Ett protokoll för kvantitativ, hög genomströmning uttryck screening och analytisk rening av fusionsproteiner från småskaliga Escherichia coli kulturer beskrivs och tillämpas på uttrycket av disulfid rika djur gift proteinmål.
Escherichia coli (E. coli) är den mest allmänt använda expressionssystem för produktion av rekombinanta proteiner för strukturella och funktionella studier. Emellertid är ibland krävande rening av proteiner, eftersom många proteiner uttrycks i en olöslig form. När du arbetar med svåra eller flera mål är det därför rekommenderat att använda hög kapacitet (HTP) proteinuttryck screening i liten skala (1-4 ml kulturer) för att snabbt identifiera förutsättningar för lösligt uttryck. För att klara av de olika strukturella genomik program labbet, en kvantitativ (i intervallet 0,1-100 mg / L kultur av rekombinant protein) och HTP proteinuttryck screening protokoll genomfördes på och godkänts för tusentals proteiner. Protokollen var automatiserade med användning av en flytande robothantering men kan även utföras manuellt utan specialutrustning.
Disulfid rika giftproteiner vinnerökande erkännande för sin potential som terapeutiska läkemedels leder. De kan vara mycket potent och selektiv, men deras komplexa disulfidbindning nätverk gör dem utmanande att producera. Som medlem i FP7 Europeiska Venomics projekt ( www.venomics.eu ), är vår utmaning att utveckla framgångsrika produktionsstrategier i syfte att ta fram tusentals nya gift proteiner för funktionell karakterisering. Med hjälp av redox egenskaper disulfidbindning isomeras DsbC anpassade vi vår HTP produktion rörledning för expressionen av oxiderade, funktionella gift peptider i E. coli-cytoplasman. De protokoll som även kan tillämpas på produktion av olika disulfid-rika proteiner. Här kan vi visa vår pipeline tillämpas på produktionen av djurgiftproteiner. Med de protokoll som beskrivs häri är det troligt att lösliga disulfid-rika proteiner kommer att erhållas i så lite som en vecka. Även från en liten skala, det finns potential att använda ee renade proteiner för att validera oxidationstal med masspektrometri, för karakterisering i pilotstudier, eller för känsliga mikroanalyser.
Motiverade av en positiv utveckling av genomik och accelererad av upptäckten av nya proteiner, har hög genomströmning rörledningar utvecklats för att parallellisera traditionella metoder för screening och identifiering av optimala proteinproduktionsstrategier. Potentiella variabler som ska optimeras innefattar, men är inte begränsade till, att variera expressionsstammar 1,2, temperatur 3,4, media 2,3, Mål varianter 5, fusionspartners 6-13, samexpression med chaperones 14,15, cytoplasmisk eller periplasmiska uttryck 16-18, och rening buffertkomponenter 3. Genom att implementera hög genomströmning metoder, många variabler eller flera mål kan testas parallellt med en hög verkningsgrad, samtidigt begränsa batch-till-batch variation. I vår erfarenhet, strategin ger också god reproducerbarhet vid uppskalning använder samma kultur (temperatur, media, luftning, etc.) och reningsförhållanden (samma restn, buffertar, etc.). Flera hög genomströmning plattformar har använts under det senaste decenniet för att identifiera förutsättningar för lösligt protein uttryck, nämligen genom olika parametrar som fusionspartner, uttryck stammar eller temperatur 19-23.
Vi använde nyligen vår high throughput screening för uttryck av lösliga disulfid-rika proteiner 11. Proteinerna som väljs inte bara från giftiga källor, men även disulfid rika hämmare från en rad olika arter, inklusive växter, grisar, kor och människor. Experimentet jämfördes effekten av 12 olika fusionspartner och tre olika uttrycks påfrestningar på lösligheten och vikning av 28 disulfid-nätformade proteiner. Vi visade att använda DsbC som en fusionspartner för produktion i stammen BL21 (DE3) pLysS kraftigt outproduced (i både avkastning och antal lösliga proteiner som erhållits) någon annan kombination av stam-och fusions testade 11. DenResultaten av detta experiment utgjorde grunden för anpassning vår ursprungliga allmänna hög genomströmning rörledning (som har använts för expression screening av ett brett spektrum av proteiner) 22,24 till en mer lämpad för uttryck av disulfid-rika mål. Disulfid rika proteiner från djur-gifter är av särskilt intresse. Gifter är en komplex blandning av bioaktiva peptider och proteiner, med potentiellt värde farmakologiskt och terapeutiskt. Emellertid är inte trivialt uttryck av disulfidbindning-innehållande proteiner. Dessa proteiner innehåller i allmänhet mellan 1-7 disulfidbindningar, och måste oxideras med de korrekta disulfid-bindningsmönster, för att vara aktiv. För närvarande är den plattform som används för screening av uttrycket av ett stort antal disulfidbind-rika djur-giftproteiner som en del av FP7 Europeiska VENOMICS Project (www.venomics.eu) och jämföra nya protokoll för hög genomströmning uttryck av tusentals av mål . Här, en automatisk metodär anordnad för hög genomströmning småskaligt uttryck screening och rening (se figur 1) som appliceras till disulfid rika djurgiftproteiner. Strategin för disulfid-rika peptider och proteiner utnyttjar en His-tag för rening och redox-aktiv fusionspartner, DsbC, vilket skapar klyvbara HIS-DsbC fusioner till målproteinerna (se figur 2).
