Cryo-elektron mikroskopi prøven forberedelse ved hjelp av en Focused Ion Beam

Summary

Cryo elektronmikroskop, enten Scanning (SEM) eller Transmission (TEM), er mye brukt for karakterisering av biologiske prøver eller andre materialer med høyt vanninnhold ^en. En SEM / Fokusert Ion Beam (FIB) brukes til å identifisere funksjoner av interesse i prøver og trekke en tynn, elektron-transparent lamell for overføring til en Cryo-TEM.

Abstract

Her presenterer vi en protokoll som brukes til å forberede Cryo-TEM prøver av Aspergillus niger sporer, men som lett kan tilpasses for en rekke mikroorganismer eller løsninger. Vi gjør bruk av en tilpasset bygget cryo-overføring stasjon og en modifisert cryo-SEM forberedelse kammeret ^to. Sporene er tatt fra en kultur, stupe-frosset i flytende nitrogen slaps og observert i Cryo-SEM for å velge et område av interesse. En tynn lamell blir deretter ekstrahert ved bruk av FIB, festet til en TEM nettet og deretter tynnet til elektron gjennomsiktighet. Gitteret blir overført til et cryo-TEM holderen og inn i en TEM med høy oppløsning for studier. Takket være innføringen av en avkjølt nanomanipulator tips og en Cryo-overføring stasjon, er denne protokollen en enkel tilpasning til kryogen temperaturen på rutinemessig brukt FIB utarbeidelse av TEM prøver. Som sådan har fordelene av å kreve en liten mengde modifiseringer av eksisterende instrumenter, oppsett og fremgangsmåter; det jegs lett å gjennomføre; det har et bredt spekter av applikasjoner, i prinsippet den samme som for cryo-TEM prøvepreparering. En begrensning er at det krever mer smidig håndtering av prøvestykkene på kritiske trinn for å unngå eller minimere forurensninger.

Introduction

I denne protokoll et cryo-FIB/SEM brukes til å produsere TEM-prøver fra et bestemt område av prøven, tidligere identifisert med høy presisjon ved SEM-analyse. Elektronmikroskopi (skanning eller overføring) analyse av biologiske prøver er en rutine teknikk som brukes til forskning og diagnostikk. SEM er ganske rask og enkel å bruke og tolke, men informasjonen er innhentet kun fra prøven overflaten og med en oppløsning på 1,5 nm. TEM har en høyere oppløsning, men er vanskeligere å gjennomføre, er bildeanalyse mindre enkel og mens bulkinformasjon blir oppnådd, ble prøver må tynnes til elektron transparens (mindre enn omtrent 500 nm tykt). Et ytterligere problem er at vakuum kravene disse instrumenter er sjelden tolerert av prøver av vanninneholdende. I de fleste tilfeller biologiske prøver må enten kjemisk fast (erstatte vann med for eksempel polymerer) eller tørket. I begge tilfeller, betydelige endringer imorfologi og struktur av prøven sannsynligvis vil forekomme. Cryo TEM utarbeidelse av hydrerte prøver induserer minimal kjemiske endringer, og det produserer prøver så nært som mulig til deres opprinnelige tilstand, spesielt hvis Vitrifisering av is oppnås ^1-6.

FIB er mye brukt til å forberede TEM prøver for sine mange fordeler ^syv. For å nevne noen: bruk av høy-energi ioner på nær-normal forekomst minimerer effekten av materialrelatert differensialfrese priser; regionen ekstraheres fra bulkprøve kan velges med en sub-mikron presisjon; en meget liten mengde av materiale som er utvunnet. Noen nyere tekniske utviklingen har gjort mulig ved hjelp av FIB også for TEM prøven ved kryogene temperaturer ^2,8-10 forberedelse. Det er flere fordeler i forhold til den tradisjonelle fremstillingsmetode for kryo-skjæringen ^11,12 brukt hovedsakelig for myk substans prøver, slik som mangel på mekanisk deformasjon av skiver lamella,fravær av knivmerker, og muligheten for å forberede sammensatte prøver med harde / myk grensesnitt eller komponenter.

Protocol

MERK: alle parametere gitt i denne protokollen gjelder for instrumentene og modeller som er angitt her. Noen av disse parametre (som er merket med * i teksten) kan være forskjellig hvis en annen produsent og modell blir brukt.

En. Oppstart av FIB / SEM

1. Monter spesialbygd kald nanomanipulator (NM) tips uten å legge Cu flettene til anticontaminator (AC). I stedet være sikker flettene er koblet til resten av NM over isolasjonen punktet for å forhindre at lade opp i løpet av slipe trinn (1.2).
   1. Lukk SEM kammer, pumpe til høyt vakuum og bilde på NM tips.
   2. Dersom spissen er butt, bøyd eller forurenset av tidligere bruk, skjerpe den ved hjelp av ione-stråle: velg polygonale fresemønster langs sidene av tuppen, slik at etter fresing, vil spissen avta ned til 1 mikrometer eller mindre.
   3. Når sidene av spissen er blitt frest bort, manuelt rotere 90 ° i hele NM tangenfra utsiden av SEM-kammeret.
   4. Juster polygonale frese mønstre for å tilpasse seg den roterte tips og gjenta fresing fra en annen vinkel.
2. Når spissen er blitt skjerpet for å være mindre enn 1 mikrometer, trekke NM og stikk nålen i Gas Injection System (GIS); reposisjonere nålen for å være på omtrent 1 mm over arbeidsavstanden (i stedet for den vanlige 175 mikrometer).
3. Ved å bruke en Pt-forløper, endre driftstemperaturen til 24-26 ° C (i stedet for den vanlige 40 ° C). Denne fremgangsmåten er nødvendig for kryo-avsetning ¹³ av Pt.
4. Åpne SEM kammer og forberede FIB / SEM for Cryo-modus ved å montere cryo prøven scenen og AC.
5. Slå NM til den innsatte posisjon og koble sine Cu flettene til AC. Sørg for å ikke borti den NM tips. Systemet er avkjølt med NM satt inn for å sørge for at tapet av fleksibilitet av Cu flette ved kryogene temperaturer ikke vil hemme NM fartenment.
6. Purge rørene for kjøling med tørr nitrogengass i noen få minutter.
7. Pump cryo preparatet kammeret og hovedprøvekammeret til høyt vakuum.
8. Til flytende nitrogen til Dewars å kjøle begge kamre. Vent til den ønskede temperatur er nådd.

2. Sample Frysing

1. 1. Monter to TEM nett for FIB prøver på SEM overføring holderen. Sikre dem ved å stramme de tilsvarende skruene med en skrutrekker.
   2. Monter en prøve stub egnet for prøven og legge til en del av prøven. Avhengig av typen av prøven, kan prøven bli løst med kryogen lim eller med en klemme. Bruk mengder så små som mulig for å sikre en optimal frysepunktet.
   3. Monter SEM overføringsholderen på vakuumoverføringsanordningen (VTD).
2. 1. Til flytende nitrogen inn i oppslåing stasjonen og pumpe ned for å skaffe nitrogen-sørpe.
   2. Åpne slushing stasjonen og stupe-fryse SEM overføring holderen. Pumpe ned igjen før koking er fullført og slaps oppnås igjen. Det bør bemerkes at en av etan eller propan slush eller høytrykks frysing er bedre egnet teknikk for å oppnå en forglassing av prøven.
3. 1. Trekk SEM overføring holderen inn i vakuumkammeret til VTD og forsegle det.
   2. Luft oppslåing stasjonen og cryo forberedelse kammeret luftslusen.
   3. Matche VTD tetning med luftslusen av cryo forberedelse kammer og pumpe.
   4. Når en god vakuumnivå er nådd, engasjere luftslusen pin for å åpne forseglingen av VTD og den ytre luftslusen; Sett SEM overføring holderen. Det er markeringer på skyve kontakter i forberedelse kamre indikerer prøven posisjon for sputtering og oppsprekking.
4. Om nødvendig, kan prøven: brukket med kald kniv; sublimert ved å sette en høyere temperatur (som regel -1006, C); belagt med Au / Pd-eller Pt ved hjelp av den kalde sputterer (300 V, 10 mA, 60 sekunder for en 2-3 nm Au / Pd cap) *. Sublimering bør ikke brukes for vitrified prøver å unngå deres omkrystallisering.
5. 1. Bruk den kalde kniv for å åpne den beskyttende lokk av TEM grid-plasser.
   2. Bring det kalde trinn i prøvekammeret til den mottakende høyde (16 mm *).
   3. Slå av HT på FIB / SEM og åpne det indre luftslusen.
   4. Bruk VTD å overføre SEM holderen inn i prøvekammeret. Dimming av belysning i rommet kan hjelpe på dette trinnet.
   5. Når SEM holderen er i den kalde scenen, løsne VTD ved å skyve og rotere.
   6. Trekk VTD stang hele veien inn i VTD vakuumkammer og lukk den indre luftslusen, det ytre luftslusen og VTD segl. Den ytre luftslusen kan nå luftes for å fjerne VTD segl. Det siste trinnet er ikke nødvendig, men det anbefales som VTD stang kan lett forskyves ved et uhell, som kan forårsake skadetil VTD eller luftslusen.

Tre. Ion Fresing

1. Slå på høy spenning på begge kolonner og sette de riktige bildeparametre (akselererende spenning: 10 kV for elektronstråle, 30 kV for ionestrålen; spot størrelse: 3; arbeidsavstand: 5 mm, ionestråle gjeldende: 10-100 pA for bildebehandling, 1-3 nA for fresing) *.
2. Bruk elektronstråle for å finne en funksjon av interesse og for å hente bilder for å dokumentere status av prøven før utvinning av lamellen.
3. Når en region av interesse (ROI) for utvinning har blitt identifisert, merk det med ion stråle mønster, med mindre topografi av utvalget selv gir en enkel identifisering av ROI selv etter Pt deponering. For økt nøyaktighet, å bruke fremgangsmåten beskrevet av Pettersson et al. ^14. Markeringene må være dyp, bredt og langt nok til å være fremdeles synlige etter å ha blitt dekket av cryo-Pt nedfall (som er ikke-selektiv og vil dekke flere mm ² av prøvens overflate).
4. Varm opp forløper gass til 24-26 ° C og før GIS nålen til en høyde på omtrent 1 mm over prøvens overflate (se også trinn 1.3).
5. Mens bildebehandling med elektronstråle, åpne gassventilen i noen få sekunder. Frekvensen av cryo-Pt deponering er 100-500 nm / sek eller mer, avhengig av avstanden til GIS nål, prøven ruhet og brukerens system. Det er tilrådelig å kjøre noen test avsetninger for å bestemme de optimale parametre.
6. Den rå Cryo-Pt deponering er svært grov og inhomogene. Kurere innskudd over avkastningen ved hjelp av en 1000 pA ion stråle ved lav forstørrelse (for eksempel 2000 X). I motsetning til cryo deponering, er denne herde nettstedet selektiv og bør utføres på ROI bare. Formålet med dette første cryo-avsetning, er å beskytte overflaten av prøven fra skade ionestråle, og for å redusere curtaining under ion tynning ^13..
7. Vipp prøven til52 °, slik at overflaten er vinkelrett på ionestrålen. Mill unna to terrasserte grøfter på hver side av ROI. Typiske dimensjoner for grøftene er 20 til 30 mikrometer i retningen (X) parallelt med den lamell som skal ekstraheres, 10 til 15 mikrometer i den vinkelrette retning (Y) og med en variabel, skrånende dybde (Z), med det dypeste punktet lukke til ROI. Skråningen bør være 45-55 °. I noen instrumenter, kan terrasserte grøfter kun freses med det dypeste punktet på toppen. I så fall mill én under ROI, og roter bildet 180 ° og mølle den andre på den andre siden. Dybden av fresing kan velges hvis frese sats av materialet er kjent. For det meste frossen hydrert prøven, kan frese sats på isen brukes ^7.
8. Vipp prøven tilbake til 0 ° og bruke ion stråle som kan skjære bort sidene og undersiden av lamellen, noe som gjør at kuttemerker gå gjennom hele lamell (De skal gi frese merker på terrasserte skråninger milled i forrige trinn). La bare to små broer forbinder lamell til resten av utvalget.
9. Sett GIS nål (dette kan lett skifte prøven). Manøvrere NM til tuppen er i fysisk kontakt med lameller, helst på siden. Pass på at NM er ikke til hinder ionestrålen visning av de to små forbindelsesbroer.
10. 1. Åpne GIS ventil i noen sekunder og overvåke cryo deponering ved kontinuerlig avbildning med elektronstråle.
    2. Når en ekstra 1-2 mikrometer lag med Pt har vært Cryo-deponert, lukke ventilen.
    3. Cure Pt (se trinn 2.6) bare i noen få mikrometer rundt det punkt hvor NM er i kontakt med lamellen.
    4. Bruk en høy ion strålestrømmen å kutte lamellene gratis. De to forbindelsesbroer skal freses bort, så vel som en hvilken som helst overskudd av Pt som kan ha dannet nye kontaktpunkter mellom lamellen og resten av prøven. Ikke trekke GIS nål ennå.
    Nøye manøvrere NM for å pakke ut lamell fra skyttergravene og flytte den minst 500 mikrometer over prøven overflaten. Først etter dette trinnet, trekke GIS nål.
11. Senk prøven scenen et par mm og flytte den til et av TEM nett er i sikte. Flytt festeområde på nettet i arbeidsstilling og sett GIS nål.
12. 1. Manøvrere NM forsiktig for å bringe den vedlagte lamellen i fysisk kontakt med festeområdet på TEM rutenettet. Det skal ikke være noe press eller spenning mellom lamellene, TEM rutenett og NM.
    2. Åpne gassventilen for et par sekunder og cryo-innskudd ytterligere 1-2 mikrometer lag med Pt.
    3. Kurere Pt (se trinn 2.6) bare i noen få mikrometer rundt kontaktpunkt mellom lamell og TEM rutenett.
13. Bruk en høy ion strålestrømmen å kutte lamellene fri fra NM. Dette kan oppnås ved maling bort enten NM spissen eller den siden av prøven. I tHan første tilfellet, vil spissen ha som skal slipes på nytt før videre bruk, slik som beskrevet i trinn 1.2.
14. EKSTRA: på dette stadium er det mulig å bruke VTD å ta SEM overføringsholderen og lagre det O / N i et Dewar fylt med flytende nitrogen. Denne overføring og O / N lagring vil sannsynligvis forårsake isdannelse på overflaten av lamellen hvis iskrystaller er allerede til stede, og / eller hvis det flytende nitrogen er utsatt for fuktig luft; men slike urenheter blir fjernet ved det neste trinn i en relativt kort tid. Som de foregående trinnene kan ha tatt flere timer å fullføre, kan det være hensiktsmessig å gjøre det, siden etter følgende trinn slik lagring O / N anbefales ikke, da det ikke ville være noen måte å fjerne isen forurensning unntatt ved sublimering (som kan ikke utføres hvis forglassing av prøven som skal opprettholdes).
15. Vipp prøven til 52 ° og bruke ion stråle å tynne det til elektron åpenhet ^7. Det anbefales å starte med høyere, roughennes Strålestrømmen å fjerne bulk og fortsett til fine polering overflaten med lavere strålestrømmer, eventuelt også redusere den akselererende spenning. Den endelige tykkelse på lamellen bør være 100-200 nm eller mindre for ultrastruktur-analyse i en 100 til 200 kV TEM eller opp til 500 nm for tomografi i en 300 kV TEM, avhengig av prøvesammensetning. Under tynning, kan de indre spenninger av prøven forårsake lamellen å krølle eller bøye. I et slikt tilfelle bør region tynnet begrenses. Dette skjedde for eksempel i figurene 11 og 12.

4. Cryo Transfer til TEM

1. 1. Skyll cryo-overføring stasjon med tørr nitrogengass for noen få minutter.
   2. Til flytende nitrogen til Dewar av TEM AC og cryo-overføringsstasjonen.
   3. Sett cryo-overføring TEM holderen i riktig spor av cryo-og omlastningsstasjon og fylle sin Dewar også. Vent til hver komponent har nådd ønsket temperatur (ca 15 min). Hvis det er mulig, bør regulatoren av cryo-TEM overførings holderen være koblet for å overvåke temperaturen i løpet av overføringen. Det er viktig å innse at spissen av TEM holderen (der temperatursensoren er plassert) kommer i kontakt med kryo-overføringsstasjon, og vil derfor avkjøles mye raskere enn resten av TEM holderen. Det anbefales derfor at den tiden som trengs for hele cryo-overføring TEM holder å kjøle ned måles på forhånd, og at systemet er lov å thermalize minst at mye tid.
   4. Fyll en kryogenisk kopp med flytende nitrogen og fordype seg i det: TEM prøven oppspenningsverktøyet, en skrutrekker og pinsett, for å kjøle ned sine tips til ønsket temperatur. Alt verktøy skal være riktig isolert på den andre enden slik at det ikke forårsake frostskader i førerens hånd.
2. Matche VTD til det ytre luftslusen. Ta den kalde hjorte til overførings høyde (16 mm *). Slå av høy spenning.
3. 1. Åpne VTD segl, den ytre luftslusen og den indre luftslusen.
   2. Bruk VTD stang for å låse inn i SEM overføring holderen ved å skyve og rotere med klokken.
   3. Trekk SEM overføring holderen i cryo forberedelse kammeret.
   4. Bruk den kalde kniven for å lukke den beskyttende lokk av TEM nett. Dette er nødvendig for å redusere mulig is kontaminering under overføring.
   5. Bruk VTD stang å flytte prøven i vakuum kammer av VTD.
   6. Lukk airlocks og segl.
4. Vent ytre luftslusen og ta av VTD. Matche VTD til SEM-porten på cryo-overføring stasjon. Mens spyling med tørr nitrogen, bruker pinnen på stasjonen for å åpne forseglingen av VTD og skyv SEM overføring holderen i Dewar av cryo-overføring stasjon.
5. 1. Legg nok til flytende nitrogen slik at nivået i cryo-overføringsstasjonen er høy nokbare senke prøven.
   2. Bruk tidligere avkjølt skrutrekker for å åpne en av lokkene og løsne den tilsvarende skruen som holder den TEM nettet på plass.
   3. Bruk tidligere avkjølte pinsett til å plukke den TEM rutenett og legg den inn i TEM holderen.
   4. Bruk den avkjølte hexring å feste TEM rutenett på TEM holderen.
   5. Lukk lukker av cryo-overføring TEM holderen. Prøven overførings trinn er avgjørende, og kan bli hemmet av nitrogengass reduserer synligheten av de små TEM prøven.
   6. Trekk cryo-overføringsstasjonen fra pumpesystemet og transportere den ved TEM, sammen med varmeren kontrolleren av cryo-TEM overførings holderen.
   7. Start turbomolecular pumpe i TEM å pumpe underlags linje til TEM luftslusen.
   8. Sett TEM prøven scenen til en tilt * av -70 °.
   9. Sett på kortest pumpetid for luftslusen (30-60 sek), med bare en syklus av sletting med tørr nitrogengass.
   10. Sørg for at den beskyttende lukkeren på cryo-overføring TEM holderen er avsluttet. Fjern TEM holderen fra Cryo-overføringsstasjonen og sett den inn i skrå goniometer (flytende nitrogen vil renne ut av TEM holderen Dewar). Pumpe syklus starter. Når syklusen er avsluttet, setter goniometer til å vippe tilbake til 0 °, og, på samme tid, holder TEM holderen, slik at den ikke roterer med goniometer. Sett det fullt inne i TEM. Under dette trinn, bør cryo-TEM overføringsholderen være koplet til sin varmeapparat kontrolleren for å overvåke temperaturen. Fremgangsmåten for å sette inn prøveholderen i TEM kan variere mellom ulike TEMS. Det anbefales derfor å ta kontakt med TEM produsenten for å få den riktige fremgangsmåten.
   11. Fyll opp cryo-overføring TEM holder Dewar. Vent på at vakuumet i TEM for å nå et akseptabelt nivå.

Representative Results

I dette arbeidet har vi gjort bruk av: en to-stråle FIB / SEM utstyrt med en nanomanipulator og en Cryo-forberedelse kammer; en TEM med en Cryo-overføring holder; en prototype cryo-overføring stasjon. Den anticontaminator (AC) blader av cryo-preparatet kammeret og spissen av nanomanipulator (NM) ble modifisert ved Gatan. Med hensyn til en standard cryo-preparat kammer, AC-knivene er større for å gi en større varmeleder for NM spissen. Dessuten er strøm utstyrt med klemmer for tilkobling av Cu flettene for varmeveksling med NM spissen. De pneumatikk av FIB / SEM ble modifisert for å tillate NM å være og forbli satt inn selv når prøvekammeret ble utluftet. Det bør bemerkes at parameterne som brukes i dette arbeidet er best egnet for det utstyret som er oppført ovenfor; disse parametrene kan måtte justeres når du arbeider med andre typer utstyr. Å arbeide med denne protokollen, de vanlige forholdsreglene ved håndtering cryogenics, flytende nitrogen og vakuumsystemer børfølges.

Metoden har blitt testet på ulike typer prøver med gode resultater, alt fra løsninger eller polymer matriser som inneholder nanopartikler, til encellede organisme til nematoder. Eksempler på de ulike trinnene i prosedyren er illustrert i figurene 1-12 på A. niger sporer farget med osmium-tetroksyd, og kaliumpermanganat. Sporene først avbildes ved SEM (figur 1) for å identifisere stedet for ekstraksjon. I dette tilfellet er et tverrsnitt av en hvilken som helst spore var tilstrekkelig, men det er mulig å plassere ROI for ekstraksjon med sub-mikrometer presisjon til, for eksempel, skjære en bestemt celle ved en bestemt avstand fra cellemembranen. En gang i fremtiden av interesse har blitt identifisert, er det første trinn i cryo-Pt avsetning gjennomføres (fig. 2), for å beskytte prøven fra strålen skade fra ione-fresing. Prøven er vippet til 52 ° for å fortsette med de første skritt of fresing (figur 3): sputtering av to grøfter på begge sider av lamellen. Prøven blir deretter vippet tilbake og ytterligere males for å la bare to små broer som forbinder den til hoveddelen (figur 4). Den avkjølte nanomanipulator bringes i kontakt med lamellen (figur 5) og en annen cryo-avsetning av Pt loddemateriale dem sammen (fig. 6). De små forbindelsesbroer blir deretter maskinert bort, og det NM beveger lamell nær festeområdet på TEM grid (figur 7), hvor den er fastloddet til en endelig cryo-avsetning av Pt (figur 8). Den NM blir deretter separert fra lamellen (figur 9), som er tynnet ned til elektrontran med ionestrålen (fig. 10 og 11). Denne lamell er endelig overført til TEM (figur 12), hvor høy oppløsning, spektroskopi, tomografi og andre teknikker can være ansatt.

Figur 1. Cryo-SEM bilde av sporer av A. niger, før Pt deponering.

Figur 2. Det samme område i figur 1 etter at Pt avsetning, men før herding.

Fig. 3. Cryo-SEM-bilde av det samme området i figur 2, på skrå 52 °, etter Pt avsetning og herding, og grøften fresing gang(Se trinn 3.7).

Figur 4. Den lamell, klar for lift-out.

Figur 5. Kulden nanomanipulator spissen får kontakt med lamellen.

Figur 6. Et andre Pt cryo-deponering blir brukt til å lodde sammen nanomanipulator og lamell.

Figur 7. Kulden nanomanipulator blir brukt til å overføre lamellen til festeområdet på TEM rutenettet.

Figur 8. Cryo-deponering er brukt en gang mer å feste lamell til TEM rutenett.

Figur 9. Den lamell er skåret fri av nanomanipulator, og det er nå klart for verken lagring eller tynt til elektron åpenhet.

Figur 10. Intermediat trinn av fortynning, med noen få sporer synlig i tverrsnitt.

Figur 11 Cryo-SEM-bilde av prøven etter endelig fortynning.; de fleste av de andre sporene måtte freses bort, fordi lamellene hadde begynt å bøye seg.

Figur 12. En sammensatt Cryo-TEM bilde av lamellen. En del av Al stubben har vært inkluderti lamellen (svart pil).

Discussion

Denne protokollen er en ganske grei tilpasning til kryogene temperaturer på standard FIB / TEM prøveopparbeidelse brukes i materialvitenskap ved RT. Metoden produserer TEM prøver uten mekanisk deformasjon og knivmerker (den store ulempen med skjæringen), selv om curtaining kan oppstå hvis prøven overflaten er inhomogene. Dette kan reduseres ved kryo-avsetning av et capping lag (i dette arbeidet Pt ble anvendt), herdet til det er glatt og uten særpreg ^13.. Prøver med komponenter av meget forskjellig hardhet kan fremstilles, så vel uten risiko for at de vil brekke under påkjenning i preparatet. Interne påkjenninger kan likevel føre den tynne lamellen til å bøye eller krølle, og da størrelsen av seksjonen må reduseres. En ulempe i forhold til andre fremgangsmåten er muligheten for å endre den biologiske struktur ved eksponering til ionestrålen og mulig implantasjon av ionene i prøven. Disse ulemper forekommer også ved RT i prøven preparasjon i materialvitenskap ^15. De kan reduseres ved å utføre tynning med en endelig polering trinn ved den laveste akselererende spenning for ioner (500-1000 V). Denne svært milde polering trinnet vil fjerne den skadede lag fra lamellen.

På grunn av arten av den kryo-deponering (trinn 3.5, 3.10 og 3.13), vil store deler av prøven være dekket, for derved å hindre utsikten over den opprinnelige overflate. Dette kan gjøre det vanskelig å holde styr på ROI, med mindre flere markeringer brukes som foreslått i trinn 3.3.

Under trinn 4,5 og 4,7 de tynne lamell risiko som kommer i kontakt med luft. Dette må unngås da det ville føre til at fuktighet i luften til å danne iskrystaller på overflaten av prøven, eventuelt til et punkt som visker viktige funksjoner. Bør utføres disse trinnene så raskt som mulig, men samtidig en mishandling under overføringen vil sannsynligvis resultere i tap av utvalget detselv. Det anbefales at brukeren praktiserer disse trinnene ved å bruke tomme TEM nett før et forsøk på en skikkelig prøve er gjort.

I materialvitenskap, har FIB instrumentet bli den viktigste metoden for TEM prøveopparbeidelse innen et tiår med kommersialisering. Siden det kan anvendes på praktisk talt alle prøven, fjerner det behov for å skreddersy fremstilling teknikk til den type av prøve. Vi har stor tro det samme kan skje ved kryogene temperaturer, takket være prosedyren beskrevet her. Sin søknad til større prøver er fortsatt gjenstand for evnen til Cryo-bevare dem i en vitrified tilstand, men teknikker som stupe-frysing eller høytrykks frysing ^3,5 kan vise seg å være de optimale løsninger på dette problemet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strata DB 235	FEI		FIB/SEM
Omniprobe 100	Oxford Instruments		Nanomanipulator
Alto 2500	Gatan		Cryo preparation chamber
Cryo-holder model 626	Gatan		Cryo transfer TEM holder
Tecnai F30	FEI		TEM