Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת RNA קטן מסרום אדם. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מיקרו RNA בסרום מהסרטן לשימוש במערכי ה-DNA וגם PCR כמו singleplex. הפרוטוקול מנצל ריאגנטים פנול וthiocyanate guanidinium עם שינויים להניב RNA באיכות גבוהה.
Abstract
הניתוח של RNA והביטוי שלה הוא תכונה נפוצה במעבדות רבות. משמעות היא הופעתה של RNA קטן כמו מיקרו RNA, אשר נמצאים בתאי יונקים. RNAs הקטן אלה הם רגולטורים גן עוצמה שליטה מסלולים חיוניים כגון צמיחה, פיתוח ומוות ועניין רב כבר מופנים כלפי הביטוי שלהם בנוזלי גוף. זאת בשל חוסר הוויסות שלהם במחלות בבני אדם כגון סרטן ויישום הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים בסרום. עם זאת, הניתוח של ביטוי מירנה בסרום עשוי להיות בעייתי. ברוב המקרים הסכום של סרום הוא להגביל וסרום מכיל כמויות נמוכות של רנ"א הכל, מתוכם RNAs הקטן מהווים 0.4-0.5 1% בלבד. לכן הבידוד של כמויות מספיקות של RNA האיכותי מסרום הוא אתגר גדול לחוקרים כיום. במאמר זה טכני, אנחנו מדגימים שיטה שבה משתמשת רק 400 μl של סרום אנושי להשיג RNA מספיק לאף אחד ממערכי ה-DNA או ניתוח qPCR.dvantages של שיטה זו הוא הפשטות והיכולת להניב RNA באיכות הגבוהה שלה. זה לא דורש עמודות מיוחדות עבור טיהור של RNA הקטן ומנצל חומרים כימיים בכלל וחומרה שנמצאו במעבדות משותפות. השיטה שלנו מנצלת שלב נעילת ג'ל כדי למנוע זיהום פנול ואילו באותו הזמן מניב RNA באיכות גבוהה. גם אנחנו מציגים את צעד נוסף כדי להסיר את כל המזהמים נוספים במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה הוא יעיל מאוד בבידוד תשואות של RNA הכולל של עד 100 ng / μl מסרום, אבל יכול גם להיות מותאם לרקמות ביולוגיות אחרות.
Introduction
בשנים האחרונות, חלה דחיפה גוברת לגלות סמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי המוקדם של מחלות בבני אדם. תשומת לב רבה התמקדה באמצעות RNA קטן כגון מיקרו RNA 2 (miRNAs או מירס) כסמנים פוטנציאליים. RNAs הקטן אלה נמצאים בנוזלי גוף כגון סרום ומחקרים הראו שהם עמידים לפירוק ויציבים על פני טווח של תנאים סביבתיים משתנים 3. בהתחשב miRNAs תכונות, הסרום או במחזור אלה הם הסמן הביולוגי האידיאלי 4, 5. נכון לעכשיו יש שתי גישות עיקריות לבידוד של RNA הקטן מנוזלים ביולוגיים. הגישה הראשונה משתמשת בטכנולוגיה מבוססת עמודה להיקשר וelute RNA הקטן 6, ואילו הגישה השנייה משתמשת בפרוטוקול ארוכת השנים עם חומרים כימיים פנול וthiocyanate guanidinium 7. פיתחנו פרוטוקול פשוט, יעיל, ללא עמודה כדי לבודד RNAs הקטן מסרום אדם. RNA הבודד הוא היא מידately שמיש ביישומים במורד הזרם, כוללים מערכי oligonucleotide DNA ורצף RNA.
פרוטוקול זה פותח בגלל שאנחנו מתמודדים עם כמה בעיות בעת השימוש בשיטות המבוסס על פנול לבודד RNA מסרום. גישת Chomczynski המסורתית משמשת לעתים קרובות ברוב המעבדות עם מגוון של חומרים כימיים זמינים מרוב הספקים מסחריים. עם זאת שוקל השימוש הנרחב שלהם, הנחיות מחמירות שלא פותחו באופן עקבי לייצר RNA איכות גבוהה מנוזלי גוף, בדם או בסרום מסוים.
בעיות נפוצות הקשורות לבידוד RNA מן הסרום כוללות תשואות RNA נמוכות וזיהום עם חומרים כימיים המשמשים בבידוד, במיוחד פנול. הגישה שלנו מבטלת מזהמים פנול אלה כדי לספק RNA באיכות גבוהה לניתוח במורד כגון PCR כמוני (qPCR) ורצף RNA. בדקנו עוד RNA זה על מערכי מירנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שים לב: דגימות סרום אדם מחולים או חולים עם הסרטן בריאים התקבלו עם הסכמה מדעת לפי פרוטוקולים אתיים אדם שאושרו מהנסיך המלכותי אלפרד החולים סידני (מספר פרוטוקול X10-0016 וHREC/10/RPAH/24) והאוניברסיטה טכנולוגי, סידני. דגימות סרום שנאספו ממטופלים לפני הניתוח מבתי חולים שונים בסידני והניחו באחסון ב -80 ° C.
