Summary
Un metodo è descritto per l'analisi degradazione delle proteine usando radioattivo e proteine luciferasi-fusione in estratto uovo Xenopus e il suo adattamento per lo screening high-throughput per piccoli modulatori molecola di degradazione delle proteine.
Abstract
Xenopus laevis estratto uovo è un ben caratterizzato, robusto sistema per studiare la biochimica di diversi processi cellulari. Estratto uovo Xenopus è stato usato per studiare il ricambio proteico in molti contesti cellulari, tra cui il ciclo cellulare e trasduzione del segnale percorsi 1-3. Qui, è descritto un metodo per isolare estratto uovo Xenopus che è stato ottimizzato per promuovere la degradazione della componente pathway Wnt critico, β-catenina. Due diversi metodi sono descritti per valutare β-catenina degradazione delle proteine in estratti di uova di Xenopus. Un metodo è visivamente informativo ([35 S] radiomarcato proteine), mentre l'altro è più facilmente scalato per saggi high-throughput (lucciola proteine di fusione luciferasi-tagged). Le tecniche descritte possono essere utilizzate per, ma non sono limitati a, valutare β-catenina turnover proteico e identificare i componenti molecolari che contribuiscono al fatturato. Inoltre, la poslità di purificare grandi volumi di omogenea estratto uovo Xenopus combinata con la lettura quantitativa e facile di proteine luciferasi-tag permette questo sistema di essere facilmente adattato per screening ad alto rendimento per modulatori di degradazione β-catenina.
Introduction
Estratto uovo Xenopus laevis è stato ampiamente utilizzato per studiare molti cellulari processi biologici, tra cui la dinamica del citoscheletro, l'assemblaggio e l'importazione nucleare, l'apoptosi, il metabolismo ubiquitina, progressione del ciclo cellulare, trasduzione del segnale, e proteine fatturato 1-17. Il sistema estratto uovo Xenopus è riconducibile alla analisi biochimica di una legione di processi cellulari perché estratto uovo rappresenta sostanzialmente citoplasma non diluito che contiene tutti i componenti essenziali citoplasmatici necessari per eseguire questi processi e consentire indagine. Grandi quantità di estratto di uova possono essere preparati in una sola volta per le manipolazioni biochimiche che richiedono grandi quantità di materiale (ad esempio, purificazione di proteine o high-throughput screening) 18-20. Un altro vantaggio è che la concentrazione di proteine specifiche in estratto uovo Xenopus può essere regolata con precisione mediante aggiunta di proteine e / o immunodeplezione di endog ricombinanteproteine enous in contrasto trasfezione di DNA plasmidico in cui l'espressione della proteina di interesse è difficile da controllare. Inoltre, la mancanza di proteine ricombinanti disponibili può essere superato con l'aggiunta di trascritti codificanti la proteina di interesse, sfruttando elevata capacità estratto uovo Xenopus preparata per tradurre mRNA esogenamente aggiunti.
La regolazione della degradazione delle proteine è fondamentale per il controllo di molte vie cellulari ed elabora 21. Estratto uovo di Xenopus è stato ampiamente utilizzato per studiare la degradazione delle proteine in quanto il sistema permette diversi modi per monitorare il turnover proteico, senza influenze confondenti di trascrizione e traduzione. La via di segnalazione Wnt è una via di segnalazione altamente conservato che svolge un ruolo critico nello sviluppo e nella malattia. Il fatturato di β-catenina, il principale effettore della via di Wnt, è altamente regolamentato, e un aumento steady-state level di β-catenina è critica per l'attivazione di Wnt geni bersaglio. L'importanza di degradazione β-catenina è evidenziata dal fatto che mutazioni nella via di Wnt che inibiscono la degradazione β-catenina trovare in ~ 90% di tutti i casi sporadici di tumore colorettale 22. β-catenina degradazione di componenti della via di Wnt può essere fedelmente riassunta in estratto uovo Xenopus per studiare il meccanismo del fatturato nonché per identificare nuovi modulatori piccole molecola della sua degradazione 2, 19, 20, 23-29.
Metodi per la preparazione di estratto uovo Xenopus per studiare il ciclo cellulare sono stati descritti in precedenti pubblicazioni JoVE 30-32. Il protocollo attuale descrive una modifica di questi metodi ed è ottimizzato per la degradazione di [35 S]-radiomarcato β-catenina e luciferasi-tag β-catenina inEstratto uovo di Xenopus. Il test di degradazione radioattivo permette la visualizzazione diretta dei livelli di proteine tramite autoradiografia. [35 S] metionina è incorporata nella proteina di interesse utilizzando una reazione di traduzione in vitro che possono poi essere aggiunto direttamente ad una reazione di degradazione. Inoltre, la proteina radiomarcato dosaggio fatturato non richiede un anticorpo contro la proteina di interesse o un epitopo, che può influenzare la stabilità della proteina. Poiché anche piccoli cambiamenti nei livelli di proteine, che si riflette in variazioni dell'intensità della banda di proteina radiomarcato, sono facilmente visualizzati mediante autoradiografia, la [35 S]-radiomarcato saggio degradazione rappresenta un metodo molto utile per la visualizzazione di proteine fatturato 2.
