Summary
Este protocolo descreve um método para extrair pequenos RNAs de soro humano. Temos utilizado este método para isolar microRNAs de soro câncer para uso em matrizes de DNA e também singleplex PCR quantitativo. O protocolo utiliza fenol e tiocianato de guanidina reagentes com modificações para produzir RNA de alta qualidade.
Abstract
A análise do ARN e a sua expressão é uma característica comum em muitos laboratórios. De importância é o surgimento de pequenos RNAs como microRNAs, que são encontradas em células de mamíferos. Estes pequenos RNAs são genes reguladores potentes que controlam as vias vitais como crescimento, desenvolvimento e morte e muito interesse tem sido direcionada para a sua expressão em fluidos corporais. Isto é devido à sua desregulação em doenças humanas como câncer e sua potencial aplicação como marcadores biológicos. No entanto, a análise da expressão de miARN no soro pode ser problemático. Na maioria dos casos, a quantidade de soro é limitante e soro contém baixas quantidades de ARN total, da qual os pequenos RNAs constituem apenas 0,4-0,5% 1. Assim, o isolamento de quantidades suficientes de ARN de qualidade a partir de soro é um grande desafio para os investigadores hoje. Neste documento técnico, demonstramos um método que utiliza apenas 400 mL de soro humano para obter RNA suficiente tanto para matrizes de DNA ou análise de qPCR. A umdvantages deste método são sua simplicidade e capacidade para produzir RNA de alta qualidade. Ele não requer colunas especializadas para purificação de pequenos RNAs e utiliza reagentes gerais e hardware encontrados em laboratórios comuns. O nosso método utiliza uma fase de bloqueio do gel para eliminar a contaminação com fenol e, ao mesmo tempo obtendo-se o RNA de alta qualidade. Apresentamos também um passo adicional para remover mais contaminantes durante a fase de isolamento. Este protocolo é muito eficaz no isolamento de rendimentos de ARN total de até 100 ng / mL de soro, mas também podem ser adaptadas para outros tecidos biológicos.
Introduction
Nos últimos anos, tem havido um esforço crescente para descobrir novos biomarcadores para a detecção precoce de doenças humanas. Muita atenção tem sido focada no uso de pequenos RNAs como microRNAs 2 (miRNAs ou RIM) como potenciais marcadores. Estes pequenos RNAs são encontradas nos fluidos corporais, tais como soro e estudos têm demonstrado que são resistentes à degradação e são estáveis ao longo de um intervalo de variação das condições ambientais 3. Dadas estas características miRNAs, soro ou circulantes são o biomarcador ideal 4, 5. Atualmente, existem duas abordagens principais para o isolamento de RNA pequeno a partir de fluidos biológicos. A primeira abordagem utiliza tecnologia baseada em coluna para ligar e eluir os pequenos RNAs 6, enquanto a segunda abordagem utiliza o protocolo de longa data com fenol e guanidina tiocianato reagentes 7. Nós desenvolvemos um protocolo livre de coluna simples, eficaz para isolar pequenos RNAs de soro humano. O ARN isolado é imediatamentediatamente utilizável em aplicações a jusante, incluindo arranjos de oligonucleotídeos de DNA e RNA seqüenciamento.
Este protocolo foi desenvolvido porque fomos confrontados com vários problemas ao usar métodos baseados em fenol para isolar RNA do soro. A abordagem tradicional Chomczynski é freqüentemente usado na maioria dos laboratórios com uma gama de reagentes disponíveis da maioria dos fornecedores comerciais. No entanto, considerando a sua utilização generalizada, directrizes rigorosas não foram desenvolvidos para produzir consistentemente RNA de alta qualidade a partir de fluidos corporais, em particular sangue ou soro.
Os problemas comuns associados com o isolamento de RNA a partir do soro incluem rendimentos baixos de RNA e contaminação com os reagentes utilizados durante o isolamento, em particular fenol. Nossa abordagem elimina esses contaminantes fenol para fornecer RNA de alta qualidade para a análise a jusante, como PCR quantitativo (qPCR) e RNA seqüenciamento. Nós testamos ainda este RNA em matrizes de miRNA.
