Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von kleinen RNAs aus menschlichem Serum. Wir haben diese Methode verwendet, um microRNAs von Krebsserum für den Einsatz in DNA-Arrays isolieren und auch Singleplex quantitative PCR. Das Protokoll nutzt Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien mit Modifikationen, um qualitativ hochwertige RNA ergeben.
Abstract
Die Analyse von RNA und deren Ausdruck ist ein gemeinsames Merkmal in vielen Labors. Von Bedeutung ist die Entstehung von kleinen RNAs wie microRNAs, die in Säugetierzellen zu finden sind. Diese kleinen RNAs sind potente Genregulatoren Steuerung Vitalwege wie Wachstum, Entwicklung und Tod und hat viel Interesse an ihren Ausdruck in Körperflüssigkeiten gerichtet. Dies ist aufgrund der Fehlregulation im menschlichen Krankheiten wie Krebs und ihre potentielle Anwendung als Serum Biomarker. Jedoch kann die Analyse der miRNA-Expression in serum problematisch sein. In den meisten Fällen die Menge an Serum und Serum Begrenzungs geringe Mengen an Gesamt-RNA, von denen kleine RNAs bilden nur 0,4-0,5% 1. So ist die Trennung von ausreichenden Mengen an Qualität RNA aus Serum ist eine große Herausforderung für Forscher heute. In diesem Fachbeitrag zeigen wir, ein Verfahren, das nur 400 ul Humanserum verwendet, um eine ausreichende RNA entweder für DNA-Arrays oder qPCR-Analyse zu erhalten. Die einorteile dieser Methode sind seine Einfachheit und Fähigkeit, qualitativ hochwertige RNA ergeben. Es erfordert keine speziellen Spalten für die Reinigung von kleinen RNAs und nutzt allgemeine Reagenzien und Hardware gemeinsam Laboratorien gefunden. Unsere Methode nutzt eine Phase Lock Gel zu Phenol Verunreinigung zu beseitigen, während zur gleichen Zeit ergibt hohe Qualität RNA. Außerdem stellen wir einen weiteren Schritt, um alle Verunreinigungen während der Isolierung Schritt weiter zu entfernen. Dieses Protokoll ist sehr effektiv bei der Isolierung von Gesamt-RNA-Ausbeuten von bis zu 100 ng / &mgr; l aus Serum, sondern kann auch für andere biologische Gewebe angepasst werden.
Introduction
In den letzten Jahren hat es eine wachsende Druck neuartige Biomarker für die Früherkennung von menschlichen Krankheiten zu entdecken. Viel Aufmerksamkeit wurde zur Verwendung von kleinen RNAs, wie microRNAs 2 (miRNAs oder miRs) als potenzielle Marker konzentriert. Diese kleinen RNAs werden in Körperflüssigkeiten wie Serum und Studien gefunden haben gezeigt, sie sind robust, um den Abbau und sind über einen Bereich von 3 unterschiedlichen Umweltbedingungen stabil. Angesichts dieser Eigenschaften, Serum oder zirkulierenden miRNAs sind die ideale Biomarker 4, 5. Derzeit gibt es zwei Hauptansätze zur Isolierung von kleinen RNA aus biologischen Flüssigkeiten. Der erste Ansatz verwendet spaltenbasierte Technologie zu binden und zu eluieren die kleinen RNAs 6, während der zweite Ansatz nutzt die langjährige Protokoll mit Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien 7. Wir haben eine einfache, effektive, stützenfreie Protokoll an kleinen RNAs aus menschlichem Serum isolieren entwickelt. Die isolierte RNA wird sofortLICH verwendbar in nachgelagerten Anwendungen, einschließlich DNA-Oligonukleotid-Arrays und RNA-Sequenzierung.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, weil wir mit einigen Problemen bei der Verwendung von Phenol-basierte Methoden zur RNA aus Serum isolieren konfrontiert. Die traditionelle Chomczynski Ansatz wird häufig in den meisten Labors mit einer Reihe von Reagenzien von den meisten kommerziellen Anbietern verwendet. Jedoch unter Berücksichtigung ihrer Verbreitung haben strenge Richtlinien nicht entwickelt worden, um konsequent qualitativ hochwertige RNA aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut oder Serum.