Medan fokus i protokollen här är automatisering med hjälp av en vätskehanteringsrobot och HTP elektrofores, dessa metoder är också lämpliga för en hög genomströmning manuell inställning, vilket innebär att även laboratorier med en grundläggande inställning kan dra nytta av de protokoll utan någon förutsättning för dyr utrustning . Manuella protokoll för omvandling till rening och analys (ej specifik för disulfid-rika proteiner) har publicerats på annat håll 24 och kommer inte att upprepas här. Genomströmningen av den manuella proceduren (från expressionsklon, som produceras av rekombinantanationell kloning 25, till analys av lösliga proteinnivåer) är 96 (med användning av SDS-PAGE-detektion) eller 384 (4 x 96, med hjälp av dot blöt och SDS-PAGE 26) kulturer per vecka (se figur 1). Detta kan ökas om det utförs i ett halvautomatiskt sätt (med användning av en vätskehanteringsrobot och dot blot-26 eller HTP-elektrofores, såsom med en Caliper GXII LabChip systemet 22 för analys av resultat) och upp till 1152 (12 x 96) kulturer parallellt över en vecka, såsom beskrivs häri. Odling utförs i djup brunn 24 (DW24) format så att regelbundna skakar inkubatorer kan användas i motsats till kulturer odlade i djup brunn 96 (DW96)-format, vilket nödvändiggör användningen av korta omloppshöghastighets skakande inkubatorer för tillräcklig luftning (skakning vid 800 rpm). Användning av autoinduktion media 27 förenklar också uttryck, vilket eliminerar den manuella induktionssteget. Även där laboratorierna använder redan fördefinierade uttryck och purificering förhållanden, kan dessa överföras direkt till denna HTP system bara för att förbättra effektiviteten. Ett detaljerat schema av high throughput screening rörledning för disulfid-rika proteiner ges i figur 3. Parametrarna i rörledningen valdes ut baserat på omfattande screeningsexperiment 11, 22, som tillät oss att välja de mest användbara förhållanden för proteinproduktion.
Karaktärisering kan utföras på taggade proteiner som renats direkt från småskaliga uttrycken i pilotstudier där tiotals mikrogram av provet är tillräcklig eller för känsliga funktionella analyser och bindningsanalyser (t.ex. låg volym HTP patch clamp-system 28). Detsamma kan även utföras på de omärkta mål efter klyvning, förutsatt taggen och proteas avlägsnas (t ex genom omvänd fas-HPLC). Kvalitetskontrollen kan också genomföras med hjälp av masspektrometri (för att bekräfta den förväntade storleken och oxidation ståt) eller kromatografiska metoder (för att bekräfta renhet eller heterogenitet) 29. Ibland tagga klyvning är onödiga eller till och med önskvärt (speciellt för svårlösliga proteiner 30,31), så i detta protokoll klyvning är valfritt. Oavsett, i alla konstruktioner finns det en TEV-proteas-klyvningsställe (ENLYFQ / [G] 32) direkt föregår den målgen för att producera nativa proteinet efter klyvning (se figur 2 och diskussion). Om klyvning av fusions taggen önskas, kan klyvning testas (på elueringsfraktionen eller "på kolumnen") på liten skala för att analysera effektiviteten, optimera förhållanden om det behövs och få tillförlitliga uppskattningar av avkastningen för efterföljande skala upp experiment.
