbraak in Xenopus ei extract is een energie-afhankelijk proces dat snel put de endogene ATP winkels. Bijgevolg wordt een energie regeneratie systeem nodig om robuuste β-catenine degradatie te behouden.
    1. Bereid een 20x energie regeneratie (ER) mix bestaande uit 150 mM creatine fosfaat, 20 mM ATP, 600 ug / ml creatinefosfokinase,en 20 mM MgCl2. ER worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -80 ° C. Vermijd herhaalde vries / dooi cycli met behulp van kleine porties ingevroren.
    2. Snel ontdooien Xenopus ei extract door wrijven de bevroren buis tussen de handen. Plaats de buis op ijs net voordat alle extract is gesmolten.
    3. Voeg 10 ul van energie regeneratie mix (20x ER) in een hoeveelheid (200 pl) van Xenopus ei extract. Meng goed door snel te vegen de buis en pols vortexen. Pulse-spin en direct te plaatsen op ijs.
    4. (Optioneel) De omzet van β-catenine kan enigszins versterkt Xenopus ei extract door toevoeging van ubiquitine (1,25 mg / ml final). Cycloheximide (0.1 mg / ml final) kunnen ook worden toegevoegd aan translatie van endogene transcripten minimaliseren.
    5. Aliquot de juiste hoeveelheden voor degradatie assay in pre-gekoelde microfugebuisjes op ijs. Voor radioactief gemerkt β-catenine degradatie assays, intrekken 2-5 ml extract voor elk tijdstip. </ Li>

3. Gelabeld β-catenine degradatie assay Xenopus ei extract

Opmerking: alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs, tenzij anders aangegeven.

  1. Voorbereiden van radioactief gemerkt β-catenine
    1. Bereid vers in vitro gesynthetiseerd [35S] methionine-radioactief gemerkt eiwit met behulp van commercieel verkrijgbare kits. OPMERKING: genereren 35S-gemerkte (halfwaardetijd 87 dagen) eiwitten worden gemakkelijk en efficiënt geproduceerd uit commercieel beschikbare in vitro gekoppelde transcriptie-translatie kits. Het is belangrijk dat het vertaalde eiwit voldoende zodanig dat veranderingen in eiwitturnover gemakkelijk gevisualiseerd worden gelabeld.
    2. Om succesvol radiolabeling bevestigen uitvoeren SDS-PAGE/autoradiography met 0,5 ul van het vertaalde eiwit. Kwantificeer de intensiteit van het radioactief gemerkte β-catenine band met ImageJ, ImageQuant, of een andere kwantitatieve software progrben. OPMERKING: De radioactief gemerkte β-catenine eiwit band moet duidelijk zichtbaar op film binnen een paar uur (4-6 uur).
    3. Snap-vries het radioactief gemerkte eiwit in vloeibare stikstof voor opslag tot gebruik. Opmerking: Langdurige opslag (> 2 maanden) en meerdere vries / dooi (meer dan 2) kunnen ernstige gevolgen de capaciteit van de radioactief gemerkte β-catenine krachtig is afgebroken in Xenopus ei extract. Typisch, de stabiliteit van radioactief gemerkte eiwitten significant afneemt na 1 maand opslag bij -80 ° C; dus relatief vers bereide radiogelabeld β-catenine geeft de beste resultaten bij deze degradatie assays.
  2. Het uitvoeren van β-catenine Degradatie Assay
    1. Voeg 1-3 pl (afhankelijk van de sterkte van de radioactief gemerkte band signaal) in vitro vertaalde β-catenine (en andere eiwitten, kleine moleculen, enz. die worden getest) in 20 ui Xenopus reactiemengsel op ijs. Meng goed door quickly flicking de buis en een korte puls van vortexen; Dit is een belangrijke stap als Xenopus ei extract is erg stroperig, en onvolledige menging zal de consistentie van de resultaten beïnvloeden. Pulse spin en leg ze op ijs.
    2. Start de β-catenine afbraak reactie van het verschuiven van de buizen tot kamertemperatuur.
    3. Op het aangewezen tijdstip, verwijderen 1-5 ml van het monster en direct beginnen met mixen met SDS sample buffer (5x volume) om de reactie te stoppen. Om ervoor te zorgen dat de afbraak reactie wordt volledig beëindigd, flick buis meerdere malen en vortex krachtig.
    4. Voeren SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalent (~ 50 mg eiwit) van het extract voor elk tijdstip / baan. Degradatie van β-catenine in Xenopus ei extract moet blijken uit de tijdsafhankelijke afname van de intensiteit van het radioactief gemerkte β-catenine band Figuur 2. Resultaten te kwantificeren volgens ImageJ, ImageQuant, of andere gewenste imaging software indien nodig.
    5. (Optionale) Soak SDS-polyacrylamide gel in fixeeroplossing (10% azijnzuur en 30% methanol in gedestilleerd water) vóór drogen achtergrondradioactiviteit verlagen en de kwaliteit van het beeld.

