Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב Published: June 17, 2014 doi: 10.3791/51425
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Cell and Developmental Biology and Program in Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Division of Gastroenterology, Hepatology & Nutrition and Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Vanderbilt Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

שיטה מתוארת לניתוח פירוק חלבונים באמצעות רדיואקטיבי וחלבונים לוציפראז-Fusion בתמצית ביצי Xenopus והתאמת להקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה קטנים של פירוק חלבונים.

Abstract

תמצית ביצת laevis Xenopus היא מערכת מאופיינת היטב, חזקה ללימוד הביוכימיה של תהליכים תאיים שונים. תמצית ביצי Xenopus נעשתה שימוש כדי ללמוד מחזור חלבון בהקשרים רבים תאיים, כולל את מחזור התא ומסלולים הולכים אותות 1-3. בזאת, שיטה מתוארת לבידוד תמצית ביצי Xenopus שעבר אופטימיזציה כדי לקדם את ההשפלה של המרכיב הקריטי Wnt המסלול, β-catenin. שתי שיטות שונות מתוארות להעריך פירוק חלבוני β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. שיטה אחת היא מבחינה ויזואלית אינפורמטיבי ([S 35]-radiolabeled חלבונים), ואילו השני הוא לשנותם בקלות רבה יותר למבחני תפוקה גבוהה (גחלילית חלבוני היתוך מתויג לוציפראז). הטכניקות המתוארות יכולות לשמש, אך אינם מוגבלות, להערכת מחזור חלבון β-catenin ולזהות רכיבים מולקולריים תרמו למחזור שלה. בנוסף, ability לטהר כמויות גדולות של תמצית ביצים הומוגנית Xenopus בשילוב עם קריאת הנתונים הכמותיים וקלילות של חלבונים מתויגים לוציפראז מאפשר מערכת זו כדי להתאים בקלות להקרנת תפוקה גבוהה למאפננים של השפלה β-catenin.

Introduction

תמצית ביצת laevis Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד תהליכים בתא ביולוגיים רבים כולל דינמיקת cytoskeletal, הרכבה ויבוא גרעיניים, אפופטוזיס, חילוף חומרים של היוביקוויטין, התקדמות מחזור התא, העברת אותות, ומחזור חלבון 1-17. מערכת תמצית ביצי Xenopus ניתן לניתוח ביוכימי של לגיון של תהליכים תאיים, כי תמצית ביצה מייצגת בעצם ציטופלסמה חי המכילה את כל המרכיבים החיוניים cytoplasmic דרוש לביצוע תהליכים אלו ולאפשר חקירה. ניתן להכין כמויות גדולות של תמצית ביצים בפעם אחת למניפולציות ביוכימיות הדורשות כמויות גדולות של חומר (למשל, טיהור חלבון או הקרנת תפוקה גבוהה) 18-20. יתרון נוסף הוא שהריכוז של חלבונים ספציפיים בתמצית ביצי Xenopus יכול להיות מותאם בדיוק על ידי תוספת של חלבון ו / או immunodepletion של endog רקומביננטיחלבונים בוגדניים בניגוד לtransfection של DNA פלסמיד שבו ביטוי של החלבון של עניין הוא קשה לשליטה. בנוסף, המחסור בחלבונים רקומביננטיים זמינים ניתן להתגבר על ידי התוספת של תמלילים המקודדים את החלבון של עניין, תוך ניצול של הקיבולת הגבוהה של תמצית ביצי Xenopus מוכנה הטרי לתרגם mRNA הוסיף אקסוגני.

הרגולציה של פירוק חלבונים היא קריטית לשליטה רבים מסלולי הסלולר ומעבדת 21. תמצית ביצי Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד פירוק חלבונים, שכן המערכת מאפשרת מספר דרכים לעקוב אחר מחזור חלבון ללא השפעות מבלבלות של שעתוק ותרגום. מסלול איתות Wnt הוא מסלול איתות שמור ביותר שמשחק תפקידים קריטיים בהתפתחות ומחלה. מחזור של β-catenin, מפעיל העיקרי של מסלול Wnt, מוסדר מאוד, ואני במצב יציב מוגבראיבל של β-catenin הוא קריטי להפעלה של גנים מטרת Wnt. החשיבות של השפלה β-catenin מודגשת על ידי העובדה שמוטציות במסלול Wnt המעכבות השפלה β-catenin מצאו ב~ 90% מכל מקרים ספורדיים של סרטן מעי גס 22. השפלה β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt יכולה להיות סכמה בנאמנות בתמצית ביצי Xenopus ללמוד את המנגנון של המחזור שלה, כמו גם לזהות מאפנני מולקולה קטנים רומן של השפלה שלה 2, 19, 20, 23-29.

שיטות להכנה של תמצית ביצי Xenopus לחקר מחזור התא תוארו בפרסומי יופיטר הקודמים 30-32. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינוי של שיטות אלה, והוא מותאם לשפלה של [35 S]-radiolabeled β-catenin ומתויג לוציפראז β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. Assay השפלה radiolabeled מאפשר הדמיה ישירה של רמות חלבון באמצעות autoradiography. מתיונין [35 S] הוא שולב החלבון של עניין באמצעות תגובה בתרגום חוץ גופית שלאחר מכן ניתן להוסיף ישירות לתגובת השפלה. בנוסף, assay מחזור חלבון radiolabeled אינו דורש נוגדן נגד החלבון של עניין או תג אפיטופ, שיכול להשפיע על יציבות חלבון. כי אפילו שינויים קטנים ברמות חלבון, כפי שבאו לידי ביטוי בשינויים בעוצמתה של להקת חלבון רדיואקטיבי, הם דמיינו בקלות על ידי autoradiography, [S 35]-radiolabeled assay השפלה מייצג שיטה שימושית מאוד להדמיה של חלבון מחזור 2.

שילוב של β-catenin לגחלילית בלוציפראז (להלן בפשטות "לוציפראז") מאפשר למדידות כמותיות מדויקות וקלילות של רמות חלבון, כדיכדי לקבוע את מאפייני הקינטית של מחזור β-catenin 19, 20. יתרון עיקרי של assay בלוציפראז הוא שהיא מספקת מערכת כמותיים חזקה הלשנותם בקלות. הפרוטוקול הבא מספק שיטות פשוטות למנסה לאמוד השפלה β-catenin ושיטה חזקה, יעילה ואפקטיבית להקרנת תפוקה גבוהה של מאפנני β-catenin רומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תמצית ביצי Xenopus

הערה: כל צפרדע בתשואה של כ 1 מיליליטר של תמצית ביצים שמישה. תמציות מ10 צפרדעים מוכנות בדרך כלל בזמן זה, והנפח של החיץ המתואר להלן הוא לביצוע הכנת תמצית ביצת 10 צפרדע Xenopus. חיץ הנפח יכול להיות מותאם בהתאם לגדולות יותר או קטנות יותר בהכנות של תמצית ביצים. Preps שנוצר באופן זה יניב בעקביות ריכוזי חלבון ≥ 50 מ"ג / מיליליטר. התהליך של איסוף ביצים ועיבודם לתמצית הוא יעיל ביותר בעת שנערך על ידי שני אנשים. (לטכניקות גידול בעלי צפרדע בסיסיות, ראה סייב et al. 33).