1. בידוד RNA קטן מסרום
רנ"א הכל הוכן מסרום אדם משתמש בגרסה שונה של פרוטוקול LS Tri-מגיב RT.
- הפשירו מדגם סרום קפוא על קרח ולאחר מכן להעביר 400 μl של הסרום מופשר הטרי לתוך צינור microcentrifuge שכותרתו.
- לדלל את הסרום עם של H 2 O RNase ללא 100 μl ולהוסיף K proteinase בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר.
- לדגור על C ° 37 עבור 20 דקות כדי לאפשר את עיכול חלבון על ידי proteinase ק
- To להבטיח solubilization מלא, להוסיף 1.5 פעמיה נפח של Tri-מגיב RT LS ושל 4 bromoanisole-100 μl.
- בקצרה להפוך את homogenate, לבצע pipetting חוזר על עצמו במשך 5 שניות ולהעביר לתוך צינור 2 מיליליטר כבד שלב נעילה שכותרתו.
- ספין homogenate ב12,000 × גרם ל20 דקות ב 4 ° C.
- למזוג בזהירות לפחות 1 מיליליטר של התמיסה המימית שנוצרה לתוך צינור ה-DNA LoBind טרי. ביניים האורגניים ויש לכודים מתחת לג'ל הלבן של צינור שלב הנעילה.
- הוספת 5.0 μl של גליקוגן (5 מ"ג / מיליליטר) ו500 μl של isopropanol 100% לתמיסה המימית, מערבב על ידי היפוך, ודגירת O / N ב -20 ° C.
- דגירה O הבא / N, צנטריפוגות המדגם עבור 20 דקות ב 12,000 × גרם בצנטריפוגה 4 ° C.
- בטל supernatant ברור ולבצע ספין "הבזק" במשך 2 דקות ב 16,000 × גרם בצנטריפוגה 4 ° C.
- להסיר את סול ברור בזהירותution המקיף את הכדור בעזרת פיפטה.
- שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 70% אתנול ו צנטריפוגות ב 10,000 × גרם ל10 דקות. למזוג את הפתרון לשטוף ולחזור על פעולת שטיפה.
2. RNA resuspension לפתרון
- Resuspend את הכדור ב10 μl של H 2 O RNase ללא, על מנת להבטיח את גלולה הוא נמסה לגמרי. כדי להבטיח כי RNA הוא solubilized לחלוטין המדגם יכול להיות מחומם ל55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. במהלך הזמן הזה, לערבב את המדגם עם pipetting חוזר ונשנה. עבור סכום כולל תשואת RNA גבוהה, בריכת שתי הכנות RNA מאותו החולה.
- לכמת RNA resuspended באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis ולהעריך את איכות RNA באמצעות 2100 Bioanalyzer. לאחסן דגימות RNA נקוו ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש ביישומים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מייצג ספקטרום UV / Vis טיפוסי של רנ"א מבודד מסרום. מפרופיל זה שציינו זיהום חלבון בננומטר 280 עם פנול ומזהמים אורגניים הן ב270 ננומטר ו230 ננומטר, בהתאמה. thiocyanate guanidinium שאריות היה גם ציין ב260 ננומטר. כדי להפחית את המזהמים, בשורה של צעדי אופטימיזציה נעשו הליך RT-LS הסטנדרטי Tri-מגיב. הוספנו 5 מ"ג / מיליליטר של גליקוגן כדי להגדיל את שניהם בסך הכל תשואת RNA ולהפחית את הזיהום (קו שחור, איור 1 א).
בהמשך אנו ציינו כי לאחר הסרת isopropanol היה בערך 100-300 μl של חיץ לשטוף מקיף את גלולה RNA. ספין צנטריפוגות נוסף התווסף לפרוטוקול והפתרון לשטוף שאריות הוסר בזהירות. זה הביא לשינוי פרופיל מ270 ננומטר 280 ננומטר (עקבות אדומות, איור 1). אנחנו הסקנו שספין "פלאש" זה לא הפחית את זיהום פנולב270 ננומטר והגיע למסקנה כי שיא 280 ננומטר סביר להניח שייצג זיהום חלבון.