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Protocol
Nota: as amostras de soro humano de pacientes saudáveis ou pacientes com câncer foram obtidos com o consentimento informado no âmbito de protocolos éticos humanos aprovados do Royal Prince Alfred Hospital Sydney (número protocolo X10-0016 e HREC/10/RPAH/24) e da Universidade de Tecnologia, Sydney. As amostras de soro foram coletadas de pacientes antes da cirurgia de vários hospitais Sydney e colocados em armazenamento a -80 ° C.
1. Pequeno Isolamento de ARN a partir de Soro
O RNA total foi preparado a partir de soro humano, utilizando uma versão modificada do protocolo LS Tri-Reagent RT.
- Descongelar amostra de soro congelado em gelo e, em seguida, transferir 400 ul do soro descongeladas recentemente para um tubo de microcentrífuga rotulado.
- Diluir o soro com 100 uL de RNase livre H2O e adicionar proteinase K numa concentração de 1 mg / ml.
- Incubar a 37 ° C durante 20 min para permitir a digestão de proteínas por proteinase K.
- To assegurar a solubilização completa, adicionar 1,5 vezes o seu volume de Tri-Reagent RT LS e 100 uL de 4-bromoanisole.
- Resumidamente inverter o homogeneizado, efectuar trabalho repetitivo de 5 seg e transferir para um tubo de 2 mL pesado Phase Lock rotulado.
- Girar o homogeneizado a 12.000 x g durante 20 min a 4 ° C.
- Decantar cuidadosamente, pelo menos, 1 ml da solução aquosa resultante para um tubo de ADN LoBind fresco. A interfase orgânico e deve ser preso debaixo do gel branco do tubo Phase Lock.
- Adicionar 5,0 mL de glicogénio (5 mg / ml) e 500 mL de isopropanol a 100% para a solução aquosa, misturar por inversão, e incubar O / N à temperatura de -20 ° C.
- Na sequência S / N de incubação, centrifuga a amostra durante 20 min a 12.000 x g numa centrífuga a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante transparente e realizar uma rotação de "flash" durante 2 min a 16.000 x g numa centrífuga a 4 ° C.
- Retire cuidadosamente o sol clarouição em torno do sedimento utilizando uma pipeta.
- Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se a 10000 × g durante 10 min. Decantar a solução de lavagem e repita o passo de lavagem.
2. ARN ressuspensão em Solução
- Ressuspender o sedimento em 10 ml de RNase livre H2O, garantindo a pelete estar completamente dissolvido. Para assegurar que o RNA está completamente solubilizado, a amostra pode ser aquecida a 55 ° C durante 5 min. Durante este tempo, a mistura da amostra com pipetagem repetida. Para um rendimento total de ARN mais elevado, reunir duas preparações de RNA a partir do mesmo paciente.
- Quantificar o ARN ressuspendido utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis e avaliar a qualidade do RNA utilizando um 2100 Bioanalyzer. Armazenar as amostras de ARN reunidas a -80 ° C para utilização em aplicações a jusante.
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Representative Results
A Figura 1 representa um espectro típico de UV / Vis de RNA isolado a partir do soro. A partir deste perfil, observamos contaminação de proteína a 280 nm com fenol e contaminantes orgânicos, tanto a 270 nm e 230 nm, respectivamente. Resíduo de tiocianato de guanidina foi também observado a 260 nm. Para reduzir os contaminantes, uma série de passos de optimização foram feitas com o processo RT-LS Tri-Reagent padrão. Nós adicionados 5 mg / mL de glicogénio para aumentar tanto o rendimento total do RNA e reduzir a contaminação (linha preta, Figura 1A).
Além disso observou-se que após a remoção de isopropanol havia aproximadamente 100-300 mL de tampão de lavagem do sedimento de ARN circundante. Uma rotação de centrifugação adicional foi adicionada ao protocolo ea solução de lavagem resíduo foi cuidadosamente removido. Isto resultou em uma mudança de perfil de 270 nm a 280 nm (traço vermelho, Figura 1B). Deduzimos que esta rodada de "flash" tinha reduzido a contaminação de fenola 270 nm, e concluíram que o pico de 280 nm, mais provavelmente representado contaminação de proteína.
