Summary
妊娠は、母体組織の脂肪酸組成に有意な変化をもたらす。脂質プロフィールは、ラットの間で個々の脂質クラス内の脂肪酸の同定および定量は、妊娠中の種々の高および低脂肪食を給餌できるように、ガスクロマトグラフィーを介して得ることができる。
Abstract
ガスクロマトグラフィー（GC）を高精度かつ再現性の高い結果が得られ、組織、細胞、血漿/血清から脂質の脂肪酸含量を同定および定量するために使用される高感度な方法である。代謝および栄養の研究においてGCは、脂肪酸濃度の変化の評価は、介入の後、または妊娠などの生理的状態の変化の間に可能にする。アミノプロピルシリカカートリッジを使用して固相抽出（SPE）は、トリアシルグリセロール、様々なリン脂質、およびコレステリルエステル（CE）を含む主要な脂質クラスの分離を可能にする。 SPEと組み合わさGCは、種々の高および低脂肪食を給餌されたバージン及び妊娠ラットの肝臓におけるCE画分の脂肪酸組成の変化を分析するために使用した。肝臓CEのω-3およびω-6脂肪酸含有量に大きなダイエット/妊娠相互作用効果は、妊娠中の女性が食物manipulatに対して異なる応答を有することを示してありよりイオンは処女雌の間で見られます。
Introduction
ガスクロマトグラフィー（GC）は、肥満症（および糖尿病などの関連疾患）、または妊娠3などの補充または生理学的状態の間脂質プールおよび細胞膜1,2への脂肪酸の取り込みを同定および定量するために使用される十分に確立された技術である- 5。それはまた、食品中の脂肪のタイプおよび量を分析するのに適している。実験食を特徴付けるだけでなく、食品業界は、規制に準拠していることを確実にする場合に便利です。例えば、GC、その標識が正しく、規制が6,7に接着されるように、このような栄養補助食品のような製品内のアイデンティティおよび脂肪酸の量を確認するために使用することができる。脂肪酸の分析では、健康と病気、食事変更の影響、および生理的状態8の変化の影響での脂質代謝への貴重な洞察を提供することができます。妊娠中にサンプルを研究するため、GCの使用が重要に提供してきました脂肪酸と複合脂質の恒常3の変化についての情報。
クロマトグラフィー分離の前に、脂質は、典型的には、クロロホルムとメタノールの溶媒混合物中の脂質の溶解度を用いてサンプルから抽出される。塩化ナトリウム相9,10を含有する水性および有機脂質への混合物の分離を容易にするために添加される。関心対象の複合脂質クラスは、固相抽出（SPE）によって総脂質抽出物から分離することができる。この分離技術は、それらの極性または結合親和性に基づいた脂質クラスを溶出する。 Triacyglycerols（TAG）およびコレステリルエステル（CE）を合わせた画分、さらにクラス、ホスファチジルコリン（PC）として最初に溶出され、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、および非エステル化脂肪酸（NEFA）は、溶出溶媒の極性を増加させることによって溶出される。 CEからのタグの分離は、新鮮なのSPE cartri、タグの結合を利用DGE、CEが溶出することができるようにする。 TAGは、次いで溶出溶媒9,10の極性を増加させることによって溶出させることができる。この方法は、複数のサンプルが比較的小さいサイズのサンプル（ 例えば、<100μlの血漿または血清、<100 mgの組織）は11,12分析することができることを意味する薄層クロマトグラフィーを用いて達成されるよりも高い収率で同時に分離することができる。
GCは、最初、1950に記載された十分に確立された技術であり、これは、次いで、液 - 液系における移動相は蒸気で置き換えることができることが示唆された。当初は石油分析のために使用されるが、そのような急速に主要な関心が依然としてあるアミノ酸分析および脂質生化学などの他の分野に拡大した。以前に使用した充填カラムからこのようなキャピラリカラムの開発など、GC機器や技術の進歩により、脂肪酸があることができるかが私たちの現在の技術につながっているGCは、日常的な調査13の広い範囲で脂肪酸を同定および定量するために使用され、その結果、より低い温度でより効率的に分離する。
GCは、それらが熱分解することなく、妥当な温度で溶出するのに十分に揮発性になることができるようにするために誘導体化される脂肪酸を必要とする。これは、通常、分析のためにエステル、チオエステル、またはアミドを形成するために水素を含む官能基の置換を含む。メチルエステルは一般的にメチル化によって製造される誘導体を、研究されている。この方法では、複合脂質中のエステル結合が脂肪酸メチルエステル（FAME）を形成するtransmethylatedされている遊離脂肪酸を放出するために加水分解される。 GCにより決定FAMEの結果として生じるプロファイルは、脂肪酸組成物と呼ばれ、簡単に異なる実験群9,10の間で比較することができる。技術は個々を、両方の割合ができますUALの脂肪酸およびそれらの濃度を測定する。
