Summary
妊娠导致显著改变母体组织中的脂肪酸组合物。血脂可通过气相色谱法来获得允许在怀孕期间大鼠中识别和个别类脂质的脂肪酸定量饲喂各种高，低脂肪饮食。
Abstract
气相色谱（GC）是用于从组织，细胞，血浆/血清识别和量化脂质的脂肪酸含量，得到具有高精度和高再现性的结果高度敏感的方法。代谢和营养研究的GC允许更改下列措施中的脂肪酸浓度或在改变生理状态，如妊娠的评估。固相萃取（SPE），使用氨丙基硅胶管允许各大类脂质包括甘油三酯，磷脂不同，和胆固醇酯（CE）的分离。气相色谱结合固相萃取是用来分析的变化，行政长官在部分已被送入各种高和低脂肪饮食的处女和孕鼠的肝脏中脂肪酸的组成。有肝经行政长官的ω-3和ω-6脂肪酸含量显著饮食/妊娠互动效应，这表明怀孕的女性有不同的反应，饮食manipulat离子比被认为是处女的女性之一。
Introduction
气相色谱（GC）是一种用于识别和量化的脂肪酸掺入脂质池和细胞膜1,2期间补充或生理条件，例如肥胖（及其相关的疾病，如糖 尿病），或者怀孕3行之有效的技术- 5。它也适合于分析中的食物的种类和脂肪的数量。当表征实验饲料，以及确保食品行业符合规定，这是很有用的。例如，GC可以用来确认商品如膳食补充剂中的身份和脂肪酸的量，以确保标签是正确和法规粘附到6,7。脂肪酸的分析可以提供有价值的见解在健康和疾病，饮食变化的影响，并改变生理状态8的影响脂质代谢。使用GC在怀孕期间，研究的样本提供了重要的变动脂肪酸和复合脂质稳态3的信息。
提前的色谱分离的，脂质通常从样品用脂质中的溶解度在氯仿和甲醇的混合溶剂萃取。加入氯化钠，以促进该混合物的成含有相9,10水溶液和有机脂质的分离。感兴趣的复合脂质类可以从总脂提取物固相萃取（SPE）分离。这种分离方法洗脱根据其极性或结合亲和力的脂质类。 Triacyglycerols（TAG）和胆甾醇酯（CE）是首先被洗脱的馏分合并，进一步类，磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰乙醇胺（PE），和非酯化脂肪酸（NEFA）通过增加洗脱溶剂的极性洗脱。 TAG的从CE分离利用的TAG只能到一个新的SPE cartri绑定DGE，允许CE被洗脱。 TAG然后可以通过增加洗脱溶剂9,10的极性进行洗脱。这种方法允许多个样品有较高的产率比同时分离与薄层层析来实现，这意味着相对小尺寸的样品（ 如 <100微升的血浆或血清，<100 mg组织）可以分析11,12。
GC是一个行之有效的技术在20世纪50年代首次描述，有人提出，在当时的液 - 液系统中的流动相可以被替换为蒸气。它最初是用于石油分析，但迅速扩大到其他领域，如氨基酸分析和脂类生物化学，这仍然是主要的利益。前进中的GC设备和技术，例如从以前使用填充柱的毛细管柱的发展导致了我们目前的技术，其中的脂肪酸是能够被在导致GC被常规用于鉴定和定量脂肪酸在广泛调查13的较低的温度下更有效地分离。
GC需要的脂肪酸，使他们有可能成为充分挥发在合理的温度被洗脱不热分解进行衍生化。这通常涉及到含有氢以形成酯，硫酯或酰胺的用于分析的官能团的取代。甲酯通常被研究的衍生物，它是由甲基化制备。在该方法中复合脂质的酯键被水解以释放游离脂肪酸，它们transmethylated以形成脂肪酸甲基酯（FAME）。 FAME的所得到的轮廓，由GC测定，被称为的脂肪酸组成和可能不同的实验组9,10之间容易地进行比较。该技术允许individ两者的比例UAL脂肪酸和它们的浓度进行测量。
除了使用气相色谱，用于分析在营养学和食品工业中的脂肪酸，该技术可以在宽范围的分析领域中使用。例如，使用气相色谱环境分析包括通过杀虫剂和土壤测量水质污染分析测定氯苯的内容。在毒理学，GC也被用于识别非法物质在尿和个体的血液样品，这样的运动性能增强剂12和分离烃类的复杂混合物的能力，使得在石油工业中这种技术流行的用于石油化学分析12。