Det finns två alternativ för volymen av kulor används under affinitetsrening, beroende på vilka mål och förväntningar försöket. För att kunna fånga så mycket protein som möjligt (för att rena för pilot analyser eller MS, eller att extrapolåt att skala upp avkastningen) en slutlig volym på 200 l av plast bör användas, så att detektion av lösligt protein i intervallet 1-100 mg / L kultur före mättning av systemet (se protokoll (A) i avsnitt 8.1) . Men om syftet med experimentet är detektion av låga mängder av lösliga proteiner sedan en slutlig volym av 50 | il av harts är lämpligt, så att detekteringen av lösligt protein i intervallet från 0,1 till 25 mg / l kultur (se protokoll (B ) i avsnitt 8.2).
Produktionen kan skalas upp, om så erfordras, för erhållande av milligrammängder av renat mål för ytterligare strukturella och funktionella studier med användning av de villkor som fastställts för löslig uttryckning. Detaljerna i skal-up protokoll som används vid AFMB har diskuterats på andra ställen 22,24.
Ytterligare detaljer som är relevanta för den experimentuppställning, kritiska steg i protokollet, är ändringar och felsökning och begränsningar i den teknik som tillhandahålls på skivanussion. Läs diskussionen innan du börjar experimenten.
Under hela protokollen vi förväntar en framgång på 90% vid varje steg (till exempel, måste minst 90% av odlingarna växer vid varje steg). Om andelen framgångsrika varje steg i experimentet sjunker under 90% proverna kasseras och försöket upprepas för hela samlingen av konstruktioner. Emellertid är denna framgång inte tillämpliga på det antal konstruktioner som uttrycker som lösliga proteiner eller den andel av konstruktionerna som klyver med 100% effektivitet, eftersom detta kommer att vara mycket beroende av de testade proteinerna.
De specifika detaljerna för installation av roboten arbetsbord finns för varje protokoll (se även figur 4), men de kan anpassas efter behov för alternativa arbetsbord uppställningar. Roboten hårdvara (Tecan) består av en 96-multichannel arm (MCA96), robotmanipulator (Roma) och 8-kanals vätskehanteringshuvudet (Liha). Alla steg som utnyttjar MCA96 kan även utföras med användning av Liha om en MCA96 inte är tillgänglig, men de kommer att ta längre tid på grund av att Liha måste tvättas mellan stegen. Medan roboten är tekniskt sett inte en steril miljö, införandet av antibiotika ger i allmänhet att det inte finns problem med kontaminering eller sterilitet.
Det finns ingen enda universell protokoll för uttryck av lösliga, vikta, funktionella proteiner. För att vara kostnadseffektivt och tidseffektivt, de flesta laboratorier eller proteinkärnanläggningar som arbetar med flera mål använder därför hög genomströmning proteinuttryck screening för att hitta den bästa "generiska" kombination av variabler för att erhålla ett lösligt aktivt protein för de flesta målen. Vi har identifierat DsbC som en allmängiltig fusionspartner för lösliga uttryck av disulfid rika peptider och proteiner 11. Använda DsbC fusioner och hög genomströmning metoder, inom en vecka kan observeras den lösliga uttryck för flera mål 11 och sedan ytterligare variabler, t.ex. de som diskuterats i inledningen, kan screenas i efterföljande rundor på de mål som kräver ytterligare optimering. De protokoll som beskrivs häri är inriktade på expression av disulfid-rika proteiner och peptider. Men för användare som vill expRess icke-retikulerade proteiner i en hög genomströmning sätt, har de motsvarande protokoll som publicerats tidigare och kan hittas någon annanstans 22,24.
Den höga genomströmning inställning är idealisk för en rad tillämpningar, inklusive screening av ett stort antal olika proteiner för lösligt uttryck eller screening av ett stort antal uttryckskonstruktioner (inklusive olika fusions taggar) för flera mål gener samtidigt ( eller multipelexpressionskonstruktioner för ett enda mål) i syfte att förbättra andelen framgångsrika. Plattformen kan även användas för den riktmärkning och validering av nya protokoll på ett stort antal mål. Andra tillämpningar är screening av varianter för en enda svår mål, till exempel, alla ortologer eller medlemmar av samma familj, eller för att testa framgång för produktion av en panel av mutanter av ett enda mål i ett experiment. Detta protokoll har också använts i kombination med co-expressionsvektorer (with ett enda taggat protein) för att tillåta den pådragbara nedåt och preliminär karakterisering av protein-protein-komplex, följt av mer noggrann biofysisk analys för att bekräfta den korrekta komplexbildning och stökiometrin 33. Mängden protein renades är ibland lämplig för mikroanalyser (funktionstester, protein-DNA-34 eller protein-protein-interaktionsanalyser). Det finns flera fördelar med hög genomströmning uttryck screening strategi: (i) möjligheten att testa ett stort antal mål och ett stort antal variabler i ett enda experiment, (ii) begränsad batch-till-batch variation, (iii) enkelhet och arbeta på en mindre skala med hjälp av djupa brunnar, (iv) skalbarhet och reproducerbarhet i större skala, (v) möjligheterna till automatisering, och (vi) enkelhet i spårning och hantering (ingen märkning av enskilda rör, mindre misstag introduceras vid användning av plattformat än med behandling av enskilda rör i blandning eller utbyte av kloner).
