Summary
Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.
Abstract
כאן אנו מציגים פרוטוקול המשמש להכנת דגימות cryo-TEM של נבגי ניז'ר אספרגילוס, אך אשר יכולים בקלות להיות מותאם עבור כל מספר של מיקרואורגניזמים או פתרונות. אנו עושים שימוש בתחנת cryo-העברה בנויה מותאם אישית וחדר הכנת cryo-SEM שונה 2. נבגי לקוחים מתרבות, לצלול, קפוא בחנקן נוזלי רפש ונצפו בcryo-SEM כדי לבחור אזור של עניין. Lamella דקה לאחר מכן הופקה באמצעות FIB, מחובר לרשת TEM ולאחר מכן דליל אלקטרוני שקיפות. הרשת מועברת לבעל cryo-TEM ולTEM ללימודים ברזולוציה גבוהה. בזכות כניסתה של טיפ nanomanipulator מקורר ותחנת cryo-העברה, פרוטוקול זה הוא עיבוד ישיר לטמפרטורת קירור של הכנת FIB בשימוש שגרתית של דגימות TEM. ככזה יש לו את היתרונות של צורך בכמות קטנה של שינויים במכשירים, הגדרות ונהלים קיימים; אני זהזה קל ליישום; יש לו מגוון רחב של יישומים, באופן עקרוני זהה להכנת מדגם cryo-TEM. מגבלה אחת היא שזה דורש טיפול מיומן של הדגימות בשלבים קריטיים, כדי למנוע או למזער את זיהומים.
Introduction
בפרוטוקול זה cryo-FIB/SEM משמש להפקת דגימות TEM מאזור מסוים של המדגם, זוהה בעבר עם דיוק גבוה על ידי ניתוח SEM. ניתוח מיקרוסקופית אלקטרונים (סריקה או העברת) של דגימות ביולוגיות הוא טכניקה שגרתית המשמשת למחקר ואבחון. SEM הוא די מהיר וקל להעסיק ולפרש, אבל מידע מתקבל רק ממדגם השטח ועם רזולוציה בטווח 1.5 ננומטר. יש TEM ברזולוציה גבוהה יותר, אך קשה יותר ליישום, ניתוח התמונה הוא פחות ישיר ואילו מידע בתפוצה רחבה מתקבל, דגימות צריכה להיות דלילה אלקטרוני שקיפות (פחות מ כ -500 עבה ננומטר). בעיה נוספת היא שדרישות הוואקום של אותם מכשירים נסבלות לעתים רחוקות על ידי דגימות המכילים מים. ברוב המקרים, דגימות ביולוגיות צריכים להיות קבועות או כימי (החלפת מים עם, למשל, פולימרים) או מיובש. בשני המקרים, שינויים משמעותייםמורפולוגיה ומבנה של הדגימה צפויה להופיע. הכנת Cryo TEM של דגימות התייבשות גורמת לשינויים כימיים מינימאליים והיא מייצרת דגימות קרובה ככל האפשר למצב הטבעי שלהם, במיוחד אם vitrification קרח מתקבלת 1-6.
FIB נעשה שימוש נרחב להכנת דגימות TEM ליתרונות הרבים שלה 7. עד כמה שם: השימוש ביונים עתירה אנרגיה בשכיחות כמעט נורמלית ממזער את השפעת השינויים בשערי כרסום ההפרש הקשורים לחומר; ניתן לבחור את האזור שחולץ מן המדגם בתפזורת עם דיוק תת מיקרון; כמות קטנה מאוד של חומר מופק. כמה התפתחויות טכניות האחרונות התאפשרו באמצעות FIB גם להכנת מדגם TEM בקירור 2,8-10. ישנם מספר יתרונות על פני שיטת ההכנה המסורתית של cryo-microtomy 11,12 משמש בעיקר לדגימות חומר רך, כגון חוסר העיוות מכאנית של lamella הפרוס,העדר סימני סכין והאפשרות להכנת דגימות מורכבות עם ממשקים קשים / רכים או רכיבים.
