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Biology

Β-catenin गिरावट में के पुनर्गठन Published: June 17, 2014 doi: 10.3791/51425
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Cell and Developmental Biology and Program in Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Division of Gastroenterology, Hepatology & Nutrition and Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Vanderbilt Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

एक विधि Xenopus अंडा निकालने और प्रोटीन गिरावट के छोटे अणु modulators के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के लिए अपने अनुकूलन में radiolabeled और luciferase संलयन प्रोटीन का उपयोग प्रोटीन गिरावट का विश्लेषण करने के लिए वर्णित है.

Abstract

Xenopus laevis अंडे निकाल सकते हैं. Xenopus अंडा निकालने सेल चक्र और संकेत पारगमन मार्ग 1-3 सहित कई सेलुलर संदर्भों में प्रोटीन कारोबार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है विविध सेलुलर प्रक्रियाओं के जैव रसायन के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता, मजबूत प्रणाली है. इस के साथ साथ, एक विधि महत्वपूर्ण Wnt मार्ग घटक, β-catenin की गिरावट को बढ़ावा देने के लिए अनुकूलित किया गया है कि Xenopus अंडा निकालने के लिए अलग वर्णन किया गया है. दो अलग अलग तरीकों Xenopus अंडा निकालने में β-catenin प्रोटीन गिरावट का आकलन करने के लिए वर्णित हैं. अन्य अधिक आसानी से उच्च throughput assays (जुगनू luciferase टैग फ्यूजन प्रोटीन) के लिए बढ़ाया है, जबकि एक विधि, ([35 एस]-radiolabeled प्रोटीन) नेत्रहीन जानकारीपूर्ण है. वर्णित तकनीकों β-catenin प्रोटीन कारोबार का आकलन करने और अपने कारोबार के लिए योगदान दे आणविक घटकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन तक सीमित नहीं हैं. इसके अतिरिक्त, abilluciferase टैग प्रोटीन की मात्रात्मक और सतही readout के साथ संयुक्त समरूप Xenopus अंडा निकालने के लिए बड़ी मात्रा में शुद्ध करने के लिए अल्पसंख्यक इस प्रणाली को आसानी से β-catenin गिरावट के modulators के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के लिए अनुकूलित किया जा करने की अनुमति देता है.

Introduction

Xenopus laevis अंडे निकालने cytoskeletal गतिशीलता, परमाणु विधानसभा और आयात, apoptosis, ubiquitin चयापचय, सेल चक्र प्रगति, संकेत पारगमन, और प्रोटीन कारोबार 1-17 सहित कई सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. अंडा निकालने अनिवार्य रूप से इन प्रक्रियाओं पर अमल और जांच सक्षम करने के लिए आवश्यक सभी आवश्यक cytoplasmic घटक शामिल है कि undiluted कोशिका द्रव्य का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि Xenopus अंडा निकालने प्रणाली सेलुलर प्रक्रियाओं के एक सैन्य टुकड़ी के जैव रासायनिक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है. अंडा निकालने की बड़ी मात्रा में सामग्री (जैसे, प्रोटीन शुद्धि या उच्च throughput स्क्रीनिंग) 18-20 की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है कि जैव रासायनिक जोड़तोड़ के लिए एक समय में तैयार किया जा सकता है. एक और लाभ यह Xenopus अंडा निकालने में विशिष्ट प्रोटीन की एकाग्रता ठीक पुनः संयोजक प्रोटीन और / या endog की immunodepletion के अलावा द्वारा समायोजित किया जा सकता हैब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है, जहां प्लास्मिड डीएनए के अभिकर्मक के विपरीत enous प्रोटीन. इसके अलावा, उपलब्ध पुनः संयोजक प्रोटीन की कमी exogenously गयी mRNA अनुवाद करने के लिए हौसले से तैयार Xenopus अंडा निकालने के लिए उच्च क्षमता का लाभ लेने, ब्याज की प्रोटीन एन्कोडिंग टेप के अलावा द्वारा दूर किया जा सकता है.

प्रोटीन गिरावट के नियमन कई सेलुलर रास्ते के नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है और 21. Xenopus अंडा निकालने प्रणाली प्रतिलेखन और अनुवाद के confounding प्रभाव के बिना प्रोटीन कारोबार पर नजर रखने के लिए कई तरीके के लिए अनुमति देता है के रूप में प्रोटीन गिरावट का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है प्रक्रियाओं. WNT सिगनल मार्ग विकास और बीमारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि एक उच्च संरक्षित संकेतन मार्ग है. β-catenin, Wnt मार्ग का प्रमुख प्रेरक का कारोबार, अत्यधिक एक वृद्धि स्थिर राज्य एल विनियमित, और हैβ-catenin की Evel Wnt लक्ष्य जीन की सक्रियता के लिए महत्वपूर्ण है. β-catenin गिरावट के महत्व β-catenin गिरावट बाधित कि Wnt मार्ग में परिवर्तन के ~ कोलोरेक्टल कैंसर 22 के सभी छिटपुट मामलों के 90% में पाया कि इस तथ्य से प्रकाश डाला है. Wnt मार्ग के घटकों द्वारा β-catenin गिरावट ईमानदारी से अपने कारोबार की व्यवस्था का अध्ययन करने के साथ ही इसकी गिरावट 2, 19, 20, 23-29 के उपन्यास छोटे अणु modulators की पहचान करने के लिए Xenopus अंडा निकालने में recapitulated किया जा सकता है.

सेल चक्र के अध्ययन के लिए Xenopus अंडा निकालने की तैयारी के लिए तरीके पिछले जौव प्रकाशनों 30-32 में वर्णित किया गया है. मौजूदा प्रोटोकॉल इन तरीकों में से एक संशोधन का वर्णन करता है और की गिरावट के लिए अनुकूलित है [35 एस]-radiolabeled β-catenin और luciferase टैग β-catenin मेंXenopus अंडा निकाल सकते हैं. radiolabeled गिरावट परख autoradiography के माध्यम से प्रोटीन के स्तर के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है. [35 एस] methionine तो सीधे एक गिरावट प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा जा सकता है कि इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रिया का उपयोग ब्याज की प्रोटीन में शामिल किया है. इसके अलावा, radiolabeled प्रोटीन कारोबार परख प्रोटीन स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं, जो ब्याज की प्रोटीन या एक मिलान टैग, के खिलाफ एक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है. प्रोटीन के स्तर में भी छोटे परिवर्तन, radiolabeled प्रोटीन बैंड की तीव्रता में परिवर्तन के रूप में परिलक्षित, आसानी से autoradiography द्वारा कल्पना कर रहे हैं, [35 एस]-radiolabeled गिरावट परख प्रोटीन कारोबार 2 के दृश्य के लिए एक बहुत ही उपयोगी विधि का प्रतिनिधित्व करता है.

आदेश में जुगनू luciferase को β-catenin की फ्यूजन (इसके बाद बस के रूप में "luciferase" कहा जाता है), प्रोटीन के स्तर की सटीक और सरल मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता हैβ-catenin कारोबार 19, 20 की गतिज गुणों का निर्धारण करने के लिए. Luciferase परख का एक बड़ा फायदा यह है कि यह आसानी से पहुंचा है कि एक मजबूत मात्रात्मक प्रणाली प्रदान करता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल β-catenin गिरावट और उपन्यास β-catenin modulators के उच्च throughput प्रदर्शन के लिए एक मजबूत, कुशल, और प्रभावी विधि परख करने की क्रिया के लिए सरल तरीके प्रदान करता है.

