स्क्रीनिंग मात्रात्मक, उच्च throughput अभिव्यक्ति और छोटे पैमाने पर कोलाई संस्कृतियों से संलयन प्रोटीन की विश्लेषणात्मक शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और डाइसल्फ़ाइड युक्त पशु विष प्रोटीन लक्ष्य की अभिव्यक्ति के लिए आवेदन किया है.
Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल अभिव्यक्ति प्रणाली है. कई प्रोटीन एक अघुलनशील रूप में व्यक्त कर रहे हैं लेकिन, जब से प्रोटीन सफ़ाई कभी कभी चुनौतीपूर्ण है. मुश्किल या कई लक्ष्यों के साथ काम करते हैं इसलिए यह जल्दी से घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए शर्तों की पहचान करने के लिए उच्च throughput (HTP) एक छोटे पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग (1-4 मिलीलीटर संस्कृतियों) का उपयोग करने की सिफारिश की है. प्रयोगशाला के विभिन्न स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कार्यक्रम, एक (पुनः संयोजक प्रोटीन की .1-100 मिलीग्राम / एल संस्कृति की एक सीमा के भीतर) मात्रात्मक और HTP प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रोटीन के हजारों पर लागू किया और मान्य किया गया था के साथ सामना. प्रोटोकॉल एक तरल से निपटने रोबोट के उपयोग के साथ स्वचालित थे लेकिन यह भी विशेष उपकरणों के बिना मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है.
डाइसल्फ़ाइड युक्त विष प्रोटीन प्राप्त कर रहे हैंचिकित्सकीय दवा सुराग के रूप में अपनी क्षमता के लिए मान्यता बढ़ रही है. वे अत्यधिक शक्तिशाली और चुनिंदा हो सकता है, लेकिन उनके जटिल डाइसल्फ़ाइड बांड नेटवर्क का निर्माण करने के लिए उन्हें चुनौती दे रही है. FP7 यूरोपीय Venomics परियोजना (के एक सदस्य के रूप में www.venomics.eu ), हमारी चुनौती कार्यात्मक विशेषता के लिए उपन्यास विष प्रोटीन के हजारों उत्पादन के उद्देश्य के साथ सफल उत्पादन रणनीति विकसित करने के लिए है. डाइसल्फ़ाइड बांड Isomerase DsbC के redox गुण द्वारा सहायता प्राप्त, हम ई. में ऑक्सीकरण, कार्यात्मक विष पेप्टाइड्स की अभिव्यक्ति के लिए हमारे HTP उत्पादन पाइपलाइन अनुकूलित कोली कोशिका द्रव्य. प्रोटोकॉल भी विविध डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए लागू कर रहे हैं. यहाँ हम हमारे पाइप लाइन पशु विष प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए लागू प्रदर्शित करता है. प्रोटोकॉल के साथ साथ वर्णित के साथ यह घुलनशील डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन एक सप्ताह के रूप में छोटे में प्राप्त किया जा जाएगा संभावना है. यहां तक कि एक छोटे पैमाने से, वें का उपयोग करने की क्षमता हैई पायलट अध्ययन में, या संवेदनशील सूक्ष्म assays के लिए लक्षण वर्णन के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा ऑक्सीकरण राज्य मान्य के लिए प्रोटीन शुद्ध किया.