Fusione di β-catenina a luciferasi di lucciola (di seguito denominato semplicemente "luciferasi") consente di misure quantitative precise e facili dei livelli di proteine, al fine diper determinare le proprietà cinetiche di β-catenina fatturato 19, 20. Uno dei principali vantaggi del saggio luciferasi è che fornisce un sistema quantitativo forte che è facilmente calcificato. Il protocollo che segue fornisce metodi semplici per saggiare la degradazione β-catenina e un metodo affidabile, efficiente ed efficace per high-throughput screening nuovi modulatori β-catenina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di Xenopus estratto Egg
NOTA: Ogni rana produce circa 1 ml di estratto uovo utilizzabile. Estratti di 10 rane sono tipicamente preparati in una sola volta, e il volume di tampone di seguito descritto è per l'esecuzione di un 10 rana Xenopus estratto uovo prep. Il volume buffer può essere regolata di conseguenza per preparazioni più o meno grandi di estratto uovo. Preps generato in questa maniera coerente produrre concentrazioni proteiche ≥ 50 mg / ml. Il processo di raccolta delle uova e loro trasformazione in estratto è più efficace se condotta da due persone. (Per le tecniche di base della rana di allevamento, vedere Sive et al. 33).
- Egg Collection
- Per adescare le rane, iniettano ogni rana femminile con 100 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) da un appena fatto 250 U / ml di brodo. Utilizzare una siringa da tubercolina 3 ml con un ago G 27 per iniettare per via sottocutanea, con la smussatural'ago, nella linfa sacco dorsale, che si trova a circa 1 cm di distanza dalla linea mediana dalle macchie dentellato lungo la lunghezza delle gambe della rana.
- Conservare rane innescato in acqua (oltre 20 mM NaCl, vedere Sive et al. 33) a 18 ° C per 5-10 giorni. Per i piedi sistemi serbatoio dell'acqua, la densità degli animali è di circa 4 litri di acqua per ogni rana femminile. NOTA: Il tempo minimo richiesto per l'innesco abbia effetto è di 5 giorni, e gli effetti di priming svanire dopo 10 giorni.
- Preparare la soluzione 0.5x di Marc Modificato Ringers (MMR) da un MMR magazzino 20x. 20x MMR consiste di 2 M di cloruro di sodio, cloruro di potassio 40 mM, 40 mM di cloruro di calcio, cloruro di magnesio 20 mM e 100 mM di 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), pH 7,4.
- Impostare benne per tutte le rane iniettati (una rana per 4 L secchio). NOTA: Anche se più di una rana può essere posizionato nello stesso bucket di raccolta delle uova, se una delle ranedepone le uova di qualità prevalentemente poveri, una notevole quantità di sforzo sarà necessario separare le uova di scarsa qualità da quelli che sono adatto a fare estratto. Così, massimizzando il numero di rane nello stesso serbatoio per minimizzare la quantità di buffer utilizzato per uovo raccoglie non vale il rischio.
- Iniettare 750 U gonadotropina corionica umana (HCG) nel sacco linfatico dorsale di ogni rana utilizzando un ago 27 G, come indicato al punto 1.1.1.
- Posizionare ciascuna delle rane HCG-iniettato in singole secchi 4 L contenenti 0,5 x MMR raffreddata a 16 ° C.
- Posizionare i contenitori con le rane in un incubatore a 16 ° C a raccogliere uova O / N (15-16 ore). NOTA: Mantenere la temperatura corretta è fondamentale per l'intera procedura, dalla raccolta delle uova alla preparazione estratto uovo.
- Dejellying Uova
NOTA: Le uova sono ricoperte da uno strato di gelatina che deve essere rimossa prima di effettuare estratto. La probabilità di lisi spontanea delle uova aumenta il tempo between deposizione delle uova ed estrarre gli aumenti di preparazione. Pertanto, è importante procedere attraverso i seguenti passi più rapidamente possibile.- Preparare 4 L di 1x MMR, 50 ml di 0,1 x MMR, e 400 ml di 2% cisteina, pH 7.7, effettuate in acqua distillata. Mantenere tutte le soluzioni a 16 ° C.
- Per espellere le uova aggiuntive, premere delicatamente la parte bassa della schiena e l'addome della rana.
- Rimuovere le rane e il grosso del MMR, di lasciare le uova in circa 1-200 ml di MMR in ciascun segmento.
- Rimuovere i detriti con una pipetta di trasferimento, e valutare la qualità delle uova: uova di alta qualità sono generalmente caratterizzata da una netta separazione tra l'emisfero animale cupamente pigmentate e l'emisfero vegetale leggermente colorato e hanno il più alto contrasto scuro-chiaro. Eliminare con una pipetta di trasferimento tutte le uova che appaiono filante, screziato, o lisato (bianco e gonfio) in quanto diminuirà la qualità complessiva degli estratti. Se> 10% delle uova sono di scarsa qualità, l'interolotto deve essere eliminata.
- Unire le uova in un bicchiere di vetro da 500 ml e versare fuori tanto MMR possibile, mantenendo le uova sommerse.
- Risciacquare uova delicatamente agitando con il doppio del volume uovo di MMR. Ripetere due volte, e rimuovere eventuali detriti o uova di qualità, ovviamente povere.
- Aggiungere circa 100 ml di 2% cisteina per il bicchiere, agitare delicatamente per mescolare, e permettono di uova di stabilirsi per 5 minuti a 16 ° C. Eliminare il cisteina. NOTA: Dejellying è caratterizzata dalla progressiva comparsa di strati di gelatina galleggianti sopra le uova e l'imballaggio più compatta delle uova come ora occupano un volume inferiore senza il cappotto gelatina.
- Aggiungere altri 100 ml di 2% cisteina, agitare delicatamente, attendere 5 minuti e poi versare lentamente al largo della cisteina. Ripetere fino uova sono diventate strettamente compattato (di solito dal terzo trattamento cisteina). Nota: Se le uova sono troppo lunghi in cisteina, essi sono soggetti ad lisi. Analogamente, uova dejellied sono fragili e inclini a lisi meccanica sesono roteato troppo vigorosamente o se sono esposti all'aria. Una volta che le uova sono state dejellied, è importante procedere rapidamente alle fasi di centrifugazione.