  1. אוסף ביצה
    1. לראש הצפרדעים, להזריק כל נקבת צפרדע עם של הריון Mare סרום גונדוטרופין 100 U (PMSG) ממניות U / ml טרי 250. השתמש במזרק טוברקולין 3 מיליליטר עם מחט G 27 להזריק מתחת לעור, עם השיפוע שלאת המחט, לתוך שק הלימפה הגבי, הנמצא כ 1 סנטימטר מקו האמצע מכתמי מחורצים לאורכו של הרגליים של הצפרדע.
    2. צפרדעי חנות דרוכה במים (בתוספת 20 mM NaCl, ראו סייב et al. 33) ב18 מעלות צלזיוס למשך 5-10 ימים. לעומד מערכות מיכל מים, צפיפות בעלי החיים היא כ -4 ליטר מים לצפרדע ממין נקבה. הערה: הזמן המינימאלי הנדרש לתחולו ייכנס לתוקף הוא 5 ימים, ואת ההשפעות של הטרמה להתפוגג לאחר 10 ימים.
    3. הכן פתרון האצבעות (MMR) ממניות MMR 20x השתנה של 0.5x מארק. 20x MMR מורכב מ2 M נתרן כלורי, אשלגן כלורי 40 מ"מ, סידן כלורי 40 מ"מ, מגנזיום כלוריד 20 מ"מ, ו100 4 מ"מ - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 7.4.
    4. הגדר את הדליים לכל צפרדעים מוזרקות (צפרדע אחת לכל 4 דלי L). הערה: למרות שצפרדע יותר מאחד יכולה להיות ממוקמת באותו הדלי לאיסוף ביצים, אם אחד מהצפרדעיםמטיל ביצים באיכות ירודה בעיקר, כמות ניכרת של מאמץ תידרש להפריד את הביצים באיכות ירודה מאלה המתאימים להכנת תמצית. לפיכך, למקסם את מספר הצפרדעים באותו הטנק כדי למזער את הכמות של חיץ המשמשת לביצה לאסוף הוא לא שווה את הסיכון.
    5. הזרק 750 U גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG) לתוך שק הלימפה הגבי של כל צפרדע באמצעות מחט 27 G כפי שמתואר ב1.1.1.
    6. מניחים כל אחד מהצפרדעים הזריק HCG לסלים 4 L בודדים המכילים MMR 0.5x מקורר 16 ° C.
    7. מניחים את המכולות עם הצפרדעים בחממה 16 ° C כדי לאסוף ביצי O / N (15-16 hr). הערה: שמירה על הטמפרטורה הנכונה היא קריטית עבור ההליך כולו, מאיסוף ביצים להכנת תמצית ביצה.
  2. Dejellying ביצים
    הערה: ביצים מכוסות במעיל ריבה שיש להסירו לפני קבלת תמצית. הסבירות של תמוגה הספונטנית של הביצים גדלה ככל שהזמן betweeביצת n הנחת ולחלץ עליות הכנה. לכן, חשוב להמשיך את השלבים הבאים במהירות אפשרית.
    1. הכן 4 L של 1x MMR, 50 מיליליטר של 0.1x MMR, ו400 מיליליטר של ציסטאין 2%, pH 7.7, שנעשה במים מזוקקים. לשמור את כל הפתרונות ב16 ° C.
    2. לגרש ביצים נוספות, ללחוץ בעדינות בגב התחתון והבטן של הצפרדע.
    3. הסר את הצפרדעים ואת חלק הארי של MMR, לעזוב את הביצים בכ 1-200 מיליליטר של MMR בכל אחד מהסלים.
    4. להסיר שאריות עם טפטפת העברה, ולהעריך את איכות הביצים: ביצים באיכות גבוהה בדרך כלל מתאפיינות בהפרדה ברורה בין האונה החיה הכהה פיגמנט וחצי הכדור הצמחי בצבע בקלילות ויש החושך לאור הניגוד הגבוה ביותר. בטל עם טפטפת העברה כל ביצים המופיעות סיבי, מנומר, או lysed (לבן ונפוח) כפי שהם יקטינו את האיכות הכוללת של התמצית. אם> 10% מהביצים הם באיכות ירודה, כלאצווה צריך להיות מושלך.
    5. מערבבים את הביצים לתוך כוס זכוכית 500 מיליליטר ולשפוך את כמה שיותר MMR ככל האפשר, תוך שמירה על ביצים מתחת למים.
    6. יש לשטוף את ביצים על ידי מתערבל עדין עם פעמיים ביצת הנפח של MMR. חזור על הפעולה פעמיים, ולהסיר את כל פסולת או ביצים באיכות ירודה ללא ספק.
    7. להוסיף כ 100 מיליליטר של ציסטאין 2% לכוס הזכוכית, לערבל בעדינות לתערובת, ולאפשר ביצים להתפשר על 5 דקות ב16 ° C. יוצקים את ציסטאין. הערה: Dejellying מתאפיין בהופעה ההדרגתית של שכבות ריבה צפות מעל הביצים והאריזה קומפקטית יותר של הביצים כפי שהם עכשיו תופסים נפח קטן יותר ללא מעיל הג'לי.
    8. הוספה של ציסטאין 2% עוד 100 מיליליטר, בעדינות מערבולת, חכה 5 דקות, ואז לשפוך לאט ציסטאין. חזור על פעולה עד ביצים הפכו בחוזקה דחוסה (בדרך כלל על ידי טיפול ציסטאין השלישי). הערה: אם ביצים נשארות יותר מדי זמן בציסטאין, הם נוטים תמוגה. בדומה לכך, ביצי dejellied שבירות ונוטה תמוגה מכאנית אם הםהם הסתחררו נמרצים מדי, או אם הם נחשפים לאוויר. ברגע שהביצים כבר dejellied, חשוב להמשיך במהירות לשלבי צנטריפוגה.
    9. יוצקים את ציסטאין, ולשטוף משם את מעיל הריבה ופסולת אחרת בעדינות על ידי שטיפת ביצים ב1x MMR. יוצקים את החיץ בזהירות בצד של הכוס. חזור פעמיים או עד פתרון MMR הוא כבר לא מעונן. בעוד שטיפה עם 1x MMR תמשיך להסיר את הביצים הרעות באמצעות פיפטה העברה.