जीनोमिक्स की उन्नति और नए प्रोटीन की खोज की दर तेजी से प्रेरित है, उच्च throughput पाइपलाइनों स्क्रीनिंग और इष्टतम प्रोटीन उत्पादन रणनीतियों की पहचान के लिए पारंपरिक तरीकों parallelize करने के लिए विकसित किया गया है. अनुकूलित किया जाना संभावित चर अलग अभिव्यक्ति लक्ष्य संरक्षिकाओं 14,15 के साथ 5, संलयन भागीदारों 6-13, सह अभिव्यक्ति वेरिएंट, 1,2, तापमान 3,4, मीडिया 2,3 उपभेदों, cytoplasmic शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं या periplasmic अभिव्यक्ति 16-18, और शुद्धि बफर घटकों 3. बैच को बैच भिन्नता सीमित है, जबकि उच्च throughput दृष्टिकोण, कई चर या कई लक्ष्यों क्षमता का एक उच्च स्तर के साथ समानांतर में परीक्षण किया जा सकता को लागू करने से. हमारे अनुभव में, रणनीति भी उसी संस्कृति (तापमान, मीडिया, वेंटिलेशन, आदि) और शुद्धि की स्थिति (एक ही निवासियों का उपयोग बड़े पैमाने अप पर अच्छा reproducibility देता हैएन, buffers, आदि). कई उच्च throughput प्लेटफार्मों अर्थात् ऐसे फ्यूजन पार्टनर्स, अभिव्यक्ति उपभेदों या तापमान 19-23 के रूप में अलग मापदंडों के माध्यम से, घुलनशील प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए शर्तों की पहचान करने के लिए पिछले एक दशक में इस्तेमाल किया गया है.
हमने हाल ही में घुलनशील डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन 11 की अभिव्यक्ति के लिए हमारे उच्च throughput प्रदर्शन के दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया. चयनित प्रोटीन विषैला स्रोतों से न केवल थे, लेकिन यह भी पौधों, सूअर, गाय और मानव सहित प्रजातियों में से एक विस्तृत श्रृंखला से डाइसल्फ़ाइड युक्त एंजाइम inhibitors शामिल थे. प्रयोग 12 विभिन्न फ्यूजन भागीदारों और 28 डाइसल्फ़ाइड-जालीदार प्रोटीन की घुलनशीलता और तह पर तीन अलग अभिव्यक्ति उपभेदों के प्रभाव की तुलना में. हम तनाव BL21 में उत्पादन के लिए एक संलयन साथी (DE3) के रूप में DsbC का उपयोग pLysS बेहद outproduced (प्राप्त घुलनशील प्रोटीन की उपज और संख्या दोनों में) तनाव और फ्यूजन के किसी भी अन्य संयोजन 11 का परीक्षण किया है कि प्रदर्शन किया.इस प्रयोग के परिणाम डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्य की अभिव्यक्ति के लिए अधिक अनुकूल एक में (प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है) हमारे मूल सामान्य उच्च throughput पाइपलाइन 22,24 आदत डाल के लिए आधार बनाया. पशु विष से डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन विशेष रुचि के हैं. विष औषधीय और therapeutically संभावित मूल्य के साथ, bioactive पेप्टाइड्स और प्रोटीन का एक जटिल मिश्रण हैं. हालांकि, डाइसल्फ़ाइड बांड युक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति तुच्छ नहीं है. ये प्रोटीन आम तौर पर सात डाइसल्फ़ाइड बांड के लिए एक के बीच में होते हैं, और सक्रिय होने के क्रम में सही डाइसल्फ़ाइड संबंधों पैटर्न के साथ ऑक्सीकरण किया जाना चाहिए. वर्तमान में, मंच FP7 यूरोपीय VENOMICS परियोजना (www.venomics.eu) के हिस्से के रूप में डाइसल्फ़ाइड युक्त पशु विष प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और लक्ष्य के हजारों की उच्च throughput अभिव्यक्ति के लिए उपन्यास प्रोटोकॉल बेंच मार्किंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है . इधर, एक स्वचालित विधिउच्च throughput छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और शोधन (चित्रा 1 देखें) के लिए प्रदान की जाती है डाइसल्फ़ाइड युक्त करने के लिए पशु विष प्रोटीन आवेदन किया. डाइसल्फ़ाइड अमीर पेप्टाइड और प्रोटीन के लिए रणनीति लक्ष्य प्रोटीन के लिए cleavable उसकी DsbC fusions बनाने शुद्धि और redox सक्रिय फ्यूजन साथी, DsbC के लिए एक उनकी-टैग, (देखें चित्र 2) का इस्तेमाल करता है.