- Versare cisteina, e sciacquare via il cappotto gelatina e altri detriti lavando delicatamente le uova in 1x MMR. Versare il tampone attentamente lungo il lato del bicchiere. Ripetere l'operazione due volte o fino a quando la soluzione MMR non è più torbida. Mentre risciacquo con 1x MMR continuano a rimuovere le uova marce con una pipetta di trasferimento.
- Eseguire un risciacquo delicato finale con 30 ml 0.1x MMR, e delicatamente versare fuori tanto del buffer come possibile. Anche in questo caso, rimuovere eventuali uova ovviamente cattivi.
- Imballaggio e Schiacciamento uova da centrifugazione
NOTA: L'estratto descritto di seguito che viene utilizzato per la degradazione β-catenina è una variante dell'estratto fattore citostatico (metafase II-arrestato). In contrasto con l'estratto a bassa velocità e ad alta velocità utilizzata per gli studi del ciclo cellulare, estratto di velocità intermedia funziona meglio per degradazione β-catenina. IoEstratto nterphase promuove allo stesso modo robusto degrado β-catenina, anche se è più laborioso da preparare.- Aggiungi leupeptina, Pepstatin, miscela Aprotinin (LPA, un inibitore della proteasi) a 10 mcg / ml (diluito da una / soluzione di 10 mg ml di brodo in DMSO) e Citocalasina D a 20 mcg / ml (diluito da un / ml di soluzione 10 mg in DMSO) nei restanti 20 ml di 0.1x MMR.
- Aggiungi 0. X MMR contenente LPA e Citocalasina D per le uova lavate, agitare delicatamente e incubare per 5 minuti a 16 ° C.
- Trasferire le uova in 16 ° C pre-refrigerati 50 ml provette per centrifuga, permettono le uova di stabilirsi, e rimuovere il tampone residuo dall'alto. Per evitare l'esposizione all'aria, prelevare una piccola quantità di tampone nella pipetta di trasferimento prima di ritirare le uova per il trasferimento. Continuare a trasferire le uova aggiuntivi nelle provette da centrifuga e rimuovere il tampone residuo dalla parte superiore del tubo fino a quando le uova riempiono il tubo da centrifuga all'inizio, che consentirà di massimizzare la resa deiestrarre.
- Per imballare le uova, tubi di centrifuga centrifugare a 400 xg per 60 sec a 4 ° C usando un rotore ad angolo fisso. Rimuovere il tampone residuo dalla parte superiore delle provette da centrifuga.
- Per la rotazione di frantumazione, centrifugare le provette a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Raccolta Strato citoplasmatica di estratto
NOTA: Il metodo descritto di seguito differisce dal metodo classico di bucare il lato della provetta per raccogliere lo strato citoplasmatico. Questo protocollo è stato adattato per semplificazione e per l'utilizzo con particolari provette da centrifuga riutilizzabili. Non ci sono notevoli differenze nella cinetica di degradazione β-catenina si trovano con entrambi i metodi. A questo punto dovrebbe essere estratto tenuti freddo durante tutto il processo, e tutti i passaggi devono essere eseguiti a 4 ° C.- Cancellare un buco nello strato lipidico utilizzando P1000 punta della pipetta.
- Raccogliere lo strato citoplasmatico (tra lo strato pigmentato buio e il light strato lipidico) con una nuova punta P1000 pipetta in provette da centrifuga pre-refrigerati pulite (Figura 1). Per estratto alta qualità che degrada robustamente β-catenina, minimizzare la quantità di strato pigmentato e lipidico che viene ritirata con lo strato citoplasmatico.
- Spin estratto strato citoplasmatico a 15.000 xg per 10 min a 4 ° C e nuovamente raccogliere lo strato citoplasmatico. Ripetere la rotazione ed estrazione 1X. NOTA: L'estratto dovrebbe essere "paglierino". Se esiste una notevole contaminazione con gli strati pigmentati e lipidi, a questo punto, si può ripetere il lancio ancora una volta, sebbene rotazioni eccessive diminuirà la capacità dell'estratto di degradare β-catenina.
- Aggiungere LPA e Citocalasina D all'estratto a concentrazioni finali di 10 pg / ml ciascuna. NOTA: Utilizzando il metodo descritto produce una concentrazione abbastanza consistente di proteine totali di circa 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 preparazioni separate) in Xenopus esempiog estratti.
- (Facoltativo) Per i saggi di traduzione, aggiungere capped mRNA (0,1 mg / ml), RNasin (1,5 U / ml), e il mix rigenerazione di energia (2.2.1) e incubare la reazione a temperatura ambiente per 2 ore (per ulteriori informazioni vedi salica et al. 2 e Sive et al. 33). Utilizzare immediatamente estratto tradotto per β-catenina saggi di degradazione o lo snap-congelare in azoto liquido per un uso successivo. NOTA: estratto di appena preparato ha una elevata capacità di tradurre in modo esogeno aggiunto mRNA, ma purtroppo, questa capacità è persa una volta che l'estratto è congelato. Capped mRNA può essere facilmente preparato utilizzando kit commerciali.
- Estratto Snap-congelamento in azoto liquido. NOTA: Gli estratti sono memorizzati in piccolo (200 ml) aliquote per uso singolo, perché perdono rapidamente la loro capacità di degradare β-catenina, se ricongelati. Per la conservazione a lungo termine, estratto può essere conservato in azoto liquido. Per la conservazione a breve termine, estratto può essere conservato a -80 ° C, anche se la capacità oEstratto f per degradare β-catenina può essere drasticamente ridotta con la conservazione prolungata a -80 ° C (più di 2 mesi).
