Summary
方法は、 アフリカツメガエル卵抽出物およびタンパク質分解の小分子モジュレーター用のハイスループットスクリーニングのために適応で放射性標識、ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いてタンパク質分解を分析するために記載されている。
Abstract
アフリカツメガエルの卵抽出物は、 アフリカツメガエル卵抽出物は、細胞周期、シグナル伝達経路1-3を含む多くの細胞の文脈において、タンパク質の代謝を研究するために使用されている多様な細胞プロセスの生化学を研究するための十分に特徴付けられた、堅牢なシステムである。本明細書では、本方法は、クリティカルWnt経路成分、β-カテニンの分解を促進するために最適化されたアフリカツメガエル卵抽出物を単離するために記載されている。二つの異なる方法が、 アフリカツメガエルの卵抽出物中のβ-カテニンタンパク質の分解を評価するために記載されている。他方はより容易にハイスループットアッセイ（ホタルルシフェラーゼタグ融合タンパク質）のためにスケーリングされている間の一つの方法は、（[35 S] -放射性標識された蛋白質）を目視有益である。記載された技術は、β-カテニンタンパク質の代謝回転を評価し、その代謝回転に寄与する分子成分を同定に使用することができるが、これらに限定されない。さらに、ABILルシフェラーゼ標識タンパク質の定量的かつ容易な読み出しと組み合わせた均質なアフリカツメガエルの卵抽出物を大量に精製するITYは、このシステムを簡単にβ-カテニンの分解の調節因子のためのハイスループットスクリーニングに適合させることができるようになります。
Introduction
アフリカツメガエルの卵抽出物は、細胞骨格の動態、核アセンブリおよびインポート、アポトーシス、ユビキチン代謝、細胞周期進行、シグナル伝達、およびタンパク質代謝回転1-17を含む多くの細胞生物学的プロセスを研究するために広く使用されている。卵抽出物は、これらのプロセスを実行し、調査を可能にするために必要な全ての必須細胞質成分が含まれている基本的に希釈されていない細胞質を表すので、アフリカツメガエル卵抽出システムは、細胞プロセスの軍団の生化学的解析に適している。卵抽出物の大量の材料（ 例えば 、タンパク質精製、高スループットスクリーニング）18-20を大量に必要とする生化学的な操作のために、一度に製造することができる。別の利点は、 アフリカツメガエルの卵抽出物中の特定のタンパク質の濃度を正確に組換えタンパク質および/ または内因の免疫除去を添加することによって調節することができることである関心対象のタンパク質の発現を制御することが困難であるプラスミドDNAのトランスフェクションとは対照的にenousタンパク質。また、利用可能な組換えタンパク質の欠如は、外因的に添加されたmRNAを翻訳するための新たに調製したアフリカツメガエルの卵抽出物の高容量を利用して、目的のタンパク質をコードする転写物を添加することによって克服することができる。
タンパク質分解の調節は、多くの細胞経路の制御に重要であり、21を処理する。 アフリカツメガエル卵抽出物は、システムが、転写および翻訳の影響を交絡することなく、タンパク質の代謝回転を監視するための複数の方法を可能にするように、タンパク質分解を研究するために広く使用されている。 Wntシグナル伝達経路の開発および疾患において重要な役割を果たしている高度に保存されたシグナル伝達経路である。 β-カテニンの代謝回転、Wnt経路の主要なエフェクター、高度に規制され、増加した定常状態リットルβ-カテニンのevelは、Wnt標的遺伝子の活性化に重要である。 β-カテニンの分解の重要性は、Wnt経路の変異は大腸癌22の全ての散発例の約90％に見β-カテニンの分解を阻害しているという事実によって強調されている。 Wnt経路の成分によるβ-カテニン分解を忠実そのターンオーバーのメカニズムを研究するため、ならびにその分解2、19、20、23-29の新規な小分子モジュレーターを同定するためにアフリカツメガエルの卵抽出物中で要約することができる。
細胞周期を研究するためのアフリカツメガエル卵抽出物の調製のための方法は、以前のJoveの刊行物30-32に記載されている。現在のプロトコルは、これらの方法の変更を説明し、[35 S] -放射性標識されたβ-カテニンとルシフェラーゼタグ付きβ-カテニンの分解に最適化されていますアフリカツメガエルの卵抽出物。放射性標識分解アッセイは、オートラジオグラフィーを介してタンパク質レベルの直接可視化を可能にする。 [35 S]メチオニンを直接分解反応に添加することができるインビトロ翻訳反応を用いて目的のタンパク質に組み込まれる。さらに、放射性標識タンパク質の代謝回転アッセイは、目的のタンパク質又はタンパク質安定性に影響を与えることができるエピトープタグに対する抗体を必要としない。タンパク質レベルの小さな変化は、放射性標識されたタンパク質バンドの強度の変化に反映されるように、容易にオートラジオグラフィーによって可視化されるので、[35 S]-放射性標識分解アッセイは、タンパク質代謝回転2の可視化のための非常に有用な方法を示している。
ために、ホタルルシフェラーゼにβ-カテニンの融合体（以下、単に「ルシフェラーゼ」という）、タンパク質レベルの正確で容易な定量的測定を可能にするβ-カテニンターン19,20の動力学的特性を決定する。ルシフェラーゼアッセイの主な利点は、それが容易にスケールアップされている強力な定量的なシステムを提供することである。以下のプロトコルは、β-カテニン分解および新規なβ-カテニンモジュレーターのハイスループットスクリーニングのための、堅牢で効率的、かつ効果的な方法をアッセイするための簡単な方法を提供する。