Protocol
הערה: כל הפרמטרים הניתנים בפרוטוקול זה תקפים למכשירים ודגמים שצוינו כאן. חלק מפרמטרים אלה (בסימן * בטקסט) עשויים להיות שונים אם יצרן או דגם אחר משמש.
1. Start-up של FIB / SEM
- הר nanomanipulator הקר שהותקן קצה (NM) מבלי לצרף צמות Cu לanticontaminator (AC). במקום לוודא הצמות מחוברות לשאר NM מעל נקודת הבידוד כדי למנוע פריצה במהלך שלב החידוד (1.2).
- סגור את תא SEM, משאבת ואקום גבוה ותמונת טיפ NM.
- אם הקצה הוא בוטה, מעוקם או שזוהם על ידי שימוש קודם, לחדד אותו באמצעות אלומת היונים: בחר דפוסי טחינת מצולעים לאורך הצדדים של הקצה, כך שלאחר טחינה, טיפ להתחדד עד 1 מיקרומטר או פחות.
- ברגע שהצדדים של הקצה כבר הסתובבו משם, לסובב באופן ידני על ידי 90 ° כל מוט NMמחוץ לחדר SEM.
- התאם את דפוסי טחינת המצולעים להסתגל לקצה המסובב וחוזרים על טחינה מזווית שונה.
- ברגע שהקצה כבר חידד להיות פחות מ 1 מיקרומטר, לחזור בי NM ולהכניס את המחט של מערכת הזרקת גז (GIS); למקם מחדש את המחט להיות בסביבות 1 מ"מ מעל מרחק העבודה (במקום מיקרומטר 175 כרגיל).
- אם באמצעות מבשר Pt, לשנות את טמפרטורת ההפעלה שלה ל-C ° 24-26 (במקום הרגילה 40 מעלות צלזיוס). צעדים אלה נדרשים לcryo-תצהיר 13 של Pt.
- פתח את תא SEM ולהכין FIB / SEM לcryo-מצב על ידי ההרכבה מדגם הבמה cryo וAC.
- לעבור NM לתפקיד המוכנס ולהתחבר צמות Cu לAC. הקפד שלא לגעת בקצה NM בטעות. המערכת מקוררת עם NM הוכנס לוודא כי אובדן הגמישות של צמת Cu בקירור לא לעכב את מהלך NMment.
- לטהר את הצינורות לקירור עם גז חנקן יבש במשך כמה דקות.
- לשאוב את חדר הכנת cryo וקאמרי המדגם העיקרי לואקום גבוה.
- להוסיף חנקן נוזלי לDewars כדי לקרר שני החדרים. חכה עד שתגיע לטמפרטורה הרצויה.
2. מקפיא לדוגמא
- הר שתי רשתות TEM עבור דגימות FIB על בעל העברת SEM. לאבטח אותם על ידי הידוק הברגים המתאימים עם מברג.
- הר מדגם מתאים בדל לדגימה ולהוסיף חלק של הדגימה. בהתאם לסוג של מדגם, ניתן לתקן את הדגימה עם דבק קריוגני או עם מהדק. להשתמש בכמויות קטנות ככל האפשר, כדי להבטיח הקפאה אופטימלית.
- הר את בעל העברת SEM על מכשיר העברת ואקום (VTD).
- להוסיף חנקן נוזלי לתוך תחנת slushing ולשאוב למטה כדי לקבל רפש חנקן.
- פתח את slתחנת ushing ולצלול להקפיא את בעל העברת SEM. לשאוב שוב עד הרתיחה הושלמה ורפש מתקבל שוב. יצוין, כי אתאן או רפש פרופאן או בהקפאה בלחץ גבוה טכניקות מתאימות יותר כדי להשיג vitrification של המדגם.
- לחזור בו בעל העברת SEM לתוך תא הוואקום של VTD ולאטום אותו.
- Vent תחנת slushing ומנעל אוויר חדר הכנת cryo.
- התאם את חותם VTD עם מנעל האוויר של חדר הכנת cryo ומשאבה.
- כשהוא הגיע לרמת ואקום טובה, לעסוק סיכת מנעל האוויר כדי לפתוח את החותם של VTD ומנעל האוויר החיצוני; להכניס את בעל העברת SEM. יש סימונים על קשר הזזה בתאי ההכנה המציינים את המיקום לדוגמה עבור המקרטעת ושבירה.