प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित के साथ साथ एक तरल से निपटने रोबोट और HTP वैद्युतकणसंचलन का उपयोग स्वचालन है, इन तरीकों एक बुनियादी सेटअप के साथ भी प्रयोगशालाओं महंगे उपकरण के लिए किसी भी शर्त के बिना प्रोटोकॉल का लाभ ले सकते हैं जिसका अर्थ है कि यह भी एक उच्च throughput पुस्तिका दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं . शुद्धि और विश्लेषण (डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन के लिए विशिष्ट नहीं) के लिए परिवर्तन के लिए मैनुअल प्रोटोकॉल कहीं 24 प्रकाशित किया गया है और यहां दोहराया नहीं जाएगा. recombi द्वारा उत्पादित अभिव्यक्ति क्लोन से मैनुअल प्रक्रिया के throughput (,घुलनशील प्रोटीन के स्तर का विश्लेषण करने के लिए राष्ट्रीय क्लोनिंग 25,) एसडीएस पृष्ठ का पता लगाने के) या 384 (4 x 96 का उपयोग (96 है, (चित्रा 1 देखें)) प्रति सप्ताह संस्कृतियों डॉट धब्बा और एसडीएस पृष्ठ 26 का उपयोग. (जैसे एक कैलिपर GXII LabChip प्रणाली 22 के साथ के रूप में, एक तरल से निपटने रोबोट और डॉट धब्बा 26 या HTP वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर एक अर्द्ध स्वचालित तरीके से प्रदर्शन करते हैं तो यह बढ़ाया जा सकता है इस के साथ साथ वर्णित के रूप में एक सप्ताह से अधिक समानांतर में अप करने के लिए 1,152 (12 x 96) संस्कृतियों, को परिणाम) के विश्लेषण के लिए. नियमित मिलाते इन्क्यूबेटरों पर्याप्त वेंटिलेशन के लिए छोटी कक्षीय उच्च गति मिलाते इन्क्यूबेटरों के उपयोग की जरूरत है, जो 96 (DW96) स्वरूप, (मिलाते हुए गहरे कुएं में उगाई संस्कृतियों के विपरीत इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि संवर्धन गहरे कुएं 24 (DW24) प्रारूप में किया जाता है 800 rpm पर). ऑटो प्रेरण मीडिया 27 का उपयोग भी मार्गदर्शन प्रेरण कदम को नष्ट करने, अभिव्यक्ति सरल करता है. प्रयोगशालाओं पहले से ही पूर्व निर्धारित अभिव्यक्ति और पुरी का उपयोग यहां तक कि जहांदिखाएं शर्तों, इन बस दक्षता में सुधार करने के लिए इस HTP सिस्टम में सीधे हस्तांतरित किया जा सकता है. डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन के लिए उच्च throughput प्रदर्शन पाइपलाइन की एक विस्तृत योजनाबद्ध चित्रा 3 में प्रदान की जाती है. पाइपलाइन में मापदंडों हमें प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे उपयोगी स्थितियों का चयन करने की अनुमति दी है जो व्यापक प्रदर्शन प्रयोगों 11, 22, के आधार पर चयन किया गया था.
कैरेक्टराइजेशन नमूना के माइक्रोग्राम के दसियों पर्याप्त, या संवेदनशील कार्यात्मक assays और बाध्यकारी assays (उदाहरण के लिए, कम मात्रा HTP पैच दबाना सिस्टम 28) के लिए है, जहां पायलट अध्ययन में छोटे पैमाने पर अभिव्यक्ति से सीधे शुद्ध किया टैग प्रोटीन पर प्रदर्शन किया जा सकता है. वही भी टैग और प्रोटीज (रिवर्स चरण HPLC द्वारा, उदाहरण के लिए) को हटा रहे हैं, बशर्ते दरार के बाद untagged ठिकानों पर प्रदर्शन किया जा सकता है. गुणवत्ता नियंत्रण भी (उम्मीद आकार और ऑक्सीकरण सेंट पुष्टि करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता हैखाया) या chromatographic तरीकों () 29 पवित्रता या विविधता पुष्टि करने के लिए. कभी कभी दरार (विशेष रूप से खराब घुलनशील प्रोटीन 30,31 के लिए) अनावश्यक या भी अवांछनीय है टैग, तो इस प्रोटोकॉल दरार में वैकल्पिक है. भले ही, सभी निर्माणों में सीधे (चित्रा 2 और चर्चा देखें) दरार के बाद देशी प्रोटीन का उत्पादन करने के लक्ष्य जीन पूर्ववर्ती एक TEV प्रोटीज दरार साइट (ENLYFQ / [जी] 32) है. फ्यूजन टैग की दरार वांछित है, दरार दक्षता का विश्लेषण करने के लिए छोटे पैमाने पर (क्षालन अंश पर या 'कॉलम पर') का परीक्षण किया जा सकता है, बाद में बड़े पैमाने अप प्रयोगों के लिए पैदावार के विश्वसनीय अनुमान की आवश्यकता है और प्राप्त अगर स्थिति अनुकूलन.