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Protocol
アフリカツメガエルの卵抽出物の1。準備
注：各カエルが使用可能な卵抽出物の約1ミリリットルが得られます。 10カエルからの抽出物は、典型的には、一度調製し、以下に記載の緩衝液の体積は10カエルアフリカツメガエル卵抽出物の分取を行うためのものであるている。バッファボリュームは、卵抽出物のより大きい又はより小さい製剤に応じて調整することができる。このようにして生成された調製物は、一貫してタンパク質濃度を≥50 mg / mlの収率。二人が行ったときに卵を収集し、抽出物にそれらを処理するプロセスは、最も効率的である。 （基本的なカエルの飼育技術のため、SIVE ら 33を参照）。
- 採卵
- プライムにカエルは、作りたての250 U / mlのストックから妊馬血清ゴナドトロピン100 U（PMSG）と各女性のカエルを注入する。のベベルで、皮下に注入するために27のG針で3ミリリットルのツベルクリン注射器を使用して、約1cm離しカエルの脚の長さに沿って切り欠きの変色からの正中線から位置して背側リンパ嚢、に針を上に、。
- 店舗下塗りし、水にカエル5-10日のために18℃で（プラス20のNaCl、SIVE ら 33を参照）。水タンクシステムを放置するため、動物の密度は、メスのカエル当たり水約4 Lである。注：有効にするには、プライミングのために必要な最小時間は5日間で、プライミングの効果は10日後に脱ぎ履き。
- 20X MMRストックから0.5倍Marcの修正リンガー（MMR）溶液を調製する。 （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、pHを7.4 - 20倍MMRは、2 Mの塩化ナトリウム、40mMの塩化カリウム、40mMの塩化カルシウム、20mMの塩化マグネシウム、および100mMの4からなる。
- すべての注入されたカエル（4Lバケットごとに1つのカエル）のためのバケツを設定します。 NOTE：カエルの1つがあるが、複数のカエルは、採卵用同じバケットに配置することができる主に低品質の卵を産む、労力のかなりの量は、抽出物を製造するのに適しているものから低品質の卵を分離するために必要とされる。このようにして、卵のために収集する使用される緩衝液の量を最小限に抑えるために、同じタンク内のカエルの数を最大化することは、リスクの価値はありません。
- 1.1.1で説明したように27 G針を使用して、各カエルの背側リンパ嚢に750 Uヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を注入。
- 0.5X MMRが16℃まで冷却を含む個々の4LのバケットにHCGを注射したカエルのそれぞれを配置
- O / N（15〜16時間）の卵を収集するために16℃のインキュベーター内のカエルとコンテナを配置します。注：適切な温度を維持することは、卵抽出物を調製した卵を集めるから、全体の手順のために重要である。
- Dejellying卵
NOTE：卵の前抽出物を製造するに除去しなければならゼリーコートで覆われている。卵の自然溶解の可能性は、時間betweeに増加n個の産卵準備の増加を抽出します。このように、できるだけ迅速に、以下の手順を進めることが重要です。- 1X MMR 4Lの、0.1X MMRの50ミリリットル、蒸留水で行われた2％のシステイン、pHが7.7の400ミリリットルを用意します。 16℃ですべてのソリューションを維持
- 追加の卵を放出するために、静かにカエルの腰と腹部を圧迫。
- 、カエルやMMRの大部分を除去各バケット内のMMRの約1〜200ミリリットル中に卵を残す。
- ホールピペットで破片を除去し、卵の品質を評価する：高品質の卵は、一般的に暗く着色された動物の半球と淡色野菜の半球の間に明確な分離によってマークされ、最高の暗い - 光のコントラストを持っている。彼らは抽出物の全体的な品質を低下させるように（白とふくらんで）まだら、ホールピペットで糸表示されるすべての卵を破棄するか、溶解した。卵の> 10％は低品質のものである場合、全体のバッチは破棄しなければならない。
- 500ミリリットルのガラス製ビーカーに卵を組み合わせて、水中に卵を維持しながら、できるだけ多くのMMRを注ぐ。
- MMRの二倍卵容量で穏やかな旋回で卵を洗浄します。二回繰り返し、任意の破片や、明らかに低品質の卵を削除します。
- 、ガラスビーカーに2％のシステインを約100ミリリットルを追加混合する優しく旋回し、卵は16℃で5分間沈降させシステインを捨てる。注：彼らは今ゼリーコートなしで小さい容積を占めるようにDejellyingが卵と卵のよりコンパクトな梱包の上に浮かんでゼリーコートの漸進的な外観でマークされている。
- 、2％のシステインの別の100ミリリットルを追加そっと渦巻、5分待ってから、ゆっくりとシステインを捨てる。卵は（通常は第三のシステイン処理による）しっかりと固めになっているまで繰り返します。注：卵がシステインに長すぎる放置された場合は、溶解する傾向がある。同様に、dejellied卵は壊れやすく、機械的な溶解の傾向がある場合、それらあまりに激しくまたはそれらが空気にさらされている場合に旋回される。卵がdejelliedされたら、それは急速に遠心分離工程に進むことが重要である。