<pclass = "jove_content"> Även om det inte diskuteras i protokollenheten, finns det flera viktiga överväganden för framställning av det experiment som kommer att diskuteras i korthet nedan. För en mer ingående diskussion se vår tidigare publikation 24. För maximal effektivitet är det fördelaktigt att ha ett lämpligt system för hög genomströmning kloning, för att förenkla subkloning av ett stort antal mål. För den inledande fasen av VENOMICS projektet använder vi den mångsidiga Gateway rekombinationssystemet 25 som tillåter subkloning i alla destinationer vektor i en takt av hundratals kloner per vecka. Protokoll för Gateway rekombination kloning finns på Invitrogen webbplats. Andra alternativ för hög genomströmning kloning inkluderar ligation oberoende kloning (LIC) 35,36 och begränsning Fritt (RF) kloning 37. Det finns flera sätt att få de mål gener för uttryck, bland annat genom PCR från mall-DNA, från entryklonen samlingar eller somsyntetiska gener, vilket är den strategi som valts för VENOMICS projektet. Syntetiska gener kan beställas med rekombinationsställen på varje ände av genen och gensyntes medger enkel kodon optimering av målgen-sekvensen (för att utesluta sällsynta E. coli-kodoner). Detta rekommenderas men inte nödvändigt. För mål utan kodon optimering som innehåller ett stort antal sällsynta kodon, Rosetta 2 (DE3) pLysS (som bär tRNA för sällsynta kodon som inte är mycket uttrycks i E. coli) kan vara bättre lämpade än BL21 (DE3) pLysS. Även om det finns stammar som finns att begränsa minskningen av disulfidbindningar i den normalt reducerande miljö i cytoplasman, i våra händer de inte har varit så framgångsrika som vanliga E. coli-stammar 11.Analytisk skala affinitetsrening utförs från provuttrycks kulturer för att återvinna de lösliga fusionsproteiner och kvantifiera avkastningen. Kvantitativa data kan erhållas på the lösliga utbyten av fusionsproteiner som uttrycks i intervallet 0,1 till 100 mg / L av kultur. Om ett mål inte är lösligt, kan alternativa uttryck och induktionstemperaturer, stammar eller media testas innan olika fusionspartners bedrivs. För lösligt uttryck för disulfid rika proteiner, tidigare rankad vi effekten av fusionspartners som DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-tagg för cytoplasmatisk uttryck 11. Periplasmisk uttryck är en annan möjlighet som kan hjälpa den framgångsrika vikning av disulfid rika mål. Periplasman är en mindre reducerande miljö än cytoplasman och innehåller nyttiga redox följeslagare att hjälpa disulfidbindning. DsbC, DsbA, och MBP-proteiner är normalt lokaliserad till periplasman av sina periplasmiska signalsekvenser. Detta ger möjlighet att utnyttja dessa taggar för att styra disulfid rika mål till periplasmautrymmet för att hjälpa vikning. För svår mål, skulle nästa steg vara att purify den olösliga HIS-märkta mål från inklusionskroppar, lösa och vik (detta är utanför ramen för detta protokoll och kommer inte att diskuteras här 3 9). Detta kan vara ganska enkelt för mål med endast en eller två disulfidbindningar, men blir allt svårare eftersom antalet disulfidbindningar ökar. Alternativt, och särskilt för proteiner och peptider med fyra eller flera disulfidbindningar, kan det vara fördelaktigt att försöka mer komplexa produktionssystem, såsom jäst-, insekts-eller däggdjursexpressions.
Med framsteg inom miniatyrisering och automation, kommer HTP elektro lab-on-a-chip-teknik 28 utan tvekan vara vägen för framtiden för funktionella analyser. Vi tänker oss att för de flesta ändamål (kanske med undantag av strukturstudier) kommer detta att förneka behovet av storskaliga kulturer. Småskaliga kulturer kommer inte bara att vara användbar för screening av expressionsförhållanden, men också att kunna tillhandahålla sufräckligt belopp av prov för dessa miniatyriserade funktionella analyser. Förmågan att producera multipla mål parallellt i tillräckliga mängder för funktionell karakterisering kommer att sänka kostnaderna för odling och användning av denna typ av plattformar kommer expression och karakterisering av rekombinanta proteiner att bli mer kostnads-och tidseffektiv.