आत्मीयता शुद्धि के दौरान इस्तेमाल मोतियों की मात्रा के लिए दो विकल्पों के प्रयोग के उद्देश्य और उम्मीदों के आधार पर कर रहे हैं. (पायलट assays या एमएस के लिए शुद्ध करने के लिए, या extrapol के लिए जितना संभव हो उतना प्रोटीन कब्जा करने में सक्षम होना करने के लिए) पैमाने अप पैदावार के लिए खाया राल के 200 μl के अंतिम मात्रा प्रणाली की संतृप्ति पहले 1-100 मिलीग्राम / एल संस्कृति की रेंज में घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति, इस्तेमाल किया जाना चाहिए) की धारा 8.1 में (प्रोटोकॉल (ए देखें) . प्रयोग का उद्देश्य घुलनशील प्रोटीन की कम मात्रा का पता लगाने हालांकि, अगर फिर राल के 50 μl के अंतिम मात्रा (बी (प्रोटोकॉल देख 0.1-25 मिलीग्राम / एल संस्कृति की रेंज में घुलनशील प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति, उपयुक्त है ) की धारा 8.2 में).
यदि जरूरी हुआ तो उत्पादन घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए पहचान की शर्तों का उपयोग आगे संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए शुद्ध लक्ष्य के मिलीग्राम मात्रा में प्राप्त करने के लिए, बढ़ाया जा सकता है. AFMB पर इस्तेमाल बड़े पैमाने अप प्रोटोकॉल का विवरण कहीं 22,24 चर्चा की गई है.
प्रयोगात्मक सेटअप, प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम के लिए प्रासंगिक आगे की जानकारी, संशोधनों और मुसीबत शूटिंग और तकनीक की सीमाओं डिस्क में प्रदान की जाती हैंussion. प्रयोगों शुरू होने से पहले चर्चा को पढ़ने के लिए धन्यवाद.
हम हर कदम पर 90% की सफलता दर की उम्मीद प्रोटोकॉल के दौरान (उदाहरण के लिए, संस्कृतियों के कम से कम 90% किसी भी कदम पर हो जाना चाहिए). प्रयोग में किसी भी कदम की सफलता की दर 90% से नीचे गिर जाता है, तो नमूने खारिज कर रहे हैं और प्रयोग निर्माणों का पूरा संग्रह के लिए दोहराया है. यह परीक्षण प्रोटीन पर अत्यधिक निर्भर हो जाएगा लेकिन, जैसा कि इस सफलता दर के रूप में घुलनशील प्रोटीन या 100% दक्षता के साथ फोड़ना कि निर्माणों के अनुपात में व्यक्त कि निर्माणों की संख्या के लिए लागू नहीं है.
रोबोट worktable के सेट अप के लिए विशिष्ट विवरण वैकल्पिक worktable सेट अप के लिए आवश्यक के रूप में हालांकि वे अनुकूलित किया जा सकता है, (यह भी देखें चित्रा 4) प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए प्रदान की जाती हैं. रोबोट हार्डवेयर (Tecan) एक 96 मल्टीचैनल हाथ (MCA96), रोबोट जोड़तोड़ (रोमा) और 8 चैनल तरल से निपटने सिर (के होते हैंLIHA). MCA96 उपयोग सभी कदम भी LIHA कदम के बीच धोया जा करने की आवश्यकता होगी क्योंकि हालांकि वे लंबे समय तक ले जाएगा, एक MCA96 उपलब्ध नहीं है अगर LIHA का उपयोग किया जा सकता है. रोबोट तकनीकी रूप से एक बाँझ वातावरण नहीं है, एंटीबायोटिक दवाओं का समावेश आम तौर पर संक्रमण या बाँझपन के साथ समस्या नहीं हैं कि यह सुनिश्चित करता है.
