Summary
Bu protokol, insan serumundan küçük RNA'ların ekstre edilmesi için bir yöntem tarif eder. Biz DNA dizileri kullanmak için kanser serumdan microRNA izole ve aynı zamanda singleplex kantitatif PCR için bu yöntemi kullandık. Protokol yüksek kalitede RNA elde edildi modifikasyonlarla fenol ve guanidinyum tiosiyanat reaktifler kullanır.
Abstract
RNA ve ifade analizi, çok laboratuvarda ortak bir özelliktir. Önemi memeli hücrelerinde bulunan mikroRNA'lar, gibi küçük RNA'lar çıkmasıdır. Bu küçük RNA'lar gibi büyüme, gelişme ve ölüm ve çok ilgi gibi hayati yollar kontrol güçlü gen düzenleyiciler vücut sıvılarında kendi ifadesi yönelik olmuştur vardır. Bu, kanser ve serum biyolojik olarak potansiyel uygulama gibi insan hastalıklarında da bozukluğunun kaynaklanmaktadır. Ancak, serum miRNA ifade analizi, sorunlu olabilir. Çoğu durumda, serum miktarı sınırlayıcı ve serum küçük RNA'lar tek 0,4-0,5% 1 teşkil eden toplam RNA düşük miktarda içerir. Böylece serumdan kaliteli RNA yeterli miktarda izolasyon araştırmacılar için büyük bir meydan okuma bugün. Bu teknik yazıda, DNA dizileri veya qPCR analizi ya için yeterli RNA elde etmek insan serumu sadece 400 ul kullanan bir yöntem ortaya koymaktadır. BirBu yöntemin dvantages sadeliği ve kaliteli RNA verim yeteneği vardır. Bu küçük RNA'lar saflaştırılması için hiçbir özel sütunları gerektirir ve ortak laboratuvarlarda bulunan genel reaktifler ve donanım kullanır. Önerilen yöntem, aynı zamanda, yüksek kaliteli RNA netice verirken, fenol kirlenmeyi elimine etmek için, bir faz kilit Jel kullanır. Ayrıca, daha da izolasyon aşaması esnasında tüm kirleri çıkarmak için ek bir adım tanıtmak. Bu protokol, serumdan kadar 100 ng / ul toplam RNA izole verim çok etkili değil, aynı zamanda diğer biyolojik dokular için uyarlanabilir.
Introduction
Son yıllarda, insan hastalıklarının erken teşhisi için yeni biyomarkerler keşfetmek için büyüyen bir itme olmuştur. Çok dikkat potansiyel belirteçleri gibi microRNA 2 (miRNAs veya Mirs) gibi küçük RNA'lar kullanılarak odaklanmıştır. Bu küçük RNA'lar gibi serum ve çalışmaları gibi vücut sıvılarında bulunan bu bozunmaya esnek ve değişen çevre koşulları 3'ün bir aralığı üzerinde kararlı olduğunu göstermiştir. Bu özellikler, serum veya dolaşımdaki miRNA'ların İdeal biyobelirtecin 4, 5 göz önüne alındığında. Şu anda biyolojik sıvılardan küçük RNA izolasyonu için iki temel yaklaşım vardır. İkinci yaklaşım fenol ve guadinyum tiosianat reaktifler 7 ile uzun soluklu protokolü kullanan ise ilk yaklaşım, küçük RNA'lar 6 bağlamak ve eluteye sütun tabanlı teknoloji kullanır. Biz insan serumu küçük RNA'lar izole etmek için basit, etkili, kolonsuz protokol geliştirdik. İzole edilen RNA derhal olduğuDNA oligonükleotid diziler ve RNA sıralanması gibi aşağı uygulamalarda rilmesi kullanılabilir.
Serumdan RNA izole etmek için fenol-tabanlı yöntemler kullanarak zaman biz çeşitli konularda karşı karşıya, çünkü bu protokol geliştirildi. Geleneksel Chomczynski yaklaşım, sıklıkla bir çok ticari satıcılardan temin edilebilir tepkin bir dizi ile en laboratuarlarda kullanılmaktadır. Bununla birlikte yaygın kullanımları göz önüne alındığında, sıkı kurallar sürekli olarak belirli bir kan ya da serum içinde, vücut sıvıları yüksek kaliteli RNA'yı üretmek için geliştirilmiş edilmemiştir.