Para aumentar ainda mais o rendimento RNA e reduzir carry proteína através de nós adicionamos um passo Phase Lock Gel. Esta etapa permitiu a transferência completa da fase aquosa, sem contaminantes orgânicos (Figura 1B). Como o soro contém uma grande abundância de proteínas, avaliamos se diluir o volume de soro original poderia fazer alguma diferença (Figura 1C). Num volume total de extracto de 500 uL, misturou-se 400 e 250 ul de soro com dH2O O rendimento maior volume quase duplicou a quantidade de RNA total quando comparada à utilização de 250 ul de soro. Houve também uma redução em contaminantes ao diminuir o volume de partida (nota: Como a única variável neste passo foi a optimização do volume de soro, o pico a 230 nm é directamente relacionado com o volume de soro e não um artefacto do isolamento Tri-Reagent) . O pequeno teor de ARN destas preparações foi em seguida avaliada utilizando a Bioanalyzer em combinação com o kit de ARN pequeno. A partir do rastreio Bioanalyzer, existe um pico distinto de aproximadamente 20 nt, que representa a população microRNA (Figura 2A). Usando este protocolo, este componente microRNA representavam 93% da população total de pequeno RNA. Este é um nível elevado de pureza e o ARN total pode agora ser usado para variar os ensaios moleculares, tais como matrizes e reacções qPCR. Um resumo do fluxo é apresentado na Figura 2B.
Em seguida, medido expressão microRNA em quatro amostras biológicas diferentes usando uma matriz oligonucleotídeo ou qPCR. Figura 3A representa um mapa de calor microRNA destes quatro amostras. Como em nosso estudo anterior, agrupamento hierárquico foi utilizado para analisar os dados de expressão e amostras do grupo com base em seu perfil de expressão de microRNA 8. QuantitativoPCR (qPCR) foi também utilizado para avaliar os níveis de microRNA nestas preparações. Usando as mesmas quatro amostras, foi realizada simplex reacções TaqMan qPCR para detectar o miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p e deixou-7a. Tal como mostrado nos gráficos de amplificação (Figuras 3B e 3C) todos os miRNAs foram detectados com sucesso.
Figura 1. Perfil espectrofotométrica do RNA a partir do soro humano. A. Um perfil típico de UV de ARN isolado a partir de soro humano (linha azul). Vários passos de optimização foram testados para reduzir os contaminantes e aumentar a produção de ARN total. B. Compara o uso de uma fase de bloqueio do gel para um isolamento normal. C. Perfil de duas medidas com diferentes volumes de partida de soro. Aumentando o volume h anúncio marcado impacto sobre os rendimentos de RNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A. representativas Bioanalyzer traço que mostra um único pico em aproximadamente 21 nucleótidos (eixo x). Este aumento representa a fração miRNA na pequena população de RNA do soro. B. Resumo do fluxo de trabalho para isolar o RNA total do soro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Os microRNAs isoladas utilizando este método foram utilizados para criação de perfil da matriz e análise qPCR. A. Três cabeça e pescoço e um soros normais foram isolados para o RNA total (incluindo microRNAs) e submetido a variedade de perfis usando o chip X 60K miRNA 8. Isto foi repetido em repetições técnicas. Depois de Controle de Qualidade de dados brutos (QC) processamento, expressão destes microRNAs foi analisada utilizando Hierarchical Clustering (HCL) e apresentado como um mapa de calor. O vermelho indica-se regulação e azul indica a regulação por diminuição dos microRNAs. Curvas de amplificação B. representativas qPCR para a detecção de miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 e deixou-7a em quatro soros humanos. C. Todos cinco miRNAs foram detectados e os valores Ct brutos foram então representada para o soro normal. Este padrão de detecção foi semelhante para os outros três amostras (dados não mostrados)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A população de microRNAs constitui cerca de 0,4-0,5% do ARN total encontrada no soro. Além disso, há também um alto teor de proteína encontrada em soro humano. Para melhorar o RNA e reduzir a proteína e fenol contamina modificámos a abordagem tradicional Chomczynski 9 com a adição de várias etapas.