- במידת צורך, המדגם ניתן: שבר עם הסכין הקר; סובלימציה על ידי הגדרת טמפרטורה גבוהה יותר (בדרך כלל -1006; ג); מצופה בAu / Pd או Pt באמצעות sputterer הקר (300 V, 10 mA, 60 שניות לכובע Au / PD 2-3 ננומטר) *. העידון לא אמור לשמש עבור דגימות המזוגגות, כדי למנוע הגיבוש מחדש שלהם.
- השתמש בסכין הקר כדי לפתוח את מכסי המגן של חריצי רשת TEM.
- להביא את השלב הקר בחדר המדגם לגובה הקולט (16 * מ"מ).
- כבה את HT בFIB / SEM ולפתוח את מנעל האוויר הפנימי.
- השתמש VTD להעביר את בעל SEM לתוך תא המדגם. עמעום התאורה בחדר יכול לעזור בשלב זה.
- ברגע שבעל SEM הוא בשלב הקר, להתנתק VTD על ידי לחיצה וסיבוב.
- לחזור בו מוט VTD כל הדרך אל תא ואקום VTD ולסגור את מנעל האוויר הפנימי, מנעל האוויר החיצוני ואת חותם VTD. מנעל האוויר החיצוני כעת ניתן פרקו כדי להסיר את חותם VTD. השלב אחרון זה לא נדרש, אבל זה מומלץ כמוט VTD ניתן משתחרר ממקומם בקלות בטעות, שעלול לגרום לניזקלVTD או מנעל האוויר.
3. כרסום יון
- הפעל את המתח הגבוה בשני העמודות ולהגדיר את הפרמטרים המתאימים הדמיה (מתח מאיץ: 10 קילו וולט עבור קרן האלקטרונים, 30 קילו וולט עבור אלומת היונים; גודל נקודה: 3; מרחק עבודה: 5 מ"מ, אלומת יונים נוכחית: 10-100 הרשות הפלסטינית עבור הדמיה, 1-3 Na עבור טחינה) *.
- השתמש בקרן האלקטרונים למצוא תכונה של עניין ולרכוש תמונות על מנת לתעד את המצב של המדגם לפני החילוץ של lamella.
- ברגע שאזור של עניין (ROI) להפקה זוהה, לסמן אותו על ידי דפוסים אלומת יונים, אלא אם כן את הטופוגרפיה של המדגם עצמו מאפשרת זיהוי קל של ההחזר על ההשקעה גם לאחר תצהיר Pt. לדיוק מוגבר, השתמש בשיטה שתוארה על ידי Pettersson et al. 14 הסימונים צריכים להיות עמוקים, רחבים ומספיק רחוק כדי להיות עדיין גלוי לאחר שמכוסה על ידי בתצהיר cryo-PT (שהוא אינו selective ויכסה כמה מ"מ 2 של מדגם השטח).
- מחממים את הגז מבשר על 24-26 מעלות צלזיוס ולהכניס את מחט GIS לגובה של כ 1 מ"מ מעל פני השטח המדגם (ראה גם צעד 1.3).
- בעוד הדמיה עם קרן האלקטרונים, לפתוח את שסתום הגז לכמה שניות. שיעור בתצהיר cryo-Pt הוא 100-500 ננומטר / שנייה או יותר, בהתאם למרחק של המערכת של המשתמש מחט GIS, החספוס והמדגם. מומלץ להפעיל כמה תצהירי בדיקה כדי לקבוע את הפרמטרים אופטימליים.
- בתצהיר cryo-Pt הגלם הוא מאוד מחוספס והומוגניות. לרפא את ההפקדה על את ההחזר על ההשקעה על ידי שימוש בקרן יונים 1,000 הרשות הפלסטינית בהגדלה נמוכה (לדוגמא 2,000 X). שלא כמו בתצהיר cryo, ריפוי זו הוא אתר סלקטיבית ויש לבצעו בהחזר על ההשקעה בלבד. מטרת cryo-בתצהיר הראשון היא להגן על פני השטח של המדגם מנזק אלומת יונים ולהפחית מסוך בדילול יון 13.