घुलनशील, जोड़, कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कोई एक सार्वभौमिक प्रोटोकॉल है. , लागत और समय कुशल होना कई लक्ष्यों के साथ काम कर रहे ज्यादातर प्रयोगशालाओं या प्रोटीन कोर सुविधाओं इसलिए लक्ष्य के बहुमत के लिए एक घुलनशील सक्रिय प्रोटीन प्राप्त करने के लिए चर का सबसे अच्छा 'सामान्य' संयोजन खोजने के लिए स्क्रीनिंग उच्च throughput प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग करें. हम डाइसल्फ़ाइड युक्त पेप्टाइड और प्रोटीन 11 के घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए एक आम तौर पर लागू फ्यूजन साथी होने के रूप में DsbC की पहचान की है. DsbC fusions और उच्च तरीकों का उपयोग करना, एक सप्ताह के भीतर कई लक्ष्यों के घुलनशील अभिव्यक्ति 11 देखा जा सकता है और फिर इस तरह के परिचय में चर्चा की उन के रूप में अतिरिक्त चर,, आगे अनुकूलन की आवश्यकता है कि उन ठिकानों पर बाद के दौर में जांच की जा सकती है. यहाँ बताया प्रोटोकॉल डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन और पेप्टाइड्स की अभिव्यक्ति के उद्देश्य से कर रहे हैं. हालांकि, उपयोगकर्ताओं के लिए विस्तार करने के इच्छुकएक उच्च throughput ढंग से ress गैर जालीदार प्रोटीन, इसी प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित किया गया है और कहीं 22,24 पाया जा सकता है.
उच्च throughput सेटअप घुलनशील अभिव्यक्ति या एक ही समय में कई लक्ष्य जीन के लिए (विभिन्न फ्यूजन टैग सहित) अभिव्यक्ति निर्माणों की एक बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए विभिन्न प्रोटीन की एक बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग सहित आवेदन की एक संख्या, (के लिए आदर्श है या एकाधिक अभिव्यक्ति की सफलता दर को बेहतर बनाने के क्रम में एक ही लक्ष्य) के लिए निर्माण करती है. मंच भी लक्ष्य की एक बड़ी संख्या पर नए प्रोटोकॉल की बेंच मार्किंग और सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य अनुप्रयोगों का एक भी मुश्किल लक्ष्य के लिए वेरिएंट की स्क्रीनिंग, उदाहरण के लिए, सभी orthologs या एक ही परिवार के सदस्य हैं, या एक प्रयोग में एक ही लक्ष्य की म्यूटेंट के एक पैनल के उत्पादन की सफलता का परीक्षण करने में शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल भी सह अभिव्यक्ति वैक्टर (बुद्धि के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया हैघंटे एक नीचे खींच और सही जटिल गठन और stoichiometry 33 पुष्टि करने के लिए और अधिक गहन biophysical विश्लेषण के बाद प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों के प्रारंभिक लक्षण वर्णन अनुमति देने के लिए) केवल प्रोटीन टैग किया. शुद्ध प्रोटीन की मात्रा सूक्ष्म assays (कार्यात्मक परीक्षण, प्रोटीन डीएनए 34 या प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत assays) के लिए कभी कभी उपयुक्त है. उच्च throughput अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग रणनीति के लिए कई फायदे हैं: (i) के लक्ष्यों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण करने की क्षमता या एक ही प्रयोग में चर की एक बड़ी संख्या है, (द्वितीय) लिमिटेड बैच को बैच विभिन्नता, (iii) सादगी और (v) स्वचालन के लिए क्षमता है, और ट्रैकिंग (vi) सादगी, बड़े पैमाने पर गहरे कुओं, (चतुर्थ) scalability और reproducibility का उपयोग कर एक छोटे पैमाने पर काम कर रहा है और व्यक्तिगत ट्यूब की (कोई लेबलिंग, कम से निपटने में आसानी ) मिश्रण में व्यक्तिगत ट्यूबों की हैंडलिंग के साथ तुलना थाली प्रारूप का उपयोग कर या क्लोन के आदान प्रदान जब शुरू की गलतियों.
<pवर्ग = "jove_content"> प्रोटोकॉल खंड में चर्चा नहीं है, नीचे संक्षेप में चर्चा की जाएगी कि प्रयोग की तैयारी के लिए कई महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं. एक और अधिक गहन चर्चा के लिए हमारे पिछले प्रकाशन 24 देखें. अधिकतम दक्षता के लिए, यह लक्ष्य की बड़ी संख्या के उप क्लोनिंग को आसान बनाने के लिए, उच्च throughput क्लोनिंग के लिए एक उपयुक्त प्रणाली के लिए फायदेमंद है. VENOMICS परियोजना के प्रारंभिक चरण के लिए, हम प्रति सप्ताह क्लोन के सैकड़ों की एक गति से किसी भी गंतव्य वेक्टर में subcloning की अनुमति देता है कि बहुमुखी गेटवे पुनर्संयोजन प्रणाली 25 का उपयोग. गेटवे पुनर्संयोजन क्लोनिंग के लिए प्रोटोकॉल Invitrogen वेबसाइट पर पाया जा सकता है. उच्च throughput क्लोनिंग के लिए अन्य विकल्पों की 37 क्लोनिंग बंधाव स्वतंत्र क्लोनिंग (एलआईसी) 35,36 और प्रतिबंध से मुक्त (आरएफ) शामिल हैं. प्रविष्टि क्लोन संग्रह से, टेम्पलेट डीएनए से पीसीआर द्वारा सहित, अभिव्यक्ति के लिए लक्ष्य जीन को प्राप्त करने के कई तरीके हैं या के रूप मेंVENOMICS परियोजना के लिए चुना रणनीति है जो कृत्रिम जीन है,. कृत्रिम जीन जीन और जीन संश्लेषण के प्रत्येक के अंत पर पुनर्संयोजन साइटों के साथ आदेश दिया जा सकता है लक्ष्य जीन अनुक्रम की आसान कोडोन अनुकूलन (दुर्लभ ई. कोलाई codons बाहर करने के लिए) की अनुमति देता है. यह सिफारिश की है, लेकिन जरूरी नहीं है. दुर्लभ codons की एक उच्च संख्या, Rosetta 2 (अत्यधिक ई. कोलाई में व्यक्त नहीं कर रहे हैं कि दुर्लभ codons के लिए tRNAs किया जाता है) (DE3) pLysS होते हैं कि कोडोन अनुकूलन के बिना लक्ष्य के लिए BL21 (DE3) pLysS से बेहतर उपयुक्त हो सकता है. कोशिका द्रव्य का सामान्य रूप से कम करने के वातावरण में डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी है कि सीमा उपलब्ध उपभेदों हैं, हमारे हाथ में है कि वे नियमित रूप से ई. के रूप में सफल नहीं किया गया है कोली 11 उपभेदों.विश्लेषणात्मक पैमाने संबंध शुद्धीकरण घुलनशील संलयन प्रोटीन की वसूली और पैदावार यों के क्रम में परीक्षण अभिव्यक्ति संस्कृतियों से किया जाता है. मात्रात्मक डेटा वें पर प्राप्त किया जा सकता हैसंस्कृति की 100 मिलीग्राम / एल – 0.1 की एक सीमा के भीतर व्यक्त संलयन प्रोटीन की ई घुलनशील पैदावार. एक लक्ष्य घुलनशील नहीं है, तो अलग फ्यूजन भागीदारों पीछा कर रहे हैं, इससे पहले वैकल्पिक अभिव्यक्ति और प्रेरण तापमान, उपभेदों या मीडिया का परीक्षण किया जा सकता है. डाइसल्फ़ाइड युक्त प्रोटीन की घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए, हम पहले से cytoplasmic अभिव्यक्ति 11 के लिए DsbC> DsbA> जीएसटी> MBP> TRX> उनकी-टैग के रूप में फ्यूजन भागीदारों के प्रभाव स्थान पर रहीं. Periplasmic अभिव्यक्ति डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्य का सफल तह सहायता कर सकते हैं कि एक और संभावना है. periplasm कोशिका द्रव्य से एक कम कम करने के वातावरण है और डाइसल्फ़ाइड संबंधों की सहायता के लिए उपयोगी redox संरक्षक होता है. DsbC, DsbA, और MBP प्रोटीन सामान्य रूप से उनके periplasmic संकेत दृश्यों से periplasm के लिए स्थानीय कर रहे हैं. इस तह की सहायता के लिए periplasmic अंतरिक्ष के लिए डाइसल्फ़ाइड युक्त लक्ष्य निर्देशित करने के लिए इन टैग का फायदा उठाने का अवसर प्रदान करता है. असभ्य लक्ष्यों के लिए, अगले कदम के पी के लिए किया जाएगा(यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है और यहाँ 3 से 9 चर्चा नहीं होगी) solubilize और refold, समावेश शरीर से अघुलनशील उसके टैग लक्ष्य urify. यह केवल एक या दो डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ लक्ष्य के लिए काफी आसान हो सकता है, लेकिन डाइसल्फ़ाइड बांड बढ़ जाती है की संख्या के रूप में तेजी से और अधिक मुश्किल हो जाता है सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, और विशेष रूप से चार या अधिक डाइसल्फ़ाइड बांड के साथ प्रोटीन और पेप्टाइड्स के लिए, यह इस तरह खमीर, कीट या स्तनधारी अभिव्यक्ति के रूप में और अधिक जटिल उत्पादन प्रणालियों प्रयास करने के लिए फायदेमंद हो सकता है.
Miniaturization और स्वचालन के क्षेत्र में प्रगति के साथ, HTP इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगशाला-on-a-चिप टेक्नोलॉजीज 28 निस्संदेह कार्यात्मक विश्लेषण के लिए भविष्य का रास्ता हो जाएगा. हम (शायद संरचनात्मक अध्ययन के अपवाद के साथ) इस बड़े पैमाने पर संस्कृतियों के लिए आवश्यकता नकारना होगा सबसे प्रयोजनों के लिए कि कल्पना. छोटे पैमाने संस्कृतियों अभिव्यक्ति की स्थिति स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन यह भी suf प्रदान करने में सक्षम हो जाएगा न केवलficient इन छोटी कार्यात्मक assays के लिए नमूने के बराबर है. कार्यात्मक विशेषता के लिए पर्याप्त मात्रा में समानांतर में कई लक्ष्यों का उत्पादन करने की क्षमता संवर्धन और प्लेटफार्मों के इन तरह के प्रयोग की लागत कम होगी, पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति और लक्षण अधिक लागत और समय प्रभावी हो जाएगा.
प्रोटोकॉल के साथ साथ FP7 यूरोपीय VENOMICS परियोजना के प्रारंभिक चरण में डाइसल्फ़ाइड युक्त पेप्टाइड और प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए लागू किया गया है. विष अक्सर दिलचस्प औषधीय क्षमता है कि bioactive पेप्टाइड्स का बहुत अच्छा स्रोत हैं. हालांकि, उनके उत्पादन की वजह से उनके जटिल डाइसल्फ़ाइड संबंध पैटर्न और छोटे आकार के लिए चुनौतीपूर्ण है. इस के साथ साथ वर्णित की तरह उच्च throughput प्लेटफार्मों का उपयोग कर, VENOMICS परियोजना प्रकृति में मनाया विविधता को पुन: पेश करने के लिए 10,000 उपन्यास विष पेप्टाइड्स के एक पुस्तकालय उत्पन्न करना है. इस पुस्तकालय डाइसल्फ़ाइड आर के लक्षण वर्णन के लिए दोहन किया जाएगानई दवाओं के विकास के उद्देश्य के साथ संभावित औषधीय या चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ आईसीएच पेप्टाइड्स. मंच वर्तमान VENOMICS परियोजना में उपयोग के लिए नए प्रोटोकॉल बेंच मार्किंग और मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम VENOMICS परियोजना, सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 स्वास्थ्य 2011-2015) के माध्यम से 278,346 ° यूरोपीय परियोजना अनुदान एन द्वारा समर्थित किया गया. VENOMICS परियोजना यूरोप में कई अनुसंधान संस्थानों और कंपनियों के बीच एक सहयोग है:
AFMB, ऐक्स मारसैल विश्वविद्यालय (फ्रांस), सीईए Saclay (फ्रांस), NZYTech (पुर्तगाल), SistemasGenomicos (स्पेन), यूनिवर्सिटी डी लीग (बेल्जियम), VenomeTech (फ्रांस), Vitamib (फ्रांस), न्यूजीलैंड फार्मा (डेनमार्क)
इस काम एकीकृत स्ट्रक्चरल बायोलॉजी (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01 के लिए फ्रेंच इंफ्रास्ट्रक्चर द्वारा समर्थित किया गया.
लेखकों को भी वीडियो की शूटिंग के लिए तैयारी के साथ सहायता के लिए श्री जेरेमी Turchetto धन्यवाद देना चाहूंगा.
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot | Tecan Group Ltd. | Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8 |
|
96-well PCR (PCR96) plates | Greiner Bio-One | 652270 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/ |
LB medium | Autoclaved for sterility. | ||
Antibiotic stocks | Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 °C. Use a 1 in 1000 dilution. | ||
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity | Greiner Bio-One | 780270 | Autoclaved for sterility. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/ |
Expression vectors | For the expression of target constructs. Store at −20 °C. | ||
BL21 (DE3) pLysS competent cells | Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C. | ||
Breathseal breathable adhesive film | Greiner Bio-One | 676050 | |
PCR machine with 96-well plate block | For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples. | ||
24-well sterile tissue culture plates | Greiner Bio-One | 662165 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/ |
LB-agar | Autoclaved for sterility. | ||
200 μl sterile disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 617 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw | Infors | AJ103 | Not essential, a regular shaking incubator can also be used. http://www.infors-ht.com/index.php/en/ |
Plate incubator | |||
Microtiter plate | For glycerol stocks and elution using purification protocol B. | ||
Glycerol | For the preparation of glycerol stocks. | ||
200 μl disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 616 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Adhesive tape pads | Qiagen | 19570 | http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads |
Bactinyl | Orapi Group | Or equivalent microbial disinfectant. | |
ZYP-5052 medium | See Table 1 for recipes of components. | ||
Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity | Whatman | 7701-5102 | Autoclaved for sterility. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102 |
Flat-bottomed, clear microtiter plate | Greiner Bio-One | 655101 | For absorbance readings. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/ |
Plate reading spectrophotometer | Optional. For measuring OD600nm of cultures. | ||
Centrifuge with rotor for deep well plates | Suitable for 3800 x g. | ||
Lysozyme | 50 mg/ml in water. Store at −20 °C. | ||
Imidazole ACS grade | Merck | IX0005-1 | A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield. |
Lysis buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods. | ||
Water bath | |||
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) | Misonix Inc. | Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis. | |
DNase | 2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C. | ||
Magnesium sulphate (MgSO4) | 2M stock in water, autoclaved. | ||
SDS-PAGE or Caliper sample buffer | |||
Binding buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
Wash buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
Elution buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity | Macherey-Nagel | 740686.4 | http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx |
200 μl disposable wide bore tips | Tecan Group Ltd. | 30 050 348 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin | GE Healthcare | 17-5318-02 | For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802 |
Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C. | ||
96-well 0.22 µm filter plate | Millipore | MSGV N22 10 | Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210 |
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment | Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion. | ||
Spectrophotometer and cuvettes | For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper. | ||
ZipTip pipette tips | Millipore | Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0 |
|
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted. |