Häufige Probleme mit Isolierung von RNA aus Serum assoziiert sind geringe RNA-Ausbeuten und Kontamination mit Reagenzien während der Trennung, insbesondere Phenol. Unser Ansatz eliminiert diese Schadstoffe Phenol, qualitativ hochwertige RNA für Downstream-Analyse wie die quantitative PCR (qPCR) und RNA-Sequenzierung bieten. Wir haben weiter diesen RNA getestet auf miRNA-Arrays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Humanes Serumproben von gesunden Patienten oder Patienten mit Krebs wurden mit Einwilligung im Rahmen genehmigter menschlichen ethischen Protokolle aus der Royal Prince Alfred Hospital in Sydney (Protokollnummer X10-0016 und HREC/10/RPAH/24) und der University of Technology erhalten, Sydney. Serumproben wurden von Patienten vor der Operation aus verschiedenen Krankenhäusern Sydney gesammelt und bei -80 ° C platziert
1. Kleine RNA-Isolierung aus Serum
Gesamt-RNA wurde aus menschlichem Serum unter Verwendung einer modifizierten Version des Tri-Reagent RT LS Protokoll hergestellt.
- Tauen Sie gefrorene Serum-Probe auf Eis und dann übertragen 400 ul der frisch aufgetauten Serum in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen.
- Verdünnt das Serum mit 100 &mgr; l RNase-freiem H 2 O und fügen Proteinase K in einer Konzentration von 1 mg / ml.
- Inkubieren bei 37 ° C für 20 min, um die Proteinverdauung durch Proteinase K. ermöglichen
- To vollständige Auflösung zu gewährleisten, fügen Sie das 1,5-fache seines Volumens an Tri-Reagenz RT LS und 100 ul 4-Bromanisol.
- Kurz invertieren die Homogenat, sich wiederholende Pipettieren für 5 Sekunden und Transfer in einem markierten 2 ml schwere Phase Lock Röhre.
- Drehe das Homogenat bei 12.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
- Mindestens 1 ml der resultierenden wässrigen Lösung vorsichtig dekantieren in eine frische DNA LoBind Röhre. Die organische und die Zwischenphase sollte unterhalb der weißen Gel der Phase Lock Rohr eingeklemmt werden.
- Add 5,0 ul Glycogen (5 mg / ml) und 500 &mgr; l 100% igem Isopropanol zu der wässrigen Lösung, Mischen durch Umdrehen und inkubiert O / N bei 20 ° C.
- Folgenden O / N Inkubation Zentrifuge die Probe für 20 min bei 12.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert.
- Entsorgen Sie die klare Überstand und führen Sie einen "Flash"-Spin für 2 min bei 16.000 × g in einem 4 ° C zentrifugiert.
- Die klare Sol vorsichtig entfernenution rund um das Pellet mit einer Pipette.
- Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 min. Dekantiert man die Waschlösung und wiederholen Waschschritt.
2. RNA Resuspension in Lösung
- Das Pellet in 10 ul RNase freiem H 2 O, wodurch das Pellet vollständig gelöst ist. Um sicherzustellen, dass die RNA vollständig solubilisiert die Probe auf 55 ° C für 5 min erhitzt werden. Während dieser Zeit mischen die Probe mit wiederholten Pipettieren. Für eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute, bündeln zwei RNA-Präparationen des gleichen Patienten.
- Quantifizieren der resuspendiert RNA mit Hilfe eines UV-Vis-Spektrophotometer und Beurteilung der RNA-Qualität mit einem Bioanalyzer 2100. Speichern die gepoolte RNA-Proben bei -80 ° C zur Verwendung in nachfolgenden Anwendungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 stellt eine typische UV / Vis-Spektrum von RNA aus dem Serum isoliert. Aus diesem Profil haben wir festgestellt Protein-Kontamination bei 280 nm mit Phenol und organischen Verunreinigungen sowohl bei 270 nm und 230 nm auf. Rückstand Guanidiniumthiocyanat wurde bei 260 nm festgestellt. Um Verunreinigungen zu reduzieren, wurden eine Reihe von Optimierungsschritten zur Standard Tri-Reagent RT-LS-Verfahren hergestellt. Wir haben 5 mg / ml Glykogen, sowohl die Gesamt-RNA-Ausbeute zu erhöhen und die Verschmutzung (schwarze Linie, Abbildung 1A).
Ferner beobachteten wir, dass nach der Entfernung des Isopropanol war etwa 100-300 &mgr; l Waschpuffer, um den RNA-Pellet. Eine zusätzliche Zentrifugenspinn wurde dem Protokoll hinzugefügt und der Rückstand Waschlösung wurde sorgfältig entfernt. Dies führte zu einer Profilverschiebung von 270 nm bis 280 nm (rote Linie, 1B). Wir entnehmen, dass diese "Flash"-Spin hatte die Verunreinigung Phenol reduziertbei 270 nm und geschlossen, dass die 280 nm Peak-Protein-Kontamination am ehesten vertreten.