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Protocol

Xenopus अंडे निकालने के 1. तैयारी

नोट: प्रत्येक मेंढक प्रयोग करने योग्य अंडा निकालने के लगभग 1 मिलीलीटर पैदावार. 10 मेंढ़कों से निष्कर्षों को आम तौर पर एक समय में तैयार, और नीचे वर्णित बफर की मात्रा एक 10 मेंढक Xenopus अंडा निकालने प्रस्तुत करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. बफर मात्रा अंडे निकालने का बड़ा या छोटा तैयारी के लिए तदनुसार समायोजित किया जा सकता है. इस तरह से उत्पन्न preps लगातार प्रोटीन सांद्रता ≥ 50 मिलीग्राम / एमएल उपज. दो लोगों द्वारा किए गए जब अंडे इकट्ठा करने और निकालने में उन्हें प्रसंस्करण की प्रक्रिया सबसे कारगर है. (बुनियादी मेंढक पशुपालन तकनीक के लिए, निर्णायक एट अल. 33 देखें).

  1. अंडा संग्रह
    1. प्रधानमंत्री को मेंढ़क, एक ताजा बना 250 यू / एमएल शेयर से गर्भवती घोड़ी सीरम Gonadotropin की 100 यू (PMSG) के साथ प्रत्येक महिला मेंढक इंजेक्षन. के उठाव के साथ, subcutaneously इंजेक्षन करने के लिए एक 27 जी सुई के साथ एक 3 मिलीलीटर टुबरकुलीन सिरिंज का प्रयोग करेंलगभग 1 सेमी दूर मेंढक के पैरों की लंबाई के साथ नोकदार discolorations से midline से स्थित है जो पृष्ठीय लिम्फ थैली में सुई ऊपर,.
    2. पानी में स्टोर primed मेंढ़क 5-10 दिनों के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर (प्लस 20 मिमी NaCl, निर्णायक एट अल. 33 देखें). पानी की टंकी सिस्टम खड़ा करने के लिए, पशु घनत्व महिला मेंढक के अनुसार पानी की लगभग 4 एल है. नोट: प्रभावी करने के लिए भड़काना के लिए आवश्यक न्यूनतम समय 5 दिन है, और भड़काना का प्रभाव 10 दिनों के बाद बंद पहनते हैं.
    3. एक 20x एमएमआर स्टॉक से 0.5x मार्क संशोधित Ringers (एमएमआर) समाधान तैयार करें. (2 hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 7.4 पीएच - 20x एमएमआर 2 एम सोडियम क्लोराइड, 40 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 40 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, 20 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, और 100 मिमी 4 के होते हैं.
    4. सभी इंजेक्शन मेंढ़क (4 एल बाल्टी प्रति एक मेंढक) के लिए बाल्टी सेट करें. नोट: एक से अधिक मेंढक, अंडा संग्रह के लिए एक ही बाल्टी में रखा जा सकता है अगर मेंढ़कों में से एकमुख्य रूप से गरीब गुणवत्ता अंडे देता है, प्रयास के एक पर्याप्त राशि निकालने बनाने के लिए उपयुक्त हैं कि उन लोगों से खराब गुणवत्ता अंडे अलग करने के लिए आवश्यक हो जाएगा. इस प्रकार, अंडा के लिए इस्तेमाल किया बफर की मात्रा को कम करने के लिए एक ही टैंक में मेंढकों की संख्या में एकत्र अधिकतम जोखिम के लायक नहीं है.
    5. 1.1.1 में वर्णित के रूप में एक 27 जी सुई का उपयोग करते हुए प्रत्येक मेंढक के पृष्ठीय लिम्फ थैली में 750 यू मानव chorionic gonadotropin (एचसीजी) इंजेक्षन.
    6. 0.5x एमएमआर युक्त व्यक्ति 4 एल बाल्टी में एचसीजी इंजेक्शन मेंढ़क की हर जगह 16 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा
    7. ओ / एन (15-16 घंटे) अंडे एकत्रित करने के लिए एक 16 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मेंढक के साथ कंटेनर रखें. नोट: उचित तापमान बनाए रखने अंडा निकालने की तैयारी करने के लिए अंडे इकट्ठा करने से, पूरी प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है.
  2. अंडे Dejellying
    नोट: अंडे से पहले निकालने बनाने के लिए हटा दिया जाना चाहिए कि एक जेली कोट के साथ कवर कर रहे हैं. अंडे की सहज सेल की संभावना समय betwee के रूप में बढ़ जाती हैn अंडा बिछाने और तैयारी बढ़ जाती निकाल सकते हैं. इस प्रकार, यह जितनी तेजी निम्नलिखित कदम के माध्यम से आगे बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है.
    1. 1x एमएमआर के 4 एल, 0.1x एमएमआर के 50 एमएल, और आसुत जल में किए गए 2% सिस्टीन, पीएच 7.7, 400 मिलीलीटर की तैयारी. 16 डिग्री सेल्सियस पर सभी समाधान का रखरखाव
    2. अतिरिक्त अंडे को निष्कासित करने के लिए, धीरे मेंढक की पीठ के निचले हिस्से और पेट दबाओ.
    3. , मेंढ़क और एमएमआर के थोक निकालें प्रत्येक बाल्टी में एमएमआर की लगभग 1-200 मिलीग्राम में अंडे छोड़ने के लिए.
    4. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ मलबे को हटाने, और अंडे की गुणवत्ता का मूल्यांकन: उच्च गुणवत्ता वाले अंडे आम तौर पर अंधेरे में pigmented पशु गोलार्द्ध और हल्के रंग वनस्पति गोलार्द्ध के बीच एक स्पष्ट विभाजन द्वारा चिह्नित और उच्चतम अंधेरे से प्रकाश विपरीत हैं. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ त्यागें वे निकालने की समग्र गुणवत्ता में कमी होगी के रूप में (सफेद और झोंके), रेशेदार विचित्र, या lysed दिखाई देने वाले किसी भी अंडे. अंडे की> 10% गरीब गुणवत्ता के हैं, तो पूरेबैच खारिज किया जाना चाहिए.
    5. एक 500 मिलीलीटर कांच बीकर में अंडे का मिश्रण है और डूबे हुए अंडे रखते हुए जितना संभव एमएमआर उंडेल.
    6. एमएमआर की दो बार अंडे की मात्रा के साथ कोमल घूमता द्वारा अंडे कुल्ला. दो बार दोहराएँ, और किसी भी मलबे या स्पष्ट रूप से खराब गुणवत्ता अंडे को हटा दें.
    7. , कांच बीकर को 2% सिस्टीन की लगभग 100 मिलीलीटर जोड़ें मिश्रण करने के लिए धीरे ज़ुल्फ़, और अंडे 16 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति सिस्टीन डालो. नोट: वे अब जेली कोट के बिना एक छोटी मात्रा पर कब्जा के रूप में Dejellying अंडे और अंडे के अधिक कॉम्पैक्ट पैकिंग ऊपर चल जेली कोट के क्रमिक रूप से चिह्नित किया गया है.
    8. , 2% सिस्टीन की एक और 100 मिलीलीटर जोड़ें धीरे ज़ुल्फ़, 5 मिनट प्रतीक्षा करें, और फिर धीरे धीरे सिस्टीन टपकना. अंडे (आमतौर पर तीसरे सिस्टीन उपचार द्वारा) कसकर जमा हो गए हैं जब तक दोहराएँ. नोट: अंडे सिस्टीन में भी लंबे समय के लिए छोड़ दिया जाता है, वे सेल से ग्रस्त हैं. इसी तरह, dejellied अंडे कमजोर और यांत्रिक सेल से ग्रस्त हैं, तो वेवे हवा के संपर्क में हैं, तो भी सख्ती swirled या कर रहे हैं. अंडे dejellied मिल जाने के बाद यह तेजी से centrifugation कदम को आगे बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है.
    9. सिस्टीन डालो, और धीरे 1x एमएमआर में अंडे धोने से जेली कोट और अन्य मलबे दूर कुल्ला. बीकर के पक्ष के साथ सावधानी से बफर डालो. दो बार दोहराएँ या एमएमआर समाधान जब तक बादलमय नहीं रह गया है. 1x एमएमआर के साथ rinsing जबकि एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर बुरा अंडे को दूर करने के लिए जारी है.
    10. 30 मिलीलीटर 0.1x एमएमआर के साथ एक अंतिम कोमल कुल्ला करते हैं, और धीरे संभव के रूप में बफर के रूप में ज्यादा टपकना. फिर, किसी भी स्पष्ट रूप से बुरा अंडे को हटा दें.
  3. Centrifugation द्वारा अंडे पैकिंग और क्रशिंग
    नोट: कि नीचे वर्णित निकालने β-catenin गिरावट के लिए प्रयोग किया जाता है cytostatic कारक निकालने (मेटाफ़ेज़ द्वितीय गिरफ्तार) का एक संस्करण है. सेल चक्र के अध्ययन के लिए इस्तेमाल कम गति और उच्च गति निकालने के विपरीत, मध्यवर्ती गति निकालने β-catenin गिरावट के लिए सबसे अच्छा काम करता है. मैंतैयार करने के लिए गहन अधिक परिश्रम है, हालांकि nterphase निकालने इसी मजबूत β-catenin गिरावट को बढ़ावा देता है.
    1. एक 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से पतला 20 माइक्रोग्राम / एमएल (पर और Cytochalasin डी (एक DMSO में 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान से पतला) 10 माइक्रोग्राम / एमएल Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin मिश्रण (दीर्घावधि औसत, एक protease अवरोध) जोड़ें 0.1x एमएमआर के शेष 20 मिलीलीटर में) DMSO में.
    2. 0 जोड़ें. एक्स एमएमआर धोया अंडे को दीर्घावधि औसत और Cytochalasin डी युक्त, धीरे ज़ुल्फ़, और 16 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते
    3. , 16 डिग्री सेल्सियस पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अंडे स्थानांतरण अंडे व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं, और ऊपर से अवशिष्ट बफर हटा दें. , हवा के लिए जोखिम को रोकने के लिए पहले स्थानांतरण के लिए अंडे वापस लेने को हस्तांतरण पिपेट में बफर की एक छोटी राशि वापस लेने के लिए. अंडे शीर्ष पर अपकेंद्रित्र ट्यूब भरने तक की उपज को अधिकतम जाएगा, जो अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अतिरिक्त अंडे स्थानांतरण और ट्यूब के ऊपर से अवशिष्ट बफर दूर करने के लिए जारीनिकाल सकते हैं.
    4. एक निश्चित कोण रोटर का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए 400 XG पर अंडे, स्पिन अपकेंद्रित्र ट्यूबों पैक करने के लिए. अपकेंद्रित्र ट्यूबों के ऊपर से अवशिष्ट बफर निकालें.
    5. पेराई स्पिन के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 15,000 XG पर ट्यूब स्पिन
  4. निकालें के cytoplasmic लेयर एकत्रित
    नोट: नीचे वर्णित विधि cytoplasmic परत एकत्र करने के क्रम में अपकेंद्रित्र ट्यूब की ओर puncturing की शास्त्रीय विधि से अलग है. इस प्रोटोकॉल सरलीकरण के लिए और पुन: प्रयोज्य हैं जो विशेष अपकेंद्रित्र ट्यूब, के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है. Β-catenin गिरावट के कैनेटीक्स में कोई उल्लेखनीय मतभेद विधि या तो साथ पाए जाते हैं. इस बिंदु निकालने पर प्रक्रिया के दौरान के दौरान ठंड रखा जाना चाहिए, और सभी कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए
    1. P1000 विंदुक टिप का उपयोग लिपिड परत में एक छेद को साफ़ करें.
    2. अंधेरे pigmented परत और ली के बीच cytoplasmic परत (लीजिएस्वच्छ पूर्व ठंडा अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एक नया P1000 विंदुक टिप का उपयोग ght लिपिड परत) (चित्रा 1). मजबूती के साथ β-catenin degrades कि उच्च गुणवत्ता निकालने के लिए, cytoplasmic परत के साथ वापस ले लिया है कि pigmented और लिपिड परत की मात्रा को कम.
    3. स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15,000 XG पर cytoplasmic परत निकाला और फिर cytoplasmic परत जमा. स्पिन और निकासी 1X दोहराएँ. नोट: निकालने "भूसे रंग का." होना चाहिए पर्याप्त संदूषण इस बिंदु पर pigmented और लिपिड परतों के साथ है, तो अत्यधिक spins β-catenin नीचा करने के लिए निकालने की क्षमता में कमी होगी, हालांकि, एक, स्पिन एक बार और दोहरा सकते हैं.
    4. 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर प्रत्येक के अंतिम सांद्रता में निकालने के लिए दीर्घावधि औसत और Cytochalasin डी जोड़ें. नोट: वर्णित विधि का उपयोग एक लगभग 50 मिलीग्राम / एमएल की काफी सुसंगत कुल प्रोटीन एकाग्रता (52.41 ± 5.40 मिलीग्राम / एमएल, एन = 3 अलग preps) Xenopus में पैदावार जैसेजी अर्क.
    5. (वैकल्पिक) अनुवाद assays के लिए, छाया mRNA (0.1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने, RNAsin (1.5 यू / एमएल), और ऊर्जा उत्थान मिक्स (2.2.1) और 2 घंटे के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया सेते (अधिक जानकारी के लिए Salic एट देखना अल. 2 और निर्णायक एट अल. 33). Β-catenin गिरावट assays या बाद में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज के लिए तुरंत अनुवादित निकालने का प्रयोग करें. नोट: हौसले से तैयार निकालने exogenously गयी mRNA अनुवाद करने के लिए एक उच्च क्षमता है, लेकिन निकालने जमे हुए है एक बार दुर्भाग्य से, इस क्षमता को खो दिया है. छाया mRNA आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है.
    6. तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज निकाल सकते हैं. नोट: वे तेजी से refrozen अगर β-catenin नीचा करने के लिए अपनी क्षमता खो देते हैं क्योंकि अर्क एकल उपयोग के लिए छोटे (200 μl) aliquots में जमा हो जाती है. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, निकालने तरल नाइट्रोजन में संग्रहित किया जा सकता है. अल्पकालिक भंडारण के लिए, निकालने, -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, हालांकि क्षमता ओβ-catenin नीचा करने के लिए एफ निकालने नाटकीय रूप से -80 डिग्री सेल्सियस (2 महीने से अधिक समय) पर विस्तारित भंडारण के साथ कम किया जा सकता है.