妊娠与显著改变母体组织中的脂肪酸组合物，特别是ω-3的含量（N-3）和ω-6（N-6）多不饱和脂肪酸ACI相关DS（PUFA）3。在目前的研究中，我们通过举例说明其使用从饲喂低，高脂肪的饮食不同油源和处女孕鼠取肝组织中脂肪酸组成的分析中脂肪酸的测定采用气相色谱。这里提供的试验日粮是一种低脂肪的大豆油为主的饮食，高脂肪的大豆油为主的饮食习惯（130.9克总脂肪/公斤总脂肪）或高脂肪的亚麻子油为主的饮食习惯（130.9克总脂肪/公斤饮食），提供了20天。这些饮食的全部营养和脂肪酸组合物先前已被14所述。豆油日粮中含有丰富的亚油酸（18:2的n-6）和含有一些α-亚麻酸（18点03的n-3），而亚麻油饮食中富含α-亚麻酸。这些高脂肪的饮食代表的亚油酸与α-亚麻酸（8:1和1:1分别口粮）不同的口粮。该方法对于个别脂质类和用GC分析的隔离是我们LL建立和验证，以及先前已10但没有在此找到详细的技术说明公布。
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Protocol
1。动物规程
- 所有的动物工作应按照内政部动物（科学程序）法（1986）进行。
- 交配10周龄以一夫一妻制繁殖旧Wistar大鼠，并通过阴道塞的外观确认怀孕。记录这是怀孕的第1天，并开始试验性的饮食。对于处女女，分别容纳各组大鼠，并开始试验性的饮食。
- 喂养试验饲料20天安乐死后大鼠用CO 2窒息颈椎脱位。
- 用解剖镊子和剪刀以暴露腹腔，并通过切割韧带，其中肝脏连接至该膜片，腹部的前壁，胃和十二指肠切除肝。存放于-80°C。前PBS洗肝，冷冻在液氮中
2。提取的总脂的制备9
- 添加moleculAR筛（填写溶剂容器的1/10）所有溶剂打造'干'的溶剂。 在通风橱内进行所有的溶剂的工作 。
- 削减约100毫克冻结肝脏和权衡。将组织成筒在一个冰桶，并添加0.8毫升冰冷的0.9％NaCl溶液。均质化的组织。
- 添加溶解在无水氯仿中的1毫升/毫克内部标准：甲醇（2:1，V / V）含丁基化羟基甲苯（BHT; 50毫克/升）作为抗氧化剂。对大鼠肝100毫克加入100微克的CE标准（十七烷胆固醇十七时00分） 注意 ：氯仿和BHT是危险的。
- 加5.0ml无水氯仿：甲醇（2:1，V / V）含BHT（50毫克/升）。
- 加入1.0毫升1 M氯化钠，涡旋充分混合，直到混合均匀的外观。样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
- 离心机在1000×g离心10分钟，在室温下低速制动器。
- 低收用玻璃巴氏吸管相，在40℃下转移到新螺丝帽玻璃管和干燥氮气下样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
3。固相萃取分离脂质类的（SPE）10
- 在SPE水箱连接到真空泵，并把氨丙基硅胶固相萃取柱的坦克。
- 将新的螺旋盖玻璃管标签TAG和CE在列下的水箱架，收集第一部分。
- 溶解总脂提取物1.0ml无水氯仿和旋涡。
- 申请样品用玻璃巴氏吸管的列，并允许通过滴落到螺纹管在重力作用下。如果没有进一步的水滴落下，通过真空除去残留的液体。
- 洗脱TAG和CE分数在真空下，用干氯仿2×1.0毫升洗洗柱。
- 当所有的液体被除去，干燥的TAG和CE fractio在40℃下的氮（N）样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
- 将新的螺旋盖玻璃管标签的PC变成栏下的坦克托盘。
- 洗脱，在真空下加入2×1.0毫升无水氯仿中的PC级分：甲醇（60:40，体积/体积），直到所有的液体从柱中除去。
- 在40℃下在氮气氛下取出和干燥的PC级分样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
- 放置一个新的螺旋盖玻璃管标记的PE入罐托盘和洗脱级分的PE与另外1.0毫升下真空干燥甲醇。
- 在40℃下在氮气氛下取出并干燥聚乙烯级分样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
- 把新的螺旋盖玻璃管标记NEFA入罐托盘和洗脱真空下通过加入2×1.0毫升洗涤干燥氯仿的NEFA分数：甲醇：冰醋酸（100:2:2，V / V / V） 注意 ：冰醋酸是危险的。
- 在40℃下在氮气氛下除去收集的NEFA馏分和干样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