2. Preparazione estratto di β-catenina degradazione Assay
- L'esaurimento da Xenopus estratto
NOTA: Uno dei principali vantaggi di estratto di Xenopus è la capacità di esaurire facilmente componenti di un percorso e aggiungere precisamente indietro una quantità definita di proteine al fine di determinare i suoi effetti dipendenti dalla dose.- Utilizzare estratto uovo Xenopus preparati al momento o in modo rapido disgelo estratto e posto congelato sul ghiaccio. Eseguire tutte le manipolazioni del freddo.
- Aggiungi estratto a 1/10 del volume di anticorpo pellet o perle di affinità (ad esempio, 20 ml di perline pellet all'estratto di 200 ml). Per minimizzare diluizione dell'estratto, ritirare quanto più liquido dalle perline possibili prima aggiunta dell'estratto utilizzando punte di caricamento di gel con lunghe punte affusolate.
- Ruotare extract-miscela di sferette a 4 ° C per 1 ora.
- Spin mix extract-tallone a 12.600 xg in microcentrifuga a 4 ° C per 30 sec. In alternativa, se si usano perline magnetiche, applica il campo magnetico per raccogliere perline.
- Trasferimento impoverito estratto in una provetta da microcentrifuga fresco su ghiaccio. Fare attenzione a non trasferire le perle con l'estratto.
- Confermare l'efficienza di esaurimento mediante immunoblotting sia estratto e perline impoverito.
- Preparare l'estratto di β-catenina saggio di degradazione, come descritto in 2.2.
- Ottimizzazione Xenopus Estratto di β-catenina degradazione
NOTA: degradazione β-catenina in estratto uovo Xenopus è un processo energia-dipendente che esaurisce rapidamente le riserve di ATP endogeni. Di conseguenza, un sistema di rigenerazione di energia è necessaria per mantenere solida la degradazione β-catenina.- Preparare un mix 20x rigenerazione di energia (ER), composto da 150 mm creatina fosfato 20 mM ATP, 600 mg / ml creatinfosfochinasi,e 20 mM MgCl 2. ER dovrebbe essere aliquotati e conservati a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento utilizzando piccole aliquote congelate.
- Scongelare rapidamente estratto uovo di Xenopus strofinando il tubo ghiacciato tra le mani. Posizionare il tubo in ghiaccio poco prima che tutti dell'estratto si è sciolto.
- Aggiungere 10 ml di mix recupero dell'energia (20x ER) in una aliquota (200 ml) di estratto d'uovo Xenopus. Mescolare accuratamente muovendo rapidamente il vortex tubo e il polso. Pulse-spin e mettere immediatamente in ghiaccio.
- (Facoltativo) Il fatturato di β-catenina può essere leggermente migliorata in estratto uovo Xenopus mediante l'aggiunta di ubiquitina (1,25 mg / ml finale). Cicloeximide (0,1 mg / ml finale) può anche essere aggiunto a minimizzare definizione di trascritti endogeni.
- Aliquota i volumi adeguati per il dosaggio degrado in tubi microcentrifuga pre-refrigerati su ghiaccio. Per radiomarcati saggi di degradazione β-catenina, ritirare 2-5 estrarre ml per ogni punto di tempo. </ Li>
3. Marcata radioattivamente β-catenina degrado test in estratto uovo Xenopus
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguite su ghiaccio, se non diversamente indicato.
- Preparazione marcata radioattivamente β-catenina
- Preparare freschi in vitro per sintesi [35 S] metionina-radiomarcato proteina utilizzando kit disponibili in commercio. NOTA: Generazione 35 S-etichettati (emivita 87 giorni) proteine sono facilmente ed efficientemente prodotti utilizzando vitro accoppiato kit di trascrizione-traduzione disponibili commercialmente in. E 'importante che la proteina tradotta è sufficientemente etichettato tale che le variazioni ricambio proteico può essere facilmente visualizzati.
- Per confermare radiomarcatura successo, eseguire SDS-PAGE/autoradiography con 0,5 ml di proteina tradotta. Quantificare l'intensità della banda β-catenina radiomarcato utilizzando ImageJ, ImageQuant, o in alternativa software progr quantitativaam. NOTA: La banda proteina β-catenina radiomarcato deve essere chiaramente visibile sulla pellicola nel giro di poche ore (4-6 h).
- Snap-congelare la proteina radiomarcato in azoto liquido per la conservazione fino all'uso. Nota: prolungato (> 2 mesi) e aerei gelo / disgelo (maggiore di 2) possono influenzare gravemente la capacità del radiomarcato β-catenina a degradare robusto in estratto uovo Xenopus. Tipicamente, la stabilità delle proteine radiomarcati diminuisce significativamente dopo 1 mese di conservazione a -80 ° C; così, preparata relativamente fresco radioattivo β-catenina dà migliori risultati in questi test di degradazione.
- Esecuzione di β-catenina degradazione Assay
- Aggiungere 1-3 ml (a seconda della potenza del segnale di banda radiomarcato) in vitro tradotte β-catenina (e altre proteine, piccole molecole, ecc in prova) in 20 ml di miscela di reazione Xenopus su ghiaccio. Mescolare accuratamente quickly sfogliando il tubo e un breve impulso di vortex; questo è un passo importante in quanto estratto uovo di Xenopus è molto viscoso, e la miscelazione incompleta interesserà la coerenza dei risultati. Rotazione del polso e posto sul ghiaccio.
- Avviare la β-catenina reazione di degradazione spostando i tubi a RT.