- システインを捨て、そして優しく1X MMRで卵を洗浄することにより、ゼリーのコートやその他の破片を洗い流す。ビーカーの側面に沿って慎重にバッファを捨てる。二度繰り返さないか、MMRソリューションまで、曇りなくなった。 1X MMRですすぐながらトランスファーピペットを使用して、悪い卵を除去し続けています。
- 30ミリリットルの0.1×MMRで、最終的な穏やかなすすぎを行って、ゆっくりできるだけのバッファをできるだけ多く捨てる。この場合も、任意の明らかに悪い卵を除去します。
- 遠心分離により卵をパックし、破砕
【注】下記に記載さ抽出物、β-カテニンの分解のために使用されている細胞増殖抑制因子抽出物（中期II-逮捕）の変形である。細胞周期研究のために使用される低速および高速抽出物とは対照的に、中間速度抽出物は、β-カテニン分解に最適な。私準備するより多くの労働集約的であるが、同様に強固なβ-カテニンの分解を促進する抽出nterphase。- 10 mg / mlの原液から希釈した20μg/ mlの（時およびサイトカラシンD（DMSO中10 mg / mlの原液から希釈）を10μg/ mlでロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン液（LPA、プロテアーゼ阻害剤）を追加0.1X MMRの残りの20ミリリットルへ）のDMSO。
- 0を追加します。X MMR洗浄した卵にLPAおよびサイトカラシンDを含む、優しく旋回し、16℃で5分間インキュベート
- 、16℃で予冷した50ミリリットルの遠心管に卵を移す卵は沈降させ、上から残った液を取り除きます。空気への曝露を防止するために、従来の転送のために卵を引き出すにホールピペットに少量のバッファーを撤回。卵は上部に遠心分離管に充填されるまでの収率を最大にする、遠心管に付加的な卵を転送し、チューブの上部から残留液を除去するために継続抽出します。
- 固定角ローターを用いて4℃で60秒間、400×gで卵、スピン遠心管をパックする。遠心管の上から残った液を取り除きます。
- 破砕スピン、4℃で5分間、15,000 xgでスピンチューブ用
- エキスの細胞質層を集める
注：以下に記載する方法は、細胞質の層を収集するために遠心管の穿刺側の古典的な方法とは異なる。このプロトコルは、簡略化のため、再利用可能である特定の遠心分離管との使用に適合されている。 β-カテニンの分解の動態には顕著な違いは、メソッドのいずれかで検出されない。この時点で、抽出物は、プロセス全体の間、冷たい保たれるべきであり、全ての工程は4℃で実施されるべきである- P1000のピペットチップを用いて脂質層に穴をオフにします。
- 濃い着色層とLiとの間に細胞質層（コレクトクリーン予め冷却遠心管に新しいP1000のピペットチップを用いてGHT脂質層）（ 図1）。堅牢にβ-カテニンを分解する高品質のエキスは、細胞質の層で回収され着色された脂質層の量を最小限に抑えます。
- スピンは、4℃で10分間15,000×gで細胞質層を抽出し、再び細胞質層を収集します。スピンと抽出1Xを繰り返します。注：抽出物」麦わら色。 "である必要があります着色および脂質層との実質的な汚染がこの時点で存在する場合は、過剰なスピンはβ-カテニンを分解する抽出物の能力を減少しますが、一つは、スピン1のより多くの時間を繰り返すことができます。
- 10μg/ mlの各最終濃度で抽出物にLPAおよびサイトカラシンDを追加します。注：記載された方法を使用して、約50 mg / mlとかなり一貫総タンパク質濃度（52.41±5.40 mg / mlで、n = 3の独立した調製物）を生じるアフリカツメガエルにおいて、例えばGエキス。
- 、翻訳アッセイ用（オプション）を追加（詳細はサリカらを参照のmRNA（0.1 mg / ml）を、のRNAsin（1.5 U / mL）、およびエネルギー回生ミックス（2.2.1）を蓋をし て室温で2時間反応をインキュベートら 2及びSIVE ら 33）。 β-カテニンの分解アッセイのために、すぐに翻訳の抽出物を使用したり、後で使用するために液体窒素中で凍結スナップ。注：新たに調製した抽出物を、外から加えられたmRNAを翻訳する高い能力を持っていますが、抽出液が凍結されれば、残念ながら、この能力は失われています。キャップされたmRNAは、容易に市販のキットを用いて調製することができる。
- 液体窒素中で急速凍結エキス。注：彼らは急速に再凍結した場合、β-カテニンを分解する能力を失うため、抽出物は、単回使用のための小さい（200μL）ずつに格納されています。長期保存のために、抽出物を液体窒素中に保存することができる。短期保存のために、抽出物は、-80℃で保存することができるものの、容量oをβ-カテニンを分解するfの抽出物は、劇的に-80°C（2ヶ月より長い）で長期保存して低減することができる。
2。β-カテニン分解アッセイのための抽出物を調製する
- アフリカツメガエルの抽出物から枯渇
NOTE： アフリカツメガエル抽出物の主な利点は、容易に経路の成分を枯渇かつ正確にその用量依存性の効果を決定するために、タンパク質の規定された量を再び追加する能力である。- 新たに調製されたアフリカツメガエルの卵抽出物を使用したり、すぐに氷の上で凍結エキスと場所を解凍する。寒さの中のすべての操作を実行します。