- 将新的氨丙基硅胶固相萃取柱在SPE坦克，并放置一个螺丝帽玻璃管在坦克托盘墨盒下的垃圾收集。
- 用干燥己烷在真空条件下洗涤3次，然后在重力作用下最终1.0毫升洗洗列。不要让墨盒变干（转筒柱通道关闭位置时，正己烷水平靠近盒矩阵） 注意 ：正己烷是危险的。
- 更换废液管与新的螺丝帽玻璃管标记CE。
- 溶解干豪和CE分数（步骤3.6制备）的1.0ml无水正己烷和旋涡。将此运用到使用玻璃巴斯德吸管列，并允许根据克至滴水通过ravity。
- 如果没有进一步的水滴落下，取出在真空条件下剩余的液体。
- 在真空条件下，用2×1.0毫升洗涤干燥己烷洗柱在氮气下，以洗脱CE和干燥收集到的馏分，在40℃下样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
- 把新的螺旋盖玻璃管标记TAG在罐托盘和洗脱TAG与另外2×1.0毫升洗涤干燥己烷：甲醇：乙酸乙酯（100:5:5）在真空条件下。
- 在40℃下在氮气下干燥收集到的馏分样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。 注意 ：乙酸乙酯是危险的。
4。从CE 10 FAME的制备
- 加入0.5毫升无水甲苯分离的CE部分（收集步骤3.19）和涡注意 ：甲苯是危险的。
- 制备的甲基化试剂（干燥甲醇与2％（体积/体积）的H 2 SO 4），其为1.0毫升每采样必需的。免除无水甲醇的体积为玻璃或带盖合适的塑料容器中，加入所需的H 2 SO量4滴，然后颠倒混匀注意 ：硫酸是危险的。
- 加入1.0毫升甲基化试剂的溶解于无水甲苯的样品中，盖上管牢固，并轻轻混匀。
- 加热该样品2小时，在50℃下
- 2小时后离火管。冷却后加入1.0毫升的中和液（0.25M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3） 注意 ：碳酸氢钾和碳酸钾是危险的。
- 加入1.0ml无水正己烷和旋涡。
- 离心机在250×g离心2分钟，在室温下低速制动器。
- 收集上层相，其中包含了名气，并转移到一个新的非螺旋盖一次性玻璃管。
- 干下收集到的FAME氮气在40℃下样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。
5。从CE FAME 14去除游离胆固醇污染
（免费胆固醇会污染样品，参见图1为例色谱痕迹和不游离胆固醇去除）。
- 将废管进入固相萃取槽，然后将硅胶固相萃取柱到坦克。
- 在真空下3×1毫升洗涤干燥己烷和在重力作用下1×1毫升洗柱。
- 消除浪费清洗和添加新的废物管插入罐。
- 溶解CE成名于1ml无水正己烷，旋涡。
- 适用于使用玻璃巴斯德吸管列，并允许在重力作用下通过滴。
- 在真空下3×1毫升洗涤己烷洗柱。
- 消除浪费清洗，并放置新的非螺丝帽管插入油箱标示CE名声大噪。
- 洗脱CE FAME用2×1毫升无水己烷：乙醚（95:5体积/体积）洗涤。
- 在氮气氛下干燥，在40℃下样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一周。 注意 ：乙醚是危险的。
6。转移FAME进入气相色谱自动进样瓶
- 加入75微升的干燥己烷来样，旋涡，并转移至GC自动样品瓶。
- 添加进一步的75微升的干燥己烷样品，旋涡和转移到相同的GC自动样品瓶。样品可以封盖并储存在-20℃下在此阶段长达一个月。
7。分析使用气相色谱仪14
- 在气相色谱分析FAME。例如设置：30米×0.25微米×0.25毫米BPX-70随温度的协议熔融石英毛细管柱：
初始温度115℃，保持2分钟，斜10°C / min升至200℃，保持18.5分钟，斜60°C / min升至245°C，H老4分钟。
专栏：氦气，流速1.0，压力14.6和速度29。
进样器：温度= 300℃。
检测器：氢流量40.0，空气流量184.0，弥补气氦气，流量45.0，温度为300°C。 - 设置分流比为适当（ 如 25:1获得CE FAME分析）。
- 确定区域使用适当的软件每个峰下，并通过与标准比较确定的FAME。参见图2例如色谱图。