Zur weiteren Erhöhung RNA-und Protein-Ausbeute durch Carry reduzieren haben wir eine Phase Lock Gel Schritt. Dieser Schritt für die vollständige Überführung der wässrigen Phase ohne organische Verunreinigungen (1B) erlaubt. Als Serum enthält eine große Fülle von Protein, bewertet, wenn wir die ursprüngliche Serumvolumen verdünnt würde keinen Unterschied (Abbildung 1C) zu machen. In einem Gesamtextrakt von 500 ul vermischt man 400 und 250 ul Serum mit dH 2 O. Der größere Volumenausbeute nahezu verdoppelt die Menge an Gesamt-RNA, wenn sie unter Verwendung von 250 &mgr; l Serum zu vergleichen. Es gab auch eine Verringerung der Verunreinigungen, wenn die Verringerung der Ausgangsvolumen (Anmerkung: Da die einzige Variable in dieser Optimierungsschritt war das Volumen von Serum wird die 230 nm-Spitze direkt mit Serumvolumen zugeordnet ist, und nicht ein Artefakt aus dem Tri-Reagent Trennung) . Die kleine RNA-Gehalt der Präparate wurde dann mit dem Bioanalyzer in Kombination mit dem Small RNA Kit bewertet. Aus dem Bioanalyzer Spur gibt es einen deutlichen Peak bei etwa 20 nts, die die MikroRNA Bevölkerung (2A) darstellt. Über dieses Protokoll, vertreten diese microRNA-Komponente 93% der Gesamtbevölkerung kleine RNA. Dies ist ein hoher Reinheitsgrad und die Gesamt-RNA kann nun für unterschiedliche molekulare Assays, wie Arrays und qPCR Reaktionen verwendet werden. Eine Zusammenfassung der Workflow ist in 2B dargestellt.
Wir microRNA Expression in vier verschiedenen biologischen Proben entweder mit einem Oligonukleotid-Array oder qPCR gemessen. 3A stellt eine microRNA Wärme Karte dieser vier Proben. Wie in unserer früheren Studie wurde hierarchisches Clustern verwendet werden, die Expressionsdaten und Gruppenproben auf der Grundlage ihrer microRNA Expressionsprofil 8 zu analysieren. QuantitativPCR (qPCR) wurde ebenfalls verwendet, um microRNA Ebenen in diesen Präparaten zu beurteilen. Mit den gleichen vier Proben führten wir Singleplex TaqMan qPCR Reaktionen auf miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p und let-7a zu erkennen. Wie in den Grundverstärkung (3B und 3C) gezeigt, alle miRNAs wurden erfolgreich erkannt.
Fig. 1 ist. Spektrophotometrische Profil von RNA aus humanem Serum. A. Eine typische UV-Profil von RNA aus humanem Serum (blaue Linie) isoliert. Verschiedene Optimierungsschritte wurden getestet, um Verunreinigungen zu reduzieren und die Gesamt-RNA-Ausbeute. Vergleicht B. die Verwendung einer Phase Lock Gel auf eine normale Trennung. C. Profil von zwei Messungen mit unterschiedlichen Ausgangsmengen Serum. Erhöhen des Volumens h Anzeige markiert Auswirkungen auf RNA-Ausbeuten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. A. Repräsentative Bioanalyzer Spur, die eine einzelne Spitze bei etwa 21 Nukleotiden (x-Achse). Diese Spitze stellt die miRNA-Fraktion in der kleinen RNA-Population aus dem Serum. B. Zusammenfassung des Workflows, der Gesamt-RNA aus dem Serum zu isolieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
Abbildung 3. Die microRNAs isoliert mit dieser Methode wurden für die Array-Profiling-und qPCR-Analyse eingesetzt. A. Drei Kopf-und Halskrebs und einer normalen Seren wurden für die Gesamt-RNA (einschließlich microRNAs) isoliert und Array-Profiling mit dem 8 x 60K miRNA-Chip unterzogen. Dies wurde in der technischen Wiederholungen wiederholt. Nach Rohdaten Qualitätskontrolle (QC)-Verarbeitung, wurde die Expression dieser microRNAs mit Hierarchical Clustering (HCL) analysiert und als Wärme Stadtplan. Rot zeigt sich Regulierung und Blau zeigt Down-Regulation der microRNAs. B. Repräsentative qPCR Verstärkungskurven für den Nachweis von miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 und let-7a in vier menschlichen Seren. C. Alle fünf miRNAs wurden erkannt und rohe Ct-Werte wurden dann für den normalen Serum aufgetragen. Dieses Muster der Erfassungs war ähnlich für die anderen drei Proben (Daten nicht gezeigt)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Bevölkerung von microRNAs macht ungefähr 0,4 bis 0,5% der Gesamt-RNA im Serum gefunden. Ferner gibt es auch einen hohen Proteingehalt im menschlichen Serum gefunden. Um RNA zu verbessern und sowohl die Protein-und Phenol verseucht reduzieren wir den traditionellen Ansatz Chomczynski 9 mit dem Zusatz von mehreren Schritten modifiziert.