- ペレット化抗体またはアフィニティービーズ（ 例えば 、200ミリリットル抽出物に20ミリリットルペレット化ビーズ）の体積の1/10にエキスを追加します。長い、テーパーヒントゲルローディングチップを使用して抽出物の添加前に、可能なビーズからできるだけ多くの液体を撤回、抽出物の希釈を最小限にするために。
- 回転させるエキス1時間4℃でビーズミックス。
- 30秒間、4℃で微量12600×gでスピンエキスビーズミックス。あるいは、磁気ビーズが使用される場合、ビーズを収集するために磁界を印加する。
- 転送は、氷上で新鮮な微量遠心管にエキスを枯渇。抽出物を任意のビーズを転送しないように注意してください。
- 枯渇エキスやビーズの両方を免疫ブロッティングによって枯渇の効率性を確認してください。
- 2.2で説明したように、β-カテニン分解アッセイのための抽出物を調製する。
- β-カテニン分解のためのアフリカツメガエルの抽出を最適化
注： アフリカツメガエルの卵抽出物中のβ-カテニンの分解が急速に内因性のATP貯蔵を枯渇エネルギー依存性プロセスである。従って、エネルギー回生システムはロバストβ-カテニンの分解を維持するために必要とされる。- 150 mMのクレアチンリン酸、20 mMのATP、600μg/ mlのクレアチンホスホからなる20倍のエネルギー回生（ER）ミックスを調製するそして20のMgCl 2。 ERは、-80℃で小分けし、保管してください小さな凍結アリコートを使用して反復凍結/融解を避けてください。
- すぐに手の間凍結されたチューブを擦ってアフリカツメガエルの卵抽出物を解凍する。抽出物のすべてが溶融している直前にチューブを氷上に置きます。
- アフリカツメガエルの卵抽出物のアリコート（200μL）にエネルギー回生ミックス（20X ER）の10を添加する。すぐにチューブとパルスボルテックスをフリックでよく混ぜ。パルススピンし、すぐに氷上に置きます。
- （オプションの）β-カテニンの代謝回転が若干ユビキチン（1.25 mg / mlの最終）の添加によりアフリカツメガエル卵抽出物で強化することができる。シクロヘキシミド（最終0.1 mg / ml）を、内因性転写産物の翻訳を最小限にするために添加することができる。
- 氷上で予冷したマイクロチューブに分解アッセイのための適切なボリュームを分取。放射性標識されたβ-カテニン分解アッセイのために、2〜5が各時点で抽出ミリリットル撤回。</李>
アフリカツメガエルの卵抽出物中の3。放射標識β-カテニン分解アッセイ
注：特に指定のない限り、すべてのステップは、氷上で行うべきである。
- 放射標識β-カテニンの準備
- 市販のキットを用いてin vitro的に合成された[35 S]メチオニン-放射性標識された蛋白質で新鮮に準備します。注：生成35（87日は半減期）S-標識されたタンパク質は、容易かつ効率的に市販のインビトロ結合転写翻訳キットを使用して製造される。これは、翻訳されたタンパク質が十分にタンパク質の代謝回転の変化が容易に可視化できるように標識されることが重要である。
- 成功した放射性標識を確認するために、翻訳されたタンパク質を0.5μlのSDS-PAGE/autoradiographyを行う。 ImageJの、イメージクアント、または代替定量的なソフトウェアプログララマブルを使用して放射性標識したβ-カテニンバンドの強度を定量化AM。注：放射性標識したβ-カテニンタンパク質のバンドは、数時間（4-6時間）内膜の上にはっきりと見えるはずです。
- 使用するまで保存するために液体窒素中での放射性標識タンパク質を、スナップ凍結。注：長期保管（> 2カ月）と複数の凍結/融解（2より大きい）を大幅にアフリカツメガエルの卵抽出物に強固に分解する放射性標識したβ-カテニンの能力に影響を与えることができます。典型的には、放射性標識タンパク質の安定性は、-80℃で1ヶ月保存後に有意に低下;このように、比較的新しく調製された放射性標識したβ-カテニンはこれらの分解アッセイにおいて最良の結果が得られます。
- β-カテニンの分解アッセイを実施
- 氷上のアフリカツメガエル反応混合液20μlに（テストされているなど、および他のタンパク質、低分子、） のin vitro翻訳β-カテニンの（放射性標識されたバンド信号の強度に応じて）1-3添加する。 quicklでよく混ぜるチューブとボルテックスの短いパルスをはじくY; アフリカツメガエルの卵抽出物の粘性が高いので、これは重要なステップであり、不完全な混合が結果の一貫性に影響を与えます。氷上でのパルススピンと場所。
- RTにチューブをシフトすることによって、β-カテニンの分解反応を開始。
- 指定された時点で、試料1〜5ミリリットル除去し、反応を停止させSDSサンプル緩衝液（5倍容量）で直ちに混合する。確認するために、分解反応が完全に積極的にフリックチューブを、数回渦を終了します。
- SDS-PAGE/autoradiographyを実行します。各時点/レーンのための抽出物の1ミリリットル同等物（〜50 mgのタンパク質）を実行します。 アフリカツメガエルの卵抽出物中のβ-カテニンの分解は、放射性標識されたβ-カテニンバンド図2の強度の時間依存性の減少によって証明されるべきである。必要に応じてImageJの、イメージクアント、あるいは他の好適な画像化ソフトウェアを使用して、結果を定量。
- （最適onal）は、バックグラウンド放射能を減少させ、画像の品質を高めるために、乾燥前に蒸留水）溶液（10％酢酸、30％メタノールを固定するSDS-ポリアクリルアミドゲルを浸す。
アフリカツメガエルの卵抽出物中の4。β-カテニン-ルシフェラーゼ分解アッセイ
特に指示がない限り、氷上ですべての手順を実行します。