- הטה את המדגם כדי52 ° כך את פני השטח הוא בניצב לאלומת היונים. מיל משם שתי תעלות מדורגות בכל צד של ההחזר על ההשקעה. ממדים אופייניים לתעלות הם 20-30 מיקרומטר בכיוון המקביל (X) לlamella להיעקר, 10-15 מיקרומטר בכיוון הניצב (Y) ועם משתנה, משופע עומק (Z), עם הנקודה העמוקה ביותר לסגור להחזר על ההשקעה. השיפוע צריך להיות 45-55 °. בחלק מהמכשירים, יכולות להיות הסתובבו תעלות מדורגות רק עם הנקודה העמוקה ביותר על העליונה. במקרה כזה, טחנה אחת מתחת להחזר על ההשקעה, ואז לסובב את התמונה 180 ° וטחנה השני אחת בצד השני. העומק של טחינה ניתן לבחור אם שיעור גמגום של החומר ידוע. עבור רוב המדגם קפוא התייבשות, שיעור גמגום של קרח יכול לשמש 7.
- הטה את הדגימה חזרה ל0 ° ולהשתמש באלומת היונים לחתוך את הצדדים ותחתונים של lamella, כדי לוודא שסימני החיתוך לעבור את כל lamella (הם צריכים להשאיר סימני כרסום על טחנת מדרונות המדורגיםאד בשלב הקודם). השאר רק שני גשרים קטנים המחברים את lamella לשאר המדגם.
- הכנס את מחט GIS (עשוי מעט להעביר את הדגימה). לתמרן את NM עד קצהו הוא במגע פיזי עם אמילה, רצוי בצד. ודא NM לא חוסם את הנוף לאלומת יונים של שני גשרים המחברים קטנים.
- פתח את שסתום GIS לכמה שניות ולפקח על תצהיר cryo על ידי הדמיה רציפה עם קרן האלקטרונים.
- כאשר שכבת 1-2 מיקרומטר נוספת של Pt כבר הופקד cryo, לסגור את הברז.
- לרפא את Pt (ראה שלב 2.6) רק בכמה מיקרומטר סביב הנקודה שבה NM הוא במגע עם lamella.
- השתמש נוכחית אלומת יונים גבוהה לחתוך lamella בחינם. צריכים להיות הסתובבו שני גשרים המחברים משם, וכן כל עודף של Pt שאולי נוצר נקודות מגע חדשות בין lamella ושאר המדגם. לא חוזר בי מחט GIS עדיין.
- מנמיכים את שלב המדגם כמה מ"מ ולהזיז אותו עד שאחד מרשתות TEM הוא בתצוגה. הזזת אזור העיקול על הרשת למצב העבודה ולהכניס את מחט GIS.
- לתמרן בזהירות את NM להביא lamella המצורפת במגע פיזי עם אזור העיקול על רשת TEM. לא צריך להיות שום לחץ או מתח שבין lamella, רשת TEM וNM.
- פתח את ברז הגז לכמה שניות וcryo-הפקדת שכבת 1-2 מיקרומטר נוספת של Pt.
- לרפא את Pt (ראה שלב 2.6) רק בכמה מיקרומטר סביב נקודת המגע בין lamella ורשת TEM.
- השתמש נוכחית אלומת יונים גבוהה לחתוך lamella חופשית של NM. ניתן להשיג זאת על ידי כרסום משם גם את קצה NM או בצד של המדגם. בtהוא המקרה ראשון, הקצה יהיה חייב להיות חידד שוב לפני השימוש הבא, כפי שמתואר בשלב 1.2.
- אופציונלי: בשלב זה ניתן להשתמש בVTD לקחת את בעל העברת SEM ולאחסן אותו O / N בדיואר מלא בחנקן נוזלי. העברה זו ואחסון O / N הוא עלולה לגרום להיווצרות קרח על פני השטח של גבישי קרח lamella אם כבר בהווה ו / או אם החנקן הנוזלי חשוף לאוויר לח; אך זיהום כאלה יוסר על ידי הצעד הבא בזמן קצר יחסית. כמו השלבים הקודמים אולי לקחו כמה שעות כדי להשלים, זה יכול להיות מתאים לעשות זאת, שכן לאחר השלב הבא O אחסון כגון / N לא מומלץ, כפי שלא יהיה שום דרך כדי להסיר את זיהום הקרח אלא בסובלימציה (אשר לא ניתן לבצע אם vitrification של המדגם היא להישמר).