Gesamt-RNA wurde aus dem Serum unter Verwendung des Standard-Tri-Reagent RT-LS (Molecular Research Center) isoliert jedoch, wenn sie in unserem Labor durchgeführt, ergab dieses Verfahren RNA in geringen Mengen mit verschiedenen Verunreinigungen.
Figur 1 zeigt ein UV-spektrophotometrische RNA Profil mit Nachweis der Protein-Kontamination bei 280 nm, Phenol Verunreinigung bei 270 nm, und andere organische Verunreinigungen bei 230 nm auf. Das Reagenz, Guanidiniumthiocyanat, wurde ebenfalls bei 260 nm detektiert.
Um die Probleme der niedrigen Serum RNA-Ausbeuten ansprechen und verringern Verschmutzung, eine Reihe von optimizatIonen-Schritte wurden zur Standard-Tri-Reagenz RT-LS Verfahren aufgenommen. Erstens fanden wir, dass das Verdünnen der Serum 1 in 5 reduziert Proteinkontamination. Dieser Schritt wurde von anderen Studien 10 empfohlen worden und hat sich gezeigt, Protein-Kontamination zu verringern. Darüber hinaus haben wir 1 mg / ml-Konzentration von Proteinase K. Wir hatten ein Konzentrationsbereich von 100 geprüft, 500 und 1000 pg. Es gab keinen Unterschied zwischen den Konzentrationen so verwendet man höhere Konzentrationen und kürzere Inkubationszeiten.
Die zweite Modifikation bestand darin, die Verwendung von 2,0 ml der Phase Lock Rohre einzuführen. Die schwere Phase Lock Gel fängt die Mehrheit der Verunreinigungen, wie Phenol und Proteine in der organischen Phase. Es stellt eine Barriere für die Dichte der maximalen Überführung der wässrigen Phase ohne das Risiko einer Kontamination. Die Anwendung der Phase Lock Gel als wässrige / organische Phase Barrierematerial kann die Bearbeitungszeit zu verringern und weiter zu verbessern DNA RECOVery um mehr als 30%, während gleichzeitig die Beseitigung der Benutzer den Kontakt mit schädlichen flüchtigen organischen Verbindungen 11. Die dritte Modifikation führte zu einer erheblichen Verbesserung der Qualität der RNA. Die Einführung eines "Flash"-Zentrifugation Spin bei 12000 g wurde in Entfernen von Restschmutz aus dem RNA-Pellet vor der Ethanol-Wasch wichtig.
Beim Vergleich von unseren Ansatz auf andere Methoden veröffentlicht 6, 12, 13, haben wir die Verwendung einer Phase Lock Gel zur Genesung von kleinen nicht-kodierenden RNAs aus der wässrigen Phase zu maximieren eingeführt. Eine der Beschränkungen der Protokoll und anderen ist, dass Replikation Isolationen erforderlich, um genügend RNA für die Expressionsanalyse erhalten werden. Aus unseren Erfahrungen, bevorzugen wir die Trizol basierte Verfahren über die spaltenbasierte Kits und zahlreiche Studien haben die Vorzüge der beiden Systeme 6, 14-16 verglichen. Von allem Interessewar eine aktuelle Studie zu dem Schluss kam, dass miRNAs mit niedrigen GC-Gehalt, wie miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a und miR-34a, selektiv bei der Probenvorbereitung verloren mit der Trizol-Methode 17. Dieses Problem wurde durch die Zugabe von Magnesium bei der Probentrennung gelöst.
Zusammenfassend nutzt unser Protokoll die traditionellen Methoden, um kleine RNAs aus dem Serum zu isolieren. Diese miRNAs Serum kann von Mikropartikeln, Exosomen oder sterbenden Zellen abgeleitet werden. Dieses Protokoll würde alle diese miRNAs zu isolieren, um qualitativ hochwertige RNA, die für verschiedene Anwendungen nachgeschalteten molekularen verwendet werden kann. Das Extraktionsverfahren ist recht einfach, setzt auf gemeinsame Hardware in den meisten Labors gefunden, und ist einfach genug für die meisten Neulinge interessiert Mess miRNAs Expression in menschlichen Serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Es gibt nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Samantha Khoury und Pamela Ajuyah werden von der australischen Postgraduate-Award unterstützt. Wir würden auch gerne die Translationale Krebsforschung Network, Lowy Krebsforschungszentrum der Universität von New South Wales und der Nord Translationale Krebsforschungsstelle für ihre zusätzliche Unterstützung von Samantha Khoury bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