    10. לבצע שטיפה עדינה סופית עם 30 MMR 0.1x מיליליטר, ובעדינות לשפוך את כמה שיותר החיץ ככל האפשר. שוב, להסיר כל ביצים כמובן רעות.
  3. אריזה וריסוק ביצים על ידי צנטריפוגה
    הערה: התמצית המתוארת להלן המשמשת לפירוק β-catenin הינה נגזרת של תמצית cytostatic הגורם (metaphase II-נעצר). בניגוד לתמצית במהירות נמוכה ומהירות גבוהה המשמשת למחקרי מחזור התא, תמצית מהירות ביניים עובדת הכי טוב בשביל השפלה β-catenin. אניתמצית nterphase דומה מקדמת השפלה β-catenin חזקה אף יותר עבודה אינטנסיבית להכנה.
    1. הוספת leupeptin, Pepstatin, תערובת Aprotinin (LPA, מעכבי פרוטאז) ב10 מיקרוגרם / מיליליטר (בדילול מלא מ10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות בDMSO) וCytochalasin D ב20 מיקרוגרם / מיליליטר (בדילול מלא מ10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות DMSO) ל20 מיליליטר הנותר של 0.1x MMR.
    2. הוסף 0. X MMR המכילה LPA וCytochalasin ד 'לביצים השטופות, מערבולת בעדינות, ודגירה במשך 5 דקות ב16 ° C.
    3. העבר את הביצים לתוך 16 ° 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר טרום צוננים C, לאפשר את הביצים להתיישב, ולהסיר את החיץ שיורית מלמעלה. כדי למנוע חשיפה לאוויר, למשוך כמות קטנה של חיץ לתוך פיפטה ההעברה לפני נסיגת ביצים להעברה. תמשיך להעביר את ביצים נוספות לתוך צינורות צנטריפוגה ולהסיר חיץ שיורית מהחלק העליון של הצינור עד הביצים למלא את צינור צנטריפוגות לעליונה, אשר יהיה למקסם את התשואה שללחלץ.
    4. לארוז את הביצים, מבחנות צנטריפוגה ספין על XG 400 ל60 שניות על 4 מעלות צלזיוס באמצעות הרוטור זווית קבוע. הסרת חיץ שיורית מהחלק העליון של צינורות צנטריפוגה.
    5. לספין הריסוק, ספין צינורות ב 15,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. איסוף שכבת cytoplasmic של חלץ
    הערה: השיטה המתוארת להלן שונה מהשיטה הקלאסית של ניקוב הצד השני של צינור צנטריפוגות על מנת לגבות את שכבת cytoplasmic. פרוטוקול זה הותאם לפישוט ולשימוש עם צינורות צנטריפוגה מסוימים, שהם לשימוש חוזר. אין הבדלים בולטים בקינטיקה של השפלה β-catenin נמצאים עם אחת משיטות. בתמצית את הנקודה הזו צריכה להיות כל הזמן קר במהלך כל התהליך, ויש לבצע את כל השלבים ב 4 ° C.
    1. נקה חור בשכבת השומנים באמצעות קצה פיפטה P1000.
    2. לאסוף את שכבת cytoplasmic (בין שכבת פיגמנט הכהה וliשכבת ght שומנים בדם) באמצעות קצה פיפטה P1000 חדש לתוך צינורות צנטריפוגה טרום צוננים נקיים (איור 1). לתמצית איכות גבוהה וחסונה שמדרדרת β-catenin, לצמצם את כמות שכבת פיגמנט ושומנים בדם, כי הוא נסוג עם שכבת cytoplasmic.
    3. ספין שחולץ שכבת cytoplasmic ב15,000 XG 10 דקות ב 4 ° C ושוב לאסוף את שכבת cytoplasmic. חזור על הספין והחילוץ 1X. הערה: התמצית צריכה להיות "קש צבעוני." אם יש זיהום משמעותי עם השכבות פיגמנט ושומנים בדם בשלב זה, ניתן לחזור על הספין עוד פעם אחת, למרות ספינים מוגזמים יקטינו את הקיבולת של התמצית להשפיל β-catenin.
    4. הוספת LPA וCytochalasin ד 'לתמצית בריכוזים סופיים של 10 מיליליטר כל מיקרוגרם /. הערה: שימוש בשיטה המתוארת תשואות ריכוז עקבי למדי בסך הכל חלבון של כ 50 מ"ג / מיליליטר (52.41 ± 5.40 מ"ג / מיליליטר, n = 3 preps הנפרד) בXenopus למשלתמציות גרם.
    5. (אופציונאלי) למבחני תרגום, להוסיף mRNA (0.1 מ"ג / מיליליטר) כתרים, RNasin (1.5 U / ml), ותמהיל התחדשות אנרגיה (2.2.1) ודגירת התגובה על RT במשך שעה 2 (לפרטים נוספים ראה et Salic אל. 2 וסייב et al. 33). השתמש בתמצית תורגמה מייד למבחני השפלה β-catenin או Snap-הקפאה בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. יש תמצית שהוכנה טרי קיבולת גבוהה לתרגם mRNA הוסיף אקסוגני, אך למרבה הצער, יכולת זו הולכת לאיבוד ברגע שהתמצית קפוא: הערה. כתרי mRNA יכול להיות מוכן בקלות באמצעות ערכות זמינות מסחרי.
    6. תמצית Snap-הקפאה בחנקן נוזלי. הערה: תמציות מאוחסנות בaliquots הקטנים (200 μl) ליחד כי הם במהירות לאבד את יכולתם כדי לבזות β-catenin אם refrozen. עבור אחסון לטווח ארוך, תמצית ניתן לאחסן בחנקן נוזלי. עבור אחסון לטווח קצר, תמצית ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, אם כי o הקיבולתתמצית ו להשפיל β-catenin, ניתן להפחית באופן דרמטי עם אחסון ממושך ב-80 ° C (יותר מ 2 חודשים).