- 使用该区域下的峰值的数据来计算的单个脂肪酸占总脂肪酸的百分比贡献。
- 由量除以内标面积计算脂肪酸绝对含量添加。由这一结果除以各脂肪酸的面积，以组织的使用量范围内得到每种脂肪酸的绝对浓度。
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Representative Results
这种方法的成功依赖于精确的按照协议和有关使用清洁溶剂和试剂，以减少“噪声”，并且可以出现在色谱污染。污染的样品是更具挑战性的分析，从而降低了计算曲线下的面积的精度。如果该协议被成功地遵循的色谱图清晰对称的，明确定义的峰值和最小的背景噪声， 如图3应获得。如果已发生污染的色谱将显示额外的峰，并表现出如图4所示的非对称的（倾斜）的峰。运行时，FAME从CE衍生（参见图1中，除胆固醇被去除（如在协议5所述）将发生从游离胆固醇的污染。
使用准备好的校准组合允许FAME的在日确定Ë样品。校准混合使用相同仪器设置为样本，使得色谱可以比较样品和峰正确识别基于它们的保留时间， 如图2中运行。
峰面积来计算的总内的特定脂肪酸的百分比。一旦数据已被采集，如示于图5，检查它们为离群值是有用的。离群样品可以进一步调查，并提取和/或分析的重复，如果必要的。
添加内部标准样品（如在协议步骤2.3中描述）允许对样品内的脂肪酸通过使用内标物的相对峰到感兴趣的峰的面积，和已知量的面积计算量化调整的原始样品的体积或重量。在表1中，大鼠肝CE内FAME被描述为一个％的总脂肪酸（G/100μg总脂肪酸）肝CE内。这些数据说明在饲喂20天在三个不同的饮食之一处女或孕鼠的肝脏CE脂肪酸。采用双因素方差分析（因素：饮食，怀孕与处女）的统计分析显示饮食和怀孕后的几个脂肪酸的比例，以及显著饮食x怀孕的相互作用（ 表1）显著作用。作为一个例子， 图6显示了花生四烯酸（AA，20:4 n一6）孕鼠肝脏CE的内容更受饮食比处女女性的影响。
图1相同的样品示出的游离胆固醇切除大鼠肝组织中的重要性的比较气体色谱图。 点击这里查看大图。
图2例用于使用准备好的校正混合物从大鼠肝组织确定样品CE成名的方法。公关epared校正混合物是使用相同的仪器设置为样本，使得色谱可以比较样品中鉴定脂肪酸运行。随附色谱校准组合允许在混合的名气来进行标识。这个标记的跟踪可以进行比较，以从样品中，其中易识别的大波峰可以通过它们的保留时间进行比较，以那些在校正混合物然后适当标记的色谱图。例如强调在轨迹上。是16点00分，说明保留时间从校正混合物上面下面让脂肪酸正确标注样品微量脂肪酸的比较。 点击这里查看大图。
图4。从人血浆中得到的被污染的NEFA气相色谱图的例子，有许多意想不到的峰，如盘旋在采样的开始，这会影响真正峰的积分。看到towar峰被中断和未定义 DS的样品的端部，并已成为倾斜的圆圈。这将影响该地区的精度曲线计算，这些脂肪酸的定量下。 点击这里查看大图。
图5。中孕大鼠肝脏CE的脂肪酸组成离群数据识别喂食高脂肪豆油饮食（N = 6），这说明了如何分析脂肪酸的百分比数据可用于确定不明确的结果。这些数据表明，样品125可以是孤立点，并需要进一步调查。内CE五个主要脂肪酸（16:0，18时，18时01 N-9，18点02的n-6，20点04的n-6），未示出。jpg“格式目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图6。肝脏CE的处女和孕鼠之间花生四烯酸含量饲喂试验日粮。值是平均值±标准差，n = 6。意味着没有共同字母的不同，P <0.05。 *从内部匹配饮食组，P <0.05处女雌不同。这是从表1的结果显示喂食那些同样在日粮相比，怀孕的老鼠喂食各种饮食孕大鼠肝脏Ce含量的差异的可视化表示。差异可以看出，在处女和孕鼠之间的每个饮食组。 点击这里查看大图。
表1中。脂肪酸处女和孕鼠的大鼠肝脏胆固醇酯组成饲喂试验日粮。值为平均值（SD）中，n = 6。 ND表示未检出（平均<0.1％）。指没有处女或怀孕的女性中常见的字母不同，P <0.05; *从内部匹配饮食组，P <0.05处女雌不同。此表显示出现在处女和怀孕的老鼠喂食时低，变化的高脂肪饮食的肝组织的n-3和n-6脂肪酸的平均值。结果采用方差分析（ANOVA）分析P的显着性水平<0.05为处女孕鼠之间的差异进行统计学分析，饮食习惯和饮食x怀孕交互的类型。方差分析结果表明有处女和m内孕鼠之间的花生四烯酸的含量显著差异（20:4 n一6）出动了饮食组。
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Discussion
气相色谱法是一种精确的技术来用于脂肪酸分析，以及其高重复性认为该技术适于临床分析。适当的气相色谱柱，必须使用以使得能够识别的感兴趣的脂肪酸，具有变化的固定相，柱的长度和内径的极性可用的列。在分析这种方法的使用石英毛细管柱提供了良好的热稳定性和高的，由于其高的表面惰性和良好的分辨率8保留时间的重现性。
本协议中的关键步骤包括上，下阶段收集步骤（协议步骤2.7和4.8）。重要的是尽可能多的正确相位的收集尽可能不混入任何不想要的相。污染物的样品中的存在将导致不希望的层析输出如示于图2。当固相萃取过程中收集CE当务之急是墨盒列保持与溶剂（步骤3.15）下用己烷洗涤，以确保样本穿过塔，让行政长官从TAG成功分离饱和。 CE的进一步分离，以除去游离的胆固醇是很重要的，以避免污染出现在色谱仪的痕迹， 如图1所示。同样重要的是，以确保遵循需要去除在真空下液体的步骤正是这样所有的液体从柱完全除去，以保证良好的产率。
气相色谱仪的主要限制是复杂的脂质如磷脂和triacyglycerols需要衍生化，以形成FAME分析前先进行皂化，使这些脂质和脂肪酸的典型的组合的特定结构的信息丢失10。在所有的步骤这个协议必须在通风橱中，由于使用的溶剂，这限制了环境可以执行该方法。此方法的适宜的条件下进行也可以是耗时用于分析少量的样品，通常是采取两个工作日从感兴趣的数据输出采样得到的，除非完全自动化的程序使用。但是，在处理较大的样本数时，每个阶段可以分批进行，以最大限度地提高设备的这种技术和可用的时间有效性给其他用户。本协议中的某些技术需要实践和手的灵巧如上下相萃取（步骤2.7和4.8），这可能是一个问题的人有问题的关节或谁是容易重复动作的负面影响。
该方法中的步骤可以轻松地添加或删除，以方便不同分数的集合，适用范围广的样品秒;例如，收集的PE时，可能无法分析血浆必需的，但是是细胞和组织样本10的利息。这种方法也可以被修改为总脂质提取物，其中如果需要，可以省略在SPE步骤的细胞的分析。一种这样的变化是，对于所描述的红血细胞，其中省略了总脂质的提取步骤以及固相萃取步骤15。相反，当前的协议，在本研究中使用的方法使用250μl的甲基化试剂的（14％三氟化硼），将其直接加入到红细胞连同250μl的己烷，并在100˚C.加热10分钟中和步骤，省略和替代水和己烷加入，样品然后离心，将上层的己烷相收集，并直接转移到GC自动进样器小瓶中而不在氮气下干燥并再溶解在己烷中。
GC是一个通用的方法，并提供了REL用范围可修改15和iable结果可以用于分析多种样品。当分析的n-6和n-3脂肪酸的代谢，因为它能够在结构上相似的脂肪酸之间进行区分，因为它使用的保留时间标记，而不是原子质量它拥有质谱优点（MS）。 MS能够样本中识别脂肪酸，但无法区分的立体异构体的双键位置，因此无法分辨某些脂肪酸分开。如果需要的话，这两种方法可以通过GC-MS 16可以串联使用。调查脂质代谢和脂质组学中的字段的功能在本技术时。在串联与MS使用的GC带来了很大的进步，因为它允许操作的脂肪酸鉴定中使用不同的GC固定相的脂肪酸区别对待那个MS单独不能。 GC也可以在与电子碰撞质谱法结合使用（EI-MS），它允许对脂肪酸的识别当它们结合诸如皮考啉酯替代化学衍生物。这拓宽了该技术的使用，并继续改善脂类谱为在一定范围内的诸如生理学，临床生物标志物的检测，以及病理学，以及脂质生物化学17个方面的一个研究方法。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者要感谢马萨纳罗梅乌 - 纳达尔在大鼠研究的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
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