Summary
이 프로토콜은 인간 혈청에서 작은 RNA를 추출하는 방법을 설명합니다. 우리는 DNA 배열에 사용하기 위해 암 혈청에서 마이크로 RNA를 분리하고 또한 singleplex 정량 PCR이 방법을 사용했습니다. 프로토콜은 고품질의 RNA를 수득 수정하여 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약을 이용한다.
Abstract
RNA와 그 표현의 분석은 많은 실험실에서 일반적인 기능입니다. 중요한 것은 포유 동물 세포에서 발견되는 마이크로 RNA와 같은 작은 RNA를의 등장입니다. 이 작은 RNA를은 성장, 발달 및 죽음과 많은 관심과 같은 중요한 경로를 제어하는 강력한 유전자 규제 체액에서의 표현에 지시 된입니다. 이것은 암 혈청 바이오 마커로서의 가능성 응용 프로그램으로 인간의 질병에서의 조절 장애에 의한 것입니다. 그러나, 혈청에서의 miRNA 발현의 분석은 문제가 될 수있다. 대부분의 경우 혈청의 양을 제한하고, 혈청 작은 RNA를은 0.4 ~ 0.5 % 1을 구성하는 총 RNA의 낮은 금액을 포함합니다. 따라서 혈청에서 품질의 RNA의 충분한 양의 분리는 연구자들에게 중요한 도전 오늘입니다. 이 기술 문서에서는, 우리는 DNA 배열 또는 qPCR의 분석도 충분한 RNA를 얻기 위해 인간의 혈청 400 μl를 사용하는 방법을 보여줍니다.이 방법의 dvantages은 단순하고 고품질의 RNA를 생성 할 수있는 능력이다. 그것은 작은 RNA를 정제에 대한 전문적인 열을 필요로하지 않습니다 및 일반 실험실에있는 일반 시약 및 하드웨어를 사용합니다. 우리의 방법은 동시에 고품질의 RNA를 수득하면서 페놀 오염을 제거하기 위해 위상 잠금 젤을 이용한다. 또한, 상기 분리 단계에서 모든 오염 물질을 제거하는 추가 단계를 소개한다. 이 프로토콜은 혈청에서 최대 100 NG / μL의 총 RNA의 수율을 분리하는데 매우 효과적이지만 다른 생물 조직에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
최근, 인간의 질병의 조기 진단을위한 새로운 바이오 마커 발견 성장 밀기가 있었다. 많은 관심 잠재적 마커와 같은 마이크로 RNA 2 (의 miRNA 또는 미르)의 작은 RNA를 사용에 초점을 맞추고있다. 이러한 작은 RNA를가 혈청 및 연구 등의 체액에서 발견되는 그들이 분해에 탄력과 다양한 환경 조건 (3)의 범위에서 안정적 보여 주었다. 이러한 기능, 혈청 또는 순환의 miRNA가 이상적인 바이오 마커 4, 5 감안할. 현재 생체 액에서 작은 RNA의 분리에 대한 두 가지 접근 방법이있다. 두 번째 방법은 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약 7과의 오랜 프로토콜을 사용하면서 첫 번째 방법은, 작은 RNA를 6 바인딩 및 용출 컬럼 기반 기술을 사용한다. 우리는 인간의 혈청에서 작은 RNA를 격리하는 간단한 효과, 열이없는 프로토콜을 개발했습니다. 분리 된 RNA는 즉시 주입니다DNA 올리고 뉴클레오티드의 배열과 RNA의 염기 서열을 포함하여 다운 스트림 애플리케이션에서 ately 사용할.
혈청에서 RNA를 분리하는 페놀 계 방법을 사용할 때 우리는 몇 가지 문제에 직면했기 때문에이 프로토콜이 개발되었다. 전통적인 Chomczynski 방법은 자주 대부분의 상용 공급 업체에서 제공 시약의 범위와 대부분의 실험실에서 사용된다. 그러나 그들의 광범위한 사용을 고려, 엄격한 가이드 라인은 지속적으로 특정 혈액이나 혈청, 체액에서 고품질의 RNA를 생산하기 위해 개발되지 않았습니다.
혈청에서 RNA를 분리와 관련된 일반적인 문제는 낮은 RNA 수율 및 격리, 특히 페놀 동안 사용 된 시약의 오염이 (가) 있습니다. 우리의 접근 방식은 정량 PCR (qPCR에)와 RNA 서열 분석 등의 다운 스트림 분석을위한 고품질의 RNA를 제공하기 위해 이러한 페놀 오염 물질을 제거한다. 우리는 더 miRNA의 배열에서이 RNA를 테스트했습니다.