- Al punto di tempo designato, rimuovere 1-5 ml di campione e miscelare immediatamente con tampone campione SDS (volume 5x) per arrestare la reazione. Per assicurarsi la reazione di degradazione è completamente terminata, tubo film diverse volte e vortice vigorosamente.
- Eseguire SDS-PAGE/autoradiography. Eseguire 1 ml equivalenti (~ 50 mg di proteine) di estratto per ogni punto / corsia. Degradazione di β-catenina in estratto uovo di Xenopus dovrebbe essere evidenziata dalla diminuzione dipendente dal tempo in intensità della radioattivo β-catenina banda Figura 2. Quantificare i risultati utilizzando ImageJ, ImageQuant, o altri software di imaging preferito, se necessario.
- (Optionale) immergere il gel SDS-poliacrilammide in soluzione di fissaggio (10% acido acetico e 30% di metanolo in acqua distillata) prima dell'essiccamento a diminuire radioattività di fondo e aumentare la qualità dell'immagine.
4. Β-catenina-luciferasi Degradazione Assay in Xenopus estratto Egg
Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio, se non diversamente indicato.
- Preparazione β-catenina-luciferasi
- Sintetizzare non radioattivo, luciferasi-tagged β-catenina con il sistema accoppiato trascrizione-traduzione in piena mix di aminoacidi.
- Confermare produzione della luciferasi-tag β-catenina misurando l'attività luciferasi 0,5-1 microlitri della reazione. Valutare sfondo luminescenza misurando luminescenza da una miscela di reazione non tradotta. NOTA: kit commerciali multipli sono disponibili per misurare l'attività luciferasi. Luminescenza di lunga durata, tuttavia, funziona particolarmente bene per il ASSA degradoy.
- Esecuzione di β-catenina-luciferasi degradazione Assay
- Scongelare e preparare l'estratto uovo di Xenopus come in 2.2.
- Aggiungi in vitro tradotte β-catenina-luciferasi di fusione (da 4.1) in miscela di reazione Xenopus preparata (da 2.2) su ghiaccio e mescolare bene come in 3.2.1. NOTA: L'attività della luciferasi β-catenina che viene aggiunto l'estratto è tipicamente compresa tra 20 - 50.000 unità di luminescenza relativa (RLU) / ml di estratto (basata su misurazioni ottenute da 4.1.2). Segnale di partenza dovrebbe essere di circa 100.000 RLU (2-5 ml della vitro tradotte β-catenina-luciferasi fusione).
- Spostare l'estratto di RT per avviare la reazione di degradazione.
- Rimuovere una aliquota della reazione al tempo indicato e lo snap-congelare in azoto liquido. NOTA: i campioni in triplo sono generalmente rimosse per analisi per ogni punto di tempo. Estratto congelato può essere conservato a -80 ° C untIl loro sono pronti per essere analizzati.
- Campioni Scongelare ghiaccio, campioni di trasferimento a piastre da 96 pozzetti standard bianche su ghiaccio, ed il processo per attività di luciferasi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uno schema di degradazione β-catenina in estratto uovo Xenopus è mostrato in Figura 2A. 35 S-marcato β-catenina è stata incubata in estratto uovo Xenopus, aliquote (1 ml estratto equivalente) sono stati rimossi al momento opportuno, ed i campioni sono stati sottoposti a SDS-PAGE seguita da autoradiografia. β-catenina degradazione di componenti della via di Wnt è mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma 2, e il degrado di [35 S]-radiomarcato β-catenina in estratto di Xenopus è inibita dall'aggiunta dell'inibitore proteasoma MG132 Figura 2B. Degradazione di β-catenina da componenti della via Wnt dipende dalla sua fosforilazione da GSK3 34. Degrado GSK3-dipendente può essere facilmente dimostrato in diversi modi utilizzando Xenopus estratto uovo: 1) La β-catenina (SA) mutante (siti GSK3 fosforilazione mutati a alanina) è stabilizzato in Xenopus uovo estratto relativo alla wild-type proteina β-catenina Figura 2B. 2) Piccole molecole inibitrici di GSK3 (LiCl) analogamente inibiscono la degradazione di β-catenina (Figura 2C). 3) Infine, esaurimento di GSK3 da estratto uovo di Xenopus inibisce la degradazione di β-catenina; degradazione può essere salvato mediante aggiunta di esogeno GSK3 Figure 2D-E.
Il radioattivo β-catenina test di degradazione fornisce una valutazione visiva particolarmente informativo del suo modo di degradazione (ossia la degradazione ubiquitina-mediata rispetto scissione apoptosi). Autoradiografia, tuttavia, è laborioso, e, per la maggior parte, limitato per l'analisi ad alta produttività della via (esempio, lo screening per piccoli modulatori molecola della via di Wnt). Il saggio degradazione β-catenina-luciferasi è più facilmente e rapidamente quantificabile come la quantità di luminescenza emessa è direttamente proporzionale al mattinoAmmontare delle proteine β-catenina-luciferasi. Questa caratteristica rende il saggio di luciferasi semplice e facilmente adattabile per saggi high-throughput.
È importante determinare che la fusione luciferasi ha proprietà simili a quella della proteina nonfusion. Questo può essere determinato empiricamente fondendo la proteina luciferasi al N-terminale, C-terminale, o internamente. Fusione di luciferasi alla N-o C-terminale della β-catenina non incide sulla sua capacità di attivare Wnt geni bersaglio inculturata cellule di mammifero o il tasso di turnover in Xenopus estratto uovo 2, 19, 20.