De protokoll som häri har tillämpats på uttrycket av disulfid rika peptider och proteiner i den inledande fasen av FP7 Europeiska VENOMICS projekt. Gifter är en utmärkt källa till bioaktiva peptider som ofta har intressanta farmakologiska potential. Dock är deras produktion utmanande på grund av deras komplexa disulfid-bindningsmönster och liten storlek. Med hjälp av hög genomströmning plattformar som den som beskrivs häri, VENOMICS projektet syftar till att skapa ett bibliotek med 10.000 nya gift peptider för att återge mångfalden observerats i naturen. Detta bibliotek kommer att utnyttjas för karakterisering av disulfid-rich peptider med potential farmakologiska eller terapeutiska tillämpningar med syfte att utveckla nya läkemedel. Plattformen används för närvarande för benchmarking och validering av nya protokoll för användning i VENOMICS projektet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av The VENOMICS projektet europeiska projektbidrag nr 278346 genom det sjunde ramprogrammet (FP7 HÄLSA 2011-2015). Den VENOMICS Projektet är ett samarbete mellan flera forskningsinstitut och företag i Europa:
AFMB, Aix-Marseille Université (Frankrike), CEA Saclay (Frankrike), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanien), Universitet de Liège (Belgien), VenomeTech (Frankrike), Vitamib (Frankrike), Zealand Pharma (Danmark)
Detta arbete stöddes av den franska infrastruktur för integrerad strukturbiologi (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01.
Författarna vill också tacka Mr Jeremy Turchetto för att hjälpa till med förberedelserna för inspelningen av videon.
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot | Tecan Group Ltd. | Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8 |
|
96-well PCR (PCR96) plates | Greiner Bio-One | 652270 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/ |
LB medium | Autoclaved for sterility. | ||
Antibiotic stocks | Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 °C. Use a 1 in 1000 dilution. | ||
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity | Greiner Bio-One | 780270 | Autoclaved for sterility. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/ |
Expression vectors | For the expression of target constructs. Store at −20 °C. | ||
BL21 (DE3) pLysS competent cells | Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C. | ||
Breathseal breathable adhesive film | Greiner Bio-One | 676050 | |
PCR machine with 96-well plate block | For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples. | ||
24-well sterile tissue culture plates | Greiner Bio-One | 662165 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/ |
LB-agar | Autoclaved for sterility. | ||
200 μl sterile disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 617 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw | Infors | AJ103 | Not essential, a regular shaking incubator can also be used. http://www.infors-ht.com/index.php/en/ |
Plate incubator | |||
Microtiter plate | For glycerol stocks and elution using purification protocol B. | ||
Glycerol | For the preparation of glycerol stocks. | ||
200 μl disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 616 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Adhesive tape pads | Qiagen | 19570 | http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads |
Bactinyl | Orapi Group | Or equivalent microbial disinfectant. | |
ZYP-5052 medium | See Table 1 for recipes of components. | ||
Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity | Whatman | 7701-5102 | Autoclaved for sterility. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102 |
Flat-bottomed, clear microtiter plate | Greiner Bio-One | 655101 | For absorbance readings. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/ |
Plate reading spectrophotometer | Optional. For measuring OD600nm of cultures. | ||
Centrifuge with rotor for deep well plates | Suitable for 3800 x g. | ||
Lysozyme | 50 mg/ml in water. Store at −20 °C. | ||
Imidazole ACS grade | Merck | IX0005-1 | A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield. |
Lysis buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods. | ||
Water bath | |||
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) | Misonix Inc. | Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis. | |
DNase | 2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C. | ||
Magnesium sulphate (MgSO4) | 2M stock in water, autoclaved. | ||
SDS-PAGE or Caliper sample buffer | |||
Binding buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
Wash buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
Elution buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity | Macherey-Nagel | 740686.4 | http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx |
200 μl disposable wide bore tips | Tecan Group Ltd. | 30 050 348 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin | GE Healthcare | 17-5318-02 | For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802 |
Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C. | ||
96-well 0.22 µm filter plate | Millipore | MSGV N22 10 | Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210 |
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment | Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion. | ||
Spectrophotometer and cuvettes | For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper. | ||
ZipTip pipette tips | Millipore | Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0 |
|
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted. |