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Protocol
참고 : 건강한 환자 또는 암을 가진 환자에서 인간의 혈청 샘플, 로얄 프린스 알프레드 병원 시드니 (프로토콜 번호 X10-0016 및 HREC/10/RPAH/24) 기술 대학에서 승인 된 인간의 윤리 프로토콜에서 동의 얻어졌다 시드니. 혈청 샘플은 다양한 시드니 병원에서 수술 전 환자로부터 수집 및 -80 ° C.에 저장에 넣었다
혈청에서 1. 작은 RNA 격리
전체 RNA는 트라이 RT 시약의 LS 프로토콜의 변형 된 버전을 사용하여 인간 혈청으로부터 제조 하였다.
- 얼음에 냉동 혈청 샘플을 해동 한 다음 레이블 microcentrifuge 관에 갓 해동 혈청 400 μl를 전송합니다.
- 자유롭게 된 RNase H 2 O 100 μL로 혈청을 희석하고 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 단백질 분해 K을 추가한다.
- 프로 테 K.에 의해 단백질의 소화를 할 수 있도록 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다
- 티오, 완전한 용해를 보장 트라이 시약 RT LS의 1.5 배의 양 및 4 - 브로 모 아니 솔의 100 μl를 추가합니다.
- 간단히, 균질 반전 5 초 동안 반복 피펫 팅을 수행하고 표시된 2 ㎖ 무거운 위상 잠금 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 4 ℃에서 20 분 동안 12,000 × g에서 균질 스핀
- 정중 신선한 DNA LOBIND 튜브로 얻어진 수용액의 적어도 1 ㎖를 가만히 따르다. 유기 계면과는 위상 잠금 튜브의 흰색 겔 아래 포획한다.
- 수용액에 글리코겐의 5.0 μL (5 ㎎ / ㎖) 및 100 % 이소프로판올 500 μl를 추가 반전하여 혼합하고, -20 ℃에서 O / N을 품어
- 다음 O / N 배양, 4 ° C에서 원심 분리기에서 12,000 × g에서 20 분 동안 원심 분리기 샘플.
- 맑은 상층 액을 버리고 4 ° C에서 원심 분리기에서 16,000 × g에서 2 분간 "플래시"스핀을 수행합니다.
- 조심스럽게 분명 졸을 제거피펫을 사용하여 펠렛을 주변의 ution.
- 10 분 동안 10,000 × g에서 70 %의 에탄올과 원심 분리기 1 ㎖로 펠렛을 씻으십시오. 세척 솔루션을 가만히 따르다 및 세척 단계를 반복합니다.
솔루션에 2. RNA 재 부상
- 펠렛이 완전히 용해 보장 된 RNase H 2 O 자유로운 10 μL에 펠렛을 재현 탁. RNA가 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 샘플을 5 분 동안 55 ° C로 가열 할 수있다. 이 시간 동안 반복 피펫으로 시료를 혼합. 높은 총 RNA 수율의 경우, 동일 환자에서 두 가지 RNA 준비를 풀.
- UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 재현 탁 RNA 정량과 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다. 다운 스트림 응용 프로그램에 사용하기 위해 -80 ° C에서 풀링 된 RNA 샘플을 저장합니다.
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Representative Results
그림 1은 혈청에서 분리 된 RNA의 일반적인 UV / 비스 스펙트럼을 나타냅니다. 이 프로필에서 우리는 각각 모두 270 ㎚, 230 ㎚에서의 페놀 및 유기 오염 물질을 280 nm에서 단백질의 오염을 지적했다. 잔류 구 아니 디늄 티오 시아 네이트는 260 nm에서 관찰되었다. 오염물을 줄이기 위해 최적화 일련의 단계는 표준 트라이 시약 RT-LS 절차로 만들어졌다. 우리는 총 RNA의 수율을 모두 증가하고 오염 (검은 선, 그림 1A)를 줄이기 위해 글리코겐의 5 ㎎ / ㎖를 추가했습니다.
더욱이 우리는 이소프로판올을 제거한 후 RNA 펠렛을 둘러싼 세척 완충액 대략 100-300 μL이 있다는 것을 관찰했다. 추가적인 원심 스핀 프로토콜에 첨가하고, 잔류 물을 세척 용액을 조심스럽게 제거 하였다. 이 280 nm의 (적색 추적, 그림 1B) 270 nm의에서 프로파일의 변화의 결과. 우리는이 "플래시"스핀 페놀 오염 감소했다고 추론270 nm의 및 280 nm의 피크가 가장 가능성이 단백질의 오염을 나타내는 결론을 내렸다.
또한 RNA 수율을 증가시키고 우리를 통해 단백질 운반을 감소하는 것은 위상 잠금 젤 단계를 추가했습니다. 이 단계는 유기 오염물 (도 1b)없이 성상의 완전한 전달을 허용했다. 혈청 단백질의 큰 풍요 로움을 포함하기 때문에 원래의 혈청 볼륨을 희석하는 것은 차이 (그림 1C)를 확인하면, 우리는 평가했다. 500 μL의 총 추출물 볼륨에서, 우리는 dH보다 2 O와 혈청의 400 및 250 μl를 혼합 혈청 250 μl를 사용하여 비교할 때 큰 볼륨 수율은 거의 전체 RNA의 양을 두 배로. (이 최적화 단계에서 유일한 변수는 혈청의 부피되면서, 230 nm의 피크를 직접 혈청 볼륨과 연관 트라이 시약 분리로부터되지 아티펙트 참고) 초기 양을 감소 할 때 오염 물질의 감소가 또한 있었다 . 이러한 제제의 작은 RNA 함량이어서 작은 RNA 키트와 조합 Bioanalyzer를 사용하여 평가 하였다. Bioanalyzer 추적에서 마이크로 RNA 인구 (그림 2A)를 나타냅니다 약 20 국세청에서 뚜렷한 피크가있다. 이 프로토콜을 사용하여,이 마이크로 RNA 성분은 전체 작은 RNA 인구의 93 %를 차지했다. 이는 순도가 높은 수준이며, 전체 RNA는 이제 이러한 배열 및 qPCR의 반응과 같은 분자 분석법을 변화에 사용될 수있다. 워크 플로의 개요는 그림 (b)에 표시됩니다.
우리는 다음 올리고 뉴클레오티드의 배열 또는 qPCR에 하나를 사용하여 네 가지 생물학적 샘플에서 마이크로 RNA 발현을 측정 하였다. 그림 3a는이 4 개의 샘플의 마이크로 RNA 열 맵을 나타냅니다. 우리의 이전 연구에서와 같이, 계층 적 클러스터링들은 마이크로 RNA 발현 양상 8에 근거 발현 데이터 그룹 및 샘플을 분석하기 위해 사용되었다. 정량PCR (qPCR에)도 이러한 제제에서 마이크로 RNA 수준을 평가하기 위해 사용되었다. 같은 4 개의 샘플을 사용하여, 우리는 미르-21-5P, 미르-486-5P, 미르-15B-5P, 미르-16-5P 및하자-7A를 감지하는 singleplex의 TaqMan의 qPCR 반응을 수행 하였다. 증폭 플롯 (그림 3B 및 3C)에 나타낸 바와 같이 모두의 miRNA를 성공적으로 검출되었다.
그림 1. 인간 혈청에서 RNA의 분광 프로필. 인간 혈청 (블루 라인)에서 분리 된 RNA의 A. 일반적인 UV 프로필. 다양한 최적화 단계가 오염 물질을 줄이고 총 RNA 수율을 높이기 위해 테스트되었습니다. B. 정상적인 분리에 위상 잠금 젤의 사용 혈청 다른 시작 볼륨이 두 측정. C. 프로필을 비교합니다. 볼륨 H 늘리기 RNA의 수율에 광고 표시에 미치는 영향은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. A. 대표 Bioanalyzer 약 21 뉴클레오티드 (x 축)에 하나의 스파이크를 보여 추적. 이 스파이크는 혈청에서 작은 RNA 인구 혈청에서 총 RNA를 분리하는 워크 플로의. B. 요약에서 miRNA의 분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3.이 방법을 사용하여 고립 된 마이크로 RNA는 배열 프로파일 링 및 qPCR에 분석을 위해 사용되었다. A. 세의 머리와 목 암과 하나의 정상 혈청은 (마이크로 RNA 포함) 총 RNA에 대한 고립과 8 X 60K miRNA의 칩을 사용하여 배열을 프로파일 링을 실시 하였다. 이것은 기술적으로 반복 실험을 반복 하였다. 원시 데이터 품질 관리 (QC) 처리 한 후,이 마이크로 RNA의 발현은 계층 적 클러스터링 (HCL)을 사용하여 분석 및 열 맵으로 제시했다. 레드 규제를 나타내고 파란색은 마이크로 RNA의 조절을 나타냅니다. 미르 - 21 미르 - 486, 미르-15, 미르-16 및하자-7A 4 개의 인간 혈청에. C. 전체의 검출을위한 B. 대표 qPCR의 증폭 곡선 다섯의 miRNA가 발견 된 원시 캐럿의 값은 다음 정상 혈청에 그려졌다. 검출이 패턴은 다른 3 개의 시료 (데이터는 도시되지 않음)에 대해 유사 하였다..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마이크로 RNA의 인구는 혈청에서 발견 된 총 RNA의 약 0.4 ~ 0.5 %를 구성한다. 또한 인간 혈청에서 발견 높은 단백질 함량이있다. RNA를 개선하고 단백질과 페놀 양을 줄이기 위해 우리가 여러 단계의 추가와 함께 기존의 Chomczynski 방식 9을 수정 한 오염.
우리 연구실에서 수행 할 때 전체 RNA는 표준 트라이 시약 RT-LS (분자 연구 센터)를 사용하여 혈청에서 분리 하였다 그러나이 방법은 여러 가지 오염 물질과 낮은 수량 RNA를 얻었다.
그림 1은 280 nm의, 270 nm에서의 페놀 오염, 및 230 nm에서 다른 유기 오염 물질의 단백질 오염의 증거 UV 분광 RNA 프로파일을 보여줍니다. 시약, 구 아니 디늄 티오 시아 네이트는 또한 260 nm에서 검출되었다.
낮은 혈청 RNA 수율의 문제를 해결하고 오염 optimizat의 시리즈를 줄이기 위해이온 단계는 표준 트라이 시약 RT-LS 절차에 첨가 하였다. 첫째, 우리는 발견 5 감소 단백질 오염 혈청 1을 희석. 이 단계는 다른 연구 (10)에 의해 추천 된 단백질의 오염을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 우리는 1 ㎎ / ㎖의 우리는 (100) 농도의 범위를 테스트 한 단백질 분해 효소 K의 농도, 500, 1,000 μg을 사용했다. 농도 사이의 차이는, 따라서 우리는 더 높은 농도 짧은 배양 기간을 이용 없었다.
제 2 변형은 2.0 ml의 위상 잠금 튜브의 사용을 소개했다. 무거운 위상 잠금 젤은 유기상 페놀 및 단백질과 같은 오염 물질의 대부분을 트래핑. 이는 오염의 위험이없는 수성상의 최대 전송 밀도 장벽을 제공한다. 수성 / 유기 상 차단재로서 위상 잠금 젤의 응용 프로그램은 처리 시간을 감소시키고 추가로 DNA의 RECOV을 향상시킬 수있다만큼 30 %만큼 ERY 동시에 해로운 휘발성 유기물 (11)에 대한 노출로부터 사용자를 제거하면서. 제 3 변형은 RNA 품질의 상당한 개선 결과. 12,000 × g에서 "플래시"원심 스핀의 도입은 이전의 에탄올 세척에 RNA 펠렛에서 잔류 오염을 제거에 중요했다.
게시 된 다른 방법으로 10, 12, 13에 대한 접근 방식을 비교하면, 우리는 성상에서 작은 비 암호화 RNA를 회수를 최대화하는 위상 잠금 젤의 사용을 도입 하였다. 우리 프로토콜 등의 한계 중 하나는 복제에 아이솔레이션이 발현 분석을위한 충분한 RNA를 구하는 것이 필요할 수 있다는 것이다. 우리의 경험에서, 우리는 열 기반의 장비와 많은 연구를 통해 트리 졸 기반의 방법은 두 시스템 6, 14 ~ 16의 장점을 비교 한 것을 선호합니다. 중 특히 관심미르-141, 미르 - 29B, 미르-21, 미르-106B, 미르 - 15A와 미르 - 34A의 낮은 GC 함량의 miRNA가 선택적으로 트리 졸 방법을 사용하여 샘플 준비하는 동안 손실 된 결론 최근의 연구했다 17. 이 문제는 시료 분리 중에 마그네슘의 첨가에 의해 해결되었다.
요약하면, 우리의 프로토콜은 혈청에서 작은 RNA를 격리하는 전통적인 방법을 사용합니다. 이 혈청의 miRNA 마이크로 입자, 엑소 또는 죽어가는 세포에서 파생 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 다운 스트림 분자 애플리케이션에 이용 될 수있는 고품질의 RNA를 생성하기 위하여 이러한 모든의 miRNAs를 분리한다. 이 추출 방법은 매우 간단 대부분 실험실에서 발견 일반적으로 하드웨어에 의존하고, 인간 혈청에서의 miRNA 발현을 측정에 관심이 대부분의 초보자를위한 간단하다.
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Disclosures
공개 아무것도 없다.
Acknowledgments
사만다 Khoury와 파멜라 Ajuyah는 호주 석사 과정을 지원합니다. 우리는 또한 사만다 Khoury 자신의 추가 지원에 대한 번역 상 암 연구 네트워크, 로위 암 연구 센터, 뉴 사우스 웨일즈 대학과 북부 번역 상 암 연구 단위를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
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