- β-カテニン-ルシフェラーゼの準備
- 完全なアミノ酸混合物と転写 - 翻訳結合されたシステムを使用した非放射性標識し、ルシフェラーゼタグ付きβ-カテニンを合成する。
- 反応の0.5〜1μLからのルシフェラーゼ活性を測定することにより、ルシフェラーゼタグ付きβ-カテニンの生成を確認してください。未翻訳反応混合物からの発光を測定することにより、バックグラウンド発光を評価する。注：複数の市販のキットは、ルシフェラーゼ活性を測定するために利用可能である。長寿命の発光は、しかし、分解ASSAのために特に適していますY。
- β-カテニン-ルシフェラーゼ分解アッセイを実施
- 解凍し、2.2のように、 アフリカツメガエルの卵抽出物を準備します。
- 氷の上で（2.2から）を用意し、アフリカツメガエルの反応ミックスにin vitroで翻訳されたβ-カテニン-ルシフェラーゼ融合（4.1から）を追加し、3.2.1のようによく混ぜる。 NOTE：抽出物に添加されるβ-カテニンルシフェラーゼの活性が20の間である - 50,000相対発光単位（RLU）/ mlの抽出物（4.1.2から得られた測定値に基づいて）。起動信号は、約10万RLU（ インビトロ翻訳β-カテニン-ルシフェラーゼ融合2〜5 ml）である必要があります。
- RTにエキスをシフト 分解反応を開始した。
- 示された時間での反応のアリコートを取り出して、スナップ凍結し、液体窒素中。 NOTE：三重のサンプルは典型的には、各時点での分析のために除去される。凍結された抽出物は、-80℃で保存することができます UNT書記は、それらが分析される準備ができている。
- 融解サンプルを氷、氷上で標準白色96ウェルプレートに転写サンプル、およびルシフェラーゼ活性のためのプロセス。
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Representative Results
アフリカツメガエルの卵抽出物中のβ-カテニン分解の概略は、 図2Aに示されている。35 S-標識されたβ-カテニンは、 アフリカツメガエルの卵抽出物中でインキュベートし、アリコート（1 mlの当量抽出）適切な時期に除去し、サンプルをに供したSDS-PAGEオートラジオグラフィーを行った。 Wnt経路の成分によるβ-カテニン分解は、ユビキチン-プロテアソーム系2によって媒介され、 アフリカツメガエル抽出物中の [35 S]-放射性標識β-カテニンの分解はプロテアソーム阻害剤MG132 図2Bの添加により阻害される。 Wntシグナル経路の成分によるβ-カテニンの分解は、GSK3 34によってそのリン酸化に依存している。 Xenoの中で安定化されている1）β-カテニン（SA）変異体（GSK3のリン酸化部位をアラニンに変異）：GSK3依存性の分解が容易にアフリカツメガエルの卵抽出物を使用して、複数の方法で証明することができる野生型β-カテニンタンパク質図2Bに膿卵抽出物の相対的な。 2）GSK3リチウム（LiCl）の小分子阻害剤は、同様にβ-カテニン（ 図2C）の分解を阻害する。 3）最後に、 アフリカツメガエルの卵抽出物からのGSK3の枯渇は、β-カテニンの分解を阻害する;分解は、外因性のGSK3 図2D-Eを添加することによって救出することができます。
放射性標識されたβ-カテニン分解アッセイは、劣化のそのモード（アポトーシス切断対すなわち 、ユビキチンを介した分解）の特に有益な視覚的な評価を提供する。オートラジオグラフィーは、しかし、労働集約的であり、そして、大部分は、経路のハイスループット分析のための制限された（ 例えば 、Wnt経路の小分子モジュレーターについてのスクリーニング）。放出された発光の量が午前に正比例するようにβ-カテニンルシフェラーゼ分解アッセイは、より簡単かつ迅速に定量可能であるβ-カテニン-ルシフェラーゼタンパク質のount。この機能は、ハイスループットアッセイのためのルシフェラーゼアッセイは、単純かつ容易に適応できる。
それは、ルシフェラーゼ融合が非融合タンパク質と同様の性質を持っていることを決定することが重要である。これは、経験的に内部でN-末端、C末端、またはルシフェラーゼタンパク質に融合させることによって決定することができる。 β-カテニンのN-又はC-末端へのルシフェラーゼの融合は、 アフリカツメガエル卵抽出物2、19、20に哺乳動物細胞またはその代謝回転速度をincultured Wnt標的遺伝子を活性化するその能力に影響を及ぼさない。
アフリカツメガエルの卵抽出物中の代表的なβ-カテニン分解ルシフェラーゼアッセイは、β-カテニンの分解がルシフェラーゼ融合タンパク質の放射性標識、ルシフェラーゼ活性のSDS-PAGE/autoradiographyによって評価された図3Aに示されている。 degradatio率β-カテニン-ルシフェラーゼのNは、タグなしのβ-カテニンタンパク質に類似しています。 β-カテニン-ルシフェラーゼ融合のための劣化の調節は、β-カテニン-ルシフェラーゼ売上高が阻害されたLiClを加え、またはGSK3の枯渇などの非融合タンパク質と本質的に同一である。 図3B〜Cに示されるように、β-カテニン-ルシフェラーゼタンパク質の放射性シグナルの変化を経時的にルシフェラーゼ酵素活性の変化に匹敵する。 β-カテニン-ルシフェラーゼ（ インビトロ転写-翻訳系から生成され、特に融合タンパク質）を使用することから生じる問題は、内部の翻訳開始部位または早期翻訳終結図3Dの使用によって引き起こされるバックグラウンドルシフェラーゼ信号である。