כדי להגביר עוד יותר את תשואת RNA ולהפחית לשאת חלבון דרכנו הוסיף שלב שלב הנעילה ג'ל. צעד זה אפשר להעברה המלאה של השלב המימית ללא מזהמים אורגניים (איור 1). כסרום מכיל שפע גדול של חלבון, הערכנו אם דילול הסרום המקורי הנפח הייתי עושה שום הבדל (תרשים 1C). בסך הכל תמצית היקף של 500 μl, אנחנו מעורבים 400 ו250 μl של סרום עם DH 2 O. תשואת הנפח הגדולה יותר כמעט והכפילה את הכמות של רנ"א הכל, כאשר בהשוואה לשימוש ב250 μl של סרום. הייתה גם הפחתה במזהמים בעת להקטין את ההתחלה הנפח (הערה: כפי שמשתנה רק בשלב אופטימיזציה זה היה הנפח של סרום, שיא 230 ננומטר קשור ישירות עם כרכי סרום ולא חפץ מהבידוד Tri-מגיב) . תוכן RNA הקטן של הכנות אלה הוערך אז באמצעות Bioanalyzer בשילוב עם RNA הקטן קיט. מעקבות Bioanalyzer, יש שיא ברור בכ 20 NTS המייצג את אוכלוסיית microRNA (איור 2 א). באמצעות פרוטוקול זה, מרכיב microRNA זה מיוצג 93% מכלל אוכלוסיית RNA הקטנה. זוהי רמה גבוהה של טוהר ורנ"א הכל החברה יכול לשמש למשתנה מבחני מולקולריים כגון מערכים ותגובות qPCR. סיכום של זרימת העבודה מוצג באיור 2.
לאחר מכן, אנו נמדדים ביטוי microRNA בארבע דגימות ביולוגיות שונות או באמצעות מערך oligonucleotide או qPCR. איור 3A מייצג מפת חום microRNA של ארבע דגימות אלה. כמו במחקר הקודם שלנו, קיבוץ היררכי שימש כדי לנתח את נתוני ביטוי ודגימות קבוצה המבוססים על פרופיל ביטוי microRNA שלהם 8. כמותיPCR (qPCR) שימש גם כדי להעריך את רמות microRNA בהכנות אלה. באמצעות אותן ארבע דוגמאות, ביצענו תגובות TaqMan qPCR singleplex לזהות miR-21-5P, miR-486-5P, miR-15b-5P, miR-16-5P ולתת-7 א. כפי שניתן לראות במגרשי ההגברה (3B דמויות ו3C) כל miRNAs אותר בהצלחה.
איור 1. פרופיל spectrophotometric של RNA מסרום אדם. א פרופיל UV טיפוסי של רנ"א מבודד מסרום אדם (קו כחול). צעדי אופטימיזציה שונים נבדקו להפחתת מזהמים ולהגדיל את סך תשואת RNA. ב 'משווה את השימוש בשלב הנעילה ג'ל לבידוד רגיל. פרופיל ג של שתי מדידות עם נפחים שונים החל מסרום. הגדלת נפח שעות השפעת מודעות מסומנות על תשואות RNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. א הנציג Bioanalyzer עקבות מראים ספייק בודד בכ 21 נוקלאוטידים (ציר x). ספייק זה מייצג את החלק היחסי מירנה באוכלוסיית RNA הקטנה מסרום. סיכום ב 'של זרימת העבודה לבודד RNA המוחלט מסרום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Src =" hres.jpg / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
איור 3. רנ"א מבודד באמצעות שיטה זו שימש לאפיון מערך וניתוח qPCR. סרטן הראש וצוואר א שלוש וסרה אחד נורמלית היו מבודד לרנ"א הכל (כוללים מיקרו RNA) ונתונים לאפיון מערך באמצעות 8 השבב X 60K מירנה. זה חזר על עצמו בחזרות טכניות. לאחר עיבוד הנתונים גולמיים בקרת איכות (QC), ביטוי של מיקרו RNA אלה נותח באמצעות היררכי Clustering (HCL) ומוצג כמפת חום. אדום מציין את רגולציה וכחולה מציין את רגולציה של מיקרו RNA. עקומות הגברה B. נציג qPCR לצורך זיהוי של miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 ולתת-7a בארבע סרה אנושית. C. כל חמישה miRNAs אותר וערכי ה-CT גלם אז היו זמם לסרום הרגיל. דפוס זה של גילוי היה דומה בשלוש דוגמאות האחרות (מידע לא מוצג)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האוכלוסייה של מיקרו RNA מהווה כ 0.4-0.5% מרנ"א הכל נמצא בסרום. בהמשך יש גם תכולת חלבון גבוהה שנמצאה בסרום אדם. כדי לשפר את RNA ולהפחית חלבון וגם פנול מזהם יש לנו שונה בגישה המסורתית Chomczynski 9 עם התוספת של כמה צעדים.