Serum RNA izole edilmesi ile bağlantılı ortak sorunlar düşük verimler ve RNA izolasyonu, özellikle fenol sırasında kullanılan reaktifleri ile kontaminasyonu içerir. Bizim yaklaşım, kantitatif PCR (qPCR) ve RNA sıralanması gibi alt analizi için yüksek kaliteli RNA sağlamak için bu fenol kirleticileri ortadan kaldırır. Biz daha miRNA dizileri bu RNA test ettik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Sağlıklı hastalarda ya da kanser hastaları İnsan serum örnekleri, Kraliyet Prens Alfred Hastanesi Sydney (Protokol numarası X10-0016 ve HREC/10/RPAH/24) ve Teknoloji Üniversitesi onaylanan insan etik protokolleri altında rıza ile elde edildi Sydney. Serum örnekleri çeşitli Sydney hastane ameliyatı önceki hastalar toplanmış ve -80 ° C 'de depolama yerleştirildi
Serum 1. Küçük RNA İzolasyon
Toplam RNA, Tri-Reagent LS protokolü RT modifiye edilmiş bir versiyonu kullanılarak insan serumundan hazırlandı.
- Buz üstünde dondurulmuş serum örnek çözülme ve daha sonra etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne taze çözülmüş serumun 400 ul aktarın.
- RNase H serbest 2 O, 100 ul serum seyreltilir ve 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda, proteinaz K ekleyin.
- Proteinaz K tarafından protein sindirimini izin vermek için 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe
- To, tam çözülmesini sağlamak Tri-Reagent LS RT 1.5 misli hacim ve 4-bromoanisol 100 ul ilave edin.
- Kısaca, ters Homojenat 5 saniye boyunca tekrar eden pipetleme gerçekleştirmek ve bir işaretlenmiş 2 mi Ağır Faz Kilitli tüp içine aktarın.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 12,000 x g'de Homojenat Spin
- Dikkatli bir şekilde yeni DNA LoBind tüp içine edilen sulu çözeltinin en az 1 ml süzün. Organik ve fazlar arası Faz Kilitli borunun beyaz jel altında sıkışmış olmalıdır.
- , Sulu çözeltiye glikojen 5.0 ul (5 mg / ml) ve% 100 izopropanol, 500 ul ters çevirme ile karıştırın ve -20 ° C'de O / N inkübe
- Aşağıdaki O / N inkübasyon 4 ° C santrifüj içinde 12,000 x g'da 20 dakika boyunca santrifüj örneği.
- Net Süpernatantı atın ve 4 ° C santrifüj 16.000 × g 2 dakika için bir "flaş" sıkma gerçekleştirin.
- Dikkatle açık sol kaldırmakBir pipet kullanarak pelet çevreleyen ution.
- 10 dakika boyunca 10,000 x g 'de% 70 etanol ve 1 ml santrifüj ile pelet yıkayın. Yıkama solüsyonu Durusu ve yıkama adımı tekrarlayın.
Çözüm içine 2. RNA Tekrar Süspansiyonu
- Pelet tamamen çözülür sağlanması, RNase serbest H 2 O 10 ul pelet tekrar. RNA tamamen çözünebilir olduğundan emin olmak için, numune, 5 dakika boyunca 55 ° C'ye kadar ısıtılabilir. Bu süre boyunca, tekrar pipetleme ile örnek karıştırın. Daha yüksek bir toplam RNA verimi için, aynı hastadan alınan iki RNA preparatları havuz.
- UV-Vis spektrofotometre kullanılarak yeniden süspansiyon haline getirildi ve bir RNA miktarını belirlemek 2100 Bioanalyzer kullanılarak RNA kalitesini değerlendirmek. Alt uygulamalarında kullanılmak üzere -80 ° C'de bir araya getirilmiş RNA örnekleri saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, serumdan izole edilmiş RNA tipik bir UV / Vis spektrumunu göstermektedir. Bu profil itibaren biz, sırasıyla her iki 270 nm ve 230 nm 'de fenol ve organik kirletici maddeler ile 280 nm'de protein kontaminasyonu kaydetti. Kalıntı, guanidinyum tiosiyanat da 260 nm'de tespit edilmiştir. Kirletici maddeleri azaltmak için, optimizasyon adımları bir dizi standart Tri-Reagent LS RT-prosedürü için yapılmıştır. Biz, total RNA verimi artırmak ve hem de bulaşma (siyah çizgi, Şekil 1A) azaltmak için glikojen 5 mg / ml ilave edildi.
İleride izopropanol çıkarılmasından sonra RNA topağı çevreleyen yıkama tamponu yaklaşık 100-300 ul olduğu görülmektedir. Ek bir santrifüj sıkma protokol ilave edildi ve tortu, yıkama çözeltisi dikkatli bir şekilde kaldırıldı. Bu, 280 nm'de (kırmızı iz, Şekil 1 B) için 270 nm bir profili değişime yol açtı. Biz bu "flaş" spin fenol kontaminasyonu azalmış olduğu sonucuna270 nm ve 280 nm tepe en olası protein kirlenme temsil ettiği sonucuna vardı.