- הטה את המדגם כדי 52 ° ולהשתמש באלומת היונים כדי לדלל אותו לאלקטרוני שקיפות 7. מומלץ להתחיל עם גבוה יותר, rougזרמיה קורה כדי להסיר את כמויות גדולות ולהמשיך לקנוס ליטוש המשטח עם זרמי קורה תחתון, סופו של דבר גם לצמצם את המתח המאיץ. העובי הסופי של lamella צריך להיות 100-200 ננומטר או פחות לניתוח ultrastructure בkV TEM 100-200 או עד 500 ננומטר עבור טומוגרפיה בkV TEM 300, תלוי בהרכב המדגם. במהלך דילול, הלחצים הפנימיים של המדגם עלולים לגרום lamella להתכרבל או עיקול. במקרה כזה, צריך להיות מוגבל לאזור דליל. זה קרה למשל בדמויות 11 ו12.
4. העברת Cryo לTEM
- לשטוף את תחנת cryo-העברה עם גז חנקן יבש במשך כמה דקות.
- להוסיף חנקן נוזלי לדיואר של AC TEM ולתחנת cryo-ההעברה.
- הכנס את בעל TEM cryo-העברה בחריץ המתאים של תחנת cryo-ההעברה ותמלא דיואר גם כן. חכה עד שכל component הגיע לטמפרטורה הרצויה (כ -15 דקות). במידת האפשר, את הבקר של בעל TEM cryo-העברה צריך להיות מחובר כדי לפקח על הטמפרטורה במהלך ההעברה. זה חשוב להבין כי קצו של בעל TEM (שבו חיישן הטמפרטורה ממוקם) יהיה במגע עם תחנת cryo-ההעברה ולכן להתקרר במהירות רבה יותר מאשר שאר בעל TEM. לכן, מומלץ שהזמן דרוש לכל בעל TEM cryo-ההעברה להתקרר נמדד לפני כן, וכי המערכת היא לאפשר thermalize לפחות את הסכום הזה של זמן.
- מלא כוס קריוגני עם חנקן נוזלי וטובל בו: כלי הידוק מדגם TEM, מברג ופינצטה, כדי לצנן את הטיפים שלהם לטמפרטורה הרצויה. כל הכלים צריכים להיות מבודדים כראוי בצד השני כדי שלא לגרום לכוויות קור לכף ידו של המפעיל.
- התאם את VTD למנעל האוויר החיצוני. להביא את האייל הקרדואר לגובה ההעברה (16 * מ"מ). כבה את המתח הגבוה.
- פתח את חותם VTD, מנעל האוויר החיצוני ומנעל האוויר הפנימי.
- השתמש במוט VTD לנעול לתוך מחזיק העברת SEM על ידי לחיצה וסיבוב בכיוון השעון.
- לחזור בו בעל העברת SEM לתוך תא הכנת cryo.
- השתמש בסכין הקר כדי לסגור את מכסי המגן של רשתות TEM. זה הכרחי כדי להפחית את זיהום קרח אפשרי במהלך העברה.
- השתמש במוט VTD להעביר את הדגימה לתוך תא הוואקום של VTD.
- סגור את מנעל האוויר וחותם.
- Vent מנעל האוויר החיצוני ולנתק VTD. התאם את VTD לנמל SEM של תחנת cryo-ההעברה. בעוד שטיפה עם חנקן יבש, השתמש בסיכה בתחנה כדי לפתוח את החותם של VTD והחלק את בעל העברת SEM לתוך דיואר של תחנת cryo-ההעברה.
- להוסיף חנקן נוזלי מספיק כך שהרמה בתחנת cryo-ההעברה גבוהה מספיקרק כדי להטביע את המדגם.
- השתמש במברג מקורר בעבר כדי לפתוח אחד מהמכסים ולשחרר את הבורג המתאים שהוא שמירה על רשת TEM במקום.
- השתמש בפינצטה מקוררת בעבר לבחור את רשת TEM ולמקם אותו לתוך מחזיק TEM.
- השתמש hexring מקורר להדק את רשת TEM על בעל TEM.
- סגור את התריס של בעל TEM cryo-העברה. צעד העברת הדגימה הוא קריטי ויכול להיות הקשו על ידי גז חנקן הקטנת הנראות של מדגם TEM הקטן.
- נתק את תחנת cryo-ההעברה ממערכת השאיבה ולהעביר אותה ליד TEM, יחד עם הבקר דוד של בעל TEM cryo-העברה.
- הפעל את משאבת turbomolecular של TEM לשאוב את קו הגיבוי למנעל אוויר TEM.
- להגדיר את הבמה מדגם TEM ל* הטיה של -70 °.
- קבע את זמן השאיבה הקצר ביותר למנעל האוויר (30-60 שניות), כאשר רק מחזור אחד של מחיקת עם גז חנקן יבש.
- להבטיח כי התריס מגן על בעל TEM cryo-ההעברה הוא סגור. הסר את בעל TEM מתחנת cryo-ההעברה ולהכניס אותו לתוך goniometer המוטה (חנקן נוזלי יישפך מתוך דיואר בעל TEM). מחזור השאיבה יתחיל. ברגע שהמחזור יושלם, להגדיר את goniometer להטות חזרה ל0 °, ובו בזמן, להחזיק את בעל TEM, כך שהוא אינו מסתובב עם goniometer. הכנס אותו באופן מלא בתוך TEM. במהלך שלב זה, בעל TEM cryo-ההעברה צריך להיות מחובר לבקר דוד שלה כדי לפקח על הטמפרטורה. ההליך להכניס את בעל המדגם לTEM עשוי להשתנות בין TEMs שונה. לכן מומלץ לפנות ליצרן TEM להשיג בהליך המתאים.
- למלא את דיואר בעל TEM cryo-ההעברה. חכה לוואקום בTEM להגיע לרמה מתקבלת על הדעת.
Representative Results
בעבודה זו עשינו שימוש ב: הקורה כפול FIB / SEM מצויד בnanomanipulator וקאמרי cryo-הכנה; TEM עם בעל cryo-העברה; תחנת cryo-העברת אב טיפוס. Anticontaminator (AC) להבים של חדר cryo-ההכנה וקצה nanomanipulator (NM) שונו על ידי Gatan. עם כל כבוד לקאמרי cryo-הכנה סטנדרטית, להבי AC גדולים יותר כדי לספק גוף קירור גדול יותר לקצה NM. יתר על כן, AC מצויד במהדק לחיבור צמות Cu להחלפת חום עם קצה NM. הפנאומטיקה של FIB / SEM שונו כדי לאפשר NM להיות ולהישאר גם כאשר הוכנסה לתא המדגם פרקה. יש לציין כי הפרמטרים המשמשים בעבודה זו מתאימים ביותר לציוד המפורט לעיל; פרמטרים אלה עלולים צריכים להיות מותאמים בעבודה עם סוגים אחרים של ציוד. כדי לעבוד עם פרוטוקול זה, אמצעי הזהירות הרגילה לטיפול בנושא הקפאה, מערכות חנקן וואקום נוזל צריכהלהיות אחריו.
השיטה נבדקה על סוגים שונים של דגימות עם תוצאות טובות, החל מפתרונות או מטריצות פולימר המכילות חלקיקים, לאורגניזם חד תאי לנמטודות. דוגמאות לשלבים השונים של ההליך באים לידי ביטוי בדמויות 1-12 בא נבגי ניז'ר מוכתמים בtetroxide אוסמיום וpermanganate אשלגן. הנבגים הם צילמו לראשונה על ידי SEM (איור 1) לזהות את האתר להפקה. במקרה זה, חתך של כל נבג היה מספיק, אבל זה אפשרי למקם את ההחזר על ההשקעה עבור חילוץ עם דיוק תת מיקרומטר, למשל, פורס תא מסוים במרחק מסוים מקרום התא. ברגע שהתכונה של עניין זוהתה, הצעד הראשון של תצהיר cryo-Pt מיושם (איור 2), כדי להגן על המדגם מנזק קורה מכרסום יון. המדגם מוטה ל52 ° להמשיך עם o הצעדים הראשוניםו הטחינה (איור 3): המקרטעת של שתי תעלות משני צידי lamella. המדגם מוטה לאחור ולאחר מכן עוד הסתובב לעזוב רק שני גשרים קטנים המחברים אותו לתפוצה הרחבה (איור 4). Nanomanipulator מקורר הוא הביא במגע עם אמילה (איור 5) ועוד cryo-תצהיר של Pt חיילים אותם יחד (איור 6). אז גשרי חיבור הקטנים הם הסתובבו שם וNM נע lamella בסמוך לאזור החיבור של רשת TEM (איור 7), שבו הוא מולחם עם cryo-תצהיר סופי של Pt (איור 8). NM מכן הופרד מlamella (איור 9), שהוא דלל את אלקטרוני שקיפות עם אלומת היונים (איור 10 ו11). Lamella לבסוף הועברה לTEM (איור 12) שבו הדמיה ברזולוציה גבוהה, ספקטרוסקופיה, טומוגרפיה וטכניקות אחרות can להיות מועסק.
איור 1. תמונת Cryo-SEM של נבגים של א ' ניז'ר, לפני תצהיר Pt.
איור 2. אותו האזור באיור 1 לאחר בתצהיר Pt אבל לפני הריפוי.
איור 3. תמונת Cryo-SEM של אותו האזור באיור 2, מוטה 52 º, לאחר בתצהיר Pt וריפוי, עם טחינת תעלה לדרך(ראה שלב 3.7).
איור 4. Lamella, מוכנה לעילוי-out.
איור 5. קצה nanomanipulator הקר יוצר קשר עם lamella.
איור 6. Cryo-תצהיר Pt שני משמש לרתך יחד nanomanipulator וlamella.
איור 7. Nanomanipulator הקר משמש להעברת lamella לאזור החיבור של רשת TEM.
איור 8. קריו בתצהיר משמש פעם נוספת לצרף lamella לרשת TEM.
איור 9. Lamella נחתך ללא nanomanipulator והוא מוכן כעת לאו אחסון או דילול אלקטרוני שקיפות.
= "תמיד"> בתוך עמודים 
איור 10. שלב ביניים של הדילול, עם כמה נבגים נראים בחתך.
איור 11 תמונת Cryo-SEM של המדגם לאחר דילול סופי.; רוב הנבגים האחרים היה צריכים להיות הסתובבו משם כי lamella התחילה להתנפח.
איור 12. תמונת cryo-TEM מורכב של lamella. חלק מבדל אל נכללבlamella (החץ שחור).
Discussion
פרוטוקול זה הוא הסתגלות ולא פשוטה לקירור של הכנת מדגם FIB / TEM הסטנדרטי המשמשת במדעי חומר ב RT. השיטה מייצרת דגימות TEM ללא עיוות מכאנית וסימני סכין (החסרון העיקרי של microtomy), אם כי מסוך עלול להתרחש אם מדגם השטח הוא הומוגניות. זה יכול להיות מופחת על ידי cryo-תצהיר של שכבת מכסת (בעבודה זו Pt היה בשימוש), נרפאה עד שהוא חלק וייחוד 13. ניתן להכין דוגמאות עם רכיבים של קשיות שונות מאוד, כמו גם ללא הסיכון שהם יישברו תחת לחץ במהלך הכנה. לחצים פנימיים עדיין עשויים לגרום lamella הדק לכופף או תלתל, ובמקרה זה בגודל של הסעיף צריך להיות מופחת. חסרון בהשוואה לשיטה אחרת הוא האפשרות לשנות את המבנה הביולוגי עקב חשיפה לאלומת היונים והשתלה אפשרית של היונים במדגם. חסרונות אלה להתרחש גם ב RT עבור prepar המדגםation במדע חומרים 15. הם יכולים להיות מופחתים על ידי מילוי הדליל בצעד ליטוש סופי במתח המאיץ הנמוך ביותר ליונים (500-1,000 V). צעד ליטוש עדין מאוד זה יהיה להסיר את השכבה הפגועה מlamella.
בשל אופייה של cryo-בתצהיר (שלבים 3.5, 3.10 ו3.13), חלקים גדולים של המדגם יהיו מכוסים, ובכך חוסמים את הנוף של פני השטח המקוריים. זה עשוי להקשות כדי לעקוב אחר ההחזר על ההשקעה, אלא אם כן סימונים מרובים נמצאים בשימוש כפי שהוצעו בשלב 3.3.
במהלך שלבים 4.5 ו4.7 סיכוני lamella דקים שבאו במגע עם אוויר. זו יש להימנע כפי שהוא עלול לגרום ללחות באוויר בצורת גבישי קרח על פני השטח של המדגם, אולי עד כדי טשטוש תכונות חשובות. עליך לבצע פעולות אלה מהר ככל האפשר, אבל באותו הזמן טיפולו הכושל במהלך ההעברה עלול לגרום לאובדן של המדגם זהעצמי. מומלץ שהמשתמש נוקט צעדים אלה באמצעות רשתות TEM ריקות לפני ניסיון על מדגם אמיתי הוא עשה.
במדעי חומר, מכשיר FIB הפך את השיטה הראשית של הכנת מדגם TEM בתוך עשור של המסחור שלה. שכן הוא יכול לשמש כמעט על כל דגימה, הוא מסיר את הצורך להתאים את טכניקת ההכנה לסוג של מדגם. אנו מאמינים באותו יכול לקרות בקירור, הודות להליך המפורט כאן. היישום שלה לדגימות גדולות יותר הוא עדיין כפוף ליכולת Cryo-לשמר אותם במצב מזוגג, אבל טכניקות כגון צניחה-הקפאה או בלחץ גבוה הקפאת 3,5 יכולות להוכיח להיות הפתרון האופטימלי לבעיה זו.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה זכה לתמיכה מפרויקט QNano http://www.qnano-ri.eu שממומן על ידי תשתיות המחקר של הקהילה האירופית במסגרת תכנית FP7 נפחים (מענק מס 'אינפרא 2010-262,163).
אנו מודים גם למועצת המחקר Formas לתמיכה כספית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strata DB 235 | FEI | FIB/SEM | |
| Omniprobe 100 | Oxford Instruments | Nanomanipulator | |
| Alto 2500 | Gatan | Cryo preparation chamber | |
| Cryo-holder model 626 | Gatan | Cryo transfer TEM holder | |
| Tecnai F30 | FEI | TEM |
References
- Echlin, P. Low Temperature Microscopy and Analysis. , Plenum Press. New York. (1992).
- Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. J. Struct. Biol. 180, 572 (2012).
- Studer, D., et al. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, 285 (2001).
- Umrath, W. Cooling bath for rapid freezing in electron microscopy. J. Microsc. 101, 103 (1974).
- Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212, 34 (2003).
- Elder, H. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Cryo fixation. Techniques in Immunocytochemistry. , Academic Press. London. (1989).
- Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. Introduction to Focused Ion Beams. , Springer. New York. (2005).
- Marko, M., et al. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryoelectron microscopy. Nat. Methods. 4, 215 (2007).
- Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J. Struct. Biol. 172, 180 (2010).
- Rigort, A. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. J. Struct. Biol. 109, 4449-44 (2012).
- Hsieh, C., et al. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. J. Struct. Biol. 153, 1 (2006).
- McDowall, A. W., et al. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. J. Microsc. 131, 1 (1983).
- Hayles, M. F., et al. A technique for improved focused ion beam milling of cryo-prepared life science specimens. J. Microsc. 226, 263 (2007).
- Pettersson, H., et al. A method for producing site-specific TEM specimens from low contrast materials with nanometer precision. Microsc. Microanal. 19 (1), 73 (2013).
- Wätjen, J. T., et al. Cu out-diffusion in kesterites—A transmission electron microscopy specimen preparation artifact. Appl. Phys. Lett. Appl. Phys. Lett, 051902 (2013).