2. הכנת תמצית עבור assay השפלה β-catenin

  1. דלדול מתמצית Xenopus
    הערה: יתרון עיקרי של תמצית Xenopus הוא היכולת לרוקן בקלות רכיבים של מסלול ודווקא להוסיף בחזרה כמות מוגדרת של חלבון על מנת לקבוע את ההשפעות תלויות המינון שלה.
    1. השתמש בתמצית ביצי Xenopus מוכנה טרי או במהירות להפשיר תמצית ומקום קפוא בקרח. לבצע את כל המניפולציות בקור.
    2. להוסיף תמצית ל1/10 הנפח של נוגדן pelleted או חרוזים זיקה (לדוגמא, 20 מיליליטר חרוזים pelleted 200 תמצית מיליליטר). על מנת למזער את הדילול של התמצית, למשוך כמה שיותר נוזלים מהחרוזים ככל האפשר לפני תוספת של התמצית באמצעות טיפים טעינת ג'ל עם טיפים ארוכים, מחודדים.
    3. סובב תמציתתמהיל חרוז ב-C ° 4 במשך שעה 1.
    4. תמהיל ספין תמצית חרוז ב12,600 XG בmicrofuge ב-C ° 4 ל30 שניות. לחלופין, אם חרוזים מגנטיים משמשים, להחיל שדה מגנטי כדי לאסוף חרוזים.
    5. העברה מדולדלת תמצית לצינור microfuge טרי על קרח. היזהר שלא להעביר כל חרוזים בתמצית.
    6. לאשר את היעילות של דלדול ידי immunoblotting שתי תמצית וחרוזים מדולדלים.
    7. הכן את התמצית עבור assay השפלה β-catenin כפי שמתואר ב2.2.
  2. אופטימיזציה של Xenopus חלץ לביזוי β-catenin
    הערה: השפלה β-catenin בתמצית ביצי Xenopus היא תהליך אנרגיה תלויה שכלה את מהירות חנויות ATP אנדוגני. כתוצאה מכך, נדרשת מערכת התחדשות אנרגיה כדי לשמור השפלה β-catenin חזקה.
    1. להכין תערובת 20x התחדשות אנרגיה (ER) בהיקף של 150 קריאטין פוספט מ"מ, 20 מ"מ ה-ATP, 600 מיקרוגרם / phosphokinase קריאטין מיליליטר,ו20 מ"מ MgCl 2. ER צריך להיות aliquoted ומאוחסן ב -80 ° C. הימנע מהקפאה / הפשרה מחזורים חוזרים ונשנים באמצעות aliquots הקפואים קטנים.
    2. מהירות להפשיר תמצית ביצי Xenopus ידי שפשוף הצינור הקפוא בין ידיים. מניחים את הצינור על קרח ממש לפני כל התמצית נמס.
    3. הוסף 10 μl תמהיל התחדשות אנרגיה (20x ER) לaliquot (200 μl) של תמצית ביצי Xenopus. מערבבים היטב על ידי מצליף vortexing הצינור והדופק במהירות. Pulse-ספין ומייד מניח על קרח.
    4. (אופציונלי) מחזור של β-catenin ניתן לשפר מעט בתמצית ביצי Xenopus על ידי תוספת של היוביקוויטין (סופי 1.25 מ"ג / מיליליטר). Cycloheximide (0.1 מ"ג / מיליליטר סופי) ניתן גם להוסיף כדי למזער את התרגום של תמלילי אנדוגני.
    5. Aliquot הכרכים המתאימים עבור assay השפלה לתוך צינורות microfuge טרום צוננים על קרח. עבור מבחני השפלה β-catenin radiolabeled, לסגת 2-5 מיליליטר לחלץ עבור כל נקודת זמן. </ Li>

3. Assay השפלה β-catenin radiolabeled בתמצית ביצי Xenopus

הערה: יש לבצע את כל הצעדים על קרח, אלא אם כן צוינו אחרת.

  1. הכנת β-catenin radiolabeled
    1. הכן טרי בחלבון מתיונין-radiolabeled-מסונתז מבחנה [35 S] באמצעות ערכות זמינות מסחרי. הערה: חלבוני יצירת 35 S-שכותרתו (זמן מחצית חיים 87 ימים) מיוצרים בקלות וביעילות באמצעות במצמידי מבחנה ערכות תמלול בתרגום זמינות מסחרי. חשוב שהחלבון המתורגם מתויג מספיק כך שהשינויים במחזור חלבון ניתן דמיינו בקלות.
    2. כדי לאשר radiolabeling המוצלח, לבצע SDS-PAGE/autoradiography עם 0.5 μl של החלבון המתורגם. לכמת את עוצמת להקת β-catenin radiolabeled באמצעות ImageJ, ImageQuant, או progr תוכנה כמותיים חלופיאני. הערה: להקת חלבון β-catenin radiolabeled צריכה להיות לעין בסרט תוך כמה שעות (4-6 hr).
    3. Snap-להקפיא את חלבון רדיואקטיבי בחנקן נוזלי לאחסון עד לשימוש. הערה: אחסון ממושך (> 2 חודשים) והקפאה / הפשרה מרובה (יותר מ -2) יכול להשפיע קשות את היכולת של β-catenin radiolabeled להשפיל וחסונה בתמצית ביצי Xenopus. בדרך כלל, היציבות של חלבוני radiolabeled יורדת באופן משמעותי לאחר חודש 1 של אחסון ב -80 ° C; וכך, β-catenin radiolabeled יחסית מוכן טרי נותן את התוצאות הטובות ביותר במבחני השפלה אלה.
  2. ביצוע Assay השפלה β-catenin
    1. להוסיף 1-3 μl (תלוי בעוצמת אות להקת radiolabeled) של בβ-catenin תורגם חוץ הגופייה (וחלבונים אחרים, מולקולות קטנות, וכו 'שנבדקות) ל20 μl של תערובת תגובת Xenopus על קרח. מערבבים היטב על ידי quickly מצליף את הצינורית ודופק קצר של vortexing; זה הוא צעד חשוב כתמצית ביצי Xenopus היא צמיגה מאוד, וערבוב שלם ישפיע על העקביות של התוצאות. ספין דופק ומניחים על קרח.
    2. להתחיל את תגובת השפלה β-catenin על ידי העברת צינורות RT.
    3. בנקודת הזמן המיועדת, להסיר 1-5 מיליליטר של המדגם ומערבבים מייד עם חיץ SDS מדגם (5x נפח) כדי לעצור את התגובה. כדי לוודא תגובת השפלה הוא הופסק לחלוטין, צינור קפיצי מספר פעמים ומערבולת במרץ.
    4. בצע SDS-PAGE/autoradiography. הפעל 1 מיליליטר שווה (~ 50 מ"ג של חלבון) של התמצית עבור כל נקודה / נתיב זמן. השפלה של β-catenin בתמצית ביצי Xenopus יש שמעידה הירידה תלויה בזמן בעוצמת איור להקת β-catenin radiolabeled 2. לכמת תוצאות באמצעות ImageJ, ImageQuant, או תוכנת הדמיה מועדפת אחרת במידת צורך.
    5. (Optional) משרים ג'ל SDS-polyacrylamide בתיקון פתרון (10% חומצה אצטית ומתנול 30% במים מזוקקים) לפני הייבוש כדי להקטין רדיואקטיביות רקע ולהגדיל את האיכות של התמונה.