栄養学研究において、食品業界内の脂肪酸を分析するためのGCの使用に加えて、この技術は、分析の幅広い分野で使用できる。例えば、GCを用いて、環境分析は殺虫剤および土壌水の汚染を測定することが含まクロロベンゼン含有量を測定解析する。毒物学では、GCはまた、尿、個人の血液試料中の違法な物質を同定するために使用されている等のスポーツパフォーマンスエンハンサー12及び炭化水素の複雑な混合物を分離する能力は、石油化学分析12のための石油産業におけるこの技術が人気となる。
妊娠は、多価不飽和脂肪酸アシ有意な母体組織の脂肪酸組成の変化、具体的にはω-3の含有量が第（n-3）およびω-6（n-6）系に関連付けられているDS（PUFA）3。現在の研究では、異なる油供給源と低および高脂肪食を与えた処女と妊娠ラットから採取した肝臓組織の脂肪酸組成の分析においてその使用を記述することにより脂肪酸の測定におけるGCの使用を例示する。ここで提供される実験食は低脂肪大豆油ベースの食、高脂肪大豆油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgの総脂肪）または高脂肪亜麻仁油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgであった20日間のために提供食）、。これらの食事の完全な栄養素と脂肪酸組成は、以前に14に記載されている。大豆油食はリノール酸（18:2 n-6系）に富み、亜麻仁油食は、α-リノレン酸が豊富に含まれている間、いくつかのα-リノレン酸（18:3 n-3系）が含まれている。これらの高脂肪食は、リノールα-リノレン酸にする（それぞれ8:1 1:1の配給）の異なる飼料を表しています。個々の脂質クラスの分離とGCによる分析のための方法は、我々であるLL設立され、検証され、以前に10ではなく、ここに見つかった詳細な技術的説明なしに公開されています。
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Protocol
1。動物手続き
- 全ての動物研究は、内務省動物（科学的処置）法（1986）に従って行われるべきである。
- 一夫一婦制の繁殖による古い10週齢のWistarラットを交尾し、膣栓の出現によって妊娠を確認します。妊娠1日目としてこれを記録し、実験食を開始。処女雌については、個別にそれぞれのラットを収容し、実験食を開始。
- 20日間の実験飼料を供給した後、頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりラットは安楽死させる。
- 腹腔を露出させ、腹部、胃と十二指腸の前壁を振動板に肝臓をつなぐ靭帯を切断することにより、肝臓を切除する解剖鉗子やハサミを使用してください。 -80℃で保存する前に、PBS中で肝臓を洗浄し、液体窒素中で凍結
2。総脂質の製造は、9を抽出します
- moleculを追加ARキュラー'ドライ'溶剤を作成するためにすべての溶媒に（溶剤容器の1月10日を記入します。）。 ヒュームフード内のすべての溶剤作業を実施 。
- 約100ミリグラムを凍結した肝臓を切り取り、重量を量る。アイスバケットにチューブに組織を配置し、0.8ミリリットルの氷冷0.9％のNaClを追加します。組織を均質化する。
- 乾燥クロロホルムを1ml / mgの中に溶解し、内部標準を追加：メタノール（2:1、v / v）のブチル化ヒドロキシトルエン（BHT;を50mg / l）を含有する抗酸化剤。ラットの肝臓の100 mgのためのCE規格（コレステヘプタデカン午後05時）の100μgのを追加します。 注意 ：クロロホルムおよびBHTは危険です。
- 5.0ミリリットルの乾燥クロロホルムを追加：メタノール（2:1、v / v）のBHTた（50mg / L）を含有する。
- 混合物が均一に見えるまで、ボルテックスで十分に混和、1.0ミリリットル1MのNaClを追加します。サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
- 10分、室温で低ブレーキ1,000×gで遠心分離する。
- lower収集ガラスパスツールピペットを用いて相は、40℃の窒素下に新しいスクリューキャップガラスチューブに移し、ドライサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
3。固相抽出（SPE）10による脂質クラスの分離
- 真空ポンプにSPEタンクを接続し、タンクにアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置します。
- 第一の画分を収集するために列の下のタンクラック内のタグおよびCEというラベルの新しいスクリューキャップのガラス管を配置します。
- 1.0ミリリットルの乾燥クロロホルムや渦の総脂質抽出物を溶解する。