この問題は、時にはIVT反応において使用されるDNA濃度を最適化することによって克服することができる。我々は変化させたときに、我々は、しかし、バックグラウンドのルシフェラーゼ活性の減少は観察されなかった当社の特定のβ-カテニン-ルシフェラーゼ構築のためのプラスミドDNA濃度。我々はさらに、内部翻訳開始部位および/またはβ-カテニン-ルシフェラーゼ融合タンパク質の早期翻訳終結を最小限にするために、突然変異誘発を介して融合タンパク質をリエンジニアリングする必要がある可能性がある。ルシフェラーゼタンパク質は、 アフリカツメガエル卵抽出物の図3Aの分解反応の時間経過にわたってかなり安定であるので、全長β-カテニン融合の切断型ルシフェラーゼタンパク質の比が公知である場合、ただし、このバックグラウンド信号は、単に減算することができる。
ルシフェラーゼアッセイの強度がβ-カテニン分解のモジュレーターのためのハイスループットスクリーニングを行うことを可能にするマルチウェルフォーマットに拡張する能力である。 図4では、代表的なチェッカーボード分析は、阻害するβ-カテニン分解の阻害剤MG132を用いて示されているプロテアソーム。チェッカーボード実験の結果は、アッセイは、96ウェルフォーマットで均一で再現可能であり、ハイスループットスクリーニングのための適合性を実証することを示している。
図1。集中アフリカツメガエルの卵抽出物の調製の模式図。卵はHCGを注射したアフリカツメガエルは 、低速（400×g）でスピンして圧縮され、女性、および粉砕し、中速で区切り（15,000 XG ツメガエルから収集された）スピン。 、背側リンパ嚢に皮下に注入慎重に悪い卵を削除し、本文中で述べたように、慎重に低品質の暗い抽出物から高品質の細胞質抽出物を分離するように注意してください。
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アフリカツメガエルの卵抽出物中でインキュベートした場合、IVT反応により調製図2。 アフリカツメガエルの卵抽出物中でインキュベートした場合、β-カテニンが強固に低下します。A）の分解アッセイの概略。B）[35 S]標識β-カテニンは堅牢に低下します。 アフリカツメガエルの卵抽出物にMG132（200μM）の添加は、β-カテニンの分解を阻害する。 β-カテニン（β-カテニンSA）内のGSK3 phosphositesのアラニン変異またはLiClを加えて（25 mM）のC）は、β-カテニンの分解を阻害する。D）アキシン（アミノ酸の506から560のGSK3結合部位）を効率よく枯渇GSK3はアフリカツメガエルの卵抽出物から。E）は 、GSK3-枯渇アフリカツメガエルの卵抽出物は、β-カテニンの分解を阻害し、oを添加することによって救出することができますF組換えGSK3（0.1 mg / ml）を。 LiClを加えて（25 mM）のブロックGSK3-枯渇抽出物中のβ-カテニンの分解を救出する組換えGSK3の容量。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
アフリカツメガエルの卵抽出物中でインキュベートすると、図3。ルシフェラーゼタグ付きβ-カテニンが低下します。A）放射性標識β-カテニン-ルシフェラーゼがタグなしのβ-カテニンタンパク質と同様の速度で分解する。野生型タンパク質と同様に、塩化リチウム（25ミリモル）の添加は、β-カテニン-ルシフェラーゼ分解を阻害する。一人でルシフェラーゼは著しくアフリカツメガエルの卵抽出物に裏返していません。 β-カテニン-ルシファーのルシフェラーゼ活性の変化アーゼ融合は、タンパク質レベルの変化を平行であるB）のLiClの添加（25mMの）又はGSK3 Cの枯渇）ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価されるようにβ-カテニン-ルシフェラーゼ代謝回転を阻害する。D）免疫ブロッティングをインビトロで翻訳されたβ-カテニンのため（抗ルシフェラーゼ抗体を用いた）ルシフェラーゼは、放射性標識された分解アッセイと比較した場合、可能性が高いバックグラウンドに寄与する特定のプレップに自由ルシフェラーゼ、有意な量のタンパク質を明らかにした。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。 アフリカツメガエル抽出物中のβ-カテニン-ルシフェラーゼの調整された劣化に適応させることができるハイスループット形式。β-カテニンの分解の阻害剤としてMG132（450μM）を使用して、β-カテニン-ルシフェラーゼのための代表的なチェッカーボード分析。斜線の列は、MG132で処理したウェルを示し、軽量化列は、ビヒクル（DMSO）処理されたウェルを示す。ハイスループットスクリーニングの潜在的な使用のために許容されるアッセイを示す0.3のスコアの定量およびZ因子計算結果。
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Discussion
アフリカツメガエルの卵抽出物は、β-カテニンの離職率を調査するための堅牢な生化学システムです。 アフリカツメガエルの卵抽出物中のβ-カテニンの濃度は約25 nMの2である。最適な条件下では、卵抽出物は、50〜100 nMの/時の速度でβ-カテニンを分解することが可能であり、200 nMの24で最大の半分である。 アフリカツメガエルの卵抽出物を使用して、β-カテニンの分解を正常に再構成するためのいくつかの重要なステップがあります。これらは、1）高品質のアフリカツメガエルの卵抽出物、卵抽出物が調製される方法の生成、2）品質放射標識β-カテニンとβ-カテニンルシフェラーゼタンパク質を生成すること、3）β-カテニン分解をサポートするために反応条件を最適化すること、および4を含む反応の時点の）適切な処理。
β-カテニンが強固に分解されているアフリカツメガエルの卵抽出物の高品質の製造は、目の品質の両方に依存しますEの卵や卵だけでなく、抽出物は、その後、最終的な抽出物を得るために遠心分離する方法の前に粉砕工程をどのように処理されるか。プロトコルで述べたように、低品質の卵（、糸まだら、または白パフ）が全体で削除されていること、（暗い動物半球と光植物半球間の著しい対照によって証明）のみ高品質の卵が使用されていることを確認することが重要です卵は、手順全体を通して冷たい温度（16℃）で維持され、手順は、可能な限り迅速に行われることをしていることを方法。これは、抽出物の数量の品質を犠牲にしないことが重要です。さらに、前述したように、低品質の卵（> 10％）を産むカエルから卵が完全に廃棄されるべきである。
上記の抽出物は、減数分裂II-CSF逮捕エキス11の変形例である。 β-カテニンの分解（中速エキス）差分のためのアフリカツメガエルの卵抽出物の調製ERS低速または高速である細胞周期30〜32を研究するための準備古典抽出物から35を抽出します。他のタンパク質の最適な分解のためにアフリカツメガエルの卵抽出物を適応すると、遠心分離速度とスピンの数を変更することが必要な場合があります。低速抽出物は、そのまま細胞内小器官などの大型の細胞成分が含まれています。このため、より高速スピンは抽出物の組成を変化させ、潜在的に、目的のタンパク質の分解に影響する抑制性および/または不可欠なコンポーネントを削除します。本明細書に記載の中間速度抽出物の調製は、Wnt経路の構成要素によってβ-カテニンの分解のために最適化される。 （それは別のWntシグナルの成分、アキシンの劣化に対する影響を最小限に抑えますが）4Xよりも大きなエキスを回転すると、大幅にβ-カテニンを分解するための抽出物の容量を減らすことができます。 β-カテニンは、低速スピン抽出物中のカスパーゼを介したタンパク質分解の影響を受けやすいとnoticないeably高速スピンエキスで分解する。これにより、異なる速度抽出物は他のシグナル伝達経路の成分の分解のために最適である可能性が高い。
35 S-β-カテニンおよびβ-カテニン-ルシフェラーゼの生成は市販のキットの数を用いて行うことができる。転写 - 翻訳結合システムを用いたタンパク質の生産は、プラスミドの質に大きく依存している：プラスミドの高純度ミディの製剤は、より良い仕事とDNAミニ調製に比べて、より信頼性が高い。 β-カテニンを放射性標識するために、新たに[35 S]メチオニンまたはtranslabel（[35 S]メチオニンを加えた[35 S]システイン）が好ましいが得られた。 in vitro転写 ·翻訳共役反応で、これによりβ-カテニンへの取り込みが減少する長期の保存に酸化する傾向があることメチオニンおよびシステインの両方に注意してください。なぜなら長期保管、繰り返し凍結融解サイクル劣化を抑制することができる、放射性標識β-カテニンの少量の時間で調製し、その後すぐに使用される。
翻訳されたタンパク質とタンパク質中のメチオニンの数の量は、放射性標識された信号の強さを決定する。 β-カテニンの場合は、分解アッセイのための強力な放射性信号を得るには問題があってはならない。いくつかのメチオニンおよび/ またはその有するタンパク質はうまく変換されない、[35 S]メチオニンおよび[35 S]システインミックスを使用する代わりに、[35 S]メチオニンおよび/ またはエピトープタグ（Mycの）を追加することができ、複数含まれメチオニン。適切なファージプロモーター（T7、T3、およびSP6）を含む種々の発現プラスミドでの成功は、in vitro転写 ·翻訳反応を得ることができますが、PCS2ベースのプラスミドは、一般的に最良の結果が得られます。また、翻訳されたタンパク質のシグナルは、時には劇的に内因5を削除することによって増加させることができる'UTR。最後に、大規模実験（ 例えば 、ハイスループットスクリーニング）のために、組換えβ-カテニンルシフェラーゼの大量が必要とされてもよい。 のSf9 /バキュロウイルス系からのβ-カテニン-ルシフェラーゼはアフリカツメガエルの抽出および胚2における野生型β-カテニンと同様の反応速度で低下します。あるいは、 インビトロ発現系（ 例えば、小麦胚芽系） における高収量に成功ハイスループットスクリーニング19,20に使用されている。
確実に抽出系におけるβ-カテニンの分解を測定するためには、放射性標識β-カテニンまたはβ-カテニンルシフェラーゼ融合物のいずれかからの初期信号が十分に堅牢であることが重要である。分解アッセイのサイズ、必要とされる時点の数、およびインビトロ翻訳反応のWiの効率に関する実験者による最適化従って、いくつかの量必要になることが事前にチェック！分解反応を組み立てる際、1は堅牢な劣化を取得する可能性を高めるために実行できるいくつかのステップがあります。第一に、全ての試薬は迅速に解凍し、先立って完全に解凍する氷の上に配置する必要があります。 β-カテニンの分解は非常にエネルギーに依存するので、ERは比較的新鮮であることが重要である。等次に、 アフリカツメガエル卵抽出物が粘性であり、それは放射性標識β-catenin/β-catenin-luciferase融合の添加後に反応が十分に混合されることが重要であり、ER、タンパク質、小分子モジュレーター、第三に、反応をプレインキュベートすること小分子モジュレーターの影響を試験する場合、氷上で20〜30分間混合すると、より再現性のある結果が得られます。