4. Β-catenin-לוציפראז Assay השפלה בתמצית ביצי Xenopus

לבצע את כל הצעדים על קרח, אלא אם כן צוין אחרת.

  1. הכנת β-catenin-לוציפראז
    1. לסנתז β-catenin הלא רדיואקטיבי, מתויג לוציפראז שימוש במערכת בשילוב תמלול בתרגום עם תערובת חומצות אמינו מלאה.
    2. אשר ייצור של β-catenin-מתויג לוציפראז על ידי מדידת פעילות לוציפראז .5-1 μl של התגובה. להעריך הארה רקע על ידי מדידת הארה מתערובת תגובה לא מתורגמת. הערה: ערכות מסחריות מרובות זמינות למדידת פעילות לוציפראז. הארה חיים ארוך, לעומת זאת, עובדת טוב במיוחד עבור אסא השפלהy.
  2. ביצוע Assay השפלה β-catenin-לוציפראז
    1. להפשיר ולהכין תמצית ביצי Xenopus כמו ב2.2.
    2. להוסיף בהיתוך תורגם מבחנה β-catenin-לוציפראז (מ4.1) לתוך תערובת מוכנה Xenopus תגובה (מ2.2) על קרח ומערבבים היטב כמו ב3.2.1. הערה: הפעילות של לוציפראז β-catenin שמתווסף לתמצית היא בדרך כלל בין 20 - 50,000 יחידות הארה יחסי (RLU) / מיליליטר של תמצית (המבוסס על מדידות המתקבלות מ4.1.2). אות זינוק צריכה להיות כ 100,000 RLU (2-5 מיליליטר של-catenin-לוציפראז β ההיתוך בתורגם חוץ הגופייה).
    3. Shift כדי לחלץ RT כדי להתחיל את תגובת השפלה.
    4. הסרת aliquot של התגובה בזמן המצוין וSnap-הקפאה בחנקן נוזלי. הערה: דגימות שלושה עותקים יוסרו בדרך כלל לניתוח עבור כל נקודת זמן. תמצית קפואה יכולה להיות מאוחסנת ב -80 ° C האנטil הם מוכנים להיות מנותחים.
    5. קרח דגימות הפשרה, דגימות העברה לצלחות סטנדרטיות לבנה 96 היטב על קרח, ותהליך לפעילות לוציפראז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סכמטי של השפלה β-catenin בתמצית ביצי Xenopus מוצג באיור 2 א. 35 β-catenin כותרת-S הודגר בתמצית ביצי Xenopus, aliquots (1 מיליליטר לחלץ שווה ערך) הוסרו במועדים המתאימים, ודגימות היו נתונים SDS-PAGE ואחרי autoradiography. השפלה β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt מתווכת על ידי מערכת היוביקוויטין-proteasome 2, והשפלה של β-catenin [35 S]-radiolabeled בתמצית Xenopus הוא מעוכבת על ידי תוספת של המעכב הפרוטאזום MG132 איור 2. השפלה של β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt היא תלויה בזירחון שלה על ידי GSK3 34. השפלה GSK3 תלויה ניתן להדגים בקלות במספר הדרכים באמצעות תמצית ביצי Xenopus: 1) β-catenin (המוטציה SA) (אתרי זירחון GSK3 מוטציה לalanines) הוא התייצב בקסנוביצת מוגלה תמצית ביחס ל2B איור חלבון β-catenin wild-type. 2) מעכבי מולקולה קטנים של GSK3 (LiCl) דומים לעכב פירוק של β-catenin (איור 2 ג). 3) לבסוף, דלדול של GSK3 מתמצית ביצי Xenopus מעכב פירוק של β-catenin; השפלה יכולה להינצל על ידי תוספת של GSK3 אקסוגניים איורים 2D-E.

Assay השפלה β-catenin radiolabeled מספק הערכה חזותית אינפורמטיבי במיוחד של מצבו של השפלה (השפלה בתיווך היוביקוויטין כלומר לעומת מחשוף אפופטוטיים). Autoradiography, לעומת זאת, הוא עבודה אינטנסיבית, ו, על פי רוב, מוגבל לניתוח תפוקה גבוהה של המסלול (למשל, מיון למאפנני מולקולה קטנים של מסלול Wnt). Assay השפלה β-catenin-לוציפראז הוא יותר בקלות ובמהירות לכימות כסכום של הארה הנפלטת עומדים ביחס ישר לבוקרount חלבון β-catenin-לוציפראז של. תכונה זו הופכת את assay לוציפראז פשוט וישימה בקלות למבחני תפוקה גבוהה.

זה חשוב כדי לקבוע כי יש היתוך לוציפראז נכסים דומים לזה של חלבון nonfusion. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי פיוזינג חלבון לוציפראז לN-הסופית, C-סופית, או באופן פנימי. היתוך של בלוציפראז לN-או C-הסופית של β-catenin אינו משפיע על יכולתה להפעיל את גנים מטרת Wnt incultured תאי יונקים או התחלופה שלה בתמצית Xenopus ביצת 2, 19, 20.

Assay השפלה β-catenin-לוציפראז נציג בתמצית ביצי Xenopus מוצג באיור 3 א שבשפלה של β-catenin-לוציפראז הוערכה על ידי SDS-PAGE/autoradiography של פעילות החלבון ולוציפראז radiolabeled של ההיתוך. שיעור degradation של β-catenin-לוציפראז דומה לחלבון β-catenin לא מתויג. הרגולציה של השפלה להיתוך β-catenin-לוציפראז היא למעשה זהה לחלבון nonfusion כתוספת של LiCl או דלדול של GSK3 הביאו לעיכוב של β-catenin-לוציפראז מחזור. כפי שניתן לראות באיורים 3 ב-C, שינויים באות רדיואקטיבית של חלבון β-catenin-לוציפראז מקבילים לשינויים בפעילות האנזימטית בלוציפראז לאורך זמן. בעיה שנובעת משימוש בβ-catenin-לוציפראז (בעיקר חלבון היתוך שנוצר ממערכת תמלול בתרגום חוץ גופית) היא אות לוציפראז רקע שנגרמה על ידי שימוש באתרים פנימיים translational התחלה או סיום translational המוקדם איור 3D. בעיה זו לעתים ניתן להתגבר על ידי אופטימיזציה של ריכוז ה-DNA משמש בתגובת IVT. לא, עם זאת, להבחין ירידה בפעילות לוציפראז רקע כאשר אנחנו מגווניםריכוז ה-DNA פלסמיד למבנה β-catenin-לוציפראז המסוים שלנו. סביר להניח כי אנו צריכים לשנות את דרך מימוש חלבון ההיתוך באמצעות mutagenesis על מנת למזער עוד יותר אתרים פנימיים translational התחלה ו / או סיום של תרגום המוקדם של חלבון היתוך β-catenin-לוציפראז. בגלל חלבון לוציפראז הוא יציב למדי במהלך תגובת השפלה באיור 3 א תמצית ביצי Xenopus הזמן, עם זאת, אות רקע זה יכול להיות פשוט נגרעה אם היחס של חלבון לוציפראז הקטום להיתוך β-catenin באורך המלא הוא ידוע .

