Summary
Graviditet medfører væsentlige ændringer i fedtsyresammensætningen af maternelle væv. Lipidprofiler kan hentes via gaskromatografi for at muliggøre identifikation og kvantificering af fedtsyrer i enkelte lipidklasser blandt rotter fodret forskellige high og fedtfattig kost under graviditeten.
Abstract
Gaschromatografi (GC) er en yderst følsom metode bruges til at identificere og kvantificere fedtsyreindholdet af lipider fra væv, celler og plasma / serum, hvilket giver resultater med høj præcision og høj reproducerbarhed. I metaboliske og ernæring undersøgelser GC tillader vurdering af ændringer i fede koncentrationer syre følgende tiltag eller under ændringer i fysiologiske tilstand, såsom graviditet. Fastfase-ekstraktion (SPE) ved anvendelse aminopropylsilicagel patroner tillader adskillelse af de store lipidklasser herunder triacylglyceroler, forskellige phospholipider og cholesterylestere (CE). GC kombineret med SPE blev brugt til at analysere ændringer i fedtsyresammensætningen af CE-fraktionen i lever fra jomfruolie og gravide rotter, der var blevet fodret med forskellige høje og fedtfattig kost. Der er betydelige kost / graviditet interaktion virkninger på omega-3 og omega-6 fedtsyrer i leveren CE, hvilket indikerer, at gravide kvinder har en forskellig reaktion på kosten manipuleredeion end det ses blandt jomfruelige hunner.
Introduction
Gaschromatografi (GC) er en veletableret teknik, der anvendes til at identificere og kvantificere inkorporering af fedtsyrer i lipid pools og cellemembraner 1,2 under tilskud eller fysiologiske tilstande såsom fedme (og relaterede sygdomme såsom diabetes) eller graviditet 3 - 5.. Det er også velegnet til at analysere de typer og mængder af fedt i fødevarer. Dette er nyttigt ved karakterisering forsøgsdiæter, samt sikre, at fødevareindustrien overholder lovgivningen. For eksempel kan GC anvendes til at bekræfte identiteten og mængden af fedtsyrer i et produkt som et kosttilskud for at sikre, at mærkningen er korrekt, og regler er overholdt til 6,7. Analyse af fedtsyrer kan give værdifuld indsigt i lipid stofskiftet i sundhed og sygdom, virkningen af kostomlægning, og effekten af ændringer i fysiologiske tilstand 8. Brug af GC for at studere prøver under graviditeten har givet vigtigoplysninger om ændringer i fedtsyre og kompleks lipid homeostase 3.
Forud for den chromatografiske separation, er lipider typisk ekstraheret fra prøven ved hjælp af opløseligheden af lipider i opløsningsmiddelblandinger af chloroform og methanol. Tilsættes natriumchlorid for at lette adskillelse af blandingen i vandig og organisk lipidholdige faser 9,10. Komplekse lipidklasser af interesse kan adskilles fra den samlede fedtekstrakt ved fastfase-ekstraktion (SPE). Denne adskillelse teknik eluerer lipidklasser baseret på deres polaritet eller bindende affinitet. Triacyglycerols (TAG) og cholesterylestere (CE) elueres først som en kombineret fraktion yderligere klasser, phosphatidylcholin (PC), er phosphatidylethanolamin (PE), og ikke-esterificerede fedtsyrer (NEFA) blev elueret ved at øge polariteten af elueringsopløsningsmidlet . Adskillelsen af TAG fra CE udnytter binding af TAG kun til en frisk SPE patronDGE, så CE elueres. TAG kan derefter elueres ved at øge polariteten af eluering 9,10 opløsningsmiddel. Denne fremgangsmåde giver mulighed for flere prøver, der skal adskilles samtidigt med et højere udbytte end opnås med tyndtlagskromatografi, hvilket betyder, at relativt små og mellemstore prøver (fx <100 ul plasma eller serum, <100 mg væv) kan analyseres 11,12.