- ガラスパスツールピペットを用いてカラムにサンプルを適用し、重力下でスクリューキャップチューブに通って滴下することができます。これ以上のドリップが落ちない場合は、真空によって残った液体を除去。
- 真空下でTAGおよびCEの分画を溶出、乾燥クロロホルム2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄。
- 全ての液体が除去されると、TAGおよびCE fractioを乾燥40℃で窒素下、Nサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
- 列の下のタンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管ラベルのPCを配置します。
- 2×1.0ミリリットルを加え乾燥クロロホルムを真空下でのPCの割合を溶出：メタノール（60:40、v / v）で、すべての液体がカラムから除去されるまで。
- 40℃で窒素下でのPCの画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
- タンクトレイに、PEという新しいスクリューキャップのガラス管を配置し、1.0ミリリットルを加え、真空下で乾燥メタノールでのPE分を溶出。
- 40℃で窒素下でのPE画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
- タンクトレイにNEFAという新しいスクリューキャップのガラス管を置き、乾燥クロロホルム2×1.0ミリリットルの洗浄を添加することにより、真空下でNEFA分を溶出：メタノール：氷酢酸（100:2:2、v / v / v）を注意 ：氷酢酸危険である。
- 40℃の窒素下で収集NEFA画分と乾燥を削除サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
- SPEタンクに新しいアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置し、廃棄物を収集するためのカートリッジの下にタンクトレイにスクリューキャップのガラス管を配置します。
- 3真空下で乾燥ヘキサン洗浄および重力下で、最終的な1.0ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。 。カートリッジ（ヘキサンレベルはカートリッジ行列に近い場合に閉位置にカートリッジカラム·チャネルをオンに） 注意ドライになることを許可していない：ヘキサンは危険です。
- 新しいスクリューキャップガラス管ラベルのCEと廃液チューブを交換してください。
- 乾燥ヘキサンと渦の1.0ミリリットル中に（ステップ3.6で製造）乾燥し、タグおよびCE分を溶解する。ガラスパスツールピペットを使用して列にこれを適用するとgの下を滴らすることができますravity。
- これ以上のドリップが落ちないときは、真空下で残りの液体を除去。
- 真空下、40℃で窒素下、CEおよび乾燥回収した画を溶出する乾燥ヘキサン2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
- タンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管にラベルされたタグを配置し、乾燥ヘキサン2×1.0ミリリットルの洗浄を追加してタグを溶出：メタノール：酢酸エチル（100:5:5）を真空下。
- 40℃の窒素下で乾燥回収した画。サンプルは週までの注意のために蓋をし て、この段階で-20℃で保存することができます：酢酸エチルは危険です。
4。 CEの10からFAMEの調製
- 。分離のCE分（ステップ3.19で収集）し、ボルテックス注意を乾燥トルエン0.5ミリリットルを追加します。トルエンは危険です。
- 2％（vでメチル化試薬を調製（乾燥メタノール/体積）は1.0 mlのサンプル当たり要求されるH 2 SO 4）。ガラスや蓋付きの適切なプラスチック容器に乾燥メタノールの量を分配し、H 2の必要量を追加し、SO 4滴下し、転倒混和注意 ：濃硫酸は危険です。
- 乾燥トルエンに溶解したサンプルをメチル化試薬の1.0ミリリットルを加え、しっかりとチューブにキャップをし、穏やかに混合。
- 50℃で2時間、試料を加熱する
- 2時間後に火からチューブを取り外します。一度クール（0.25M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3）水溶液を中和する1.0ミリリットルを追加注意 ：重炭酸カリウムおよび炭酸カリウムは危険です。
- 1.0ミリリットル乾燥ヘキサンと渦を追加します。
- 2分、室温で低ブレーキ用250×gで遠心分離する。
- 名声を含んでいる上相を収集し、新しい非スクリューキャップ使い捨てガラス管に移す。
- 下で収集名声を乾かし40℃の窒素サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。
5。 CE FAME 14から遊離コレステロール汚染の除去
（遊離コレステロールは、サンプルを汚染することができます。無料のコレステロール除去をしてなくても例えば、クロマトグラフトレースの図1を参照）。
- SPEタンクに廃液チューブを配置し、タンクの上にシリカゲルSPEカートリッジを配置します。
- 真空下での乾燥ヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄と重力の下、1×1ミリリットルでカラムを洗浄します。
- 廃棄物の洗浄を取り外し、タンクに新しい廃液チューブを追加します。
- 1ミリリットル乾燥ヘキサン、渦のCE名声を溶かす。
- ガラスパスツールピペットを用いてカラムに適用され、重力の下を滴下することができます。
- 真空下でのヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。
- 廃棄物の洗浄を外し、タンクラベルCEの名声に新しい非スクリューキャップチューブを配置します。
- 溶出2×1ミリリットル乾燥ヘキサンでのCE FAME：ジエチルエーテル（95:5 v / v）で洗浄する。
- 40℃の窒素下で乾燥する。サンプルは週までの注意のために蓋をし て、この段階で-20℃で保存することができます：ジエチルエーテルは危険です。
6。 GCオートサンプラーバイアルにFAMEの転送
- 、渦をサンプリングして、GCのオートサンプルバイアルに転送する75μlの乾燥ヘキサンを追加します。
- 、サンプル渦と同じGCオートサンプルバイアルに転送し、さらに75μlの乾燥ヘキサンを追加します。サンプルは、月までのために蓋をして、この段階で-20℃で保存することができます。
7。ガスクロマトグラフ14を用いた分析
- ガスクロマトグラフ上で名声を分析します。の例では、最大セット：30 MX X 0.25ミリメートル0.25ミクロンBPX-70温度プロトコル溶融シリカキャピラリカラム：
初期温度115℃、245℃、Hに18.5分、傾斜60℃/分を保持し、200℃まで2分、勾配10℃/分を保持旧4分。
コラム：ヘリウムガス、流量1.0、圧力14.6と速度29。
インジェクタ：温度= 300℃、
検出器：水素流量40.0、空気の流れ184.0、ガスヘリウムを構成している、45.0を流量、温度= 300℃、 - （CEの名声分析用など 25:1）に応じて分割比を設定します。
- 適切なソフトウェアを使用して、各ピーク下の面積を決定し、標準と比較することによって名声を識別します。例えば、クロマトグラムについては、図2を参照してください。
- 総脂肪酸の割合として、個々の脂肪酸の寄与を計算するために、ピークデータ下の面積を使用する。
- 添加量は、内部標準の面積で割ることにより脂肪酸の絶対濃度を計算する。用いる組織量内の各脂肪酸の絶対濃度を得るために、この結果により、各脂肪酸の領域を分割する。
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Representative Results
この方法の成功は、正確かつクロマトグラムにも表示される可能性が「ノイズ」と汚染を低減するために、きれいな溶媒および試薬を使用しているプロトコルを以下に依存します。汚染されたサンプルは、曲線下面積の計算の精度を低下させること、分析することがより困難である。プロトコルが明確な左右対称、明確に定義されたピークとし、最小限のバックグラウンドノイズで正常にクロマトグラムを続いている場合は、図3に示すように得られるべきである。汚染が発生した場合のクロマトグラムは、追加のピークが表示され、 図4に示すように非対称（スキュー）ピークを示す。 CE（コレステロールが削除されない限り、 図1を参照してください（プロトコル5を参照）から派生した名声を実行する際に遊離コレステロールからの汚染が発生します。
調製されたキャリブレーション混合物の使用は、目におけるFAMEの同定を可能Eサンプル。クロマトグラムを図2に示すように、それらの保持時間に基づいて、試料と正しく同定されたピークと比較することができるように、キャリブレーション混合物を、試料と同じ機器設定を使用して実行される。
ピーク面積は、全内の特定の脂肪酸の割合を計算するために使用される。データが収集されたら、それは、図5に示すように、外れ値のためにそれらを検査することが有用である。異常値サンプルを、次いで、さらに調査することができ、必要に応じて抽出および/または分析が繰り返される。
（プロトコールステップ2.3に記載のように）試料に内部標準を添加して、目的のピークの面積に対する内部標準のピークの相対的な既知の量の面積を用いて計算することにより試料中の脂肪酸の定量化を可能にし、影響を調整元のサンプル容量または重量。 表1において、ラットの肝臓内のCE FAMEは以下のように記載されている肝臓CE内の総脂肪酸（100gあたりのグラムの総脂肪酸）のパーセント。これらのデータは、3つの異なる食事の1に20日間飼育処女や妊娠ラットの肝臓でのCE脂肪酸を説明します。二因子分散分析（要因：ダイエット、妊娠中の処女Vs）を用いた統計分析は、いくつかの脂肪酸の割合だけでなく、大幅なダイエットX妊娠相互作用（ 表1）の際に、食事と妊娠の重大な影響を明らかにしている。妊娠ラットにおける肝臓CEの内容より処女雌に比べて、食事の影響を受けて、イラストのように、 図6は、アラキドン酸（午前20時04分N-6 AA）があることを示しています。
図1：ラットの肝組織中の遊離コレステロール除去の重要性を示す同一のサンプルの比較のガスクロマトグラム。 、より大きな画像を見るにはここをクリックしてください。
図2作成した検量ミックスを使用しラット肝組織からの試料CEのFAMEを同定するために使用される方法の実施例。広報epared較正ミックスはクロマトグラムは、試料内の脂肪酸を同定するために比較できるように、サンプルと同じ機器設定を使用して実行される。キャリブレーションミックス伴うクロマトグラムは、ミックスの名声標識することができるようになります。この標識されたトレースは、次いで、容易に識別大きなピークは、次いで、適切に標識された較正ミックスにいる人々にそれらの保持時間により比較することができる試料からのクロマトグラムと比較することができる。たとえば、トレース上で強調表示。脂肪酸の正しいラベル付けを可能以下のサンプルトレース中の脂肪酸、上記のキャリブレーションミックスから保持時間の比較を示すために、午前16時00分です。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。ヒト血漿から得られた汚染されたNEFAのガスクロマトグラムの一例。本物のピークの積分に影響を与えることができるサンプルの冒頭に丸で囲んだように、多くの予期しないピークが、存在する。 towar見られるようなピークが中断し、定義されていません丸で囲んだようにサンプルの最後のDSや傾斜になっている。これは、曲線の計算およびこれらの脂肪酸の定量化の下の面積の精度に影響します。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図5。処女ラットにおける肝CEの脂肪酸組成のうち、外れ値データの識別は、高脂肪大豆油食を与えた（n = 6）で 、 これは分析され、脂肪酸の割合データが曖昧な結果を決定するために使用することができる方法を示している。これらのデータは、サンプル125は、異常値であることを示し、さらに調査が必要です。 CE（午前16時00、18:0,18:1のn-9 18:2 n-6系20:4 n-6）系内の5つの主要な脂肪酸は示されていない。。JPG「標的= "_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図6。処女と妊娠ラット間肝CEのアラキドン酸含量は実験飼料を供給した。値は平均±SDである、N = 6。一般的な手紙なしで、P <0.05を異なることを意味します。 *マッチした栄養基、p <0.05内処女雌とは異なる。それらの同じ飼料を与え、妊娠ラットに比べて様々な餌を与え、これは処女ラットの肝臓のCE含有量の違いを示す表1の結果を視覚的に表現したものである。違いは、処女と妊娠ラット間の各食餌群では見ることができます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
表1。処女と妊娠ラットのラット肝コレステリルエステルの脂肪酸組成は、実験飼料を供給した。値は平均（SD）であり、n = 6。 NDが（<0.1％を意味する）が検出されないことを示します。処女や妊娠中の女性は、P <0.05を異なる内の共通の文字なしでことを意味します。 *マッチした栄養基、p <0.05内処女雌とは異なる。この表は、処女と妊娠ラット送ら低および様々な高脂肪食の肝臓組織中に存在するN-3およびn-6脂肪酸の平均値を示しています。結果は統計的P <処女と妊娠ラットとの差0.05、食事および食事xの妊娠相互作用のタイプの有意水準で分散分析（ANOVA）を用いて分析した。分散分析の結果は、処女とm以内妊娠ラット間のアラキドン酸のレベルに有意差（20時04分、N-6）がある示唆atched食餌グループ。
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Discussion
ガスクロマトグラフィーは脂肪酸分析のために使用する正確な技術であり、その高い再現性が臨床分析に適したこの技術を認める。適切なGCカラムは、使用可能なカラムは、固定相、カラムの長さと内径の極性の変化を有する、関心対象の脂肪酸の同定を可能にするために使用されなければならない。この分析方法では、溶融シリカキャピラリーカラムの使用は、良好な熱安定性およびその高い表面不活性及び良好な分解能8による保持時間の再現性を提供する。
このプロトコルの中の重要なステップは、下限と上限位相収集ステップを（プロトコル2.7と4.8ステップ）が含まれる。それは、正しい位相の限りが不要な相のいずれかとの汚染なしに可能な限り収集することが重要である。サンプル中の汚染物質の存在は望ましくないクロマトグラフの出力になります図2に示すように、 SPE間にCEを収集する際には、カートリッジカラムは、サンプルは、タグからのCEの成功分離を可能にする列を貫通することを確認し、ヘキサンで洗浄後、溶媒（ステップ3.15）で飽和に保たれていることが不可欠です。遊離コレステロールを除去するためのCEのさらなる分離は、 図1に示すように、クロマトグラフトレース上に現れる汚染を回避することが重要である。それを真空下で液体の除去を必要とするステップは、すべての液体が完全に良好な収率を確保するために、カラムから除去されるように正確に従っていることも重要である。
GCの主な制限は、このようなリン脂質やtriacyglycerolsなどの複合脂質は、分析の前に名声を形成するために誘導体化する前に鹸化することができるようになり、これらの脂質および脂肪酸の代表的な組合せの具体的な構造についての情報は10を失っている必要があるということです。のすべてのステップこのプロトコルはまた、典型的には2営業日服用、少数のサンプルを分析するための時間がかかる可能性が、この方法は、この方法ピンを行うことができる周囲の適合性を制限する溶媒の使用によるヒュームフード中で実施されなければならない完全に自動化された手順を使用しない限り、データ出力に関心のあるサンプルから取得する。サンプルのより多くを処理するときただし、各ステージは、他のユーザーに装置のこの技術および可用性の時間性を最大化するためにバッチで行うことができる。プロトコル内の特定の技術は、練習と、このような反復動作の負の影響を受けやすいので、問題のある関節を持つ人または問題がある可能性があり、上下相抽出（2.7および4.8ステップ）、などの手先の器用さを必要とする。
この方法内のステップは、容易に、試料の広い範囲の異なる画分の収集を容易にするために追加または削除することができるsは、血漿を分析する場合、例えば、PE収集が必要とされないかもしれないが、細胞および組織の試料10の関心のものである。この方法はまた、所望であれば、SPE工程を省略することができる全脂質抽出物の細胞の分析のために修飾することができる。一つのこのような変化は、総脂質の抽出工程を省略ならびにSPEは、15ステップ赤血球について記載することである。現在のプロトコルとは対照的に、本研究で使用した方法は、メチル化試薬250μlのヘキサン250μlの100˚℃で10分間加熱すると共に赤色の細胞に直接添加される（14％三フッ化ホウ素）を使用し中和工程は省略され、代わりに水とヘキサンを添加し、次いで試料を遠心分離し、ヘキサン上相を回収し、GCオートサンプラーバイアルに直接移し、窒素下で乾燥させることなく、ヘキサンに再溶解する。
GCは汎用性の高い方法であり、RELを提供しています使用可能な修飾15の範囲でiable結果は、サンプルの多種多様を分析するために使用することができる。原子質量とは対照的に、それは標識のために保持時間を使用するので、それが構造的に類似の脂肪酸とを区別することができるように、n-6およびn-3脂肪酸の代謝を分析する際には、質量分析法を超える利点（MS）を有する。 MSは、試料内の脂肪酸を識別することなく、立体異性体の二重結合の位置を識別することができないとは別に、特定の脂肪酸を伝えるすることができない。必要に応じて、両方の方法は、GC-MSにより16タンデムに使用することができる。この技術は、脂質代謝および脂質代謝の分野での機能の調査の間に使用されている。それは、GCの異なる固定相の使用による脂肪酸識別の操作が脂肪酸とを区別することを可能にするように、MSと並行して、GCを使用することは大きな進歩をもたらしたことだけでは、MSはできません。 GCはまた、電子衝撃質量分析法と組み合わせて使用することができるそれらは、例えばピコリニルエステルのような代替的な化学的誘導体と組み合わせると脂肪酸の同定を可能にする（EI-MS）。これは技術の使用を広げ、このような生理学、臨床バイオマーカー検出、および病理学だけでなく、脂質生化学17などの分野の範囲内の研究方法としての脂質プロファイリングを改善し続けています。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、ラットの研究にMeritxellロム·ナダルの貢献を感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
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