4. Β-catenine-luciferase Afbraak Assay in Xenopus Egg Extract

Voer alle stappen op ijs, tenzij anders aangegeven.

  1. Voorbereiden van β-catenine-luciferase
    1. Synthetiseren niet-radioactief gemerkt,-luciferase gelabeld β-catenine met de transcriptie-translatie gekoppeld systeem met complete aminozuur mix.
    2. Controleer productie van het luciferase gelabeld β-catenine door meting luciferaseactiviteit 0,5-1 ul van de reactie. Beoordelen achtergrond luminescentie door het meten van luminescentie uit een onvertaald reactie mix. OPMERKING: Meerdere commerciële kits zijn beschikbaar voor het meten van luciferase-activiteit. Langlevende luminescentie, maar werkt bijzonder goed voor de afbraak ASSAy.
  2. Het uitvoeren van β-catenine-luciferase Degradatie Assay
    1. Ontdooien en bereiden Xenopus ei extract als in 2.2.
    2. Toe te voegen in-vitro vertaald β-catenine-luciferase fusie (vanaf 4.1) in de voorbereide Xenopus reactie mix (van 2,2) op ijs en meng goed als in 3.2.1. Opmerking: Activiteit van de β-catenine luciferase die wordt toegevoegd aan het extract typisch tussen 20 - 50.000 relatieve fluorescentie-eenheden (RLU) / ml extract (gebaseerd op metingen verkregen uit 4.1.2). Startsignaal moet ongeveer 100.000 RLU (2-5 ml van de in vitro vertaalde β-catenine-luciferase fusie).
    3. Shift het extract RT de afbraak reactie te starten.
    4. Verwijder een monster van het reactiemengsel op de aangegeven tijd en snap-bevriezing in vloeibare stikstof. OPMERKING: drievoudige monsters worden meestal verwijderd voor analyse voor elk tijdstip. Bevroren extract kan bij -80 ° C worden bewaard until zijn ze klaar om te worden geanalyseerd.
    5. Ontdooi monsters ijs, doorvoermonsters standaard witte 96-wells platen op ijs en werkwijze voor luciferaseactiviteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een schema van β-catenine afbraak in Xenopus ei extract wordt getoond in Figuur 2A. 35S-gemerkte β-catenine werd geïncubeerd in Xenopus ei extract werden porties (1 ml extract equivalent) verwijderd geëigende momenten en monsters werden onderworpen aan SDS-PAGE gevolgd door autoradiografie. β-catenine afbraak door componenten van de Wnt route wordt gemedieerd door de ubiquitine-proteasoom-systeem 2 en afbraak van [35 S]-radioactief gemerkt β-catenine in Xenopus extract wordt geremd door toevoeging van de proteasome inhibitor MG132 Figuur 2B. Degradatie van β-catenine door componenten van de Wnt-route is afhankelijk van de fosforylatie door GSK3 34. GSK3-afhankelijke afbraak kan gemakkelijk worden aangetoond op verschillende manieren gebruikt Xenopus ei extract: 1) Het β-catenine (SA) mutant (GSK3 fosforyleringsplaatsen gemuteerd om alanines) wordt gestabiliseerd Xenopus ei extract ten opzichte van wildtype β-catenine eiwit Figuur 2B. 2) Kleine molecuul remmers van GSK3 (LiCl) eveneens remmen degradatie van β-catenine (figuur 2C). 3) Tenslotte uitputting van GSK3 van Xenopus ei extract remt degradatie van β-catenine; afbraak kan worden gered door toevoeging van exogene GSK3 figuren 2D-E.