Ayrıca RNA verimi artırmak ve biz yoluyla protein taşımak azaltmak için bir Phase Lock Jel adım ekledi. Bu adım, organik kirletici maddeler (Şekil 1 B) olmadan, sulu fazın tam devri için izin verdi. Serum protein büyük bir bolluk içeren olarak, orijinal serum seviyesini sulandırarak herhangi bir fark (Şekil 1C) yapmak olsaydı, biz değerlendirildi. 500 ul toplam hacim ekstresi olarak, dH 2 O. serum ile 400 ve 250 ul karıştırılmış Serum 250 ul kullanarak karşılaştırdığımızda büyük hacimli verimi yaklaşık toplam RNA miktarını ikiye katladı. (Bu optimizasyon adımda tek değişken serum hacmi olduğu gibi, 230 nm tepe doğrudan serum hacimleri ile ilişkili ve Tri-Reagent izolasyondan olmayan bir obje bir Not) başlangıç hacmi azaldığı zaman kirletici bir azalma oldu . Bu müstahzarların küçük RNA içeriği daha sonra küçük RNA Kit ile bir arada Bioanalyzer kullanılarak değerlendirildi. Bioanalyzer iz itibaren, mıkroRNA nüfus (Şekil 2A) gösteren yaklaşık 20 nts da ayrı bir tepe vardır. Bu protokolü kullanarak, bu mıkroRNA bileşen toplam küçük RNA nüfusun% 93 temsil etti. Bu, yüksek bir saflık düzeyi ve toplam RNA, artık bu tür diziler ve QPCR reaksiyonları gibi moleküler tahlilleri değiştirmek için kullanılabilir. Iş akışının bir özeti Şekil 2B'de gösterilmiştir.
Daha sonra bir oligonükleotid dizisini veya qPCR kullanılarak dört farklı biyolojik örneklerde microRNA ifade ölçülür. Şekil 3A, bu dört numune microRNA ısı haritasını gösterir. Önceki çalışmamızda olduğu gibi, hiyerarşik kümeleme onların mıkroRNA ifade profiline 8 tabanlı ifade verileri ve grup örnekleri analiz etmek için kullanıldı. NicelPCR (qPCR), aynı zamanda, bu terkiplerde microRNA düzeylerini değerlendirmek için kullanıldı. Aynı dört örnekleri kullanılarak, biz miR-21-5p, miR-486-5P, miR-15b-5p, miR-16-5p ve let-7a algılamak için singleplex TaqMan qPCR reaksiyonlar gerçekleştirilir. Amplifikasyon araziler (Şekiller 3B ve 3C) 'de gösterildiği üzere tüm miRNAs başarılı bir şekilde tespit edilmiştir.
Şekil 1. Insan serum RNA spektrofotometrik profili. Insan serumu (mavi çizgi) izole edilmiş RNA A. Tipik UV profili. Çeşitli optimizasyon adımları kirleticilerin azaltılması ve toplam RNA, verimi artırmak için test edildi. B. normal izolasyonuna bir Faz Kilitli jel kullanımını serumu farklı başlangıç hacmi ile iki ölçümün. C. Profil karşılaştırır. Hacmi h artırılması RNA verimleri üzerinde reklam işaretli etkisi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2.. A. Temsilcisi Bioanalyzer yaklaşık 21 nükleotit (x-ekseni) tek bir başak gösteren iz. Bu başak serumdan küçük RNA nüfus serum toplam RNA izole etmek için iş akışı. B. Özet olarak miRNA kısmını temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
hres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51443/51443fig3.jpg "/>
Şekil 3,., Bu yöntem kullanılarak izole microRNA dizi profili QPCR ve analiz için kullanılmıştır. A. Üç baş ve boyun kanserleri ve bir normal sera (mikroRNA'lar dahil) toplam RNA izole edilmiş ve 8 X 60K miRNA yongasını kullanarak dizi profili tabi tutuldu. Bu teknik çoğaltır tekrarlandı. Ham veri Kalite Kontrol (QC) işleme sonra, bu microRNA ifadesi Hiyerarşik Kümeleme (HCL) kullanılarak analiz edildi ve bir ısı haritası olarak sundu. Kırmızı düzenleme yukarı gösterir ve mavi microRNA düzenleme aşağı gösterir. MiR-21, miR-486, Mir-15, Mir-16 ve let-7a dört insan serumunda. C. All tespiti için B. Örnek QPCR amplifikasyon eğrileri Beş miRNAs tespit edildi ve ham Ct değerleri, daha sonra, normal serum için çizilmiştir. Bu tespit model, diğer üç numune (veriler gösterilmemiştir) benzer olmuştur..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MicroRNA nüfusu serumda bulunan toplam RNA'nın yaklaşık olarak% 0.4-0.5 oluşturmaktadır. Bundan başka, insan serumunda bulunan, yüksek protein içeriği de vardır. RNA ve protein geliştirmek ve fenol hem azaltmak için biz birkaç adımda eklenmesi ile geleneksel bir yaklaşım Chomczynski 9 olarak var kirlenmektedir.
Laboratuvarımızda gerçekleştirildiğinde Toplam RNA, standart Tri-Reagent LS RT-(Molecular Research Centre) kullanarak serumdan izole edilmiştir, ancak, bu yöntem, çeşitli kirletici düşük miktarlarda RNA vermiştir.
Şekil 1, 280 nm, 270 nm 'de fenol kirlenme ve 230 nm' de bir diğer organik kirletici maddelerin en protein kirlenme kanıtı olan bir UV spektrofotometrik RNA profilini gösterir. Reaktif, guanidinyum tiyosiyanat, aynı zamanda 260 nm'de tespit edilmiştir.
Düşük serum RNA verimi sorunları ele ve kirlenmeyi, optimizat bir dizi azaltmak içiniyon adımlar, standart Tri-Reagent LS RT-prosedürüne ilave edildi. Öncelikle, bulduğumuz 5 düşük protein kirlenme serum 1. seyreltilmesi. Bu adım, başka çalışmalar 10 tarafından edilmiş ve protein kirliliği azaltmak için gösterilmiştir. Ayrıca, 1 mg / ml 'den 100 Bu bir dizi konsantrasyon halinde test edilmiş olan proteinaz K konsantrasyonu, 500 ve 1000 ug kullanılır. Konsantrasyonları arasında bir fark böylece biz daha yüksek konsantrasyonları ve daha kısa süreler kullanılır inkübasyon yapıldı.
İkinci değişiklik, 2.0 ml Phase Lock tüplerin kullanımını tanıtmak oldu. Ağır faz Lock Jel, örneğin, organik faz içinde, fenol ve protein gibi kirletici maddelerin çoğunluğu yakalar. Bu kirlenme riski olmadan sulu fazın en fazla transferi için bir yoğunluk bir engel oluşturur. Bir sulu / organik faz bariyer malzeme olarak Faz Kilitli Jel uygulama işlem süresini azaltmak ve daha fazla DNA fraksiyonu artırabilirkadar% 30 oranında ery, aynı zamanda zararlı uçucu organik 11 maruziyetten kullanıcı ortadan kaldırırken. Üçüncü modifikasyon RNA kalitesinde önemli bir gelişme ile sonuçlanmıştır. 12,000 x g 'de bir "flaş" santrifüj dönüş giriş önce etanol yıkama için RNA pelet herhangi bir kalıntı lekeleri çıkarma önemliydi.
Yayınlanan diğer metodolojiler 6, 12, 13 bizim yaklaşım karşılaştırıldığında, biz sulu fazdan küçük noncoding RNA'ların kurtarma üst düzeye çıkarmak için bir Faz Kilit Jel kullanımını girmiştik. Bizim protokol ve diğer sınırlamaları bir suret izolasyon ifade analizi için yeterli RNA elde etmek için gerekli olabilir olmasıdır. Tecrübelerimizi, biz sütun tabanlı kitleri ve çok sayıda çalışmalar üzerinde Trizol dayalı yöntemler iki sistemde 6, 14-16 yararları karşılaştırdık tercih ederim. Of özellikle faizBöyle miR-141, miR-29b, Mir-21, miR-106b, miR-15a ve miR-34a kadar düşük GC içeriği ile miRNA'ların, seçici Trizol yöntem kullanılarak numune hazırlama sırasında kaybolur sonucuna yeni bir çalışma oldu 17. Bu sorun, örnek izolasyon sırasında magnezyum eklenerek çözüldü.
Özetle, bizim protokol serumdan küçük RNA'lar izole etmek için geleneksel yöntemleri kullanır. Bu serum miRNAs mikro parçacıklar, eksozom veya ölen hücrelerden türetilebilmektedir. Bu protokol, çeşitli alt moleküler uygulamalarda kullanılabilecek yüksek kalitede RNA'yı üretmek amacıyla, bu miRNA'lar izole edebilir. Bu ekstraksiyon yöntemi, oldukça basittir çoğu laboratuvarlarda bulunan ortak donanım dayanır, ve insan serumunda miRNA'ların ifadesini ölçmek ilgilenen çoğu yeni başlayanlar için yeterince basit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Samantha Khoury ve Pamela Ajuyah Avustralyalı Lisansüstü Ödülü tarafından desteklenmektedir. Biz de Samantha Khoury kendi ek destek için Translational Cancer Research Network, Lowy Kanser Araştırma Merkezi, New South Wales Üniversitesi ve Kuzey Translational Cancer Research Unit kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