GC er en veletableret teknik først beskrevet i 1950'erne, og det blev foreslået, at den mobile fase i de dengang væske-væske-systemer kan erstattes med damp. Det blev oprindeligt anvendt til råolie analyse, men hurtigt udvides til andre områder, såsom aminosyreanalyse og lipid biokemi, som stadig er af stor interesse. Fremskridt i GC udstyr og teknologi såsom udvikling af kapillarkolonner fra de tidligere anvendte pakkede kolonner har ført til vores nuværende teknikker, hvor fedtsyrerne er i stand til at væreadskilt mere effektivt ved lavere temperaturer resulterer i GC rutinemæssigt anvendes til at identificere og kvantificere fedtsyrer i en lang række undersøgelser 13.
GC kræver fedtsyrer, der skal derivatiseres, således at de kan blive tilstrækkelig flygtig til at blive elueret ved rimelige temperaturer uden termisk nedbrydning. Denne regel medfører substitution af en funktionel gruppe indeholdende hydrogen til at danne estere, thioestere eller amider til analyse. Methylestere almindeligt undersøgt derivater, som er fremstillet ved methylering. Ved denne metode esterbindinger i komplekse lipider hydrolyseres til at frigive frie fedtsyrer, som er transmethylated til dannelse af fedtsyremethylestere (FAME). Den resulterende profil FAME, bestemt ved GC, er nævnt som fedtsyresammensætningen og kan let sammenlignes mellem de forskellige eksperimentelle grupper 9,10. Teknikken giver både proportionerne af individuelle fedtsyrer og deres koncentration skal måles.
Ud over anvendelse af GC til analyse af fedtsyrer i ernæring undersøgelser og inden for fødevareindustrien, Teknikken kan anvendes på en lang række af analytiske områder. For eksempel omfatter miljømæssige analyser ved GC måling vandforurening ved insekticider og jordbundsanalyser måling chlorbenzen indhold. I toksikologi, er GC også blevet brugt til at identificere illegale stoffer i urin og blodprøver fra enkeltpersoner sådan en sports produktionsfremmere 12 og evnen til at adskille komplekse blandinger af kulbrinter gør denne teknik populær i olieindustrien til petrokemisk analyse 12.
Graviditet er forbundet med væsentlige ændringer i fedtsyresammensætningen af maternelle væv, specielt i indholdet af omega-3 (n-3) og omega-6 (n-6) polyumættede fedtsyrer Formidabeltds (PUFA) 3. I den aktuelle undersøgelse, vi eksemplificere anvendelsen af GC i målingen af fedtsyrer ved at beskrive dens anvendelse i analyse af fedtsyresammensætningen i levervæv taget fra jomfruelige gravide rotter fodret lavt og højt fedtindhold med forskellige oliekilder. Forsøgskosten forudsat her var en fedtfattig sojaolie baseret kost, et højt fedtindhold sojaolie-baserede kost (130,9 g total fedt / kg total fedt) eller et højt fedtindhold linolie-baseret kost (130,9 g total fedt / kg kost), forudsat i 20 dage. Den fulde næringsstof og fedtsyresammensætning af disse diæter er blevet beskrevet tidligere 14. Sojabønneolien kost er rig på linolsyre (18:02 n-6) og indeholder nogle α-linolensyre (18:03 n-3), mens linolie kost er rig på α-linolensyre. Disse højt fedtindhold kost repræsenterer forskellige rationer af linolsyre til α-linolensyre (rationer 8:1 og 1:1, henholdsvis). Fremgangsmåden til isolering af enkelte lipidklasser og ved GC er vill etableret og valideret, og er blevet offentliggjort tidligere 10, men uden den detaljerede tekniske beskrivelse findes heri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Dyreforsøg
- Alle dyr arbejde skal udføres i overensstemmelse med indenrigsministeriet Dyr (videnskabelige procedurer) Act (1986).
- Mate Wistarrotter alderen 10 uger gammel ved monogamt avl, og bekræft graviditet ved fremkomsten af en vaginal prop. Optag dette som dag 1 i drægtighedsperioden, og begynde eksperimenterende kost. For jomfruelige hunner huse hver rotte individuelt, og begynde eksperimenterende kost.
- Efter fodring forsøgskosten i 20 dage aflive rotter ved CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
- Brug dissektion pincet og saks til at eksponere bughulen og punktafgifter leveren ved at skære ledbånd, der forbinder leveren til mellemgulvet, forreste væg af maven, mave og duodenum. Vask leveren i PBS og fryse i flydende nitrogen før opbevaring ved -80 ° C.
2. Udarbejdelse af en Total lipidekstrakt 9
- Tilføj molecular sier (til at fylde 1/10 af container opløsningsmiddel) til alle opløsningsmidler til at skabe "tørre" opløsningsmidler. Gennemfør alle opløsningsmiddel arbejde inden en emhætte.
- Skær cirka 100 mg frosset lever og vejer. Placer vævet ind i et rør i en isspand og tilsæt 0,8 ml iskold 0,9% NaCl. Homogenisere vævet.
- Læg interne standarder opløst i 1 ml / mg tørt chloroform: methanol (2:1, v / v) indeholdende butylhydroxytoluen (BHT, 50 mg / l) som anti-oxidant. For 100 mg rottelever tilsættes 100 ug CE standard (Cholesteryl heptadecanoat 17:00) Advarsel:. Chloroform og BHT er farlige.
- Tilføj 5,0 ml tør chloroform: methanol (2:1, v / v) indeholdende BHT (50 mg / L).
- Tilsæt 1,0 ml 1 M NaCl, bland grundigt efter vortex indtil blandingen ser uniform. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
- Centrifuger ved 1.000 x g i 10 minutter, lav bremsen ved stuetemperatur.
- Saml laverefase ved hjælp af glas Pasteur pipette til nye skruelåg glasrør og tørre under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
3. Adskillelse af lipidklasser af Solid Phase Extraction (SPE) 10.
- Slut SPE tank til en vakuumpumpe og placere aminopropylsilicagel SPE-patronen på tanken.
- Placer ny skruelåg glasrør mærket TAG og CE i tanken rack under kolonnen til at indsamle første fraktion.
- Den totale lipidekstrakt opløses i 1,0 ml tør chloroform og vortex.
- Påfør prøven til kolonnen ved hjælp af et glas Pasteur pipette og lad det dryppe igennem i skruelåg rør under tyngdekraften. Når yderligere drypper falde, fjerne den resterende væske ved hjælp af vakuum.
- Eluer fraktionen TAG og CE under vakuum, kolonnen vaskes med 2 x 1,0 ml vask tør chloroform.
- Når al væsken er fjernet, tørres TAG og CE fraktioneringsn under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
- Placer ny skruelåg glasrør mærket pc ind i tanken bakke under kolonnen.
- Eluere PC fraktion under vakuum med tilsætning af 2 x 1,0 ml tør chloroform: methanol (60:40, v / v), indtil al væsken er fjernet fra søjlen.
- Fjern og tør PC brøkdel under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
- Placer en ny skruelåg glasrør mærket PE i tanken bakke og der elueres PE fraktion med tillæg af 1,0 ml tør methanol under vakuum.
- Fjern og PE-fraktion tør under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
- Placer ny skruelåg glasrør mærket NEFA i tanken bakken, og der elueres NEFA fraktion under vakuum ved tilsætning af 2 x 1,0 ml vask tør chloroform: methanol: iseddikesyre. (100:2:2, v / v / v) Forsigtig: Eddikesyre er farligt.
- Fjern indsamlet NEFA fraktion og tørres under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
- Placer en ny aminopropylsilicagel SPE patron på SPE tank og placere et skruelåg glasrør i tanken bakke under patron til at indsamle affald.
- Kolonnen udvaskes med 3 vaske tørt hexan under vakuum, og dernæst en endelig 1,0 ml vask under tyngdekraften. Lad ikke patronen bliver tør (drej cylinderampullen kolonne kanaler til en lukket position, når hexan niveauet er tæt på patronen matrix) Forsigtig:. Hexan er farlig.
- Udskift affald rør med nye skruelåg glasrør mærket CE.
- Tørret TAG og CE fraktion (fremstillet i trin 3.6) opløses i 1,0 ml tør hexan og vortex. Anvende denne til søjlen ved hjælp af en glas Pasteur-pipette og lad det dryppe igennem under gravity.
- Når yderligere drypper falde, fjerne den resterende væske under vakuum.
- Under vakuum kolonnen, vaskes med 2 x 1,0 ml vask tør hexan til eluering CE og tør opsamlede fraktion under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
- Placer ny skruelåg glasrør mærket TAG i tanken bakke, og der elueres TAG med tillæg af 2 x 1,0 ml vaske tør hexan: methanol: ethylacetat (100:5:5) under vakuum.
- Dry opsamlede fraktion under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C i denne fase i op til en uge Forsigtig:. Ethylacetat er farligt.
4.. Fremstilling af FAME fra CE 10
- Tilsæt 0,5 ml tør toluen til den separerede CE fraktion (i trin 3.19) og vortex Forsigtig:. Toluen er farlig.
- Forbered methyleringsreagens (tør methanol med 2% (v/ V) H 2 SO 4), hvoraf 1,0 ml er påkrævet per prøve. Dispenseringsvolumen tør methanol i glas eller egnet plast beholder med låg og tilsæt den nødvendige mængde af H 2 SO 4 dråbevis derefter blandes ved at vende Forsigtig:. Svovlsyre er farligt.
- Tilsæt 1,0 ml methyleringsreagens til opløst i tør toluen prøver cap rørene sikkert, og blandes forsigtigt.
- Opvarm prøverne i 2 timer ved 50 ° C.
- Efter 2 timer fjernes rørene fra varmen. Når den er afkølet tilsættes 1,0 ml neutraliserende opløsning (0,25 M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3) Forsigtig:. Kaliumbicarbonat og kaliumcarbonat er farlige.
- Tilsæt 1,0 ml tørt hexan og vortex.
- Centrifuger ved 250 x g i 2 minutter, lav bremsen ved stuetemperatur.
- Saml øvre fase, som indeholder FAME, og overføres til en ny ikke skruelåg engangs glasrør.
- Tør indsamlede FAME undernitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en uge.
5.. Fjernelse af Free Kolesterol Forurening fra CE FAME 14
(Gratis Kolesterol kan forurene prøven, se figur 1 for eksempel chromatograph spor med og uden fri kolesterol fjernelse).
- Placer en spild slange i SPE tank og placere en silicagel SPE patron på tanken.
- Vask søjlen med 3 x 1 ml vaske tør hexan under vakuum og 1 x 1 ml under tyngdekraften.
- Fjern affald vasker og tilføje nyt affald røret ind tank.
- CE FAME opløses i 1 ml tør hexan, vortex.
- Påfør til kolonnen ved hjælp af et glas Pasteur pipette og lad det dryppe igennem under tyngdekraft.
- Vask søjlen med 3 x 1 ml vaske med hexan under vakuum.
- Fjern affald vasker og placere nye ikke skruelåg rør ind i tanken mærket CE FAME.
- EluereCE FAME med 2 x 1 ml tør hexan: diethylether (95:5 v / v) vaske.
- Tørres under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette tidspunkt i op til en uge Forsigtig:. Diethylether er farligt.
6.. Overførsel af FAME i GC Auto Sampler Vial
- Tilføj 75 pi tør hexan til at prøve, vortex, og overføres til en GC auto hætteglas.
- Tilføj yderligere 75 pi tør hexan til at prøve, vortex og overføre til samme GC auto prøvehætteglas. Prøver kan låg og opbevares ved -20 ° C på dette trin i op til en måned.
7.. Analyse Brug af gaskromatograf 14
- Analyser FAME på en gaskromatograf. Eksempel oprettet: 30 mx 0,25 um x 0.25 mm BPX-70 kvartsglas kapillarkolonne med temperatur protokol:
Starttemperatur 115 ° C, hold 2 min, rampe 10 ° C / min til 200 ° C, hold 18,5 min, rampe 60 ° C / min til 245 ° C, hgammel 4 min.
Kolonne: Helium gas, flow 1,0, tryk 14,6 og hastighed 29.
Injector: Temperatur = 300 ° C.
Detektor: Hydrogen flow 40,0, luft flow 184,0, fyldes op gas Helium, flow 45,0, temperatur = 300 ° C. - Sæt split forhold som eventuelt (25:1 for CE FAME analyse).
- Bestem arealet af hver enkelt top ved hjælp af passende software og identificere FAME ved sammenligning med standarder. Se Figur 2 for eksempel kromatogrammer.
- Brug området under peak data til at beregne bidrag af individuelle fedtsyrer som en procentdel af totale fedtsyrer.
- Beregn absolutte koncentrationer af fedtsyrer ved at dividere området intern standard af den tilsatte mængde. Opdel arealet af hver fedtsyre af dette resultat at opnå absolutte koncentrationer af hver fedtsyre i mængden af væv, der anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesen for denne metode er afhængig af at følge protokollen præcist og på ved hjælp af rene opløsningsmidler og reagenser for at reducere "støj" og forurening, der kan vises på et kromatogram. Forurenede prøver er mere udfordrende at analysere, sænke nøjagtigheden af arealet under kurven beregninger. Hvis protokollen følges held et kromatogram med klare symmetriske, veldefinerede toppe og med minimal baggrundsstøj skal opnås som vist i figur 3. Hvis der er sket forurening kromatogrammet vil vise yderligere toppe og udviser ikke-symmetriske (skæve) toppe som vist i figur 4.. Forurening fra frit cholesterol vil forekomme, når de kører FAME stammer fra CE (se figur 1, medmindre kolesterol fjernes (som beskrevet i protokol 5).
Anvendelsen af en forberedt kalibrering blanding giver mulighed for identifikation af FAME the prøve. Kalibreringen blanding køres med indstillingerne samme instrument som prøver, så at kromatogram kan sammenlignes med prøven og toppe korrekt identificeres baseret på deres retentionstider som illustreret i figur 2.
Topareal bruges til at beregne den procentdel af specifikke fedtsyrer i alt. Når data er indsamlet, er det nyttigt at inspicere dem for outliers, som vist i figur 5.. Afvigende prøver kan derefter blive undersøgt yderligere, og udtræk og / eller analyse gentages om nødvendigt.
Tilføjelse af en intern standard til prøver (som beskrevet i protokol trin 2.3) muliggør kvantificering af fedtsyrer i prøven ved beregninger ved hjælp af det område kendt mængde af intern standard-toppen i forhold til arealet af toppen af interesse, og korrigeret for oprindelige prøve volumen eller vægt. I tabel 1 er FAME inden rottelever CE beskrives som enprocent af totale fedtsyrer (g/100 g total fedtsyre) i leveren CE. Disse data beskriver CE fedtsyrer i leveren af ubrugte eller drægtige rotter fodret i 20 dage på en af tre forskellige diæter. Statistisk analyse ved hjælp af to-faktor ANOVA (faktorer: kost, gravid vs jomfru) afslører betydelige effekter af kost og graviditet upon andelen af flere fedtsyrer, samt betydelige kost x graviditet vekselvirkninger (tabel 1). Som en illustration, figur 6 viser, at arachidonsyre (AA, 20:4 n-6) indhold af lever CE drægtige rotter mere påvirket af kosten end jomfruelige hunner.
Fig. 1. Sammenlignende gas kromatogrammer af identiske prøver, der illustrerer betydningen af frit cholesterol fjernelse i rotte-levervæv. Klik her for at se større billede.
Figur 2.. Eksempel på metode, der anvendes til at identificere prøven CE FAME fra rottelevervæv hjælp af en forberedt kalibrering mix. En PRepared kalibrering blanding køres med indstillingerne samme instrument som prøver, så at kromatogrammerne kan sammenlignes for at identificere fedtsyrer i prøven. Den ledsagende kromatogram for kalibrering mix tillader FAME i blandingen skal mærkes. Dette mærkede spor kan derefter sammenlignes med kromatogrammet fra prøven, hvor let identificerbare store toppe kan sammenlignes med deres retentionstider til dem på kalibreringen mix derefter mærket korrekt. For eksempel fremhævet på spor. er 16:00 for at illustrere sammenligning af retentionstider fra kalibreringen mix ovenfor til de fedtsyrer i prøven spor nedenfor tillade korrekt mærkning af fedtsyrer. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Eksempel på en forurenet NEFA Gaskromatogrammer fra humant plasma. Der er mange uventede toppe, som kredsede i starten af prøven, som kan påvirke integrationen af ægte toppe. Toppene afbrydes og udefineret set towar ds slutningen af prøven og er blevet skrå som cirkel. Dette vil påvirke nøjagtigheden af arealet under kurven beregninger og kvantificering af disse fedtsyrer. Klik her for at se større billede.
Figur 5. Identifikation af afvigende data mellem fedtsyresammensætningen af lever CE i virgin rotter fodret med et højt fedtindhold sojabønneoliediæten (n = 6). Dette illustrerer, hvordan procent data analyseres fedtsyrer kan anvendes til at bestemme tvetydige resultater. Disse data indikerer, at prøven 125 kan være en outlier, og kræver yderligere undersøgelse. De fem store fedtsyrer indenfor CE (16:00, 18:00, 18:01 n-9, 18:02 n-6, 20:4 n-6) er ikke vist.. Jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Figur 6. Arachidonsyre indhold af lever CE blandt jomfruolie og gravide rotter fodret forsøgsdiæter. Værdier er middel ± SD, n = 6. Midler uden en fælles brev forskellige, P <0,05. * Forskellige fra jomfruelige hunner inden matchede kosten gruppe, p <0,05. Dette er en visuel repræsentation af resultaterne fra tabel 1, der viser forskellene i leveren CE indhold af ubrugte rotter fodret forskellige kostvaner i forhold til gravide rotter fodret med de samme kost. Forskelle kan ses i hver kosten gruppe mellem de jomfruelige og gravide rotter. Klik her for at se større billede.
Tabel 1. Fedtsyresammensætningen rottelever cholesterylestere ubrugte og gravide rotter fodret forsøgsdiæter. Værdier er middel (SD), n = 6. ND indikerer ikke påvist (gennemsnitlig <0,1%). Midler uden en fælles brev inden jomfruolie eller drægtige hunner forskellige, P <0,05. * Forskellige fra jomfruelige hunner inden matchede kosten gruppe, p <0,05. Denne tabel viser de gennemsnitlige værdier af n-3 og n-6 fedtsyrer er til stede i leveren væv af jomfruolie og drægtige rotter, når fodret lave og varierende højt fedtindhold kost. Resultaterne blev analyseret statistisk ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA) med et signifikansniveau på p <0,05 for forskelle mellem jomfruelige gravide rotter, typen af diæt og kost x graviditet interaktion. ANOVA resultater antyder, at der er betydelige forskelle i niveauet af arachidonsyre (20:4 n-6) mellem jomfru og gravide rotter inden for matched kostgrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gaskromatografi er en nøjagtig metode til at bruge til fedtsyre-analyse, og den høje reproducerbarhed finder denne teknik er egnet til kliniske analyser. Passende GC kolonner skal bruges til at muliggøre identifikation af fedtsyrer af interesse, med tilgængelige kolonner have variationer i polaritet den stationære fase, kolonne længde og indvendig diameter. Brugen af en smeltet silica kapillarkolonne i denne analysemetode giver god termisk stabilitet og høj reproducerbarhed af retentionstider grund af sin høje overflade træghed og god opløsning 8.
Kritiske trin i denne protokol omfatter nedre og øvre fase indsamling trin (protokol trin 2.7 og 4.8). Det er vigtigt, at så meget af den korrekte fase opsamles som muligt uden forurening med nogen af de uønskede fase. Tilstedeværelsen af forurenende stoffer i en prøve vil resultere i en uønsket kromatografisk udgangSom illustreret i figur 2. Ved indsamling CE under SPE er det bydende nødvendigt, at patronen kolonner holdes mættet med opløsningsmiddel (trin 3.15) efter vask med hexan til at sikre prøven trænger kolonnen for at tillade en vellykket adskillelse af CE fra TAG. Den yderligere adskillelse af CE at fjerne frit cholesterol er vigtigt at undgå kontaminering optræder på kromatografen spor som vist i figur 1. Det er også vigtigt at sikre trin kræver fjernelse af væske under vakuum følges nøjagtigt, så al væske er fjernet fuldstændig fra kolonnen for at sikre et godt udbytte.
Den væsentligste begrænsning af GC, at komplekse lipider, såsom phospholipider og triacyglycerols skal forsæbes før derivatisering til dannelse af FAME forud for analyse, så oplysninger om de specifikke strukturer i disse lipider og typiske kombinationer af fedtsyrer tabt 10. Alle trin idenne protokol skal udføres i et stinkskab på grund af anvendelsen af opløsningsmidler, som begrænser egnethed omgivelser denne metode kan udføres i. Denne metode kan også være tidskrævende for at analysere et lille antal prøver, der typisk tager to arbejdsdage at komme fra prøve af interesse for data output, medmindre der anvendes fuldautomatiske procedurer. Men når behandlingen større antal prøver, hvert trin kan gøres på partier for at maksimere tid effektiviteten af denne teknik og tilgængeligheden af udstyr til andre brugere. Visse teknikker inden protokollen kræver praksis og håndelag som øvre og nedre fase ekstraktioner (trin 2.7 og 4.8), som kunne være et problem for folk med problematiske samlinger eller som er tilbøjelige til at negative virkninger af gentagne bevægelser.
Skridt i denne metode kan nemt tilføjes eller fjernes for at lette samling af forskellige fraktioner til en bred vifte af prøves, for eksempel PE samling kan ikke kræves, når man analyserer plasma, men er af interesse i celle-og vævsprøver 10. Denne fremgangsmåde kan også ændres til analyse af celler fra total lipid ekstrakter, hvor SPE trin kan udelades, hvis det ønskes. En sådan variation er der er beskrevet for de røde blodlegemer, som udelader samlede lipidekstraktionen skridt samt SPE skridt 15. I modsætning til den nuværende protokol, hvor fremgangsmåden anvendes i denne undersøgelse benytter 250 pi af en methyleringsreagens (14% bortrifluorid), som tilsættes direkte til røde celler sammen med 250 pi af hexan og opvarmet i 10 minutter ved 100 ˚ C. Neutraliseringen trin udelades, og der indsættes i stedet for vand og hexan; prøven centrifugeres derefter og hexan øvre fase indsamles og overføres direkte til en GC autosampler hætteglas uden tørring under nitrogen og genopløsning i hexan.
GC er en alsidig fremgangsmåde og giver reliable resultater med en række tilgængelige modifikationer 15 og kan anvendes til at analysere en lang række prøver. Det har fordele i forhold til massespektrometri (MS), når man analyserer n-6 og n-3-fedtsyre-metabolisme, som det er i stand til at skelne mellem strukturelt tilsvarende fedtsyrer, som det anvender retentionstiden for mærkning i modsætning til atommasse. MS er i stand til at identificere fedtsyrer i en prøve, men ude af stand til at skelne dobbeltbinding positioner i stereoisomerer og derfor ude af stand til at fortælle visse fedtsyrer fra hinanden. Hvis det ønskes, kan begge metoder anvendes i tandem ved GC-MS 16. Denne teknik er ansat under efterforskningen i lipid metabolisme og funktion inden for lipidomics. Brugen af GC i tandem med MS har ført til store fremskridt, da det giver mulighed for manipulation af fedtsyre identifikation ved anvendelse af forskellige stationære faser i GC til at diskriminere mellem fedtsyrer, at MS ikke kan det alene. GC kan også anvendes i kombination med elektron impact massespektrometri(EI-MS), som giver mulighed for identifikation af fedtsyrer, når de kombineres med alternative kemiske derivater, såsom picolinyl estere. Dette udvider brugen af teknikken og fortsætter med at forbedre lipid profilering som en forskningsmetode i en række områder såsom fysiologi, klinisk biomarkør opdagelse og patologi, samt lipid biokemi 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende det bidrag Meritxell Romeu-Nadal til rotteforsøget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from: http://lipidlibrary.aocs.org (2013).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. Quantitative chromatographic analysis. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P.
- Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from eprints.soton.ac.uk 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf (2013).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