De radioactief gemerkte β-catenine degradatie assay biedt een bijzonder informatieve visuele beoordeling van de wijze van afbraak (dwz ubiquitine-gemedieerde afbraak versus apoptotische decollete). Autoradiografie, is echter arbeidsintensief, en grotendeels beperkt voor hoge-doorvoer analyse van de route (bijv. screenen op kleine moleculen modulatoren van Wnt-route). De β-catenine-degradatie luciferase assay is gemakkelijker en sneller kwantificeerbaar de hoeveelheid luminescentie uitgestoten is recht evenredig met de amount van β-catenine-luciferase eiwit. Deze functie maakt het luciferasetest eenvoudig en gemakkelijk aan te passen voor high-throughput assays.

Het is belangrijk vast te stellen dat de luciferase fusie heeft vergelijkbare eigenschappen als die van de nonfusion eiwit. Dit kan empirisch worden bepaald door het fuseren van de luciferase eiwit aan het N-uiteinde, C-uiteinde of intern. Fusie van luciferase tot de N-of C-terminus van β-catenine heeft geen invloed op het vermogen om Wnt doelgenen incultured zoogdiercellen of de omloopsnelheid Xenopus ei extract 2, 19, 20 te activeren.

Een representatieve β-catenine-degradatie luciferase assay Xenopus ei extract wordt getoond in figuur 3A waarbij degradatie van β-catenine-luciferase werd bepaald door SDS-PAGE/autoradiography van het radioactief gemerkte eiwit en luciferase-activiteit van het fusie. Het tarief van degradation van de β-catenine-luciferase lijkt op de ongelabelde β-catenine eiwit. De regulatie van afbraak van de β-catenine-luciferase fusie wezen gelijk is aan de nonfusion eiwit als de toevoeging van LiCI of uitputting van GSK3 resulteerde in remming van β-catenine-luciferase omzet. Zoals getoond in figuren 3B-C, veranderingen in de radioactieve signaal van de β-catenine-luciferase eiwit parallel veranderingen in luciferase-enzymatische activiteit in de tijd. Een probleem dat voortvloeit uit het gebruik van β-catenine-luciferase (met name fusie-eiwit gegenereerd uit de in vitro transcriptie-translatie-systeem) is de achtergrond luciferase signaal veroorzaakt door het gebruik van interne translationele startplaatsen of voortijdige beëindiging translationele Figuur 3D. Dit probleem kan soms worden overwonnen door het optimaliseren van de DNA-concentratie in de IVT reactie. We hadden echter geen acht een afname van de achtergrond luciferase activiteit wanneer we varieerdehet plasmide-DNA concentratie onze bijzondere β-catenine-luciferase construct. Het is waarschijnlijk dat we nodig hebben om het fusie-eiwit reengineer via mutagenese om verder te minimaliseren interne translationele startplaatsen en / of voortijdige translationele beëindiging van de β-catenine-luciferase fusie-eiwit. Omdat de luciferase eiwit is vrij stabiel het tijdsverloop van de afbraak reactie in Xenopus ei extract figuur 3A, maar dit achtergrondsignaal kan eenvoudig worden afgetrokken indien de verhouding van de partiële luciferase eiwit met de volledige lengte β-catenine fusie bekend .

Een sterkte van de luciferase assay wordt het vermogen aan schaal op een multi-well formaat dat zorgt voor het uitvoeren van hoge-doorvoer screening op modulators van β-catenine afbraak. In figuur 4 wordt een representatieve dambord analyse gegeven met een remmer van β-catenine afbraak, MG132, die remt proteasoom. Het resultaat van het dambord experiment geeft aan dat de test is uniform en reproduceerbaar in een 96-well formaat en toont de geschiktheid voor hoge-doorvoer screening.