Un rappresentante β-catenina-luciferasi degradazione saggio in estratto uovo Xenopus è illustrato nella Figura 3A in cui degradazione di β-catenina-luciferasi è stata valutata SDS-PAGE/autoradiography della proteina luciferasi e attività radiomarcato della fusione. Il tasso di degradation della β-catenina-luciferasi è simile alla proteina β-catenina non etichettato. La regolazione della degradazione per la fusione β-catenina-luciferasi è essenzialmente identica alla proteina nonfusion come l'aggiunta di LiCl o deplezione di GSK3 provocato inibizione della β-catenina-luciferasi turnover. Come mostrato nelle figure 3B-C, variazioni del segnale radioattivo della proteina β-catenina-luciferasi paralleli i cambiamenti dell'attività enzimatica luciferasi nel tempo. Un problema che nasce da utilizzare β-catenina-luciferasi (particolare proteina di fusione generato dal sistema di trascrizione-traduzione in vitro) è il segnale luciferasi sfondo causati da uso di siti di inizio traslazionale interne o premature terminazione traslazionale Figura 3D. Questo problema può a volte essere superato attraverso l'ottimizzazione della concentrazione di DNA utilizzato nella reazione IVT. Non abbiamo, però, osserviamo una diminuzione sfondo attività luciferasi quando abbiamo variatola concentrazione di DNA plasmide per la nostra particolare costrutto β-catenina-luciferasi. È probabile che dovremo riprogettare la proteina di fusione mediante mutagenesi per minimizzare ulteriormente siti interni traduzionali di inizio e / o terminazione prematura traduzionale della proteina di fusione β-catenina-luciferasi. Poiché la proteina luciferasi è abbastanza stabile nel corso tempo della reazione di degradazione in Xenopus uovo estratto figura 3A, tuttavia, questo segnale di fondo può essere dedotta semplicemente se il rapporto della proteina luciferasi troncata al full-length β-catenina fusione è noto .
Una forza del saggio luciferasi è la capacità di scalare in un formato multi-pozzetto che permette di eseguire screening ad alto rendimento per modulatori di degradazione β-catenina. In Figura 4, un'analisi scacchiera rappresentativo è dimostrata utilizzando un inibitore della degradazione β-catenina, MG132, che inibisce la proteasoma. Il risultato dell'esperimento scacchiera indica che il saggio è uniforme e riproducibile in un formato a 96 pozzetti e dimostra la sua idoneità per screening ad alto rendimento.
Figura 1. Rappresentazione schematica della preparazione di estratto uovo Xenopus concentrato. Uova sono raccolte HCG-iniettato Xenopus laevis femmine, compattato con una bassa velocità (400 xg) centrifuga, e schiacciati e separati con una media velocità (15.000 xg ) di spin. Fare attenzione a iniettare per via sottocutanea nel sacco linfatico dorsale, rimuovere con attenzione le uova marce, e separare accuratamente l'estratto citoplasmatico di alta qualità dall'estratto più scura di qualità inferiore come indicato nel testo.
IGURA 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Figura 2. Β-catenina degrada robustamente se incubati Xenopus estratto uovo. A) uno schema di un saggio di degradazione. B) [35 S]-marcato β-catenina preparato da una reazione IVT degrada robustamente se incubati estratto uovo Xenopus. Aggiunta di MG132 (200 micron) per estratto uovo di Xenopus inibisce la degradazione del β-catenina. Mutazione di alanina delle phosphosites GSK3 all'interno di β-catenina (β-catenina SA) o l'aggiunta di LiCl (25 mm) C) inibisce la β-catenina degrado. D) Il sito GSK3 legame di Axin (aminoacidi 506-560) esaurisce in modo efficiente GSK3 da estratto uovo di Xenopus. E) Estratto di uova di Xenopus GSK3-impoverito inibisce la degradazione del β-catenina e può essere salvato mediante aggiunta of GSK3 ricombinante (0,1 mg / ml). Aggiunta di LiCl (25 mm) blocca la capacità di GSK3 ricombinante per salvare il degrado β-catenina in estratto GSK3-impoverito. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Luciferase-tagged β-catenina degrada quando incubati in estratto uovo Xenopus. A) marcata radioattivamente β-catenina-luciferasi degrada ad un tasso simile a quello del non etichettato proteina β-catenina. Come con la proteina wild-type, aggiunta di LiCl (25 mM) inibisce la β-catenina-luciferasi degradazione. Solo Luciferase non sensibilmente girare in estratto uovo Xenopus. Cambiamenti in attività di luciferasi della β-catenina-luciferase fusion parallelo i cambiamenti nei suoi livelli di proteine. B) aggiunta di LiCl (25 mm) o esaurimento di GSK3 C) inibisce la β-catenina-luciferasi fatturato valutata misurando l'attività luciferasi. D) Immunoblotting in vitro tradotto β-catenina- luciferasi (utilizzando un anticorpo anti-luciferasi) ha rivelato notevoli quantità di proteina luciferasi gratuito in alcune preparazioni che probabilmente contribuisce allo sfondo più alto se confrontato con il test degrado radioattivo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4. Regolamentata degradazione di β-catenina-luciferasi in estratto di Xenopus può essere adattato aun formato high-throughput. Un'analisi rappresentante scacchiera per β-catenina-luciferasi utilizzando MG132 (450 micron), come un inibitore della degradazione β-catenina. Colonne ombreggiate indicano pozzi MG132-trattati, e le colonne rappresentano il veicolo più leggero pozzi (DMSO) trattati. Quantificazione e risultato di calcolo Z-fattore in un punteggio di 0,3 indica un test accettabile per l'uso potenziale di screening high-throughput.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Estratto uovo di Xenopus è un sistema biochimico robusto per indagare fatturato β-catenina. La concentrazione di β-catenina in estratto uovo di Xenopus è ~ 25 Nm 2. In condizioni ottimali, l'estratto uovo è in grado di degradare β-catenina ad una velocità di 50-100 nM / hr e metà-massimale a 200 nM 24. Ci sono diversi passaggi critici per il successo ricostituzione del degrado β-catenina con estratto di uova di Xenopus. Questi includono 1) generare Xenopus estratto uovo di alta qualità e il modo in cui viene preparato estratto uovo, 2) generando qualità radiomarcato β-catenina e proteina β-catenina-luciferasi, 3) ottimizzazione delle condizioni di reazione per sostenere degradazione β-catenina, e 4 ) un adeguato trattamento di reazione punti temporali.