כוח של assay בלוציפראז הוא היכולת לשנות את קנה מידה לפורמט רב היטב, המאפשר לביצוע הקרנת תפוקה גבוהה למאפננים של השפלה β-catenin. באיור 4, ניתוח שחמט נציג מוצג באמצעות מעכב של השפלה β-catenin, MG132, אשר מעכב את הפרוטאזום. התוצאה של ניסוי השחמט מציינת כי assay הוא אחיד ושחזור בפורמט 96 היטב ומדגים את התאמתה להקרנת תפוקה גבוהה.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של ההכנה של תמצית ביצי Xenopus מרוכזת. ביצים נאספות מXenopus הזריק HCG laevis נקבות, נדחסו עם ספין במהירות נמוכה (400 XG), ומרוסקות ומופרדות עם מדיום במהירות (XG 15,000 ספין). תשמור על עצמך להזריק מתחת לעור לתוך שק הלימפה הגבי, להסיר את הביצים הרעות בזהירות, ולהפריד בזהירות את תמצית cytoplasmic באיכות גבוהה מהתמצית כהה יותר באיכות נמוכה יותר כפי שצוין בטקסט.

igure 2 "עבור: תוכן width =" 5in "עבור: src =" "/> /" = src "/ files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg
β-catenin כותרת איור 2. β-catenin מדרדרת חסונה כאשר הודגרו בXenopus לחלץ ביצה.) סכמטי של assay השפלה. ב ') [S 35] הוכן על ידי תגובת IVT מדרדרת חסונה כאשר הודגרו בתמצית ביצי Xenopus. תוספת של MG132 (200 מיקרומטר) כדי לחלץ ביצת Xenopus מעכבת השפלה β-catenin. מוטציה לalanines של phosphosites GSK3 בתוך β-catenin (β-catenin SA) או תוספת של LiCl C (25 מ"מ)) מעכבת השפלה β-catenin. ד ') אתר GSK3 המחייב של' תה שואל (חומצות אמינו 506-560) מכלה את יעילות GSK3 מתמצית ביצי Xenopus. ה) תמצית ביצים מדולדלת GSK3 Xenopus מעכבת השפלה β-catenin ויכולה להינצל על ידי בנוסף oו GSK3 רקומביננטי (0.1 מ"ג / מיליליטר). תוספת של LiCl לוקים (25 מ"מ) הקיבולת של GSK3 רקומביננטי להציל השפלה β-catenin בתמצית מדולדלת GSK3. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. Β-catenin-מתויג בלוציפראז מדרדרת כאשר הודגרו בתמצית ביצי Xenopus.) Radiolabeled β-catenin-לוציפראז מדרדרת בקצב דומה לזה שחלבון β-catenin לא מתויג של. כמו עם חלבון wild-type, תוספת של LiCl (25 מ"מ) מעכבת β-catenin-לוציפראז השפלה. לוציפראז לבדו אינו ניכר להתהפך בתמצית ביצי Xenopus. שינויים בפעילות בלוציפראז של β-catenin-וציפרתוספת היתוך ASE מקביל לשינויים ברמות החלבון שלה. ב) LiCl (25 מ"מ) או דלדול של GSK3 C) מעכבת β-catenin-לוציפראז מחזור כפי שהוערך על ידי מדידת פעילות לוציפראז. ד) immunoblotting במבחנה תורגם β-catenin- לוציפראז (באמצעות נוגדן אנטי לוציפראז) גילה כמויות משמעותיות של חלבון בלוציפראז ללא בpreps מסוים שסביר להניח שתורם לרקע גבוה יותר בהשוואה לassay השפלה radiolabeled. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
השפלה איור 4. מוסדר של β-catenin-לוציפראז בתמצית Xenopus ניתן להתאיםפורמט תפוקה גבוהה. ניתוח שחמט נציג לβ-catenin-לוציפראז באמצעות MG132 (450 מיקרומטר) כמעכב של השפלה β-catenin. עמודות מוצלות מצביעות על בארות שטופלו ב-MG132, ועמודות קלות לייצג רכב בארות שטופלו (DMSO). כימות ותוצאת חישוב Z-פקטור בציון של 0.3 המציין assay מקובל לשימוש פוטנציאלי בהקרנת תפוקה גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תמצית ביצי Xenopus היא מערכת ביוכימית חזקה לחקירת מחזור β-catenin. הריכוז של β-catenin בתמצית ביצי Xenopus הוא ~ 25 ננומטר 2. בתנאים אופטימליים, תמצית הביצה היא מסוגלת משפיל β-catenin בשיעור של 50-100 ננומטר / שעה וחצי מקסימאלי ב200 ננומטר 24. ישנם מספר צעדים קריטיים לכינון מחדש מוצלח של השפלה β-catenin באמצעות תמצית ביצי Xenopus. אלה כוללים 1) יצירת תמצית איכות גבוהה Xenopus ביצה ואת האופן בו תמצית ביצה מוכנה, 2) שהניבו radiolabeled β-catenin איכות וחלבון β-catenin-לוציפראז, 3) אופטימיזציה של תנאי תגובה לתמיכה בשפלת β-catenin, ו4 ) עיבוד נכון של נקודות זמן תגובה.