O RNA total foi isolado a partir de soro, usando o padrão de Tri-Reagent RT-LS (Centro de Investigação Molecular), no entanto, quando executados no nosso laboratório, este método produziu RNA em baixas quantidades, com vários contaminantes.
A Figura 1 mostra um perfil de ARN espectrofotometria de UV com evidência de contaminação de proteína a 280 nm, a contaminação de fenol a 270 nm, e de outros contaminantes orgânicos em 230 nm. O reagente, tiocianato de guanidina, também foi detectado a 260 nm.
Para resolver os problemas de baixo rendimento de RNA no soro e reduzir a contaminação, uma série de Optimizatetapas de iões foram adicionadas ao processo de RT-LS Tri-Reagent padrão. Em primeiro lugar, verificou-se que a diluição do soro de 1 em 5 a diminuição da contaminação de proteínas. Este passo tem sido recomendado por outros estudos 10 e tem sido mostrado para reduzir a contaminação de proteínas. Além disso, utilizou-se uma concentração mg / ml de proteinase K. Testamos uma gama de concentrações de 100, 500 e 1000 ug. Não houve diferença entre as concentrações assim utilizamos concentrações mais elevadas e períodos de incubação mais curtos.
A segunda modificação foi para introduzir a utilização dos tubos de 2,0 ml da fase de bloqueio. O fechamento da fase pesada Gel intercepta a maior parte dos contaminantes, tais como fenol e proteínas na fase orgânica. Proporciona uma barreira de densidade para a transferência máxima da fase aquosa, sem o risco de contaminação. A aplicação do fechamento da fase de gel como um material aquoso / orgânico fase barreira pode diminuir o tempo de processamento e melhorar ainda mais o ADN recuery por tanto como 30%, enquanto, ao mesmo tempo, eliminando o utilizador da exposição aos compostos orgânicos voláteis prejudiciais 11. A terceira modificação resultou numa melhoria considerável na qualidade de ARN. A introdução de um "Flash" da rotação de centrifugação a 12.000 x g foi importante na remoção de qualquer contaminação residual a partir do sedimento de ARN antes das lavagens de etanol.
Ao comparar a nossa abordagem a outras metodologias publicadas 6, 12, 13, nós introduzimos o uso de um Phase Lock Gel para maximizar a recuperação de pequenos RNAs não-codificantes de fase aquosa. Uma das limitações do nosso protocolo e outros é que isolamentos réplicas podem ser necessários para obter RNA suficiente para análise de expressão. A partir de nossas experiências, nós preferimos os métodos baseados Trizol sobre os kits baseados em colunas e numerosos estudos têm comparado os méritos de ambos os sistemas de 6, 14-16. É nomeadamente o interesseFoi realizado um estudo recente que concluiu que miRNAs com baixo teor de GC, tais como miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a e miR-34a, são perdidos seletivamente durante a preparação da amostra utilizando o método de Trizol 17. Este problema foi resolvido através da adição de magnésio, durante o isolamento da amostra.
Em resumo, a nossa protocolo utiliza os métodos tradicionais para isolar a partir de soro de pequenos RNAs. Estes miRNAs soro pode ser derivada a partir de micro-partículas, os exossomas ou células moribundas. Este protocolo seria isolar todos estes miRNAs para produzir RNA de alta qualidade que pode ser utilizado para várias aplicações moleculares a jusante. Este método de extração é bastante simples, se baseia em hardware comum encontrado na maioria dos laboratórios, e é simples o suficiente para a maioria dos novatos interessados em medir a expressão miRNAs no soro humano.
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Disclosures
Não há nada a divulgar.
Acknowledgments
Samantha Khoury e Pamela Ajuyah são suportados pelo Prêmio de Pós-Graduação da Austrália. Gostaríamos também de agradecer o Cancer Research Rede Translational, Lowy Cancer Research Centre, da Universidade de Nova Gales do Sul e da Unidade de Pesquisa do Câncer do Norte Translational pelo apoio adicional de Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
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