アフリカツメガエルの卵抽出物からタンパク質を枯渇させる能力は、タンパク質の機能およびそれらの濃度依存的効果を評価するための強力なツールを表す。例として、 キセノンから、GSK3を枯渇させることを証明しているnopusの卵抽出ブロックβ-カテニンの分解を、β-カテニン売上高のGSK3の重要な役割を示している。別の枯渇条件は経験的に異なるタンパク質について決定される必要がある。例えば、豊富なタンパク質は、完全な枯渇を達成するために使用される抗体またはアフィニティーリガンドのビーズの量の増加を必要とする。良好な出発点は、抽出物希釈を最小化するために、1/10抽出物の容量で充填したビーズを使用することである。標的タンパク質に対する抗体/アフィニティーリガンドの結合の強さに加えて、使用されるビーズの種類（ 例えば 、セファロース、アガロース、または磁気）がアフリカツメガエルの卵抽出物36からのタンパク質枯渇の効率に影響を与えることができる。最後に、（典型的には、免疫ブロッティングによって）枯渇の程度を分析するために理想的であろう。 β-カテニン反応が完了したら、サンプルが処理される方法が大幅に実験の結果に影響を与えることができる。の濃度のようにして作製したアフリカツメガエルの卵抽出プレップは52.41 MGは/ 5.40 mg / mlの、±ミリリットルであり、SDS-PAGEゲルの容量をオーバーロードしないことが重要です。これは、ルシフェラーゼ-β-カテニン検定の問題ではありません。このように、各時点について、抽出物の当量を超えない1mlのSDS-PAGEゲルの各レーンにロードされるべきではない。さらに、結果の質を高めるために、ゲル固定工程（オプション）バックグラウンド放射能を減少させ、信号対雑音比を増大させる。ルシフェラーゼアッセイのために、 アフリカツメガエル卵抽出100,000 RLUの初期信号から減少が忠実にβ-カテニン-ルシフェラーゼ融合タンパク質のタンパク質レベルの変化を反映している。
アフリカツメガエル卵抽出物系は、β-カテニン分解の調節を研究するための魅力的な系を表す。抽出システムは、枯渇およびreconstituを介して個々のタンパク質の濃度の正確な制御を可能にする TiONから。時間をかけて、β-カテニンの離職率の動態への影響を監視する能力が優れてWntシグナル伝達におけるこの重要なステップの生化学的メカニズムを理解することができます。このような操作は、Wnt経路の構成要素間の複雑な分子相互作用に深く洞察を提供し、Wnt経路24の第1の数学的モデルの開発のために重要であってきた。一つの注意点は、 アフリカツメガエルの卵抽出物および哺乳類細胞溶解物中のWnt経路成分の濃度は、おそらくWnt経路は、大人の状況37対胚形成の間に調節されている方法の違いを反映して異なることが判明しているということです。 アフリカツメガエルの卵抽出物を使用した放射性および酵素の両方、ルシフェラーゼベースのアッセイを実行する能力は、β-カテニンの分解の生化学的調節を研究するための追加の強力な補完的な質的および定性的なツールを提供しています。
に融合トン">β-カテニンの代謝回転の監視に加えて、負のWntレギュレータ、アキシン、劣化がアフリカツメガエルの卵抽出物のいずれかのルシフェラーゼの放射性標識タンパク質または融合体としてモニターすることができる。ルシフェラーゼの変異体を使用して、ウミシイタケ、アキシンは、以前に同時に2 Wnt経路タンパク質、β-カテニンとアキシン19、20のモジュレーターをスクリーニングするためのハイスループットフォーマットにルシフェラーゼ分解アッセイのために適応させた。この生化学画面は増加FDA承認薬、ピルビニウムを特定し、 アフリカツメガエルの卵抽出物19において、それぞれ、β-カテニンとアキシンの分解速度を減少させた。ピルビニウムは、その後標準的なWntの小分子阻害剤（ 例えば 、 アフリカツメガエルや虫 ）培養ヒト細胞では、様々なモデル生物で検証した経路は、要約すると、 アフリカツメガエルの卵抽出システムは、汎用性の高い生化学システムTHAですtは、Wntシグナル伝達のメカニズムを研究ならびにWnt経路の小分子モジュレーターの同定のためのための多くの方法で利用することができる。本明細書に記載の生化学的方法は、タンパク質の分解が重要な役割を果たしている可能性のある他のシグナル伝達経路にも適用することができる。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、原稿の重要な読書のためのローリー·リーに感謝します。 TWCは、米国心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（12PRE6590007）でサポートされています。 MRBは、国立がん研究所の訓練助成金（T32のCA119925）によってサポートされています。 SSHは国立衛生研究所（R01DK078640）でサポートされています。 ELは、国立衛生研究所（R01GM081635とR01GM103926）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
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