הכנה באיכות גבוהה של תמצית ביצי Xenopus בי β-catenin נפגעת וחסונה תלויה הן באיכות של הביצים ודואר איך ביצי מטופלות לפני שלב הריסוק, כמו גם אופן שבו התמצית היא centrifuged לאחר מכן כדי להשיג את התמצית הסופית. כפי שהוזכר בפרוטוקול, חשוב כדי להבטיח שביצים רק באיכות גבוהה (שמעידות ניגוד חריף בין האונה הכהה בעלי החיים וצמחיים חצי כדור אור) נמצאות בשימוש, כי ביצים באיכות ירודה (פחזניות סיבי, מנומר, או לבן) יוסרו לאורך התהליך, שביצים נשמרות בטמפרטורה קרירה (16 מעלות צלזיוס) לאורך כל ההליך, וכי ההליך מתבצע במהירות אפשרית. חשוב שלא להקריב את האיכות לכמות של תמצית. בנוסף, כפי שהוזכר קודם לכן, ביצים מצפרדע שמטילה ביצים באיכות ירודה (> 10%) צריכה להיות מושלכות לגמרי.

התמצית שתוארה לעיל היא שינוי של מיוזה II-נעצר תמצית CSF 11. ההכנה של תמצית ביצי Xenopus לשפלת β-catenin הבדל (תמצית מהירות ביניים)ERS מתמציות קלאסיות מוכנות ללימוד תא מחזור 30-32, שהם במהירות נמוכה או במהירות גבוהה תמציות 35. התאמת תמצית ביצי Xenopus לפירוק אופטימלי של חלבונים אחרים עשויה לדרוש לשנות את מהירות צנטריפוגה ומספר הספינים. תמצית במהירות נמוכה מכילה אברונים שלמים ורכיבים סלולריים גדולים אחרים. לפיכך, ספינים מהירות גבוהים יותר יהיו לשנות את ההרכב של התמצית ואפשרות להסיר רכיבים מעכבים ו / או חיוניים שישפיעו על פירוקו של החלבון של עניין. הכנת תמצית מהירות ביניים המתוארת כאן היא מותאמת לפירוק של β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt. ספינינג לחלץ יותר מ 4X יכול להקטין באופן משמעותי את היכולת של התמצית להשפיל β-catenin (אם כי יש לו השפעה מינימאלית על השפלה של עוד מרכיב Wnt, 'תה שואל). β-catenin הוא רגיש proteolysis תיווך caspase בתמצית ספין במהירות נמוכה ולא noticeably בזות בתמצית ספין במהירות גבוהה. לפיכך, סביר להניח כי תמציות מהירות שונות תהיה אופטימליות לפירוק של מרכיבים של מסלולי איתות אחרים.

הדור של 35 S-β-catenin וβ-catenin-לוציפראז יכול להתבצע באמצעות מספר ערכות זמינות מסחרי. הפקת חלבון באמצעות מערכות בשילוב תמלול בתרגום תלויה מאוד באיכות של פלסמיד: פוליפוני-הכנות טהורות ביותר של פלסמידים לעבוד טוב יותר ואמינות יותר בהשוואה ל-DNA מיני הכנות. לradiolabeling β-catenin, טרי הושג מתיונין [35 S] או Translabel (מתיונין [35 S] בתוספת ציסטאין [35 S]) הוא מועדפת. שים לב שמתיונין וציסטאין לשניהם יש נטייה להתחמצן באחסון ממושך ובכך להקטין שילובם בβ-catenin בתגובה במבחנה בשילוב תמלול בתרגום. מכיוון שאחסון ממושך ולהקפיא הפשרה חוזרת ונשניתמחזורים יכולים לעכב השפלה, כמויות קטנות של β-catenin radiolabeled מוכנים בזמן ושימוש קצר לאחר מכן.

כמות החלבון המתורגם ומספר methionines בחלבון לקבוע את עוצמת אות רדיואקטיבי. עבור β-catenin, לא צריכה להיות שום בעיות בהשגת אותות רדיואקטיביים חזקים למבחני השפלה. לחלבונים עם כמה methionines ו / או ש, מתיונין לא לתרגם גם [35 S] ו [35 S] תמהיל ציסטאין יכול לשמש במקום מתיונין [35 S] ו / או להוסיף תג epitope (Myc) המכיל מספר רב של methionines. למרות שניתן להשיג הצלחה עם פלסמידים ביטוי שונים המכילים מקדמי הפאג המתאימים (T7, T3, וSP6) במבחנת תגובות תמלול בתרגום, המבוסס על פלסמיד pCS2 בדרך כלל נותן את התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, האות של החלבון המתורגם לפעמים יכולה להיות מוגברת באופן דרמטי על ידי מחיקת אנדוגני 5'UTR. לבסוף, לניסויים בקנה מידה גדולה (לדוגמא, תפוקה גבוהה הקרנה), ייתכן שתהיה צורך בכמות גדולה של β-catenin-לוציפראז רקומביננטי. β-catenin-לוציפראז ממערכת Sf9 / baculovirus מדרדרת עם קינטיקה דומה כמו β-catenin wild-type בתמצית Xenopus ועוברים 2. לחלופין, תשואה גבוהה במערכת ביטוי חוץ גופית (למשל מבוסס נבט חיטה) שמשה בהצלחה להקרנת תפוקה גבוהה 19, 20.

על מנת למדוד את ההשפלה של β-catenin במערכת לחלץ באופן מהימן, חשוב שהאות הראשונה משני β-catenin radiolabeled או היתוך β-catenin לוציפראז היא מספיק חזקה. לפיכך, מידה מסוימת של אופטימיזציה על ידי הנסיין בגודל של assay השפלה, את מספר נקודות זמן הנדרש, ואת היעילות של wi תגובת התרגום חוץ גופיתתהיה צורך. כשהרכבת תגובת השפלה, ישנם מספר צעדים שניתן לנקוט כדי לשפר את הסיכוי להשגת השפלה חזקה. ראשית, צריכים להיות מופשרים כל ריאגנטים במהירות והניחו על קרח לפני ההפשרה המלאה שלהם. משום השפלה של β-catenin היא מאוד תלויה אנרגיה, חשוב שחדר המיון הוא יחסית טרי. שנית, תמצית ביצי Xenopus היא צמיגה, וזה קריטי, כי התגובה היא מעורבת באופן יסודי לאחר תוספת של היתוך β-catenin/β-catenin-luciferase radiolabeled, ER, חלבון, מאפנני מולקולה קטנים, וכו 'שלישית, מראש דוגרים התגובה לערבב במשך 20-30 דקות על קרח נותן תוצאות לשחזור יותר כאשר בודקים השפעות של מאפנני מולקולה קטנים.