RNA סה"כ היה מבודד מסרום באמצעות Tri-מגיב RT-LS הסטנדרטי (Molecular Research Centre) לעומת זאת כאשר היא מבוצעת במעבדה שלנו, שיטה זו הניבה RNA בכמויות נמוכות עם מזהמים שונים.
איור 1 מציג פרופיל RNA spectrophotometric UV עם עדות לזיהום חלבון ב280 ננומטר, זיהום פנול ב270 ננומטר, ומזהמים אורגניים אחרים ב230 ננומטר. מגיב, thiocyanate guanidinium, גם התגלה ב260 ננומטר.
כדי לטפל בבעיות של תשואות RNA בסרום נמוכות ולהפחית את הזיהום, סדרה של optimizatצעדי יון נוספו להליך RT-LS הסטנדרטי Tri-מגיב. ראשית, מצאנו כי דילול הסרום 1 ב 5 זיהום חלבון מופחת. צעד זה כבר מומלץ על ידי מחקרים אחרים 10 והוכח כדי להפחית את זיהום חלבון. יתר על כן, השתמשנו ריכוז 1 מ"ג / מיליליטר של proteinase ק אנחנו בדקנו טווח של ריכוזים מ100, 500, ו -1,000 מיקרוגרם. לא היה הבדל בין הריכוזים ובכך אנו מנוצלים ריכוזים ותקופות דגירה קצרות יותר גבוהים יותר.
השינוי השני היה להציג את השימוש ב2.0 צינורות מיליליטר שלב הנעילה. כבד שלב הנעילה ג'ל לוכד את רוב המזהמים כגון פנול וחלבונים בשלב האורגני. הוא מספק מחסום צפיפות להעברה המרבית של השלב המימית ללא הסיכון של זיהום. היישום של שלב נעילת ג'ל כחומר מימי / אורגני שלב מכשול יכול להקטין את זמן העיבוד ולשפר עוד יותר recov DNAery ידי ככל 30%, ואילו באותו הזמן לחסל את המשתמש מחשיפה לחומרים אורגניים נדיפים מזיקים 11. השינוי השלישי הביא לשיפור ניכר באיכות RNA. כניסתה של ספין צנטריפוגה "פלאש" ב12,000 × גרם הייתה חשובה בהסרת כל זיהום שיורית מגלולת RNA לפני שטיפות אתנול.
כאשר משווים את הגישה שלנו לשיטות אחרות שפורסמו 6, 12, 13, יש לנו הצגתי את השימוש בשלב הנעילה ג'ל על מנת למקסם את ההתאוששות של RNAs noncoding הקטן מהשלב המימית. אחת המגבלות של הפרוטוקול ואחרים שלנו הוא שייתכן שיהיו צורך בידודים לשכפל להשיג מספיק RNA לניתוח ביטוי. מהניסיון שלנו, אנחנו מעדיפים את השיטות המבוססות Trizol על ערכות המבוסס על הטור ומחקרים רבים בהשוואה לגופו של שתי המערכות 6, 14-16. מעניין במיוחדהיה מחקר שנערך לאחרונה שהגיע למסקנה כי miRNAs עם תוכן GC נמוך, כגון miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a, ו miR-34a, הולכים לאיבוד באופן סלקטיבי במהלך הכנת דגימה בשיטת Trizol 17. בעיה זו נפתרה על ידי התוספת של מגנזיום בבידוד לדוגמא.
לסיכום, הפרוטוקול שלנו משתמש בשיטות המסורתיות לבודד RNA קטן מסרום. ניתן לגזור miRNAs הסרום אלה ממייקרו חלקיקים, exosomes או תאים מתים. פרוטוקול זה יבודד כל miRNAs אלה כדי לייצר RNA באיכות גבוהה אשר יכול לשמש עבור יישומים במורד הזרם מולקולריים שונים. שיטת השאיבה הזו היא פשוטה למדי, מסתמכת על חומרה נפוצה הנמצאת ברוב המעבדות, והוא די פשוט עבור רוב הטירונים מעוניינים במדידת ביטוי miRNAs בסרום אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לחשוף.
Acknowledgments
סמנתה חורי ופמלה Ajuyah נתמכים לאחר התואר הראשון בפרס האוסטרלי על ידי. אנחנו רוצים גם להכיר ברשת Translational חקר הסרטן, לואי מרכז לחקר הסרטן, אוניברסיטת ניו סאות' ויילס והצפון Translational היחידה לחקר הסרטן לקבלת תמיכה הנוספת של סמנתה חורי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