Una preparazione di alta qualità dell'estratto uovo Xenopus in cui β-catenina è robusto degradata dipende sia dalla qualità del secoloe uova e le uova vengono trattati prima della fase di schiacciamento così come l'estratto viene successivamente centrifugato per ottenere l'estratto finale. Come menzionato nel protocollo, è importante assicurarsi che vengano utilizzati solo uova di alta qualità (rappresentati dal forte contrasto tra l'emisfero animale buio e la luce nell'emisfero vegetale), che le uova di scarsa qualità (soffi filamentose, screziati, o bianco) vengono rimossi in tutta il processo, che le uova sono mantenute ad una temperatura fredda (16 ° C) durante la procedura, e che la procedura è effettuata il più rapidamente possibile. E 'importante non sacrificare la qualità per la quantità di estratto. Inoltre, come accennato in precedenza, le uova di una rana che depone le uova di scarsa qualità (> 10%) dovrebbero essere completamente eliminati.
L'estratto sopra descritto è una modifica della meiosi II-CSF arrestato estratto 11. La preparazione di estratto di uova di Xenopus per β-catenina degradazione (estratto velocità intermedia) differs da estratti classici preparate per lo studio del ciclo cellulare 30-32, che sono a bassa velocità o ad alta velocità estratti 35. Adattamento estratto uovo di Xenopus per la degradazione ottimale di altre proteine può richiedere alterare la velocità di centrifugazione e il numero di giri. Estratto a bassa velocità contiene organelli intatti e altri grandi componenti cellulari. Così, giri a velocità più elevate alterano la composizione dell'estratto e potenzialmente rimuovere componenti inibitori e / o essenziali che influenzano la degradazione della proteina di interesse. La preparazione di estratto velocità intermedia descritto è ottimizzato per la degradazione di β-catenina da componenti della via Wnt. Spinning l'estratto superiore a 4X può ridurre significativamente la capacità dell'estratto di degradare β-catenina (anche se ha un effetto minimo sulla degradazione di un altro componente Wnt, Axin). β-catenina è suscettibile alla proteolisi caspasi-mediata in estratto di rotazione a bassa velocità e non noticeably degradare in estratto centrifuga ad alta velocità. Pertanto, è probabile che gli estratti di velocità differenti saranno ottimali per la degradazione dei componenti di altre vie di segnalazione.
La generazione di 35 S-β-catenina e β-catenina-luciferasi può essere eseguita utilizzando un numero di kit disponibili in commercio. Produzione di proteine utilizzando sistemi accoppiati trascrizione-traduzione è altamente dipendente dalla qualità del plasmide: altamente puri midi-preparazioni dei plasmidi funzionano meglio e sono più affidabili rispetto al DNA mini-preparazioni. Per radiomarcatura β-catenina, appena ottenuto [35 S] metionina o translabel ([35 S] metionina più [35 S] cisteina) è preferito. Si noti che metionina e cisteina entrambi hanno la tendenza ad ossidarsi con conservazione prolungata riducendo sensibilmente le loro incorporazione in β-catenina nella trascrizione-traduzione reazione in vitro accoppiato. Poiché una conservazione prolungata e ripetuta di congelamento-scongelamentocicli possono inibire la degradazione, piccole quantità di radioattivo β-catenina sono preparati per volta e usate subito dopo.
La quantità di proteina tradotta e il numero di metionine nella proteina determinare la forza del segnale radiomarcato. Per β-catenina, non ci dovrebbero essere problemi per ottenere forti segnali radioattivi per saggi di degradazione. Per le proteine con pochi metionine e / o che non si traducono bene, un [35 S] e metionina [35 S] mix cisteina può essere usata al posto di [35 S] metionina e / o aggiunto un epitopo (Myc) contenente più metionine. Sebbene il successo con vari plasmidi di espressione contenenti i promotori appropriati fagi (T7, T3 e SP6) può essere ottenuto per reazione di trascrizione-traduzione in vitro, plasmide basato pCS2 dà generalmente i migliori risultati. Inoltre, il segnale della proteina tradotta a volte può essere notevolmente aumentata eliminando il endogeno 5'UTR. Infine, per esperimenti su larga scala (ad esempio, screening ad alto rendimento), una grande quantità di ricombinante β-catenina-luciferasi può essere richiesto. β-catenina-luciferasi dal / sistema baculovirus Sf9 degrada con cinetiche simili a quelli wild-type β-catenina in estratto ed embrioni 2 Xenopus. In alternativa, un alto rendimento nel sistema di espressione in vitro (ad esempio a base di germe di grano) è stato usato con successo per lo screening ad alta produttività 19, 20.
Al fine di misurare in modo affidabile la degradazione di β-catenina nel sistema estratto, è importante che il segnale iniziale sia dal radiomarcato β-catenina o la luciferasi β-catenina fusione è sufficientemente robusto. Così, una certa quantità di ottimizzazione dallo sperimentatore delle dimensioni del dosaggio degrado, il numero di punti di tempo necessario, e l'efficienza della reazione di traduzione in vitro will essere richiesto. Quando si monta la reazione di degradazione, ci sono diversi passaggi si possono prendere per migliorare la possibilità di ottenere robusti degrado. In primo luogo, tutti i reagenti devono essere scongelati rapidamente e immessi sul ghiaccio prima della loro disgelo completo. Poiché la degradazione di β-catenina è altamente dipendente energia, è importante che l'ER è relativamente fresco. In secondo luogo, estratto uovo Xenopus è viscoso, ed è fondamentale che la reazione sia ben mescolata dopo aggiunta di fusione radiomarcata β-catenin/β-catenin-luciferase, ER, proteina, piccole molecola modulatori, ecc In terzo luogo, pre-incubando la reazione mescolare per 20-30 min in ghiaccio dà risultati più riproducibili quando testare gli effetti di piccoli modulatori della molecola.
La capacità di esaurire le proteine da estratti di uova di Xenopus rappresenta un potente strumento per valutare la funzione delle proteine e dei loro effetti concentrazione-dipendente. A titolo di esempio, dimostriamo che riducono GSK3 da Xenopus blocchi estratto uovo la degradazione di β-catenina, che indica l'importante ruolo di GSK3 fatturato β-catenina. Diverse condizioni esaurimento dovranno essere determinati empiricamente per diverse proteine. Ad esempio, le proteine abbondanti richiederanno un aumento della quantità di anticorpi o di affinità ligando sfere utilizzate per raggiungere la piena esaurimento. Un buon punto di partenza è usare perline confezionati a 1/10 del volume dell'estratto per minimizzare diluizione dell'estratto. In aggiunta alla forza di legame del ligando anticorpo / affinità per la proteina bersaglio, il tipo di perline (ad esempio, sefarosio, agarosio, o magnetico) utilizzati possono influenzare l'efficienza di deplezione proteica da Xenopus estratto uovo 36. Infine, sarebbe ideale per analizzare il grado di esaurimento (tipicamente mediante immunoblotting). Una volta che la reazione di β-catenina è completato, il modo in cui i campioni vengono elaborati possono influenzare notevolmente i risultati dell'esperimento. La concentrazione diXenopus uovo Preps estratto preparato nel modo descritto è 52.41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, ed è importante non sovraccaricare la capacità del gel SDS-PAGE; questo non è un problema con il saggio luciferasi-β-catenina. Così, per ogni punto temporale, non più di 1 ml di estratto equivalenti devono essere caricati in ciascuna corsia di un gel SDS-PAGE. Per migliorare ulteriormente la qualità dei risultati, la fissazione fase gel (opzionale) diminuirà radioattività di fondo e aumentare il rapporto segnale-rumore. Per il saggio di luciferasi, un calo da un segnale iniziale di 100.000 RLU estratto uovo Xenopus rispecchia fedelmente la variazione dei livelli di proteina della proteina di fusione β-catenina-luciferasi.
Il sistema di estratto di uova di Xenopus rappresenta un sistema interessante per studiare la regolazione della degradazione β-catenina. Il sistema di estrazione consente il controllo preciso della concentrazione delle singole proteine tramite deplezione e ricostituzione zione. La capacità di monitorare gli effetti sulla cinetica di fatturato β-catenina nel tempo consente una migliore comprensione del meccanismo biochimico di questo passaggio cruciale nella trasduzione del segnale Wnt. Tali manipolazioni hanno fornito visione in profondità le interazioni molecolari complesse tra componenti della via Wnt ed erano critico per lo sviluppo del primo modello matematico del pathway Wnt 24. Un avvertimento è che le concentrazioni dei componenti del pathway Wnt in estratto uovo di Xenopus e lisati cellulari di mammiferi sono stati trovati a differire, forse a causa del modo in cui la via di Wnt è regolata durante l'embriogenesi contro la situazione degli adulti 37. La capacità di eseguire, saggi basati luciferasi, sia radioattivi ed enzimatici con estratto di uova di Xenopus fornisce aggiunto potenti strumenti qualitativi e qualitativi complementari per lo studio della regolazione biochimica di degradazione β-catenina.
t "> Oltre a monitorare il fatturato della β-catenina, il degrado del regolatore Wnt negativo, Axin, può essere monitorato in estratto uovo Xenopus sia come proteina radioattivo o fusione di luciferasi. Utilizzando una variante della luciferasi, Renilla, fusa Axin, è stato precedentemente adattato per la luciferasi degradazione test in un formato high-throughput per lo screening contemporaneamente per modulatori di due proteine pathway Wnt, β-catenina e Axin 19, 20. Questa schermata biochimico ha identificato la FDA ha approvato farmaci, pyrvinium che l'aumento e diminuito il tasso di degradazione di β-catenina e Axin, rispettivamente, in Xenopus estratto uovo 19. pyrvinium stato successivamente convalidato in cellule umane coltivate in vari organismi modello (ad esempio, Xenopus e C. elegans) come una piccola molecola inibitore della canonica Wnt pathway. In sintesi, il sistema estratto uovo Xenopus è un versatile tha sistema biochimicot può essere sfruttata in una moltitudine di modi per studiare il meccanismo di segnalazione Wnt, nonché per l'identificazione di piccole molecole modulatori del pathway Wnt. Il metodo biochimico qui descritto può essere applicato ad altre vie di segnalazione in cui degradazione proteica può svolgere un ruolo fondamentale.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Laurie Lee per la lettura critica del manoscritto. TWC è supportato da un American Heart Association Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB è sostenuto da una borsa di formazione del National Cancer Institute (T32 CA119925). SSH è supportato dal National Institutes of Health (R01DK078640). EL è supportato dal National Institutes of Health (R01GM081635 e R01GM103926).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