Figuur 1
Figuur 1. Een schematische weergave van de bereiding van geconcentreerde Xenopus ei extract. Eieren worden verzameld uit-HCG geïnjecteerde Xenopus laevis vrouwtjes, verdicht met een lage snelheid (400 xg) draaien, en geplet en gescheiden met een gemiddelde snelheid (15.000 xg ) draai. Zorg om subcutaan te injecteren in de dorsale lymfe weg, verwijder de slechte eieren voorzichtig, en de hoogwaardige cytoplasmatisch extract zorgvuldig scheiden van de lagere kwaliteit donkerder extract zoals aangegeven in de tekst.

igure 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Figuur 2. Β-catenine wordt afgebroken krachtig geïncubeerd Xenopus ei extract. A) Een schema van een degradatie assay. B) [35S]-gemerkte β-catenine bereid met een IVT reactie afgebroken robuust geïncubeerd Xenopus ei extract. Toevoeging van MG132 (200 uM) aan Xenopus ei extract remt β-catenine afbraak. Mutatie naar alanines van de GSK3 phosphosites binnen β-catenine (β-catenine SA) of toevoeging van LiCl (25 mM) C) remt β-catenine afbraak. D) de GSK3 bindingsplaats van Axin (aminozuren 506-560) efficiënt put GSK3 van Xenopus ei extract. E)-GSK3 verarmd Xenopus ei extract remt β-catenine afbraak en kan worden gered door toevoeging of recombinant GSK3 (0,1 mg / ml). Toevoeging van LiCl (25 mM) blokkeert de capaciteit van recombinant GSK3 aan β-catenine degradatie redden in-GSK3 uitgeputte extract. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Luciferase-gelabeld β-catenine afgebroken geïncubeerd Xenopus ei extract. A) Gelabeld β-catenine-luciferase degradeert met een snelheid vergelijkbaar met die van gecodeerde β-catenine eiwit. Zoals met het wildtype eiwit, toevoeging van LiCl (25 mM) remt β-catenine-luciferase degradatie. Luciferase alleen niet merkbaar omdraaien in Xenopus ei extract. Veranderingen in de luciferase activiteit van de β-catenine-luciferase fusie parallel de veranderingen in de eiwit niveaus. B) Toevoeging van LiCl (25 mm) of uitputting van GSK3 C) remt de β-catenine-luciferase omzet zoals vastgesteld door het meten van luciferase-activiteit. D) Immunoblotting voor in vitro vertaald β-catenine- luciferase (gebruikmaking van een anti-luciferase antilichamen) onthulde significante hoeveelheden vrij luciferase eiwit in bepaalde preps die waarschijnlijk bijdraagt ​​aan de hogere achtergrond vergelijking met het radioactief gemerkte degradatie assay. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4
Figuur 4. Gereguleerde degradatie van β-catenine-luciferase in Xenopus extract kan worden aangepasteen hoog-format. Een vertegenwoordiger dambord analyse voor β-catenine-luciferase met MG132 (450 uM) als een remmer van β-catenine afbraak. Arcering worden MG132-behandelde putten, en lichtere kolommen vertegenwoordigen voertuig (DMSO)-behandelde putten. Kwantificering en Z-factor berekening resulteert in een score van 0,3 wijst op een aanvaardbare test voor potentieel gebruik in high-throughput screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus ei-extract is een robuust biochemisch systeem voor het onderzoeken van β-catenine omzet. De concentratie van β-catenine in Xenopus ei extract ~ 25 nM 2. Onder optimale omstandigheden, het ei extract kan afbreken β-catenine met een snelheid van 50-100 nM / uur en half-maximaal bij 200 nM 24. Er zijn een aantal cruciale stappen voor een succesvolle reconstructie van β-catenine afbraak berekend Xenopus ei extract. Deze omvatten 1) het genereren van hoge kwaliteit Xenopus ei extract en de wijze waarop ei extract wordt bereid, 2) genereren kwaliteit radiogelabeld β-catenine en β-catenine-luciferase eiwit 3) optimalisering reactieomstandigheden voor β-catenine afbraak ondersteunen en 4 ) correcte verwerking van reactietijd punten.

Een hoge kwaliteit voorbereiding van Xenopus ei extract waarin β-catenine is robuust afgebroken hangt af van zowel de kwaliteit van the eieren en de eieren worden behandeld vóór de verpletterende stap en hoe het extract vervolgens wordt gecentrifugeerd om de uiteindelijke extract te verkrijgen. Zoals vermeld in het protocol, is het belangrijk ervoor te zorgen dat alleen kwalitatief hoogwaardige eieren (bewezen door een scherp contrast tussen de donkere dier halfrond en licht vegetale halfrond) worden gebruikt, dat de slechte kwaliteit van de eieren (vezelig, gevlekt, of witte rookwolken) overal worden verwijderd het proces dat eieren worden op een koele temperatuur (16 ° C) gedurende de procedure, en de procedure wordt zo snel mogelijk uitgevoerd. Het is belangrijk niet om de kwaliteit te offeren voor hoeveelheid extract. Bovendien, zoals eerder vermeld, eieren van een kikker die slechte kwaliteit eieren (> 10%) bepaald worden volledig verwijderd.

De hierboven beschreven extract is een modificatie van meiose II gearresteerd CSF extract 11. De voorbereiding van Xenopus ei-extract voor β-catenine afbraak (intermediaire toerental extract) differs van de klassieke extracten, bereid voor het bestuderen van de celcyclus 30-32, die met lage snelheid of hoge-snelheid zijn extracten 35. Aanpassing van Xenopus ei-extract voor een optimale afbraak van andere eiwitten kan eisen veranderen van de centrifugeersnelheid en het aantal spins. Low-speed extract bevat intact organellen en andere grote cellulaire componenten. Zo zal een hogere snelheid draaien de samenstelling van het extract veranderen en mogelijk verwijderen remmende en / of essentiële componenten die degradatie van het eiwit van belang beïnvloeden. De bereiding van intermediaire toerental extract hierin beschreven is geoptimaliseerd voor de afbraak van β-catenine door componenten van de Wnt-pathway. Spinning het extract groter dan 4X kan de capaciteit van het extract β-catenine afbreken significante daling (hoewel het een minimaal effect op de afbraak van een andere component Wnt, Axin). β-catenine is gevoelig voor-caspase-gemedieerde proteolyse in lage snelheid draaien extract en niet noticeably afgebroken in hoge rotatie snelheid extract. Derhalve is het waarschijnlijk dat andere snelheid extracten optimaal voor afbraak van componenten van signalerende routes zijn.

Het genereren van 35 S-β-catenine en β-catenine-luciferase kan worden uitgevoerd met een aantal commercieel verkrijgbare kits. Eiwitproductie met transcriptie-translatie gekoppelde systemen sterk afhankelijk van de kwaliteit van het plasmide: hoogzuivere midi-bereidingen van plasmiden beter werken en betrouwbaarder dan met DNA mini-preparaten. Voor radioactief β-catenine, vers verkregen [35 S] methionine of Translabel ([35 S] methionine plus [35S] cysteïne) de voorkeur. Merk op dat methionine en cysteïne beide de neiging te oxideren met langdurige opslag daardoor hun opneming afneemt in β-catenine in de in vitro transcriptie-translatie gekoppelde reactie. Omdat langdurige opslag en herhaalde vries-dooiencycli afbraak remmen, worden kleine hoeveelheden van het radioactief gemerkte β-catenine bereid tegelijk en kort na gebruik.

De hoeveelheid eiwit vertaling en het aantal methioninen in de proteïne bepaalt de sterkte van de radioactief signaal. Voor β-catenine, zouden zich geen problemen om een ​​sterk radioactief signalen voor degradatie assays. Voor eiwitten met weinig methionines en / of die niet goed vertalen, een [35 S] methionine en kan [35S] cysteïne mix in plaats van [35S] methionine worden gebruikt en / of een epitoop-tag (Myc) die meerdere bevat methionines. Hoewel succes met verschillende expressieplasmiden die het geschikte faag promoters (T7, T3 en SP6) zijn verkrijgbaar in vitro transcriptie-translatie reacties, pCS2-gebaseerde plasmide haal algemeen de beste resultaten. Bovendien, het signaal van het vertaalde eiwit kan soms aanzienlijk verhoogd door schrapping van de endogene 5'UTR. Tenslotte, voor grootschalige experimenten (bijvoorbeeld, high-throughput screening), een grote hoeveelheid recombinant β-catenine-luciferase kan noodzakelijk. β-catenine-luciferase van Sf9 / baculovirus systeem degradeert met gelijke kinetiek als wildtype β-catenine in Xenopus embryo extract en 2. Als alternatief, een hoge opbrengst in vitro expressie (bijv. tarwekiemen gebaseerd) is met succes gebruikt voor high-throughput screening 19, 20.

Om degradatie van β-catenine in het extractiesysteem betrouwbare wijze is het belangrijk dat de aanvankelijke signaal van ofwel de radioactief gemerkte β-catenine of luciferase β-catenine fusie voldoende robuust. Derhalve bepaalde hoeveelheid van optimalisatie door de experimentator de grootte van de degradatie assay, het aantal tijdstippen nodig, en de efficiëntie van de in vitro translatiereactie will nodig. Bij de montage van de afbraak reactie, zijn er verschillende stappen kan nemen om de kans op het verkrijgen robuuste afbraak verbeteren. Ten eerste moeten alle reagentia snel worden ontdooid en voorafgaand aan de volledige dooi op ijs geplaatst. Omdat de degradatie van β-catenine is zeer energie afhankelijk is van belang dat de ER relatief vers. Tweede Xenopus ei extract viskeus, en is het essentieel dat de reactie grondig gemengd na toevoeging van radioactief gemerkt β-catenin/β-catenin-luciferase fusion, ER, eiwitten, kleine moleculen modulatoren, enz. Ten derde pre-incuberen van het reactiemengsel mengen gedurende 20-30 minuten op ijs geeft meer reproduceerbare resultaten bij het testen van effecten van kleine molecuul modulatoren.

Het vermogen om eiwitten afbreken van Xenopus ei extract vormt een krachtig instrument om de functies van eiwitten en de concentratie-afhankelijke effecten te evalueren. Als voorbeeld tonen we aan dat het uitputten GSK3 van Xenopus ei extract blokkeert de afbraak van β-catenine, met vermelding van de belangrijke rol van GSK3 in β-catenine omzet. Verschillende uitputting omstandigheden moet empirisch worden bepaald voor verschillende eiwitten. Zo zal overvloedige eiwitten een toename van de hoeveelheid antilichaam of affiniteitsligand kralen gebruikt volledige uitputting bereiken vereisen. Een goed uitgangspunt is om verpakt kralen te gebruiken op 1/10 van het volume van het extract om extract verdunning minimaliseren. Naast de sterkte van binding van het antilichaam / affiniteitsligand aan het doelwit eiwit, het type korrels (bijvoorbeeld sepharose, agarose, of magnetische) gebruikt kan de efficiëntie van eiwit depletie van Xenopus ei extract 36 beïnvloeden. Tenslotte zou het ideaal zijn om analyseren mate van uitputting (typisch door immunoblotting). Zodra de β-catenine reactie voltooid, kan de wijze waarop de monsters verwerkt grote invloed op de resultaten van het experiment. De concentratie vanXenopus ei extract preps bereid op de wijze beschreven 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, en het is belangrijk om de capaciteit van de SDS-PAGE-gel overbelasting; Dit is niet een probleem met de luciferase-β-catenine assay. Dus voor elk tijdstip, niet meer dan 1 ml equivalent extract worden in elke baan van een SDS-PAGE-gel. Ter verdere verbetering van de kwaliteit van de resultaten, wordt de gel fixatiestap (optioneel) achtergrond radioactiviteit verminderen en daarmee de signaal-ruisverhouding. Voor de luciferase-test, een afname van een eerste signaal van 100.000 RLU in Xenopus ei extract getrouw de verandering in de eiwitniveaus van de β-catenine-luciferase fusie-eiwit.

De Xenopus ei extract systeem vertegenwoordigt een aantrekkelijk systeem voor de regulering van β-catenine degradatie te bestuderen. Het extract systeem maakt de nauwkeurige controle van de concentratie van de afzonderlijke eiwitten via uitputting en gereconstitueerde tie. Het vermogen om hun effecten op de kinetiek van β-catenine omzet in de tijd te monitoren zorgt voor een beter inzicht in de biochemische mechanisme van deze cruciale stap in Wnt signaaltransductie. Dergelijke manipulaties diep inzicht gegeven in de complexe moleculaire interacties tussen componenten van de Wnt route en kritisch waren voor de ontwikkeling van de eerste mathematisch model van de Wnt-route 24. Een nadeel is dat de concentraties van Wnt-route componenten in Xenopus ei extract en zoogdieren cellysaten zijn gevonden te verschillen, mogelijk als gevolg van verschillen in de manier waarop de Wnt-route wordt tijdens de embryogenese versus de volwassen situatie 37 geregeld. Het vermogen om zowel radioactieve en enzymatische, luciferase-gebaseerde testen uitvoeren met Xenopus ei extract zorgt voor extra krachtige aanvullende kwalitatieve en kwalitatieve instrumenten voor het bestuderen van de biochemische regulatie van β-catenine degradatie.

t "> Naast het monitoren van de omzet van β-catenine, kan afbraak van de negatieve regulator Wnt, Axin worden gecontroleerd Xenopus ei extract hetzij als radioactief gemerkt eiwit of fusie luciferase. Met een variant van luciferase, Renilla, gefuseerd aan Axin, was eerder aangepast voor de luciferase degradatie assay in een high-throughput formaat gelijktijdig screenen op modulatoren van twee Wnt eiwitten, β-catenine en Axin 19, 20. Deze biochemische scherm identificeerde de FDA-goedgekeurde geneesmiddel, pyrvinium dat toegenomen en verminderde de afbraaksnelheid van β-catenine en Axin, respectievelijk in Xenopus ei extract 19. Pyrvinium werd vervolgens gevalideerd in gekweekte menselijke cellen en in verschillende modelorganismen (bijvoorbeeld Xenopus en C. elegans) als een kleine molecule inhibitor van de Wnt pathway. Kortom, de Xenopus ei extractiesysteem is een veelzijdig biochemisch systeem that kan een veelheid aan manieren om het mechanisme van Wnt signalering bestuderen en voor identificatie van moleculen modulatoren van Wnt-route worden benut. De biochemische hierin beschreven werkwijze kan worden toegepast op andere signaalwegen waarin eiwitafbraak een cruciale rol kunnen spelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Laurie Lee voor het kritisch lezen van het manuscript. TWC wordt ondersteund door een American Heart Association predoctorale Fellowship (12PRE6590007). MRB wordt ondersteund door een National Cancer Institute opleiding subsidie ​​(T32 CA119925). SSH wordt ondersteund door National Institutes of Health (R01DK078640). EL wordt ondersteund door de National Institutes of Health (R01GM081635 en R01GM103926).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) ProSpec hor-272-A Reconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropin Sigma CG10-10VL
Potassium chloride Fisher BP366-1
Sodium chloride Research Products International S23020-5000.0
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Calcium chloride Acros Organics AC42352-5000
HEPES Fisher BP310-1
Cysteine Acros Organics AC17360-1000
Leupeptin Sigma L2884-10MG
Aprotinin Sigma A1153-10MG
Pepstatin Sigma P4265-5MG
Cytochalasin B Sigma C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip Becton Dickinson 309657
27 G needle Becton Dickinson 305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed Corning 3605
Steady-Glo luciferase assay system Promega E2520 Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system Promega L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system Promega L3260 Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35] Perkin Elmer NEG772007MC
Creatine phosphate Sigma 27920-5G
ATP Sigma A2383-5G
Creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system Promega E2920 Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes Fisher Scientific 0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit Ambion AM1340
Anti-firefly luciferase antibody Abcam ab16466
Anti-GSK3 antibody BD Transduction Laboratories 610201
FLUOStar Optima BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific
16 °C Incubator Percival Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

Tags

Molecular Biology , afbraak van eiwitten radiolabel luciferase autoradiografie high-throughput screening
Reconstitutie van β-catenine afbraak in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, T. W., Broadus, M. R.,… More

Chen, T. W., Broadus, M. R., Huppert, S. S., Lee, E. Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. J. Vis. Exp. (88), e51425, doi:10.3791/51425 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter