Summary
このビデオでは、マウスの動脈の内膜のプラークの開発の2つのモデルを示し、筋内膜増殖症およびアテローム性動脈硬化症の違いを強調している。
Abstract
虚血性心疾患、例えば観察される動脈狭窄を誘導するための種々 のin vivo実験用げっ歯類モデルは、動脈プラーク形成および狭窄を含む疾患を模倣するように確立されている。 2つの高度に再現可能なマウスモデル - 両方の動脈狭窄をもたらしたが、それぞれが開発のさまざまな経路を根底には - ここで紹介されています。モデルは、動脈狭窄の2の最も一般的な原因を表し;すなわち、1マウス各筋内膜過形成のためのモデル、およびアテローム性動脈硬化症が示されている。筋内膜過形成を誘発するために、腹部大動脈のバルーンカテーテル傷害が行われる。動脈硬化性プラークの発展のために、アポE - / - 西脂肪の食事と組み合わせたマウスモデルが使用されます。結果の測定·評価のための別のモデルに適合したオプションについては、この原稿に名前が付けられ、説明されています。これらの二つのモデルを導入することと比較すると、のinformatを提供しています科学者たちは尋ねた科学的な質問への応じた適切な動脈狭窄モデルを選択するためのイオン。
Introduction
先進国における虚血性心疾患は死亡率1の主要な原因のまま。冠動脈狭窄の原因は多種多様であり、最も一般的な治療戦略2を 、残りの血行再建術と筋内膜増殖症だけでなく、アテローム性動脈硬化症が含まれる。明らかに内膜肥厚やアテローム性動脈硬化症の機構経路を区別する研究モデルは、動脈プラークの開発における病理生物学的および病態生理学的プロセスを調査するために不可欠である。このビデオでは筋内膜増殖症やアテローム性動脈硬化症の発症のどちらかを研究するために使用される二つの異なるマウスモデルを導入する。
筋内膜増殖症、アテローム性動脈硬化症は、もともと3について記載の「レスポンス·ツー·傷害」パラダイムを経由して形成することが想定される。内皮層の機械的破壊は、パラクリン効果によって増強激しいリモデリングをもたらす。いくつかのディがありますfferent動物モデルは、一般的に筋内膜過形成を研究するために使用。いくつかのグループは、ラット4の上行大動脈に金属のデバイスを使用しています。バルーンカテーテルを用いて行わ大動脈削剥モデルは、一般に実験用ラット5,6で使用される。実験用マウス7で行われる内膜過形成モデルは、頸動脈の結紮を実装し、筋内膜病変8を誘導する。私たちの研究室では、腹部大動脈侵食モデル-筋内膜過形成の発達を研究する-だけでなく、ヒトのステント再狭窄モデル9は、一般的に使用されている。このビデオでは、適切な実験動物モデルを選択すると、動脈狭窄の機序や病態生理学的研究のために重要であることを強調している。
筋内膜過形成モデルは、アテローム性動脈硬化症のモデルと区別されなければならない。後者については、（アポE - / - ）アポリポタンパク質E欠損西洋食と組み合わせたマウスは一般にatherosclを誘導するために使用されているHな病変10,11,12,13。マウスでの筋内膜疾患のこれらのタイプの両方を誘導するための例としては、血管狭窄14を分析するために別のモデルに適応したオプションと一緒に、ここに示されています。
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Protocol
全ての動物研究は、関連する動物ケアガイドラインに従って行われるべきである。前初めプロトコルへの動物の仕事のための制度的認可を受けなければならない。
1。筋内膜増殖症モデル（A）
内膜肥厚モデルの場合、約25グラムの重さ8週齢のC57BL/6J（在庫番号000664、C57BL/6J）マウスを購入。従来の条件の下で、これらの実験のための家のマウス;マウス標準マウス飼料を飼料と水を自由に提供する。
- マウスの調製：イソフルラン（2％）が導入室を利用して麻酔状態にマウスを導入する。
- ヘアトリマーを使用して腹部の毛を削除すると、その背中の上でマウスを置き、麻酔を保証するためにフェイスマスクで鼻と口をカバーしています。
- プロボ - ヨウ素と、普遍的に腹部を消毒、2サイクルで、80％エタノールが続く。
- 存在しないことを保証する麻酔の十分な深さを監視するために後肢をつまんで反射の。
- 腹部臓器を公開するには、2つのステップで白線に沿って皮膚と筋肉を分離する。
- 生理食塩水しっとり手袋で腸を置く。湿ったそれらを保つために、腸の周りに手袋を包む。
- 注意深く腹部大動脈天竺脂肪組織を離れてオフにします。任意の分岐血管を傷つけないように注意しながら、ダウンの分岐部に大動脈大動脈を公開します。
- まず、血液の流れをシャットダウンするには、近位に大動脈大動脈を顕微クランプを置く。今、大動脈分岐の隣に第2の遠位クランプを適用します。
- 血液の流れが中断されたときに、近位のクランプに近い大動脈に小さな切開を行います。
- 0.9％生理食塩水で湿らされたバルーンが先端に付いたカテーテルを挿入し、大動脈の遠位クランプに向かって前進する。
- 内皮損傷の場合は、ballooを膨張させることによって大動脈をはぎ取るN慎重にゆっくりと近位クランプの方向にカテーテルを引っ張って。
- 二回削剥演習を繰り返します。
- カテーテルを取り外し、10-0プロレンランニング縫合糸を使用して大動脈切開を閉じます。
- 慎重に遠位クランプを開きます。大動脈切開部位での出血の場合には、必要に応じて、再度、クランプを閉じ、出血を見つけて、追加の中断ステッチを配置。
- 出血が認められない場合は、ゆっくりと近位のクランプを開きます。
- 大動脈パルスが切開部から遠位側に見えるはずです。今腸その場で戻って配置することができる。
- 予め温め滅菌生理食塩水を用いた腹腔を洗浄します。
- 6-0プロレンランニング縫合糸を使用して、筋層で始まる腹壁を閉じます。
- 次の5-0プロレン実行、実行中の縫合糸の使用をして肌を適応させる。
- マウスがまだ麻酔している間、皮下麟蹄を経由して4〜5 mg / kgのカルプロフェンを適用ction。
- 疼痛コントロールのための飲料水（100ミリリットル当たり50ミリグラムメタミゾール）にメタミゾールを追加し、3日後に手術のために続けている。回復を通して動物を監視します。
注：このモデルの観察期間は28日間です。
2。アテローム性動脈硬化症モデル（B）
4週齢でマウス（在庫番号002052、B6.129P2-Apoetm1Unc / J）をした後、4〜6ヶ月間与え、アテローム性動脈硬化症のモデルでは、（ - / -アポ）アポリポタンパク質E欠損を購入。従来の条件の下で、これらの実験のための家のマウス;到着（ハーランラボラトリーズTD.88137）上にマウス高脂肪西洋食を供給し、4から6ヶ月の間、 水を自由に提供する。
- マウスの調製：
- アポフィード - / - 西洋食付きマウスは生後4週から始まる。食餌操作は、到着時に直接開始する必要があります。
- 実験期間を通して西洋食を維持している。</李>
3。分析
- 筋内膜増殖症モデル（A）
このモデルにおける関心領域」は、病変領域」である。分析のためのオプションは、管腔閉塞を含み、I / M比（内膜/中膜比）は、最大myointima厚さ、筋内膜面積、線維症トリクローム染色、および単核細胞のためのH＆E染色（ 図1A〜1Cに示されるように）。科学的な質問によると、コラーゲン、免疫組織化学、および共焦点のメソッドのピクロシリウスレッドのような他の多くの染色を適用することができる。 - アテローム性動脈硬化症モデル（B）
このモデルでの関心領域は、大動脈弁、大動脈弓だけでなく、下行大動脈である。分析のためのオプション：スーダンレッド脂質の染色や大動脈弁のトリクローム染色、大動脈弓と下行大動脈（ 図1（d）に示すように）。
このモデルはまた、他のような染色のさまざまなオプションをもたらす中性脂質については、例えばオイルレッドO、ピクロシリウスレッド、免疫組織化学、および共焦点方法。- スーダンレッド染色：新たに採取大動脈組織にスーダンレッド染色を行います。
- 収穫前にダイエット6Hを削除します。
- イソフルラン（2％）が導入室を利用して麻酔状態にマウスを導入する。麻酔の十分な深さを監視するために後肢をつまんで反射神経が存在しないことを保証する。
- 胸を開きます。心尖を切断し、大動脈を修正するために大動脈基部を通じて4％PFA（3ミリリットル）に続いて、最初に生理食塩水（3ml）で、左心室を経由して灌流する。
- その分岐ルートから大動脈を解放します。可能な限りの脂肪組織を除去するようにしてください。
- 心臓や大動脈根を切断し、組織学のために4％PFAに格納します。
- 組織学のために大動脈基部は、AORの切断を可能にするために慎重に直立位置にパラフィンブロック内に配置されなければならないすべての3弁膜チラシを表示TICルート生成スライド。
- 大動脈ツリーの一方の端をカットし、細かいピンとシリコーン層の上に固定します。縦に大動脈を開き、大動脈組織を修正。
- 50％エタノールを用いて組織を洗浄します。約15分間、スダンIII染色溶液で組織を浸す。
- 過剰スーダンIIIを除去するために50％エタノールで軽くすすいでください。 （注：50％エタノールへは、染料を洗うこと）をdH 2 Oですすぎ、そしてさらなる分析のために写真を撮る。
- スーダンレッド染色：新たに採取大動脈組織にスーダンレッド染色を行います。
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Representative Results
図1は、両方のモデルについて異なる分析オプションおよび誘導疾患状態を示している。内膜過形成モデルでは、トリクローム染色の代表断面の分析が示されている。これらの断面から、I / M比は、最大プラーク厚さが、内腔の最大内膜厚さ、パーセント管腔閉塞、ならびにプラーク面積のような結果を測定し、計算することができる。
アテローム性動脈硬化症モデルの結果を評価するために、上に挙げた全ての方法を用いることができる。また、腹部大動脈における定量的なプラーク領域において、大動脈弁、大動脈弓及び下行大動脈におけるプラーク形成の程度は、トリクローム染色によって測定することができる。
図1。裸マウスの大動脈をパラフィン包埋し、収穫し、そして代表的な断面をトリクローム染色（A）に示されている。 I / M比は、比（B）を算出したコンピュータ解析を使用して、膜および中膜厚さを測定することにより、トリクローム染色した切片上で計算される。最大プラークの厚さは、コンピュータ形態計測（B）によって内腔の最大内膜の厚さとして測定される。 （パーセント）管腔閉塞を100％を乗じ前者ルーメン、（C）で割っ前者腔から新しい内部ルーメンを減算することによって決定される。プラーク領域は、前者管腔（C）から新しい内部ルーメンを減算することによって評価される。下行大動脈は、親油性構造と縦方向に開き、スーダンレッドが（D）に示されているで染色した。定量的なプラーク面積、スーダンレッド染色病変だけでなく、総大動脈面積を決定するために、測定され、析している画像解析ソフトウェアを用いてゼット。大動脈弁のパラフィン包埋サンプルの断面は、大動脈弓、そしてクロームにおける下行大動脈は、（E）に示されている。前述したように、管腔閉塞、プラーク面積、および最大プラーク厚さが計算されます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
両疾患の患者で同様の症状を引き起こすが、プラーク発生の根本的なメカニズム、したがって、治療アプローチは、2非常に異なっている。動脈狭窄の様々な形態での患者の臨床所見だけでなく、プラークの開発期間は、基本的なメカニズムに依存しています。
患者の臨床所見に応じて、サンプル分析の異なる方法が5,15を実行する必要があります。これは、選択されたモデル14によって模倣されている疾患に特徴的な所見と分析を適応させることが必要である。逆に、研究されている疾患に応じて、最も可能かつ適切な動物モデルを選択すべきである。さらに、新薬が機構的にモデルと一致している必要があることが重要です。
この出版物で紹介両方のモデルは、迅速かつ簡単に実行するために、高度に再現可能である。いくつかのMAがありますモデル間のJOR違い。アテローム硬化性プラークの発達は、4〜6ヶ月必要としながら17、例えば、筋内膜過形成モデルにおける観察時間は、28日間16である。
もう一つの大きな違いは、異なるマウス系統への適用である。アテローム性動脈硬化症モデルでは、アポEに依存している - / - もしくはLDL - / - マウスにおいて、従って、この特定ノックアウトを保有するマウスで行うことができる。 - / - アポの両方を保有するマウスの作成に、別の目的のノックアウトすることは非常に時間がかかります。バルーン傷害の手術を誘導する筋内膜過形成は、任意のマウスで行うことができる。 - / - アテローム性動脈硬化モデルがアポを有するマウスに厳しい制限に直面しているが、興味のあるマウス系統を変更することがより多くの潜在的な筋内膜増殖症のモデルが得られます。
バルーン裸出の強度は、筋内膜過形成病変の結果のために重要である。カテーテル損傷はあまりにAGG実行される場合ressively、動脈瘤形成が発生することがあります。侵食があまりにも静かに行われた場合、プラークの開発は、群間の差を表示することが弱い可能性があります。一つの研究内の全ての手術が同じ人によって実行された場合は、この手順では、便利です。ワイヤーのような硬いまたは鋭い障害物の導入を必要とする他の技術に向けたバルーン傷害の利点は、柔軟性だけでなく、バルーンが先端に付いたカテーテルの膨張を経由して、バルーンの大きさや圧力を調整するためのオプションです。さらに、非膨張バルーンが先端に付いたカテーテルは、薄くても厚く、より剛性の裸出ツールと比較して比較的小さな切開を介して大動脈に挿入することができる。それは病変の重症度に大きな影響を与えることができるので、動脈硬化性プラーク形成のモデルの場合には、マウスの若い年齢で西洋食を供給開始することが重要です。両方の導入モデルで病変は雌雄マウスの両方で成長するので、性別はadapteすることができます実験の要件にD。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、技術支援のためにクリスティPahrmannに感謝します。 SSはドイツ学術振興（DFG）（SCHR992/3-2とSCHR992/4-2）から資金提供を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thyoglycollate Broth 3% | Fluka | 70157 | powder |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | 20% |
| Sudan III staining solution | Sigma Aldrich | S4131 | powder |
| mouse C57BL/6J | Jackson Laboratories | Stock # 0006664 | |
| mouse ApoE -/- | Jackson Laboratories | Stock #002052 | |
| Western Diet | Harlan Laboratories | TD.88137 | |
| hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Forene | Abbott | Isoflurane | |
| microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4 mm |
| clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| catheter | |||
| 10-0 prolene suture | Ethicon | 788G | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8709H | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Metacam 1.5 mg/ml | Boehringer Ingelheim | Metamizol |
References
- Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. Burden of cardiovascular disease in Canada. Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).
- ER, O. B., Ma, X., Simard, T., Pourdjabbar, A., Hibbert, B. Pathogenesis of neointima formation following vascular injury. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 11, 30-39 (2011).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 362, 801-809 (1993).
- Meng, X., Zhang, F., Valji, K., et al. Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury. J Vasc Interv Radiol. 22, 1193-1197 (2011).
- Deuse, T., Koyanagi, T., Erben, R. G., et al. Sustained inhibition of epsilon protein kinase C inhibits vascular restenosis after balloon injury and stenting. Circulation. 122, 170-178 (2010).
- Schrepfer, S., Deuse, T., Sultan, K. R., et al. Inhibition of restenosis development after mechanical injury: a new field of application for malononitrilamides. Cardiology. 108, 128-137 (2007).
- Tao, M., Mauro, C. R., Yu, P., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. Am J Pathol. 182, 277-287 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., et al. Human internal mammary artery (IMA) transplantation and stenting: a human model to study the development of in-stent restenosis. J Vis Exp. , 3663 (2012).
- Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods Mol Biol. , (2003).
- Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14, 133-1340 (1994).
- Zhang, Y., Li, L., You, J., Cao, J., Fu, X. Effect of 7-difluoromethyl-5, 4'-dimethoxygenistein on aorta atherosclerosis in hyperlipidemia ApoE(-/-) mice induced by a cholesterol-rich diet. Drug Des Devel Ther. 7, 233-242 (2013).
- Rudolph, T. K., Rudolph, V., Edreira, M. M., et al. Nitro-fatty acids reduce atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 938-9345 (2010).
- Rondelet, B., Kerbaul, F., Motte, S., et al. Bosentan for the prevention of overcirculation-induced experimental pulmonary arterial hypertension. Circulation. 107, 1329-1335 (2003).
- Zeibig, S., Li, Z., Wagner, S., et al. Effect of the oxLDL binding protein Fc-CD68 on plaque extension and vulnerability in atherosclerosis. Circ Res. 108, 695-703 (2011).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artificial organs. 15, 103-118 (1991).
- Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).