2. Β-catenin गिरावट परख के लिए निकालने की तैयारी

  1. Xenopus निकालने से रिक्तीकरण
    नोट: Xenopus निकालने का एक बड़ा फायदा यह आसानी से एक मार्ग के घटकों और गिरेगा और ठीक इसके खुराक पर निर्भर प्रभाव का निर्धारण करने के क्रम में एक प्रोटीन का एक निर्धारित राशि वापस जोड़ने की क्षमता है.
    1. हौसले से तैयार Xenopus अंडे निकालने का प्रयोग करें या जल्दी से बर्फ पर जमे निकालने और जगह पिघलना. ठंड में सभी जोड़तोड़ प्रदर्शन.
    2. Pelleted एंटीबॉडी या आकर्षण मोती (जैसे, 200 मिलीलीटर निकालने के लिए 20 मिलीलीटर pelleted मोती) की मात्रा 1/10 को निकालने जोड़ें. , निकालने के कमजोर पड़ने के कम से कम लंबा, पतला सुझावों के साथ जेल लोड हो रहा सुझावों का उपयोग कर निकालने के अलावा पहले संभव के रूप में मोती से ज्यादा के रूप में तरल वापस लेने के लिए आदेश में.
    3. बारी बारी से निकालने-1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मनका मिश्रण.
    4. 30 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस microfuge में 12,600 XG पर स्पिन निकालने मनका मिश्रण. वैकल्पिक रूप से, चुंबकीय मोतियों का उपयोग किया जाता है, तो मोती को इकट्ठा करने के लिए चुंबकीय क्षेत्र लागू होते हैं.
    5. स्थानांतरण बर्फ पर एक ताजा microfuge ट्यूब को निकालने समाप्त हो गया. निकालने के साथ किसी भी मोती स्थानांतरित करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
    6. समाप्त निकालने और मोती दोनों immunoblotting द्वारा कमी की दक्षता की पुष्टि करें.
    7. 2.2 में वर्णित के रूप में β-catenin गिरावट परख के लिए निकालने की तैयारी.
  2. Xenopus β-catenin गिरावट के लिए निकालें अनुकूलन
    नोट: Xenopus अंडा निकालने में β-catenin गिरावट जल्दी अंतर्जात एटीपी भंडार depletes कि एक ऊर्जा पर निर्भर प्रक्रिया है. नतीजतन, एक ऊर्जा पुनर्जनन प्रणाली मजबूत β-catenin गिरावट को बनाए रखने के लिए आवश्यक है.
    1. 150 मिमी creatine फॉस्फेट से मिलकर एक 20x ऊर्जा उत्थान (ईआर) मिश्रण तैयार, 20 मिमी एटीपी, 600 माइक्रोग्राम / एमएल creatine phosphokinase,और 20 मिमी 2 MgCl. ईआर -80 डिग्री सेल्सियस पर aliquoted और संग्रहित किया जाना चाहिए छोटे जमी aliquots का उपयोग करके दोहराया फ्रीज / पिघलना चक्र से बचें.
    2. जल्दी हाथों के बीच जमी ट्यूब रगड़ से Xenopus अंडा निकालने पिघलना. निकालने के सभी पिघल गया है बस से पहले बर्फ पर ट्यूब रखें.
    3. Xenopus अंडा निकालने के एक विभाज्य (200 μl) में ऊर्जा उत्थान मिक्स (20x ईआर) का 10 μl जोड़ें. जल्दी ट्यूब और नाड़ी vortexing flicking द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. स्पिन पल्स और तुरंत बर्फ पर जगह है.
    4. (वैकल्पिक) β-catenin का कारोबार थोड़ा ubiquitin (1.25 मिलीग्राम / एमएल अंतिम) के अलावा द्वारा Xenopus अंडा निकालने में बढ़ाया जा सकता है. Cycloheximide (अंतिम 0.1 मिलीग्राम / एमएल) भी अंतर्जात टेप के अनुवाद को कम करने के लिए जोड़ा जा सकता है.
    5. बर्फ पर पूर्व ठंडा microfuge ट्यूबों में गिरावट परख के लिए उचित मात्रा में विभाज्य. Radiolabeled β-catenin गिरावट assays के लिए, 2-5 मिलीलीटर हर समय बिंदु के लिए निकालने वापस ले लें. </ ली>

Xenopus अंडा निकालने में 3. Radiolabeled β-catenin गिरावट परख

नोट: जब तक अन्यथा इंगित सभी कदम बर्फ पर किया जाना चाहिए.

  1. Radiolabeled β-catenin तैयारी
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर इन विट्रो संश्लेषित [35 एस] methionine-radiolabeled प्रोटीन में हौसले से तैयार करें. नोट: उत्पन्न 35 (87 दिन आधा जीवन) एस लेबल प्रोटीन को आसानी से और कुशलता से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इन विट्रो मिलकर प्रतिलेखन अनुवाद किट का उपयोग कर उत्पादन कर रहे हैं. यह अनुवादित प्रोटीन पर्याप्त प्रोटीन कारोबार में परिवर्तन आसानी से देखे जा सकते हैं कि इस तरह के लेबल है कि महत्वपूर्ण है.
    2. सफल radiolabeling पुष्टि करने के लिए, अनुवाद प्रोटीन के 0.5 μl साथ SDS-PAGE/autoradiography प्रदर्शन करते हैं. ImageJ, ImageQuant, या एक वैकल्पिक मात्रात्मक सॉफ्टवेयर कार्यक्रम का उपयोग radiolabeled β-catenin बैंड की तीव्रता योंहूँ. नोट: radiolabeled β-catenin प्रोटीन बैंड कुछ घंटे (4-6 घंटे) के भीतर फिल्म पर स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए.
    3. भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में radiolabeled प्रोटीन तस्वीर फ्रीज उपयोग करें जब तक. नोट: लंबे समय तक भंडारण (> 2 महीने) और कई फ्रीज / पिघलना (2 से अधिक) गंभीर रूप से Xenopus अंडा निकालने में मजबूती के साथ नीचा करने के लिए radiolabeled β-catenin की क्षमता को प्रभावित कर सकता. आमतौर पर, radiolabeled प्रोटीन की स्थिरता -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के 1 महीने के बाद काफी गिरावट आती है; इस प्रकार, अपेक्षाकृत नया तैयार radiolabeled β-catenin इन गिरावट assays में सबसे अच्छा परिणाम देता है.
  2. Β-catenin गिरावट परख प्रदर्शन
    1. इन विट्रो अनुवादित β-catenin की 1-3 μl (radiolabeled बैंड संकेत की ताकत पर निर्भर करता है) में जोड़ें (और अन्य प्रोटीन, परीक्षण किया जा रहा है कि आदि छोटे अणुओं,) बर्फ पर Xenopus प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 μl में. Quickl से अच्छी तरह मिक्सट्यूब और vortexing की एक छोटी नाड़ी flicking Y; Xenopus अंडा निकालने बहुत चिपचिपा है के रूप में यह एक महत्वपूर्ण कदम है, और अधूरा मिश्रण परिणामों की स्थिरता को प्रभावित करेगा. बर्फ पर पल्स स्पिन और जगह.
    2. आर टी के लिए ट्यूब स्थानांतरण द्वारा β-catenin गिरावट रिएक्शन शुरू.
    3. निर्दिष्ट समय बिंदु पर, नमूना के 1-5 मिलीलीटर हटाने और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए एसडीएस नमूना बफर (5x मात्रा) के साथ तुरंत मिश्रण. सुनिश्चित करने के लिए गिरावट की प्रतिक्रिया पूरी तरह से सख्ती झटका ट्यूब, कई बार और भंवर समाप्त होता है.
    4. SDS-PAGE/autoradiography प्रदर्शन करना. हर समय बिंदु / लेन के लिए निकालने के 1 मिलीलीटर समकक्ष (~ प्रोटीन की 50 मिलीग्राम) चलाएँ. Xenopus अंडा निकालने में β-catenin की गिरावट radiolabeled β-catenin बैंड चित्रा 2 की तीव्रता में समय पर निर्भर कमी इसका सबूत है की जानी चाहिए. ImageJ, ImageQuant, या अन्य पसंदीदा इमेजिंग सॉफ्टवेयर यदि आवश्यक उपयोग कर परिणाम यों.
    5. (OPTIonal) पृष्ठभूमि रेडियोधर्मिता कम होती है और छवि की गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए पूर्व सुखाने के लिए आसुत जल) में समाधान (10% एसिटिक एसिड और 30% मेथनॉल फिक्सिंग में एसडीएस polyacrylamide जेल भिगोएँ.

Xenopus अंडे निकालें में 4. Β-catenin-luciferase गिरावट परख

जब तक अन्यथा इंगित बर्फ पर सभी चरणों को पूरा करें.

  1. Β-catenin-luciferase तैयारी
    1. पूरा एमिनो एसिड मिश्रण के साथ प्रतिलेखन अनुवाद युग्मित प्रणाली का उपयोग गैर radiolabeled, luciferase टैग β-catenin synthesize.
    2. प्रतिक्रिया की 0.5-1 μl से luciferase गतिविधि को मापने के द्वारा luciferase टैग β-catenin के उत्पादन की पुष्टि करें. एक untranslated प्रतिक्रिया मिश्रण से luminescence मापने के द्वारा पृष्ठभूमि luminescence का आकलन करें. नोट: एकाधिक वाणिज्यिक किट luciferase गतिविधि को मापने के लिए उपलब्ध हैं. लंबे समय रहते luminescence, हालांकि, गिरावट Assa के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करता हैवाई.
  2. Β-catenin-luciferase गिरावट परख प्रदर्शन
    1. पिघलना और 2.2 में के रूप में Xenopus अंडा निकालने तैयार करते हैं.
    2. बर्फ पर (2.2) से तैयार Xenopus प्रतिक्रिया मिश्रण में इन विट्रो अनुवादित β-catenin-luciferase संलयन (4.1) से जोड़ें और 3.2.1 में के रूप में अच्छी तरह से मिश्रण. नोट: निकालने के लिए जोड़ा है कि β-catenin luciferase की गतिविधि आमतौर के बीच 20 है - 50,000 रिश्तेदार luminescence इकाइयों (4.1.2 से प्राप्त माप के आधार पर) निकालने के (RLU) / एमएल. शुरू संकेत लगभग 100,000 RLU (इन विट्रो अनुवाद β-catenin-luciferase संलयन की 2-5 मिलीलीटर) होना चाहिए.
    3. आरटी को निकालने शिफ्ट गिरावट रिएक्शन शुरू.
    4. सूचित समय पर प्रतिक्रिया के एक विभाज्य निकालें और तस्वीर फ्रीज तरल नाइट्रोजन में. नोट: तीन प्रतियों के नमूने आमतौर पर हर समय बिंदु के विश्लेषण के लिए निकाल रहे हैं. फ्रोजन निकालने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है untआईएल वे विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार हैं.
    5. पिघलना नमूने बर्फ, बर्फ पर मानक सफेद 96 अच्छी तरह प्लेटें को हस्तांतरण के नमूने, और luciferase गतिविधि के लिए प्रक्रिया.

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Representative Results

Xenopus अंडा निकालने में β-catenin गिरावट का एक योजनाबद्ध चित्रा 2A में दिखाया गया है. 35 एस लेबल β-catenin Xenopus अंडा निकालने में incubated था, aliquots (1 मिलीलीटर बराबर निकालने) उचित समय पर हटा दिया गया है, और नमूने के अधीन थे एसडीएस पृष्ठ autoradiography द्वारा पीछा किया. Wnt मार्ग के घटकों द्वारा β-catenin गिरावट ubiquitin-एंटीबॉडी प्रणाली 2 द्वारा मध्यस्थता है, और Xenopus निकालने में [35 एस]-radiolabeled β-catenin की गिरावट एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला MG132 चित्रा 2 बी के अलावा द्वारा हिचकते हैं. Wnt मार्ग के घटकों द्वारा β-catenin की गिरावट GSK3 34 से इसकी phosphorylation पर निर्भर है. Xeno में स्थिर है 1) β-catenin (एसए) उत्परिवर्ती (GSK3 phosphorylation साइटों alanines उत्परिवर्तित): GSK3 निर्भर गिरावट आसानी Xenopus अंडे निकालने का उपयोग कई मायनों में प्रदर्शन किया जा सकता हैजंगली प्रकार β-catenin प्रोटीन चित्रा 2B के लिए मवाद अंडा निकालने रिश्तेदार. 2) GSK3 (LiCl) के छोटे अणु inhibitors इसी β-catenin (चित्रा -2) की गिरावट को रोकना. 3) अंत में, Xenopus अंडा निकालने से GSK3 की कमी β-catenin की गिरावट रोकता है; गिरावट एक्सोजेनस GSK3 के अलावा द्वारा बचाया जा सकता है 2 डी ई रु.

radiolabeled β-catenin गिरावट परख गिरावट की अपनी विधा (apoptotic दरार बनाम यानी ubiquitin की मध्यस्थता गिरावट) की एक विशेष रूप से जानकारीपूर्ण दृश्य मूल्यांकन प्रदान करता है. Autoradiography, हालांकि, श्रम गहन, और, सबसे भाग के लिए, मार्ग के उच्च throughput विश्लेषण के लिए सीमित है (जैसे, Wnt मार्ग के छोटे अणु modulators के लिए स्क्रीनिंग) है. β-catenin-luciferase गिरावट परख अधिक आसानी से और जल्दी से quantifiable उत्सर्जित luminescence की राशि के रूप में है सुबह से सीधे आनुपातिक हैβ-catenin-luciferase प्रोटीन की ount. यह सुविधा उच्च throughput assays के लिए luciferase परख सरल और आसानी से अनुकूलनीय बनाता है.

यह luciferase संलयन nonfusion प्रोटीन के रूप में समान गुण है कि निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस अनुभव से आंतरिक एन टर्मिनस, सी टर्मिनस, या करने के लिए luciferase प्रोटीन fusing द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. Β-catenin के एन या सी टर्मिनस तक luciferase का फ्यूजन Xenopus अंडा निकालने 2, 19, 20 में स्तनधारी कोशिकाओं या अपने कारोबार दर incultured Wnt लक्ष्य जीन को सक्रिय करने के लिए अपनी क्षमता को प्रभावित नहीं करता.

Xenopus अंडा निकालने में एक प्रतिनिधि β-catenin-luciferase गिरावट परख β-catenin-luciferase की गिरावट संलयन की radiolabeled प्रोटीन और luciferase गतिविधि की SDS-PAGE/autoradiography द्वारा मूल्यांकन किया गया था, जिसमें चित्रा 3 में दिखाया गया है. degradatio की दरβ-catenin-luciferase के एन untagged β-catenin प्रोटीन के समान है. β-catenin-luciferase संलयन के लिए गिरावट का विनियमन β-catenin-luciferase कारोबार के निषेध के परिणामस्वरूप LiCl के अलावा या GSK3 की कमी के रूप में nonfusion प्रोटीन को अनिवार्य रूप से समान है. आंकड़े 3 बी सी में दिखाया गया है, β-catenin-luciferase प्रोटीन का रेडियोधर्मी संकेत में बदलाव समय के साथ luciferase enzymatic गतिविधि में परिवर्तन समानताएं. Β-catenin-luciferase (इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली से उत्पन्न विशेष रूप से संलयन प्रोटीन) का उपयोग करने से उठता है कि एक मुद्दा आंतरिक translational शुरू साइटों या समय से पहले translational समाप्ति चित्रा 3 डी के उपयोग के कारण पृष्ठभूमि luciferase संकेत है. यह समस्या कभी कभी IVT प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया डीएनए एकाग्रता के अनुकूलन के द्वारा दूर किया जा सकता है. हम विविध जब हम फिर भी, पृष्ठभूमि luciferase गतिविधि में कमी का पालन नहीं कियाहमारे विशेष β-catenin-luciferase निर्माण के लिए प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता. यह हम आगे आंतरिक translational शुरू साइटों और / या β-catenin-luciferase संलयन प्रोटीन की समयपूर्व translational समाप्ति कम करने के लिए mutagenesis के माध्यम संलयन प्रोटीन reengineer करने की आवश्यकता होगी संभावना है. Luciferase प्रोटीन Xenopus अंडा निकालने चित्रा 3 ए में गिरावट प्रतिक्रिया के समय के पाठ्यक्रम पर काफी स्थिर है क्योंकि पूर्ण लंबाई β-catenin संलयन से छोटा luciferase प्रोटीन के अनुपात में जाना जाता है, हालांकि, इस पृष्ठभूमि के संकेत बस घटाया जा सकता है .

Luciferase परख की एक ताकत β-catenin गिरावट के modulators के लिए उच्च throughput प्रदर्शन के प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है एक बहु प्रारूप करने के लिए पैमाने पर करने की क्षमता है. चित्रा 4 में, एक प्रतिनिधि बिसात विश्लेषण रोकता है जो β-catenin गिरावट के एक अवरोध, MG132, का उपयोग कर दिखाया गया है एंटीबॉडी. बिसात प्रयोग के परिणाम परख एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और उच्च throughput प्रदर्शन के लिए इसकी उपयुक्तता दर्शाता है कि इंगित करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. केंद्रित Xenopus अंडा निकालने की तैयारी की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. अंडे एचसीजी इंजेक्शन Xenopus से एकत्र कर रहे हैं एक कम गति (400 XG) स्पिन के साथ जमा हुआ, और कुचल दिया और एक मध्यम गति (15,000 XG साथ अलग महिलाओं, laevis ) स्पिन. , पृष्ठीय लिम्फ थैली में subcutaneously इंजेक्षन ध्यान से बुरा अंडे को हटाने, और पाठ में नोट के रूप में ध्यान से कम गुणवत्ता वाले गहरे रंग निकालने से उच्च गुणवत्ता वाले cytoplasmic निकालने अलग करने के लिए ध्यान रखना.

igure 2 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>" src = के लिए "5in
Xenopus अंडा निकालने में incubated जब एक IVT प्रतिक्रिया द्वारा तैयार चित्रा 2. Β-catenin Xenopus अंडा निकाल सकते हैं. ए) में गिरावट परख. बी का एक योजनाबद्ध incubated जब मजबूती के साथ degrades) [35 एस] लेबल β-catenin मजबूती के साथ degrades. Xenopus अंडा निकालने के लिए MG132 (200 माइक्रोन) के अलावा β-catenin गिरावट रोकता. GSK3 β-catenin भीतर phosphosites (β-catenin एसए) या ​​LiCl (25 मिमी) सी) के अलावा के alanines उत्परिवर्तन β-catenin गिरावट. डी) axin (अमीनो एसिड 506-560 के GSK3 बाध्यकारी साइट) कुशलतापूर्वक depletes रोकता GSK3 Xenopus अंडा निकालने से. ई) GSK3 समाप्त Xenopus अंडा निकालने β-catenin गिरावट रोकता है और ओ अलावा द्वारा बचाया जा सकता हैच पुनः संयोजक GSK3 (0.1 मिलीग्राम / एमएल). LiCl (25 मिमी) ब्लॉक GSK3 समाप्त निकालने में β-catenin गिरावट के बचाव के लिए पुनः संयोजक GSK3 की क्षमता के अलावा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
Xenopus अंडा निकालने में incubated जब चित्रा 3. Luciferase टैग β-catenin degrades. ए) radiolabeled β-catenin-luciferase untagged β-catenin प्रोटीन के समान दर से degrades. जंगली प्रकार के प्रोटीन के साथ के रूप में, LiCl (25 मिमी) के अलावा β-catenin-luciferase गिरावट रोकता. अकेले luciferase काफ़ी Xenopus अंडा निकालने पर बारी नहीं है. Β-catenin-लूसिफ़ेर के luciferase गतिविधि में परिवर्तन. डी luciferase गतिविधि को मापने के द्वारा मूल्यांकन के रूप में एएसई फ्यूजन अपने प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन समानांतर. बी) LiCl (25 मिमी) के अलावा या GSK3 सी की कमी) में इन विट्रो के लिए) immunoblotting β-catenin-luciferase कारोबार रोकता अनुवादित β-catenin- (एक विरोधी luciferase एंटीबॉडी का उपयोग) luciferase संभावना radiolabeled गिरावट परख की तुलना में जब उच्च पृष्ठभूमि के लिए योगदान देता है कि कुछ preps में मुफ्त luciferase प्रोटीन की काफी मात्रा का पता चला. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
Xenopus निकालने में β-catenin-luciferase की चित्रा 4. नियमित गिरावट के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैएक उच्च throughput प्रारूप. β-catenin गिरावट के एक अवरोध के रूप में MG132 (450 माइक्रोन) का उपयोग β-catenin-luciferase के लिए एक प्रतिनिधि बिसात विश्लेषण. छायांकित कॉलम MG132 इलाज कुओं से संकेत मिलता है, और लाइटर स्तंभ (DMSO) का इलाज कुओं वाहन का प्रतिनिधित्व करते हैं. उच्च throughput स्क्रीनिंग में संभावित उपयोग के लिए एक स्वीकार्य परख का संकेत 0.3 के स्कोर में और मात्रा का ठहराव Z कारक गणना परिणाम.

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Discussion

Xenopus अंडा निकालने β-catenin कारोबार की जांच के लिए एक मजबूत जैव रासायनिक प्रणाली है. Xenopus अंडा निकालने में β-catenin की एकाग्रता ~ 25 एनएम 2 है. इष्टतम शर्तों के तहत, अंडा निकालने 50-100 एनएम / घंटा की दर से β-catenin अपमानजनक करने में सक्षम है और 200 एनएम 24 पर आधा अधिक से अधिक है. Xenopus अंडे निकालने का उपयोग β-catenin गिरावट के सफल पुनर्गठन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. इन उच्च गुणवत्ता Xenopus अंडा निकालने और अंडे निकालने तैयार किया जाता है जिस तरह से पैदा 1) शामिल हैं, 2) गुणवत्ता radiolabeled β-catenin और β-catenin-luciferase प्रोटीन, 3) β-catenin गिरावट समर्थन करने के लिए प्रतिक्रिया की स्थिति के अनुकूलन, और 4 सृजन प्रतिक्रिया समय अंक का) उचित प्रसंस्करण.

Β-catenin मजबूती के साथ अपमानित किया जाता है, जिसमें Xenopus अंडा निकालने के एक उच्च गुणवत्ता तैयारी वीं की गुणवत्ता दोनों पर निर्भर करता हैई अंडे और अंडे के रूप में अच्छी तरह से निकालने के बाद अंतिम निकालने प्राप्त करने के लिए centrifuged है कि कैसे पिछले पेराई कदम को नियंत्रित किया जाता है कैसे. प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, यह गरीब गुणवत्ता अंडे (, रेशेदार विचित्र, या सफेद कश) के दौरान हटा रहे हैं, (अंधेरे पशु गोलार्द्ध और प्रकाश वनस्पति गोलार्द्ध बीच इसके विपरीत इसका सबूत है) केवल उच्च गुणवत्ता वाले अंडे का इस्तेमाल किया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है अंडे प्रक्रिया के दौरान एक शांत तापमान (16 डिग्री सेल्सियस) पर बनाए रखा, और प्रक्रिया के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाता है कि कर रहे हैं कि प्रक्रिया,. इसे निकालने की मात्रा के लिए गुणवत्ता का त्याग करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. इसके अलावा, जैसा कि पहले उल्लेख, गरीब गुणवत्ता अंडे (> 10%) देता है एक मेंढक से अंडे पूरी तरह से खारिज किया जाना चाहिए.

ऊपर वर्णित निकालने अर्धसूत्रीविभाजन II-गिरफ्तार सीएसएफ निकालने 11 के एक संशोधन है. β-catenin गिरावट (मध्यवर्ती गति निकालने) रचनाकार के लिए Xenopus अंडा निकालने की तैयारीनेताओं कम गति या उच्च गति हैं जो कोशिका चक्र 30-32 के अध्ययन के लिए तैयार क्लासिक अर्क, से 35 निकालता है. अन्य प्रोटीन के इष्टतम गिरावट के लिए Xenopus अंडा निकालने आदत डाल centrifugation गति और spins की संख्या में फेरबदल की आवश्यकता हो सकती. कम गति निकालने बरकरार organelles और अन्य बड़े सेलुलर घटक शामिल हैं. इस प्रकार, उच्च गति spins निकालने की संरचना में परिवर्तन और संभवतः ब्याज की प्रोटीन की गिरावट को प्रभावित करेगा कि निरोधात्मक और / या आवश्यक घटकों को दूर करेगा. यहाँ बताया मध्यवर्ती गति निकालने की तैयारी Wnt मार्ग के घटकों द्वारा β-catenin की गिरावट के लिए अनुकूलित है. (यह एक और Wnt घटक, axin की गिरावट पर कम से कम प्रभाव पड़ता है, हालांकि) 4x से अधिक निकालने स्पिनिंग काफी β-catenin नीचा करने के लिए निकालने की क्षमता कम कर सकते हैं. β-catenin कम गति स्पिन निकालने में कस्पासे की मध्यस्थता proteolysis के लिए अतिसंवेदनशील है और करता notic नहींeably उच्च गति स्पिन निकालने में नीचा दिखाना. इस प्रकार, यह अलग गति के अर्क अन्य संकेत दे रास्ते के घटकों की गिरावट के इष्टतम किया जाएगा संभावना है.

35 एस β-catenin और β-catenin-luciferase की पीढ़ी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के एक नंबर का उपयोग किया जा सकता है. प्रतिलेखन अनुवाद मिलकर सिस्टम का उपयोग प्रोटीन के उत्पादन प्लाज्मिड की गुणवत्ता पर निर्भर है: plasmids के अत्यधिक शुद्ध Midi-तैयारी बेहतर काम करते हैं और डीएनए मिनी तैयारी की तुलना में अधिक विश्वसनीय हैं. Β-catenin radiolabeling के लिए, हौसले [35 एस] methionine या Translabel ([35 एस] methionine प्लस [35 एस] सिस्टीन) पसंद किया जाता है प्राप्त की. कि methionine और सिस्टीन दोनों लंबे समय तक भंडारण जिससे इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद युग्मित प्रतिक्रिया में β-catenin में उनके शामिल कम से oxidize की प्रवृत्ति है ध्यान दें. क्योंकि लंबे समय तक भंडारण और दोहराया फ्रीज विगलनचक्र गिरावट बाधित कर सकते हैं, radiolabeled β-catenin की छोटी मात्रा में एक समय पर तैयार है और जल्द ही बाद किया जाता है.

अनुवादित प्रोटीन और प्रोटीन में methionines की संख्या की राशि radiolabeled सिग्नल की शक्ति का निर्धारण. Β-catenin के लिए, गिरावट assays के लिए मजबूत रेडियोधर्मी संकेत प्राप्त करने में कोई समस्या नहीं होनी चाहिए. कुछ methionines और / या कि अच्छी तरह से अनुवाद नहीं है, एक [35 एस] methionine और साथ प्रोटीन के लिए [35 एस] सिस्टीन मिश्रण के बजाय [35 एस] methionine के लिए प्रयोग किया जाता है और / या एकाधिक होता है कि एक मिलान टैग (Myc) जोड़ा जा सकता है methionines. उचित फेज प्रमोटरों (T7, T3, और SP6) युक्त विभिन्न अभिव्यक्ति plasmids के साथ सफलता में इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रियाओं के लिए प्राप्त किया जा सकता है, pCS2 आधारित प्लाज्मिड आम तौर पर सबसे अच्छा परिणाम देता है. इसके अलावा, अनुवाद प्रोटीन का संकेत कभी कभी नाटकीय रूप से अंतर्जात 5 को हटाने के द्वारा बढ़ाया जा सकता है'UTR. अंत में, बड़े पैमाने पर प्रयोग (जैसे, उच्च throughput स्क्रीनिंग) के लिए, पुनः संयोजक β-catenin-luciferase की एक बड़ी मात्रा में आवश्यक हो सकता है. Sf9 / baculovirus प्रणाली से β-catenin-luciferase Xenopus निकालने और भ्रूण 2 में जंगली प्रकार β-catenin के रूप में समान कैनेटीक्स साथ degrades. वैकल्पिक रूप से, इन विट्रो अभिव्यक्ति प्रणाली में एक उच्च उपज (जैसे गेहूं के बीज पर आधारित) सफलतापूर्वक उच्च throughput स्क्रीनिंग 19, 20 के लिए इस्तेमाल किया गया है.

मज़बूती से निकालने प्रणाली में β-catenin की गिरावट को मापने के लिए आदेश में, यह radiolabeled β-catenin या luciferase β-catenin संलयन से या तो प्रारंभिक संकेत पर्याप्त रूप से मजबूत है कि महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, गिरावट परख के आकार के प्रयोगकर्ता द्वारा अनुकूलन के कुछ राशि, समय अंक की संख्या की जरूरत है, और इन विट्रो अनुवाद प्रतिक्रिया वाई की दक्षताआवश्यक हो जाएगा. गिरावट प्रतिक्रिया कोडांतरण है, एक मजबूत गिरावट प्राप्त करने का मौका बढ़ाने के लिए ले जा सकते हैं कई कदम उठाए हैं. सबसे पहले, सभी अभिकर्मकों जल्दी thawed किया जाना चाहिए और पूर्व उनकी पूरी पिघलना करने के लिए बर्फ पर रखा. Β-catenin की गिरावट अत्यधिक निर्भर ऊर्जा है, यह ईआर अपेक्षाकृत ताजा है कि महत्वपूर्ण है. दूसरे, Xenopus अंडा निकालने चिपचिपा है, और यह प्रतिक्रिया अच्छी तरह से radiolabeled β-catenin/β-catenin-luciferase संलयन के बाद इसके अलावा, ईआर, आदि प्रोटीन, छोटे अणु modulators, तीसरा, प्रतिक्रिया पूर्व incubating मिलाया जाता है कि महत्वपूर्ण है छोटे अणु modulators के प्रभाव का परीक्षण जब बर्फ अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देता है पर 20-30 मिनट के लिए मिश्रण.