היכולת לרוקן את החלבונים מתמצית ביצי Xenopus מייצגת כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד חלבון והאפקטים תלוי הריכוז שלהם. כדוגמא, אנו מראים כי מדלדלים GSK3 מXeלוקי nopus תמצית ביצת השפלה של β-catenin, המעידים על התפקיד החשוב של GSK3 במחזור β-catenin. תנאי דלדול שונים יצטרכו להיקבע באופן אמפירי לחלבונים שונים. כך, למשל, חלבונים בשפע ידרשו גידול בסך של חרוזים יגנד נוגדן או זיקה בשימוש כדי להשיג דלדול מלא. נקודת התחלה טובה היא להשתמש בחרוזים ארוזים ב1/10 הנפח של התמצית על מנת למזער את דילול תמצית. בנוסף לכוחו של מחייב של ליגנד נוגדן / זיקה לחלבון המטרה, הסוג של חרוזים (למשל, sepharose, agarose, או מגנטי) המשמש עשויים להשפיע על היעילות של דלדול חלבון מתמצית ביצי Xenopus 36. לבסוף, זה יהיה אידיאלי כדי לנתח את המידה של דלדול (בדרך כלל על ידי immunoblotting). ברגע שתגובת β-catenin הושלמה, את האופן שבו הדגימות מעובדות יכול מאוד להשפיע על תוצאות הניסוי. הריכוז שלpreps תמצית ביצי Xenopus שהוכן באופן מתואר הוא 52.41 מ"ג / מיליליטר ± 5.40 מ"ג / מיליליטר, וזה חשוב לא להעמיס על הקיבולת של ג'ל SDS-PAGE; זה לא בעיה עם assay לוציפראז-β-catenin. לכן, עבור כל נקודת זמן, יש לטעון לא יותר מ 1 מיליליטר של תמצית מקביל לנתיב אחד של ג'ל SDS-PAGE. כדי לשפר את איכות התוצאות נוספת, צעד ג'ל הקיבעון (האופציונלי) יקטן רדיואקטיביות רקע ולהגדיל את יחס אות לרעש. עבור assay לוציפראז, ירידה מהאות ראשונה של 100,000 RLU בתמצית ביצי Xenopus בנאמנות משקפת את השינוי ברמות החלבון של חלבון היתוך β-catenin-לוציפראז.

מערכת תמצית ביצי Xenopus מייצגת מערכת אטרקטיבית ללמוד הרגולציה של השפלה β-catenin. מערכת התמצית מאפשרת שליטה המדויקת של הריכוז של חלבונים בודדים באמצעות דלדול וreconstitu tion. היכולת לפקח על ההשפעות שלהם על קינטיקה של מחזור β-catenin לאורך הזמן מאפשרת הבנה טובה יותר של המנגנון ביוכימי של שלב מכריע זה בהעברת אותות Wnt. מניפולציות כאלה סיפקו תובנה עמוקה האינטראקציות מולקולריות מורכבות בין הרכיבים של מסלול Wnt והיו קריטיים להתפתחות של המודל המתמטי הראשון של מסלול Wnt 24. אזהרה אחת היא שהריכוזים של מרכיבים שונים של מסלול Wnt בתמצית ביצי Xenopus וlysates תא היונקים נמצאו שונים, שכנראה משקפים את ההבדלים באופן שבו מסלול Wnt מוסדר בעובר לעומת מצב המבוגרים 37. היכולת לבצע מבחני הן רדיואקטיבי והאנזימטית, מבוסס לוציפראז באמצעות תמצית ביצי Xenopus מספקת הוסיפה כלים איכותניים וכמותיים משלימים רבי עוצמה ללימוד הרגולציה ביוכימיים של השפלה β-catenin.

t "> בנוסף למעקב אחר מחזור של β-catenin, השפלה של הרגולטור השלילי Wnt, 'התה שואל, יכולה להיות במעקב בתמצית ביצי Xenopus או כחלבון או היתוך radiolabeled ללוציפראז. שימוש בגרסה של לוציפראז, Renilla, התמזגו 'תה שואל, הותאם בעבר עבור assay השפלה לוציפראז לפורמט תפוקה גבוהה מסך בו זמנית למאפננים של שני חלבוני Wnt מסלול, β-catenin ו19' תה שואל, 20. מסך ביוכימיים זה זיהה את ה-FDA בסמים, pyrvinium שגדל ו ירידה בקצב הפירוק של β-catenin ו'תה שואל, בהתאמה, בתמצית ביצי Xenopus 19. Pyrvinium קבל תוקף בתאים אנושיים בתרבית ובאורגניזמים מודל שונים (למשל, Xenopus וסי אלגנס) לאחר מכן כמעכב מולקולה קטן של Wnt הקנונית מסלול. לסיכום, מערכת תמצית ביצי Xenopus הוא tha מערכת ביוכימית תכליתילא ניתן לנצל במגוון רחב של דרכים כדי ללמוד את מנגנון האיתות של Wnt, כמו גם לזיהוי מאפנני מולקולה הקטנים של מסלול Wnt. שיטת יוכימיים המתוארות כאן יכולה להיות מיושמת על מסלולי איתות אחרים שבה פירוק חלבונים עשוי לשחק תפקיד קריטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לורי לי לקריאה ביקורתית של כתב היד. TWC נתמך על ידי predoctoral מלגת איגוד לב אמריקאי (12PRE6590007). MRB נתמך על ידי מענק לאומי לסרטן מכון אימון (CA119925 T32). SSH נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01DK078640). EL נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM081635 וR01GM103926).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) ProSpec hor-272-A Reconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropin Sigma CG10-10VL
Potassium chloride Fisher BP366-1
Sodium chloride Research Products International S23020-5000.0
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Calcium chloride Acros Organics AC42352-5000
HEPES Fisher BP310-1
Cysteine Acros Organics AC17360-1000
Leupeptin Sigma L2884-10MG
Aprotinin Sigma A1153-10MG
Pepstatin Sigma P4265-5MG
Cytochalasin B Sigma C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip Becton Dickinson 309657
27 G needle Becton Dickinson 305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed Corning 3605
Steady-Glo luciferase assay system Promega E2520 Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system Promega L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system Promega L3260 Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35] Perkin Elmer NEG772007MC
Creatine phosphate Sigma 27920-5G
ATP Sigma A2383-5G
Creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system Promega E2920 Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes Fisher Scientific 0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit Ambion AM1340
Anti-firefly luciferase antibody Abcam ab16466
Anti-GSK3 antibody BD Transduction Laboratories 610201
FLUOStar Optima BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific
16 °C Incubator Percival Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 88, פירוק חלבונים radiolabel לוציפראז autoradiography הקרנת תפוקה גבוהה
הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, T. W., Broadus, M. R.,… More

Chen, T. W., Broadus, M. R., Huppert, S. S., Lee, E. Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. J. Vis. Exp. (88), e51425, doi:10.3791/51425 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter