Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

استعمال اللوني للغاز لتحليل التغييرات التركيبية من الأحماض الدهنية في الفئران الكبد الأنسجة أثناء الحمل

Published: March 13, 2014 doi: 10.3791/51445
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Human Development & Health Academic Unit, Faculty of Medicine, University of Southampton

Summary

الحمل يؤدي إلى تغييرات كبيرة في تكوين الأحماض الدهنية من الأنسجة الأمهات. ويمكن الحصول على ملامح من المادة الدهنية عبر اللوني للغاز للسماح تحديد وتقدير الأحماض الدهنية في الطبقات الدهنية الفردية بين الفئران التي تغذت مختلف الوجبات الغذائية عالية الدهون ومنخفضة خلال فترة الحمل.

Abstract

اللوني للغاز (GC) هو وسيلة حساسة للغاية يستخدم لتحديد وقياس محتوى الأحماض الدهنية من الدهون من الأنسجة، والخلايا، والبلازما / مصل، مما أسفر عن النتائج بدقة عالية واستنساخ عالية. في دراسات التمثيل الغذائي والتغذية يسمح GC تقييم التغيرات في تركيزات الأحماض الدهنية التالية تدخلات أو خلال التغيرات في الحالة الفسيولوجية مثل الحمل. المرحلة الصلبة استخراج (SPE) باستخدام خراطيش أمينو السيليكا يسمح الفصل بين الطبقات الدهنية الرئيسية بما في ذلك زعت عشوائيا إلى ثلاثة، الدهون الفوسفاتية المختلفة، واسترات الكوليسترول (CE). تم استخدام GC جنبا إلى جنب مع جمعية مهندسي البترول لتحليل التغيرات في تكوين الأحماض الدهنية من جزء CE في كبد الفئران الحوامل البكر والتي تم تغذيتها مختلف الوجبات الغذائية العالية والمنخفضة الدهون. هناك آثار التفاعل حمية / الحمل كبير على محتوى حمض أوميغا 3 و أوميغا 6 الدهنية من الكبد CE، مشيرا إلى أن الإناث الحوامل لديهم استجابة مختلفة لmanipulat الغذائيةوينظر أيون من بين الإناث البكر.

Introduction

اللوني للغاز (GC) هي تقنية راسخة المستخدمة لتحديد وقياس إدماج الأحماض الدهنية في تجمعات الدهون وأغشية الخلايا 1،2 خلال مكملات أو الفسيولوجية الظروف مثل السمنة (والأمراض ذات الصلة مثل مرض السكري) أو الحمل 3 - 5. بل هو أيضا مناسبة لتحليل أنواع وكميات الدهون في الأطعمة. هذا مفيد عندما تميز العلائق، وكذلك التأكد من أن صناعة المواد الغذائية يتوافق مع اللوائح. على سبيل المثال، GC يمكن استخدامها لتأكيد هوية وكمية من الأحماض الدهنية داخل منتج مثل المكملات الغذائية لضمان وضع العلامات هو الصحيح، ويتم الالتزام اللوائح إلى 6،7. تحليل الأحماض الدهنية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول التمثيل الغذائي للدهون في الصحة والمرض، وتأثير تغيير النظام الغذائي، وتأثير التغيرات في الحالة الفسيولوجية 8. وقد وفرت استخدام GC لدراسة عينات خلال فترة الحمل مهمةمعلومات عن التغيرات في الأحماض الدهنية والدهون المعقدة التوازن 3.

في وقت مبكر من الفصل الكروماتوغرافي، وعادة ما تكون نسبة الدهون المستخرجة من العينة باستخدام ذوبان الدهون في مخاليط المذيبات من الكلوروفورم والميثانول. يتم إضافة كلوريد الصوديوم إلى تسهيل فصل الخليط في الدهون المائية والعضوية التي تحتوي مراحل 9،10. يمكن فصل الطبقات الدهنية المعقدة من الاهتمام من مجموع استخراج الدهون من خلال المرحلة الصلبة استخراج (SPE). هذه التقنية فصل elutes الطبقات الدهنية على أساس قطبية أو تقارب ملزمة. ومزال Triacyglycerols (TAG) واسترات الكوليسترول (CE) أولا ككسر مجتمعة، كذلك الطبقات، فسفاتيديل (PC)، فسفاتيديل (PE)، والأحماض الدهنية غير تجمعت (NEFA) ومزال عن طريق زيادة قطبية المذيب يبلغ حجمه . فصل TAG من CE يستغل الملزمة TAG فقط لخراط SPE جديدةDGE، مما يسمح CE أن مزال. ويمكن بعد ذلك أن TAG مزال عن طريق زيادة قطبية المذيب 9،10 يبلغ حجمه. يسمح هذا الأسلوب يتحقق عينات متعددة في وقت واحد لا يمكن فصلها مع تحقيق عائد أعلى من مع طبقة رقيقة اللوني، مما يعني أن عينات صغيرة نسبيا الحجم (على سبيل المثال <البلازما أو مصل 100 ميكرولتر، <100 ملغ الأنسجة) يمكن تحليلها 11،12.

GC هي تقنية راسخة وصف لأول مرة في 1950s؛ اقترح أن الطور المتحرك في النظم ثم السائل السائل يمكن الاستعاضة مع بخار. انه كان يستخدم في البداية لتحليل البترول ولكن توسعت بسرعة في مجالات أخرى مثل تحليل الأحماض الأمينية والدهون الكيمياء الحيوية، والتي لا تزال ذات أهمية كبرى. وقد أدى التقدم في المعدات والتكنولوجيا GC مثل وضع الأعمدة الشعرية من الأعمدة معبأة المستخدمة سابقا إلى التقنيات الحالية لدينا في الأحماض الدهنية التي هي قادرة على أن تكونفصل أكثر كفاءة في درجات حرارة أقل مما أدى إلى GC تستخدم بشكل روتيني لتحديد وقياس الأحماض الدهنية في مجموعة واسعة من التحقيقات 13.

يتطلب GC الأحماض الدهنية أن derivatized من اجل ان يتمكنوا قد تصبح متقلبة بما فيه الكفاية ليكون مزال في درجات حرارة معقولة دون التحلل الحراري. هذا وعادة ما ينطوي على الاستعاضة عن مجموعة وظيفية تحتوي على الهيدروجين لتكوين استرات، thioesters أو الأميدات للتحليل. ودرس استرات الميثيل عادة المشتقات التي يتم إنتاجها من قبل مثيلة. في هذا الأسلوب يتم تحلل السندات استر في الدهون المعقدة للافراج عن الأحماض الدهنية الحرة، والتي transmethylated لتشكيل استرات الأحماض الدهنية الميثيل (FAME). الملف الشخصى الناتجة من FAME، والتي تحددها القيادة العامة، ويشار إليها باسم تكوين الأحماض الدهنية، ويمكن بسهولة مقارنة بين المجموعات التجريبية المختلفة 9،10. يسمح للتقنية كل من نسب individالأحماض الدهنية السياقية وتركيزاتها المراد قياسها.

بالإضافة إلى استخدام GC لتحليل الأحماض الدهنية في دراسات التغذية وداخل صناعة الأغذية، وتقنية يمكن استخدامها عبر مجموعة واسعة من المجالات التحليلية. على سبيل المثال، التحليلات البيئية باستخدام GC تشمل قياس تلوث المياه من خلال المبيدات الحشرية والتربة تحاليل قياس محتوى كلوروبنزين. في علم السموم، كما تم استخدام GC لتحديد المواد غير المشروعة في البول وعينات الدم من الأفراد؛ مثل هذه القدرة على الأداء الرياضي 12 والقدرة على فصل مخاليط معقد من الهيدروكربونات يجعل هذه التقنية شعبية في الصناعة النفطية لتحليل البتروكيماويات 12.

ويرتبط الحمل مع تغييرات كبيرة في تكوين الأحماض الدهنية من الأنسجة الأمهات، وتحديدا في محتوى أوميغا 3 (ن 3) وأوميغا 6 (ن 6) غير المشبعة المجلس الدولي للمطارات الدهنيةس (بوفا) 3. في الدراسة الحالية، ونحن مثالا على استخدام GC في قياس الأحماض الدهنية من خلال وصف استخدامه في تحليل تكوين الأحماض الدهنية من الأنسجة المأخوذة من الكبد الفئران الحوامل البكر وتغذية حمية منخفضة الدهون وعالية مع مصادر النفط المختلفة. كانت العلائق المقدمة هنا على النفط على أساس نظام غذائي منخفض الدهون فول الصويا، اتباع نظام غذائي عالي الدهون التي تعتمد على النفط فول الصويا (130.9 ز الدهون / كجم من الدهون الكل) أو اتباع نظام غذائي تعتمد على النفط بذر الكتان غنية بالدهون (130.9 ز الدهون / كجم النظام الغذائي)، شريطة لمدة 20 يوما. وقد وصفت والمواد الغذائية كاملة وتكوين الأحماض الدهنية من هذه الوجبات سابقا 14. الوجبات الغذائية زيت فول الصويا غنية في حمض اللينوليك (18:02 ن 6) وتحتوي على بعض حمض اللينولينيك α (18:03 ن 3) في حين أن اتباع نظام غذائي زيت بذر الكتان غنية في حمض اللينولينيك-α. تمثل هذه الوجبات الغنية بالدهون حصص مختلفة من اللينوليك إلى α لينولينيك والأحماض (حصص من 8:1 و 1:1 على التوالي). طريقة لعزل الطبقات الدهنية الفردية وتحليلها بواسطة GC هو أنناليرة لبنانية أنشئت والتحقق من صحتها، وقد نشرت سابقا 10 ولكن من دون صفا تقنيا مفصلا وجدت في هذه الوثيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إجراءات الحيوان

  1. ينبغي تنفيذ جميع أعمال الحيوانية وفقا للوزارة الداخلية على الحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام (1986).
  2. تتزاوج فئران ويستار الذين تتراوح أعمارهم بين 10 أسابيع من العمر عن طريق تربية بزوجة واحدة، وتأكيد الحمل بظهور المكونات المهبلية. تسجيل هذه كيوم 1 من الحمل، ويبدأ النظام الغذائي التجريبية. للإناث عذراء، إيواء كل الفئران بشكل فردي، وبدء اتباع نظام غذائي التجريبية.
  3. بعد تغذية علائق تجريبية لمدة 20 يوما الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم.
  4. استخدام ملقط تشريح ومقص لفضح تجويف البطن واستئصال الكبد عن طريق قطع الأربطة، التي تربط الكبد إلى الحجاب الحاجز، والجدار الأمامي للبطن والمعدة والاثني عشر. يغسل الكبد في برنامج تلفزيوني وتجميد في النيتروجين السائل قبل تخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد الدهن إجمالي استخراج 9

  1. إضافة moleculالمناخل ع (لملء 1/10 من الحاويات المذيبات) لجميع المذيبات المذيبات لخلق 'الجافة'. القيام بجميع أعمال المذيبات داخل غطاء الدخان.
  2. قطع ما يقرب من 100 ملغ الكبد المجمدة وتزن. وضع الأنسجة في أنبوب في دلو الثلج وإضافة 0.8 مل الجليد الباردة 0.9٪ كلوريد الصوديوم. تجانس الأنسجة.
  3. إضافة المعايير الداخلية الذائبة في 1 مل / ملغ من كلوروفورم الجافة: الميثانول (2:1، ت / ت) التي تحتوي على hydroxytoluene الأنيسول (BHT و 50 ملغ / لتر)، ومضادة للأكسدة. ل100 ملغ من كبد الفئران إضافة 100 ميكروغرام من معيار CE (الكوليسترول heptadecanoate 17:00) تنبيه: الكلوروفورم وBHT خطرة.
  4. إضافة 5.0 مل كلوروفورم الجافة: الميثانول (2:1، ت / ت) التي تحتوي على BHT (50 ملغم / لتر).
  5. إضافة 1.0 مل 1 M كلوريد الصوديوم، مزيج دقيق من قبل vortexing حتى خليط تبدو موحدة. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة، الفرامل المنخفضة في درجة حرارة الغرفة.
  7. جمع أقلمرحلة استخدام الزجاج ماصة باستور، ونقل إلى جديدة قبعة المسمار أنبوب زجاجي والجافة تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.

3. الفصل بين فئات الدهون الصلبة عن طريق استخراج المرحلة (SPE) 10

  1. ربط خزان SPE إلى مضخة الفراغ ووضع أمينو السيليكا خرطوشة SPE على الخزان.
  2. وضع جديد المسمار غطاء أنبوب زجاجي المسمى TAG وCE في رف خزان تحت عمود لجمع جزء الأول.
  3. حل مجموع استخراج الدهون في 1.0 مل كلوروفورم الجافة والدوامة.
  4. تطبيق العينة إلى العمود باستخدام ماصة باستير الزجاج والسماح لبالتنقيط من خلال أنبوب في غطاء المسمار تحت الجاذبية. عندما تسقط لا تقطر أبعد من ذلك، إزالة السائل المتبقية فراغ.
  5. أزل TAG CE وجزء تحت فراغ، وغسل العمود مع 2 × 1.0 مل يغسل كلوروفورم الجافة.
  6. عندما تتم إزالة جميع السائل، وتجفيف TAG CE fractioن تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.
  7. وضع جديد المسمار غطاء أنبوب زجاجي PC وصفت في درج خزان تحت العمود.
  8. أزل الكسر PC تحت فراغ مع إضافة 2 × 1.0 مل كلوروفورم الجافة: الميثانول (60:40، ت / ت) حتى تتم إزالة جميع السائل من العمود.
  9. إزالة جزء PC والجافة تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.
  10. وضع المسمار غطاء أنبوب زجاجي المسمى PE جديدة في علبة دبابات وأزل PE جزء مع إضافة 1.0 مل الميثانول الجاف تحت فراغ.
  11. إزالة وPE الجافة جزء تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.
  12. وضع الزجاج الجديد المسمار غطاء أنبوب المسمى NEFA في علبة دبابات وأزل NEFA جزء تحت فراغ بإضافة 2 × 1.0 مل يغسل كلوروفورم الجافة: الميثانول: حمض الخليك الجليدي(100:2:2، ت / ت / ت) تنبيه: حامض الخليك الجليدي هو الخطرة.
  13. إزالة جزء جمعها NEFA والجافة تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.
  14. وضع أمينو السيليكا جديدة خرطوشة SPE على خزان SPE ووضع أنبوب زجاجي المسمار الحد الأقصى في علبة خزان تحت خرطوشة لجمع النفايات.
  15. غسل العمود مع 3 يغسل من الهكسان الجافة في ظل فراغ ثم يغسل 1.0ml النهائي تحت الجاذبية. لا تسمح خرطوشة لتصبح جافة (تحويل قنوات العمود خرطوشة لموقف مغلقة عند مستوى الهكسان على مقربة من مصفوفة خرطوشة) تنبيه: الهكسين خطرة.
  16. استبدال أنبوب النفايات مع أنبوب جديد الزجاج المسمار الحد الأقصى المسمى CE.
  17. حل المجففة وTAG CE جزء (المعد في الخطوة 3.6) في 1.0 مل من الهكسان الجافة والدوامة. لتطبيق هذا العمود باستخدام ماصة باستير الزجاج والسماح لبالتنقيط من خلال إطار زravity.
  18. عندما تسقط لا تقطر أبعد من ذلك، إزالة السائل المتبقية تحت فراغ.
  19. تحت فراغ، وغسل العمود مع 2 × 1.0 مل من الهكسان يغسل الجافة إلى أزل م وجزء جمعت الجافة تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.
  20. وضع جديد المسمار غطاء أنبوب زجاجي المسمى TAG في علبة دبابات وأزل TAG مع إضافة 2 × 1.0 مل من الهكسان يغسل الجافة: الميثانول: خلات الإيثيل (100:5:5) تحت فراغ.
  21. جزء الجافة التي تم جمعها تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع تحذير: خلات الإيثيل خطرة.

4. إعداد FAME من CE 10

  1. إضافة 0.5 مل من التولوين جافة لجزء CE فصل (جمعها في الخطوة 3.19) ودوامة الحذر: التولوين هو الخطرة.
  2. إعداد مثيلة كاشف (الميثانول الجاف مع 2٪ (الخامس/ V) H 2 SO 4)، منها 1.0 مل هو مطلوب لكل عينة. الاستغناء حجم الميثانول الجاف في كوب أو وعاء من البلاستيك مناسب مع غطاء وإضافة المبلغ المطلوب من H 2 SO 4 نقطه نقطه ثم تخلط بواسطة انعكاس تنبيه: حمض الكبريتيك هو الخطرة.
  3. إضافة 1.0 مل من كاشف مزج بالميثيل للعينات الذائبة في التولوين الجاف، وكأب الأنابيب بشكل آمن، والمزيج بلطف.
  4. تسخين العينات لمدة 2 ساعة على 50 درجة مئوية.
  5. بعد 2 ساعة إزالة الأنابيب من الحرارة. مرة واحدة إضافة 1.0 مل بارد تحييد الحل (0.25 M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3) تنبيه: بيكربونات البوتاسيوم وكربونات البوتاسيوم والخطرة.
  6. إضافة 1.0 مل الهكسان الجافة والدوامة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 2 دقيقة، الفرامل المنخفضة في درجة حرارة الغرفة.
  8. جمع المرحلة العليا، والذي يحتوي على الشهرة، ونقل إلى غير المسمار غطاء أنبوب زجاجي المتاح الجديدة.
  9. تجفيف FAME جمعها تحتالنيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع.

5. إزالة الكولسترول مجانا من التلوث CE FAME 14

(الكولسترول الحرة يمكن أن تلوث العينة، وانظر الشكل 1 لآثار سبيل المثال اللوني مع وبدون إزالة الكولسترول مجانا).

  1. وضع أنبوب في خزان النفايات SPE ووضع هلام السيليكا خرطوشة SPE على الخزان.
  2. غسل العمود مع 3 × 1 مل من الهكسان يغسل الجافة في ظل فراغ و1 × 1 مل تحت الجاذبية.
  3. إزالة النفايات ويغسل إضافة أنبوب في خزان النفايات الجديد.
  4. حل FAME CE في 1 مل الجافة الهكسان، دوامة.
  5. تنطبق على العمود باستخدام ماصة باستير الزجاج والسماح لبالتنقيط من خلال إطار الجاذبية.
  6. غسل العمود مع 3 × 1 مل من الهكسان يغسل تحت فراغ.
  7. إزالة يغسل النفايات ووضع أنبوب جديد غير سقف المسمار في خزان المسمى FAME CE.
  8. أزلFAME CE مع 2 × 1 مل الهكسان الجافة: ايثر (95:5 ت / ت) يغسل.
  9. تجف تحت النيتروجين عند 40 درجة مئوية. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل إلى أسبوع تحذير: ثنائي اثيل ايثر غير الخطرة.

6. نقل FAME إلى GC السيارات عينات فيال

  1. إضافة 75 ميكرولتر الهكسان الجافة لعينة، دوامة، ونقل إلى GC عينة السيارات القارورة.
  2. إضافة 75 ميكرولتر مزيد من الهكسان الجافة لعينة، دوامة ونقل إلى GC نفس العينة السيارات القارورة. عينات يمكن توج وتخزينها في -20 درجة مئوية في هذه المرحلة لمدة تصل الى شهر.

7. التحليل باستخدام كروماتوغرافيا الغاز 14

  1. تحليل FAME على الكروماتوجرافي الغاز. تعيين المثال الأعلى: 30 متر x 0.25 ميكرون 0.25 × مم BPX-70 تنصهر السيليكا العمود الشعري مع بروتوكول درجة الحرارة:
    درجة الحرارة الأولية 115 درجة مئوية، وعقد 2 دقيقة، منحدر 10 درجة مئوية / دقيقة إلى 200 درجة مئوية، وعقد 18.5 دقيقة، منحدر 60 درجة مئوية / دقيقة إلى 245 درجة مئوية، حالعمر 4 دقائق.
    العمود: الغاز الهليوم، ومعدل تدفق 1.0، 14.6 ضغط وسرعة 29.
    حاقن: درجة الحرارة = 300 ° C.
    كاشف: تدفق الهيدروجين 40.0، 184.0 تدفق الهواء، وتشكل الهليوم الغاز، وتدفق 45.0، ودرجة الحرارة = 300 ° C.
  2. تعيين نسبة الانقسام حسب الاقتضاء (على سبيل المثال 25:1 لتحليل FAME CE).
  3. تحديد منطقة تحت كل الذروة باستخدام البرمجيات المناسبة وتحديد المجد من خلال المقارنة مع المعايير. انظر الشكل 2 على سبيل المثال الاستشرابية.
  4. استخدام المنطقة تحت بيانات الذروة لحساب مساهمة الأحماض الدهنية الفردية كنسبة مئوية من مجموع الأحماض الدهنية.
  5. واضاف حساب تركيزات المطلقة من الأحماض الدهنية من خلال تقسيم المنطقة من المعايير الداخلية من المبلغ. تقسيم مساحة كل الأحماض الدهنية من خلال هذه النتيجة للحصول على تركيزات المطلقة من كل الأحماض الدهنية داخل كمية الأنسجة المستخدمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نجاح هذه الطريقة يعتمد على بعد بروتوكول بالضبط وعلى استخدام المذيبات والكواشف نظيفة من أجل الحد من 'الضوضاء' والتلوث التي يمكن أن تظهر على اللوني. العينات الملوثة هي أكثر صعوبة لتحليل، وتخفيض دقة المساحة تحت منحنى العمليات الحسابية. إذا تم اتباع البروتوكول بنجاح اللوني مع واضحة متناظرة، وقمم محددة جيدا، وبأقل قدر من الضوضاء في الخلفية ينبغي الحصول على كما هو موضح في الشكل 3. إذا حدث تلوث للاللوني سوف تظهر قمم إضافية ويحمل غير متناظرة (منحرفة) القمم كما هو موضح في الشكل (4). سوف التلوث من الكولسترول مجانا تحدث عند تشغيل FAME المستمدة من CE (انظر الشكل 1، ما لم تتم إزالة الكولسترول (كما هو موضح في البروتوكول 5).

استخدام مزيج المعايرة استعداد يسمح لتحديد FAME في العينة ه. يتم تشغيل مزيج المعايرة باستخدام إعدادات أداة نفس العينات بحيث يمكن مقارنة اللوني للعينة والقمم التي تم تحديدها بشكل صحيح على أساس مرات الاحتفاظ بها كما هو موضح في الشكل 2.

يستخدم منطقة ذروة لحساب النسبة المئوية للأحماض الدهنية محددة ضمن مجموع. مرة واحدة وقد تم جمع البيانات، فمن المفيد أن تفتيشها عن القيم المتطرفة كما هو مبين في الشكل 5. العينات النموذجية ويمكن بعد ذلك مزيد من التحقيق واستخراج و / أو تحليل المتكررة إذا لزم الأمر.

مضيفا معيار الداخلية لعينات (كما هو موضح في البروتوكول الخطوة 2.3) يسمح الكمي من الأحماض الدهنية داخل عينة من الحسابات باستخدام مجال كمية معروفة من الداخلية القياسية المنحنى النسبية إلى منطقة ذروة الفائدة، وتعديلها ل حجم العينة الأصلي أو الوزن. في الجدول رقم 1، موصوفة FAME داخل الفئران الكبد CE باعتبارهافي المئة من إجمالي الأحماض الدهنية (ز g/100 مجموع الأحماض الدهنية) داخل الكبد CE. تصف هذه البيانات الأحماض الدهنية CE في كبد الفئران الحوامل البكر أو تغذية لمدة 20 يوما على واحد من ثلاثة حمية مختلفة. التحليل الإحصائي باستخدام اثنين عامل ANOVA (عوامل: النظام الغذائي، مقابل الحوامل البكر) يكشف آثار كبيرة من النظام الغذائي والحمل على نسبة العديد من الأحماض الدهنية، وكذلك اتباع نظام غذائي التفاعلات الحمل س كبيرة (الجدول 1). وكمثال على ذلك، الشكل (6) يبين أن حمض الأراكيدونيك (AA؛ 20:04 ن 6) محتوى الكبد في الفئران الحوامل CE أكثر تأثرا من ذلك النظام الغذائي للإناث عذراء.

الشكل 1
الشكل 1. المخططات الاستشرابية الغاز مقارنة العينات متطابقة يدل على أهمية إزالة الكولسترول مجانا في أنسجة كبد الفئران. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. مثال على الطريقة التي استخدمت لتحديد عينة من الأنسجة FAME CE كبد الفئران باستخدام مزيج المعايرة المعدة. والعلاقات العامةيتم تشغيل epared مزيج المعايرة باستخدام إعدادات أداة نفس العينات بحيث يمكن مقارنة المخططات الاستشرابية لتحديد الأحماض الدهنية داخل العينة. واللوني المرافق لمزيج المعايرة يسمح للFAME في هذا المزيج ليكون المسمى. ومن ثم يمكن مقارنة هذا التتبع المسمى إلى اللوني من العينة حيث يمكن مقارنة قمم كبيرة يسهل التعرف عليها من قبل مرات الاحتفاظ بها لتلك التي على مزيج المعايرة ثم وصفت بشكل مناسب. على سبيل المثال أبرزت على أثر. و16:00 لتوضيح المقارنة بين مرات الاحتفاظ من مزيج المعايرة أعلاه إلى الأحماض الدهنية في تتبع عينة أدناه يسمح وضع العلامات الصحيحة من الأحماض الدهنية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. مثال على الغاز اللوني NEFA الملوثة التي تم الحصول عليها من البلازما البشرية. هناك العديد من القمم غير متوقعة، كما حلقت في بداية العينة، والتي يمكن أن تؤثر على تكامل قمم حقيقية. ما توقفت القمم وغير معروف كما رأينا طوار س في نهاية العينة وأصبحت منحدر كما حلقت. وهذا يؤثر على دقة المساحة تحت منحنى العمليات الحسابية والكمي لهذه الأحماض الدهنية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
الرقم 5. تحديد البيانات النموذجية بين تكوين الأحماض الدهنية من الكبد في الفئران CE عذراء تغذية حمية عالية الدهون زيت فول الصويا (ن = 6)، وهذا يوضح كيف يمكن استخدام البيانات نسبة الأحماض الدهنية تحليلها لتحديد نتائج غامضة. وتشير هذه البيانات إلى أن العينة 125 قد تكون قيمة عزلاء، ويتطلب مزيدا من التحقيق. الأحماض الدهنية الخمس الكبرى داخل CE (16:00، 18:00، 18:01 ن 9، 18:02 ن 6، 20:04 ن 6) لا تظهر. . JPG "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 6
الرقم 6. محتوى حمض الأراكيدونيك من الكبد CE بين الفئران الحوامل البكر وطعاما التجريبية. القيم هي الوسائل ± SD، ن = 6. يعني من دون بريد إلكتروني مشترك تختلف، P <0.05. * مختلفة من الإناث البكر داخل يقابل فريق الغذائية، P <0.05. هذا هو تمثيل مرئي من النتائج من الجدول رقم 1 يبين الاختلافات في الكبد المحتويات CE الجرذان عذراء تغذية مختلف الوجبات الغذائية بالمقارنة مع الفئران الحوامل تغذية تلك الوجبات نفسها. ويمكن رؤية الاختلافات في كل مجموعة غذائية بين الفئران البكر والحوامل. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

> الجدول 1
الجدول 1. تكوين الأحماض الدهنية من الكبد الفئران استرات الكوليسترول في الفئران الحوامل البكر وطعاما التجريبية. القيم هي الوسائل (SD)، ن = 6. ND يشير لم يتم الكشف عن (يعني <0.1٪). يعني من دون بريد إلكتروني مشترك ضمن الإناث الحوامل البكر أو تختلف، P <0.05. * مختلفة من الإناث البكر داخل يقابل فريق الغذائية، P <0.05. يبين هذا الجدول متوسط ​​قيم ن 3 و n-6 والأحماض الموجودة في أنسجة الكبد من الفئران الحوامل البكر وعندما يتغذى حمية منخفضة الدهون عالية ومتفاوتة الدهنية. تم تحليل النتائج إحصائيا باستخدام تحليل التباين (أنوفا) مع مستوى أهمية P <0.05 الاختلافات بين الفئران البكر والحوامل، ونوع من النظام الغذائي والنظام الغذائي س التفاعل الحمل. نتائج ANOVA تشير الى وجود اختلافات كبيرة في مستويات حمض الأراكيدونيك (20:04 ن 6) بين البكر والفئران الحوامل في غضون مالمجموعات الغذائية atched.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اللوني للغاز هو أسلوب دقيق لاستخدامها لتحليل الأحماض الدهنية، ويرى استنساخ العالية هذه التقنية مناسبة للالتحليلات السريرية. يجب استخدام الأعمدة GC المناسبة لتمكين تحديد الأحماض الدهنية من الفائدة، مع وجود اختلافات الأعمدة المتوفرة في قطبية الطور الثابت، طول العمود وقطره الداخلي. استخدام عمود السيليكا تنصهر الشعرية في هذا الأسلوب من التحليل يوفر الاستقرار الحراري الجيد واستنساخ عالية من مرات الاحتفاظ بسبب همود سطحه عالية وقرار جيد 8.

خطوات حاسمة في هذا البروتوكول تشمل الدنيا وخطوات جمع المرحلة العليا (بروتوكول الخطوات 2.7 و 4.8). من المهم أن تصل للمرحلة التي يتم جمعها الصحيح ممكن من دون تلوث مع أي من مرحلة غير مرغوب فيها. فإن وجود الملوثات في عينة يؤدي إلى إخراج الكروماتوغرافي غير مرغوب فيه، كما هو موضح في الشكل 2. عند جمع CE خلال SPE لا بد من أن يتم الاحتفاظ الأعمدة خرطوشة مشبعة المذيبات (الخطوة 3.15) بعد يغسل مع الهكسان لضمان تخترق عينة العمود للسماح الانفصال الناجح لCE من TAG. فصل المزيد من اوربا لإزالة الكوليسترول الحر هو المهم لتجنب التلوث تظهر على آثار الكروماتوجرافي كما هو موضح في الشكل 1. من المهم أيضا لضمان اتباع الخطوات تتطلب إزالة السائل تحت فراغ بدقة حتى تتم إزالة جميع السائل تماما من العمود لضمان محصول جيد.

القيد الرئيسي للGC هو أن الدهون المعقدة مثل الدهون الفوسفاتية وtriacyglycerols تحتاج إلى تصبن قبل derivitization لتشكيل FAME قبل التحليل، وبالتالي يتم فقدان المعلومات على هياكل محددة من هذه الدهون ومجموعات نموذجية من الأحماض الدهنية 10. جميع الخطوات فييجب أن يتم هذا البروتوكول في غطاء الدخان بسبب استخدام المذيبات، مما يحد من مدى ملاءمة هذه الطريقة المناطق المحيطة بها لا يمكن أن يؤديها فيها وهذا الأسلوب يمكن أيضا أن يكون مضيعة للوقت لتحليل عدد صغير من العينات، وعادة ما تأخذ يومين من أيام العمل للحصول على عينة من الاهتمام لإخراج البيانات، إلا إذا استخدمت إجراءات مؤتمتة بالكامل. ومع ذلك، عند معالجة عدد أكبر من العينات، ويمكن أن يتم كل مرحلة على دفعات لتعظيم فعالية هذه التقنية من الوقت وتوافر المعدات للمستخدمين الآخرين. تقنيات معينة داخل بروتوكول تتطلب الممارسة والبراعة اليدوية مثل الاستخراج المرحلة العليا والسفلى (الخطوات 2.7 و 4.8)، والتي يمكن أن يكون مشكلة للأشخاص الذين يعانون مشاكل المفاصل أو الذين هم عرضة لآثار سلبية من الحركات المتكررة.

الخطوات في هذا الأسلوب يمكن أن تضاف بسهولة أو إزالتها لتسهيل جمع الكسور مختلفة لمجموعة واسعة من عينةق، على سبيل المثال، قد لا تكون هناك حاجة لجمع PE عند تحليل البلازما، ولكن هو من مصلحة في الخلية والأنسجة عينات 10. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الأسلوب لتحليل الخلايا مقتطفات من إجمالي الدهون، حيث يمكن حذف الخطوات SPE اذا شئت. واحد مثل هذا التباين هو أن وصفها لخلايا الدم الحمراء، التي يغفل مجموع الخطوة استخراج الدهون وكذلك الخطوات SPE 15. وعلى النقيض من البروتوكول الحالي، والطريقة المستخدمة في هذه الدراسة يستخدم 250 ميكرولتر من كاشف مزج بالميثيل (14٪ فلوريد البورون)، التي تضاف مباشرة إلى خلايا الدم الحمراء جنبا إلى جنب مع 250 ميكرولتر من الهكسان وساخنة لمدة 10 دقيقة في 100 ˚ C. تم حذف الخطوة تحييد وتضاف بدلا المياه والهكسان، ثم يتم طرد العينة والمرحلة العليا الهكسان جمعها ونقلها مباشرة إلى GC العينات السيارات قارورة دون تجفيف تحت النيتروجين وإعادة حل في الهكسان.

GC هو أسلوب يوفر تنوعا ويختلطالنتائج iable مع مجموعة من التعديلات المتاحة 15، ويمكن استخدامها لتحليل مجموعة واسعة من العينات. لها مزايا أكثر من مطياف الكتلة (MS) عند تحليل ن 6 و n-3 الدهنية استقلاب حمض كما أنها قادرة على التمييز بين الأحماض الدهنية مماثلة هيكليا كما أنه يستخدم الوقت الاحتفاظ لوصفها في مقابل الكتلة الذرية. MS قادر على تحديد الأحماض الدهنية داخل عينة كنها غير قادرة على التمييز بين المواقف الرابطة المزدوجة في الفراغية وبالتالي غير قادر على إخبار الأحماض الدهنية معينة على حدة. إذا لزم الأمر، على حد سواء أساليب يمكن استخدامها جنبا إلى جنب بواسطة GC-MS 16. ويستخدم هذه التقنية خلال التحقيق في استقلاب الشحوم وظيفة في مجال lipidomics. وقد أدى استخدام GC جنبا إلى جنب مع MS إلى التطور الكبير لأنها تتيح التلاعب في تحديد الأحماض الدهنية بواسطة استخدام مراحل مختلفة ثابتة في GC للتمييز بين الأحماض الدهنية التي لا يستطيع وحده MS. ويمكن أيضا GC أن تستخدم في تركيبة مع مطياف الكتلة تأثير الإلكترون(EI-MS)، والذي يسمح لتحديد الأحماض الدهنية عندما يتم دمجهما مع المشتقات الكيميائية البديلة مثل استرات picolinyl. هذا يوسع استخدام هذه التقنية ويواصل تحسين التنميط الدهون كوسيلة من وسائل البحث في مجموعة من المجالات مثل علم وظائف الأعضاء، وكشف العلامات البيولوجية السريرية، وعلم الأمراض، وكذلك الدهون الكيمياء الحيوية 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن نعترف بمساهمة Meritxell روميو ونادال لدراسة الفئران.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol Fisher Scientific M/4056/17 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform Fisher Scientific C/4966/17 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT Sigma- Aldrich W218405 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl Sigma- Aldrich S9888 Anhydrous
Hexane Fisher Scientific H/0406/17 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid Sigma- Aldrich 695084 'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid Sigma- Aldrich 339741 'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate Sigma- Aldrich 209619 99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate Sigma- Aldrich 237205 99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10204340 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene Fisher Scientific T/2300/15 'CAUTION' Fumes
Diethyl ether Sigma- Aldrich 309966 'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder BOC 44-w 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges Agilent 12102014 Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges Agilent 14102010 Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives Sigma- Aldrich 334324 Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes Fisher Scientific FB50251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
  2. Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
  3. Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
  4. Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
  5. Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
  6. Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
  7. Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
  8. American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from: http://lipidlibrary.aocs.org (2013).
  9. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
  10. Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
  11. Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
  12. Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. Quantitative chromatographic analysis. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).
  13. Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
  14. Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from eprints.soton.ac.uk 378 (2008).
  15. Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
  16. Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf (2013).
  17. Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).

Tags

الكيمياء، العدد 85، اللوني للغاز، الأحماض الدهنية، والحمل، استر الكوليسترول، واستخراج المرحلة الصلبة، والأحماض الدهنية غير المشبعة
استعمال اللوني للغاز لتحليل التغييرات التركيبية من الأحماض الدهنية في الفئران الكبد الأنسجة أثناء الحمل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fisk, H. L., West, A. L., Childs, C. … More

Fisk, H. L., West, A. L., Childs, C. E., Burdge, G. C., Calder, P. C. The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy. J. Vis. Exp. (85), e51445, doi:10.3791/51445 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter