En protokol til kvantitativ, high throughput udtryk screening og analytisk oprensning af fusionsproteiner fra små Escherichia coli kulturer er beskrevet og anvendt til at udtrykke disulfid-rigt dyre gift protein-targets.
Escherichia coli (E. coli) er den mest udbredte ekspressionssystem til fremstilling af rekombinante proteiner til strukturelle og funktionelle studier. Men oprensning af proteiner er undertiden udfordrende, da mange proteiner udtrykkes i en uopløselig form. Når du arbejder med vanskelige eller flere mål anbefales det derfor at anvende high throughput (HTP) protein udtryk screening på en lille skala (1-4 ml kulturer) til hurtigt at identificere betingelserne for opløselig udtryk. For at kunne håndtere de forskellige strukturelle genomics programmer laboratoriet, en kvantitativ (inden for et område 0,1-100 mg / L kultur af rekombinant protein) og HTP proteinekspression screening protokol blev gennemført og valideret på tusindvis af proteiner. Protokollerne blev automatiseret ved anvendelse af en flydende håndtering robot, men kan også udføres manuelt uden specialiseret udstyr.
Disulfid-rige venom proteiner vinderstigende anerkendelse for deres potentiale som terapeutiske lægemiddelkandidater. De kan være meget potent og selektiv, men deres komplekse disulfidbindings netværk gør dem udfordrende at producere. Som medlem af RP7 europæiske Venomics projekt ( www.venomics.eu ), vores udfordring er at udvikle vellykket produktion strategier med det formål at producere tusindvis af nye venom proteiner til funktionel karakterisering. Hjulpet på vej af redox egenskaber disulfidbindings isomerase DsbC, vi tilpasset vores HTP produktion pipeline for ekspression af oxideret, funktionelle venom peptider i E. coli cytoplasma. Protokollerne gælder også for produktionen af diverse disulfid-rige proteiner. Her demonstrerer vi vores pipeline anvendes til produktionen af animalsk venom proteiner. Med de protokoller, der er beskrevet heri, er det sandsynligt, at opløselige disulfid-rige proteiner vil blive opnået i så lidt som en uge. Selv fra en lille skala, er der potentiale til at bruge the renset proteiner til validering af oxidationstrin ved massespektrometri, til karakterisering i pilotundersøgelser, eller for følsomme mikro-analyser.
Motiveret af avancement for genomforskning og accelererende opdagelsen af nye proteiner har høj throughput rørledninger blevet udviklet til at parallelize traditionelle metoder til screening og identifikation af optimale protein produktions strategier. Potentielle variabler, der skal optimeres, indbefatter, men er ikke begrænset til, varierende ekspressionsstammer 1,2, temperatur 3,4, medier 2,3 mål varianter 5, fusionspartnere 6-13, co-ekspression med chaperoner 14,15 cytoplasmisk eller periplasmiske ekspressionssystemer 16-18, og oprensning pufferkomponenter 3. Ved at implementere højkapacitetmetoder, mange variabler eller mange mål kan testes parallelt med en høj grad af effektivitet, samtidig begrænse batch-til-batch variation. Det er vores erfaring strategien giver også god reproducerbarhed ved opskalering ved hjælp af den samme kultur (temperatur, medier, beluftning, osv.) og rensning betingelser (samme resin, buffere, etc.). Adskillige high throughput platforme har været anvendt i de sidste ti år på at identificere betingelserne for opløseligt protein udtryk, nemlig gennem forskellige parametre som fusionspartnere, ekspressionsstammer eller temperatur 19-23.
Vi har for nylig brugt vores high throughput screening metode til ekspression af opløselige disulfid-rige proteiner 11. De udvalgte proteiner var ikke kun fra giftige kilder, men også disulfid-rige enzyminhibitorer fra en lang række arter, herunder planter, grise, køer og mennesker. Forsøget sammenlignede effekten af 12 forskellige fusionspartnere og tre forskellige ekspressionsstammer på opløselighed og foldning af 28 disulfid-reticulated proteiner. Vi viste, at ved hjælp af DsbC som en fusionspartner til produktion i stammen BL21 (DE3) pLysS langt outproduced (i både udbytte og antallet af opløselige proteiner opnået) enhver anden kombination af belastning og fusion testet 11. DenResultaterne af dette forsøg dannede grundlag for at tilpasse vores oprindelige generelle high throughput rørledning (som er blevet anvendt til ekspression screening af en lang række proteiner) 22,24 til en mere egnet til ekspression af disulfid-rige mål. Disulfid-rige proteiner fra animalske gifte er af særlig interesse. Gifte er en kompleks blanding af bioaktive peptider og proteiner med potentiel værdi farmakologisk og terapeutisk. Imidlertid ekspression af disulfidbinding-holdige proteiner er ikke trivielt. Disse proteiner indeholder i almindelighed mellem 6:59 disulfidbindinger og skal oxideres med de korrekte disulfid-bindingsmønstre for at være aktiv. I øjeblikket er platform, der bruges til screening udtryk for et stort antal disulfid-rigt dyre venom proteiner som en del af FP7 europæiske VENOMICS Project (www.venomics.eu) og benchmarking nye protokoller for high throughput udtryk for tusindvis af målene . Her en automatiseret metodeer fastsat til high throughput små udtryk screening og rensning (se figur 1) anvendt til disulfidholdig rigt dyre venom proteiner. Strategien for disulfid-rige peptider og proteiner anvender en HIS-tag til oprensning og redox-aktive fusionspartner, DsbC skabe spaltelige HIS-DsbC fusioner til målproteiner (se figur 2).
Mens fokus i de protokoller heri er automatisering ved hjælp af en væske håndteringsrobot og HTP elektroforese, disse metoder er også velegnet til en high throughput manuel tilgang, hvilket betyder, at selv laboratorier med en grundlæggende opsætning kan drage fordel af de protokoller, uden nogen forudsætning for dyrt udstyr . Manuelle protokoller for forvandling til oprensning og analyse (ikke specifik for disulfid-rige proteiner) er blevet offentliggjort andetsteds 24 og vil ikke blive gentaget her. Throughput på manuelle procedure (fra ekspressionsklon, produceret af recombinational kloning 25, til analyse af opløseligt protein i blodet) er 96 (ved hjælp af SDS-PAGE detektion) eller 384 (4 x 96, ved hjælp af dot blot og SDS-PAGE 26) kulturer per uge (se figur 1). Dette kan øges, hvis der udføres i en semi-automatiseret måde (ved hjælp af en væske håndteringsrobot og dot blot 26 eller HTP elektroforese, såsom med en Caliper GXII LabChip-systemet 22 til analyse af resultaterne) til op til 1.152 (12 x 96) kulturer i parallel over en uge som beskrevet heri. Dyrkning udføres i dyb brønd 24 (DW24) format, så regelmæssige rystende kuvøser kan bruges i modsætning til kulturer dyrket i dyb brønd 96 (DW96) format, som kræver brug af korte orbitale højhastighedstog ryste inkubatorer tilstrækkelig beluftning (rysten ved 800 opm). Brugen af auto-induktion medier 27 forenkler også udtryk, hvilket eliminerer manuelle induktion trin. Selv hvor laboratorier anvender allerede foruddefinerede udtryk og purifikation betingelser, kan disse overføres direkte ind i denne HTP system, blot for at forbedre effektiviteten. En detaljeret skematisk af high throughput screening rørledning til disulfid-rige proteiner er tilvejebragt i fig. 3. Parametrene i rørledningen blev udvalgt baseret på omfattende screening eksperimenter 11, 22, hvilket gav os mulighed for at vælge de mest egnede betingelser for proteinproduktion.
Karakterisering kan udføres på taggede proteiner oprenset direkte fra små udtryk i pilotundersøgelser, hvor snesevis af mikrogram prøve er tilstrækkelig, eller til følsomme funktionelle assays og bindingsassays (f.eks lav volumen HTP patch clamp-systemer 28). Det samme kan også udføres på umærkede mål efter spaltning, hvis tag og proteasen fjernes (for eksempel ved omvendt fase HPLC). Kvalitetskontrol kan også udføres ved hjælp af massespektrometri (for at bekræfte den forventede størrelse og oxidation stspiste) eller kromatografiske metoder (for at bekræfte renhed eller heterogenitet) 29. Sommetider tag spaltning er unødvendig eller endda uønsket (især for dårligt opløselige proteiner 30,31), så i denne protokol spaltning er valgfrit. Uanset i alle konstruktioner er der en TEV-protease-spaltningssted (ENLYFQ / [G] 32) umiddelbart forud for målgenet at producere native protein efter spaltning (se figur 2 og diskussion). Hvis der ønskes spaltning af fusion tag, kan spaltning testes (på elueringsfraktionen eller 'på kolonne ") ved den lille skala til at analysere effektiviteten, optimere betingelserne, hvis det kræves, og få pålidelige skøn over udbytterne for efterfølgende opskalering eksperimenter.
Der er to muligheder for mængden af perler, der anvendes under affinitetsrensning, afhængig af de mål og forventninger til eksperimentet. At være i stand til at fange så meget protein som muligt (for at rense for pilot assays eller MS, eller at extrapolspiste til opskalering udbytter) et slutvolumen på 200 pi harpiks bør anvendes, så påvisning af opløseligt protein i området fra 1-100 mg / L kultur, før mætning af systemet (se protokol (A) i afsnit 8.1) . Men hvis formålet med forsøget er påvisning af små mængder af opløselige proteiner derefter et endeligt volumen på 50 pi harpiks er egnet, så påvisning af opløseligt protein i intervallet 0,1-25 mg / L kultur (se protokol (B ) i afsnit 8.2).
Produktionen kan skaleres op, hvis det er nødvendigt, for at opnå milligram mængder rensede mål for yderligere strukturelle og funktionelle undersøgelser ved hjælp af de betingelser, der er identificeret for opløselig udtryk. Detaljerne i opskalering protokoller, der anvendes på AFMB blevet diskuteret andetsteds 22,24.
Yderligere oplysninger er relevante for forsøgsopstillingen, kritiske skridt i protokollen, ændringer og fejlfinding og begrænsninger af teknikken forudsat i skivenussion. Læs venligst diskussionen, før de påbegynder forsøgene.
Gennem de protokoller vi forventer en succesrate på 90% ved hvert trin (for eksempel skal mindst 90% af kulturerne vokse på et givet trin). Hvis succesrate på ethvert trin i eksperimentet falder til under 90% prøverne kasseres, og forsøget gentages for den fulde samling af konstruktioner. Men denne succes rate er ikke anvendelig til antallet af konstruktioner, der udtrykker som opløselige proteiner eller andelen af konstruktioner, som spalter med 100% effektivitet, da dette vil være meget afhængig af de testede proteiner.
De specifikke oplysninger om opsætning af robotten arbejdsbord er fastsat for hver protokol (se også figur 4), men de kan tilpasses efter behov for alternative Arbejdsbord set-ups. Robotten hardware (Tecan) består af en 96-multikanal arm (MCA96), robot manipulator (Roma) og 8-kanals væskehåndtering hoved (Liha). Alle trin anvender de MCA96 kan også udføres ved hjælp af liha hvis en MCA96 ikke er tilgængelig, men de vil tage længere tid, fordi liha bliver nødt til at blive vasket mellem trin. Mens robotten er teknisk set ikke et sterilt miljø, inddragelse af antibiotika generelt sikrer, at der ikke er problemer med forurening eller sterilitet.
Der er ingen enkelt universel protokol for ekspression af opløselige, foldede, funktionelle proteiner. At være omkostningseffektive og tid-effektive, de fleste laboratorier eller protein core faciliteter, der arbejder med flere mål derfor benytte high throughput protein udtryk screening for at finde den bedste »generiske« kombination af variabler til at opnå et opløseligt aktivt protein for de fleste af målene. Vi har identificeret DsbC som en generelt anvendelig fusionspartner for den opløselige ekspression af disulfid-rige peptider og proteiner 11. Brug DsbC fusioner og high throughput metoder inden for en uge den opløselige udtryk for flere mål kan observeres 11 og derefter yderligere variabler, som dem omtalt i indledningen, kan screenes i de efterfølgende runder på de mål, der kræver yderligere optimering. De heri beskrevne protokoller er rettet mod ekspression af disulfid-rige proteiner og peptider. Men for brugere, der ønsker at expRESS ikke-retikulerede proteiner i en high throughput måde, har de tilsvarende protokoller blevet offentliggjort tidligere, og kan findes andre steder 22,24.
Den high throughput opsætning er ideel til en række anvendelser, herunder screening af et stort antal forskellige proteiner til opløselige ekspression eller screening af et stort antal ekspressionskonstruktioner (herunder forskellige fusion tags) for flere målgener på samme tid ( eller flere ekspressionskonstruktioner for et enkelt mål) for at forbedre succesraten. Platformen kan også bruges til benchmarking og validering af nye protokoller på en lang række mål. Andre anvendelsesområder omfatter screening af varianter for en enkelt vanskeligere mål, fx alle orthologer eller medlemmer af samme familie, eller teste succes i produktionen af et panel af mutanter af et enkelt mål i et eksperiment. Denne protokol er også blevet anvendt i kombination med co-ekspressionsvektorer (with en mærkede protein) for at tillade pull down og indledende karakterisering af protein-protein-komplekser efterfulgt af mere grundig biofysisk analyse for at bekræfte korrekte kompleks dannelse og støkiometri 33. Mængden af protein renses undertiden egnet til mikro-assays (funktionelle tests, protein-DNA 34 eller protein-protein interaktion assays). Der er flere fordele til high throughput screening ekspression strategi: (i) evnen til at afprøve en lang række mål eller et stort antal variabler i et enkelt eksperiment, (ii) begrænset batch-til-batch variation, (iii) enkelhed og lethed i at arbejde på en mindre skala ved hjælp af dybe brønde, (iv) skalerbarhed og reproducerbarhed på større skala, (v) muligheden for automatisering, og (vi) enkelhed sporing og håndtering (ingen mærkning af enkelte rør, mindre fejltagelser, der blev indført ved brug af pladeformat end med håndtering af enkelte rør i blanding eller udveksling af kloner).
<pclass = "jove_content"> Selvom det ikke diskuteret i protokollen afsnit, er der flere vigtige overvejelser til forberedelse af forsøget, som vil blive kort beskrevet nedenfor. For en mere grundig diskussion se vores tidligere publikation 24. For at opnå maksimal effektivitet, er det gavnligt at have et passende system til high throughput kloning, at forenkle sub-kloning af et stort antal mål. For den indledende fase af VENOMICS projektet udnytter vi den alsidige Gateway rekombinationssystemet 25, der tillader subkloning i enhver destination vektor i et tempo på hundredvis af kloner ugen. Protokoller til Gateway rekombination kloning kan findes på Invitrogen hjemmeside. Andre alternativer til high throughput kloning omfatter ligatur-uafhængig kloning (LIC) 35,36 og begrænsning (RF) kloning 37.. Der er flere måder at opnå målgenerne for ytringsfriheden, herunder ved PCR fra skabelon-DNA, fra entry klonsamlingerne ellersyntetiske gener, som er den strategi, der er valgt til VENOMICS projektet. Syntetiske gener kan bestilles med rekombinationssites i hver ende af genet og gensyntese tillader nem kodonoptimering af målgenet sekvens (for at udelukke sjældne E. coli kodoner). Det anbefales, men ikke afgørende. For mål uden kodonoptimering, der indeholder et stort antal sjældne codons, Rosetta 2 (DE3) pLysS (som bærer tRNAs for sjældne codons, der ikke er stærkt udtrykt i E. coli) kan være bedre egnet end BL21 (DE3) pLysS. Mens der er stammer til rådighed, begrænse reduktionen af disulfidbindinger i den normalt reducerende miljø i cytoplasmaet, i vore hænder de har ikke været så vellykket som regelmæssig E. coli-stammer 11.Analytisk skala affinitetsrensning udføres fra testudtrykket kulturer med henblik på at inddrive de opløselige fusionsproteiner og kvantificere udbyttet. Kvantitative data kan fås på the opløselige udbytter af fusionsproteiner udtrykt i et område fra 0,1 til 100 mg / l kultur. Hvis målet ikke er opløseligt, kan alternative udtryk og induktion temperaturer, stammer eller medier testes, inden de forskellige fusionspartnere forfølges. Til opløselig ekspression af disulfid-rige proteiner, vi tidligere rangeret effekten af fusionspartnere som DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-tag for cytoplasmatisk udtryk 11. Periplasmisk ekspression er en anden mulighed, der kan hjælpe en vellykket foldning af disulfid-rige mål. Periplasmaet er mindre reducerende miljø end cytoplasmaet og indeholder nyttige redox chaperoner til at bistå disulfidbinding. DsbC, DsbA, og MBP-proteiner normalt lokaliseret til periplasmaet deres periplasmatiske signalsekvenser. Dette giver mulighed for at udnytte disse tags til direkte disulfid-rige mål til det periplasmiske rum med henblik på at hjælpe foldningen. For vanskelige targets, vil det næste skridt være at purify det uopløselige HIS-tagget target fra inklusionslegemer, solubilisering og foldes igen (dette er uden for rammerne af denne protokol og vil ikke blive diskuteret her 3 9). Dette kan være forholdsvis enkelt for mål med kun en eller to disulfidbindinger, men bliver mere og mere vanskeligt, da antallet af disulfidbindinger stiger. Alternativt, og især for proteiner og peptider med fire eller flere disulfidbindinger, kan det være fordelagtigt at prøve mere komplekse produktionssystemer, såsom gær, insekt eller mammal ekspression.
Med fremskridt inden for miniaturisering og automatisering, vil HTP elektrofysiologi lab-on-a-chip teknologi 28 uden tvivl være vejen for fremtiden for funktionelle analyser. Vi forestiller os, at til de fleste formål (måske med undtagelse af strukturelle studier), vil ophæve behovet for store skala kulturer. Lille skala kulturer vil ikke kun være anvendelige til screening af ekspressionsbiblioteker betingelser, men også være i stand til at tilvejebringe tilstrækkekeligt mængder af prøven for disse miniaturiserede funktionelle assays. Evnen til at producere flere mål parallelt i tilstrækkelige mængder til funktionel karakterisering vil sænke omkostningerne ved dyrkning og brug af disse slags platforme, vil ekspression og karakterisering af rekombinante proteiner blive mere omkostningseffektive og tid-effektive.
Protokollerne heri er blevet anvendt til at udtrykke disulfid-rige peptider og proteiner i den indledende fase af FP7 europæiske VENOMICS projekt. Gifte er en glimrende kilde til bioaktive peptider, der ofte har interessante farmakologiske potentiale. Men deres produktion er udfordrende på grund af deres komplekse disulfid-bonding mønstre og lille størrelse. Ved hjælp af high-throughput platforme som den er beskrevet heri, VENOMICS projektet har til formål at generere et bibliotek på 10.000 nye venom peptider til at gengive mangfoldighed observeret i naturen. Dette bibliotek vil blive udnyttet til karakterisering af disulfid-rICH-peptider med potentielle farmakologiske eller terapeutiske anvendelser med henblik på at udvikle nye lægemidler. Platformen er i øjeblikket bliver brugt til benchmarking og validering af nye protokoller til brug i VENOMICS projektet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af The VENOMICS projektet europæisk projekttilskud nr. 278.346 gennem det syvende rammeprogram (FP7 HEALTH 2011-2015). Den VENOMICS Projektet er et samarbejde mellem flere forskningsinstitutioner og virksomheder i Europa:
AFMB, Aix-Marseille Université (Frankrig), CEA Saclay (Frankrig), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanien), Université de Liège (Belgien), VenomeTech (Frankrig), Vitamib (Frankrig), Zealand Pharma (Danmark)
Dette arbejde blev støttet af den franske infrastruktur for Integrated Strukturel Biologi (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01.
Forfatterne vil også gerne takke hr. Jeremy Turchetto for at bistå med forberedelserne til optagelserne af videoen.
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot | Tecan Group Ltd. | Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8 |
|
96-well PCR (PCR96) plates | Greiner Bio-One | 652270 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/ |
LB medium | Autoclaved for sterility. | ||
Antibiotic stocks | Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 °C. Use a 1 in 1000 dilution. | ||
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity | Greiner Bio-One | 780270 | Autoclaved for sterility. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/ |
Expression vectors | For the expression of target constructs. Store at −20 °C. | ||
BL21 (DE3) pLysS competent cells | Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C. | ||
Breathseal breathable adhesive film | Greiner Bio-One | 676050 | |
PCR machine with 96-well plate block | For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples. | ||
24-well sterile tissue culture plates | Greiner Bio-One | 662165 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/ |
LB-agar | Autoclaved for sterility. | ||
200 μl sterile disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 617 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw | Infors | AJ103 | Not essential, a regular shaking incubator can also be used. http://www.infors-ht.com/index.php/en/ |
Plate incubator | |||
Microtiter plate | For glycerol stocks and elution using purification protocol B. | ||
Glycerol | For the preparation of glycerol stocks. | ||
200 μl disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 616 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Adhesive tape pads | Qiagen | 19570 | http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads |
Bactinyl | Orapi Group | Or equivalent microbial disinfectant. | |
ZYP-5052 medium | See Table 1 for recipes of components. | ||
Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity | Whatman | 7701-5102 | Autoclaved for sterility. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102 |
Flat-bottomed, clear microtiter plate | Greiner Bio-One | 655101 | For absorbance readings. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/ |
Plate reading spectrophotometer | Optional. For measuring OD600nm of cultures. | ||
Centrifuge with rotor for deep well plates | Suitable for 3800 x g. | ||
Lysozyme | 50 mg/ml in water. Store at −20 °C. | ||
Imidazole ACS grade | Merck | IX0005-1 | A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield. |
Lysis buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods. | ||
Water bath | |||
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) | Misonix Inc. | Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis. | |
DNase | 2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C. | ||
Magnesium sulphate (MgSO4) | 2M stock in water, autoclaved. | ||
SDS-PAGE or Caliper sample buffer | |||
Binding buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
Wash buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
Elution buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity | Macherey-Nagel | 740686.4 | http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx |
200 μl disposable wide bore tips | Tecan Group Ltd. | 30 050 348 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin | GE Healthcare | 17-5318-02 | For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802 |
Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C. | ||
96-well 0.22 µm filter plate | Millipore | MSGV N22 10 | Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210 |
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment | Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion. | ||
Spectrophotometer and cuvettes | For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper. | ||
ZipTip pipette tips | Millipore | Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0 |
|
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted. |