Xenopus अंडा निकालने से प्रोटीन ख़ाली क्षमता प्रोटीन समारोह और उनकी एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है. एक उदाहरण के रूप में, हम दिखाना है कि Xe से GSK3 घटβ-catenin कारोबार में GSK3 की महत्वपूर्ण भूमिका का उल्लेख करते nopus अंडा निकालने ब्लॉक β-catenin की गिरावट,. विभिन्न कमी की स्थिति अनुभव से अलग प्रोटीन के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी. उदाहरण के लिए, प्रचुर मात्रा में प्रोटीन पूर्ण कमी को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी या समानता ligand मोतियों की राशि में वृद्धि की आवश्यकता होगी. एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु निकालने कमजोर पड़ने कम करने के लिए 1/10 निकालने की मात्रा में पैक मोतियों का इस्तेमाल होता है. इस्तेमाल किया लक्ष्य प्रोटीन, मोती के प्रकार (जैसे, sepharose, agarose, या चुंबकीय) के लिए एंटीबॉडी / समानता ligand के बंधन की ताकत के अलावा Xenopus अंडा निकालने 36 से प्रोटीन की कमी के दक्षता प्रभाव हो सकता है. अंत में, यह (आमतौर पर immunoblotting द्वारा) कमी की हद तक का विश्लेषण करने के लिए आदर्श होगा. Β-catenin प्रतिक्रिया के पूरा होने पर, नमूने संसाधित कर रहे हैं जिस तरह से बहुत प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. की एकाग्रतावर्णित ढंग से तैयार Xenopus अंडा निकालने preps 52.41 मिलीग्राम / 5.40 मिलीग्राम / एमएल ± मिलीलीटर है, और यह एसडीएस पृष्ठ जेल की क्षमता अधिभार के लिए महत्वपूर्ण नहीं है; इस luciferase-β-catenin परख के साथ एक समस्या नहीं है. इस प्रकार, हर बार बिंदु के लिए, निकालने के बराबर नहीं 1 से अधिक मिलीग्राम एक एसडीएस पृष्ठ जेल की प्रत्येक गली में लोड किया जाना चाहिए. आगे परिणामों की गुणवत्ता को बढ़ाने के लिए, जेल नियतन कदम (वैकल्पिक) पृष्ठभूमि रेडियोधर्मिता कम होती है और संकेत करने वाली शोर अनुपात में वृद्धि होगी. Luciferase परख के लिए, Xenopus अंडा निकालने में 100,000 RLU की एक शुरुआती संकेत से कमी ईमानदारी β-catenin-luciferase संलयन प्रोटीन के प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन को दर्शाता है.

Xenopus अंडा निकालने प्रणाली β-catenin गिरावट के नियमन का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है. निकालने प्रणाली कमी और reconstitu के माध्यम से व्यक्ति प्रोटीन की एकाग्रता की सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है tion. समय के साथ β-catenin कारोबार के कैनेटीक्स पर उनके प्रभाव पर नजर रखने की क्षमता एक बेहतर Wnt संकेत पारगमन में इस महत्वपूर्ण कदम के जैव रासायनिक तंत्र को समझने के लिए अनुमति देता है. ऐसे जोड़तोड़ Wnt मार्ग के घटकों के बीच जटिल आणविक बातचीत में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान की है और Wnt मार्ग 24 के पहले गणितीय मॉडल के विकास के लिए महत्वपूर्ण थे. एक चेतावनी Xenopus अंडा निकालने और स्तनधारी सेल lysates में Wnt मार्ग घटकों की सांद्रता संभवतः Wnt मार्ग वयस्क स्थिति 37 बनाम embryogenesis दौरान नियंत्रित किया जाता है रास्ते में मतभेद को दर्शाती है, अलग पाया गया है. Xenopus अंडे निकालने का उपयोग रेडियोधर्मी और enzymatic दोनों, luciferase आधारित assays प्रदर्शन करने की क्षमता β-catenin गिरावट के जैव रासायनिक विनियमन के अध्ययन के लिए शक्तिशाली पूरक गुणात्मक और गुणात्मक औजार प्रदान करता है जोड़ा.

β-catenin के कारोबार की निगरानी के अलावा टी ">, नकारात्मक Wnt नियामक, axin की गिरावट या तो luciferase के लिए एक radiolabeled प्रोटीन या संलयन के रूप में Xenopus अंडा निकालने में नजर रखी जा सकती है. luciferase का एक संस्करण का उपयोग करना, Renilla, इनकार axin, पहले से एक साथ दो Wnt मार्ग प्रोटीन, β-catenin और axin 19, 20 की modulators लिए स्क्रीन के लिए एक उच्च throughput प्रारूप में luciferase गिरावट परख के लिए अनुकूलित किया गया था. यह जैव रासायनिक स्क्रीन वृद्धि की है कि एफडीए को मंजूरी दी दवा, pyrvinium पहचान और , क्रमशः β-catenin और axin की गिरावट की दर में कमी आई Xenopus अंडा निकालने 19 में. Pyrvinium बाद में विहित Wnt का एक छोटा सा अणु अवरोध के रूप में सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं में और विभिन्न मॉडल जीवों (जैसे, Xenopus और एलिगेंस) में मान्य किया गया था मार्ग. सारांश में, Xenopus अंडा निकालने प्रणाली एक बहुमुखी जैव रासायनिक सिस्टम था हैटी WNT सिगनल की व्यवस्था का अध्ययन करने के साथ ही Wnt मार्ग के छोटे अणु modulators की पहचान के लिए करने के तरीके के एक भीड़ में शोषण किया जा सकता है. यहाँ बताया जैव रासायनिक विधि प्रोटीन गिरावट एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, जिसमें अन्य संकेत दे रास्ते के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए लॉरी ली धन्यवाद. TWC एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन predoctoral फैलोशिप (12PRE6590007) द्वारा समर्थित है. MRB एक राष्ट्रीय कैंसर संस्थान प्रशिक्षण अनुदान (T32 CA119925) द्वारा समर्थित है. SSH राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01DK078640) द्वारा समर्थित है. ईएल राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01GM081635 और R01GM103926) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) ProSpec hor-272-A Reconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropin Sigma CG10-10VL
Potassium chloride Fisher BP366-1
Sodium chloride Research Products International S23020-5000.0
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Calcium chloride Acros Organics AC42352-5000
HEPES Fisher BP310-1
Cysteine Acros Organics AC17360-1000
Leupeptin Sigma L2884-10MG
Aprotinin Sigma A1153-10MG
Pepstatin Sigma P4265-5MG
Cytochalasin B Sigma C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip Becton Dickinson 309657
27 G needle Becton Dickinson 305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed Corning 3605
Steady-Glo luciferase assay system Promega E2520 Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system Promega L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system Promega L3260 Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35] Perkin Elmer NEG772007MC
Creatine phosphate Sigma 27920-5G
ATP Sigma A2383-5G
Creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system Promega E2920 Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes Fisher Scientific 0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit Ambion AM1340
Anti-firefly luciferase antibody Abcam ab16466
Anti-GSK3 antibody BD Transduction Laboratories 610201
FLUOStar Optima BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific
16 °C Incubator Percival Scientific

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References

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 88, प्रोटीन गिरावट radiolabel luciferase autoradiography उच्च throughput प्रदर्शन
Β-catenin गिरावट में के पुनर्गठन<em&gt; Xenopus</em&gt; अंडा निकालें
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Chen, T. W., Broadus, M. R.,… More

Chen, T. W., Broadus, M. R., Huppert, S. S., Lee, E. Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. J. Vis. Exp. (88), e51425, doi:10.3791/51425 (2014).

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