Summary
私たちは、ミクロンスケールのくびれのシーケンスを通過する細胞のためのタイムスケールを測定するためのマイクロ流体ベースのアッセイを実証する。
Abstract
ここでは、詳細設計、製作、及び効率的な方法で個別の多数の細胞の変形能を評価するためのマイクロ流体デバイスの使用。典型的には、約10 2細胞についてのデータは、1時間の実験内で取得することができる。自動画像解析プログラムは、数時間以内に完了することが処理を可能にする、画像データを効率的に後の実験分析を可能にする。細胞は、それによってアッセイされるべき個体の細胞の初期変形及び時間依存性弛緩を可能にする、ミクロンスケールのくびれ一連の変形しなければならないという点で、私たちのデバイス形状が独特である。人間の前骨髄球性白血病（HL-60）細胞へのこの方法の適用が実証されている。圧力駆動流を用いたミクロンスケールのくびれを通って変形するようにセルを駆動する、私たちは人間の前骨髄球（HL-60）細胞が瞬間的に、その後の収縮によって、より迅速に継代する前に、9.3ミリ秒の時間の中央値の最初のくびれを塞ぐことを観察くびれあたり4.0ミリ秒の中央値は走行時間を有するイオン。これとは対照的に、オールトランスレチノイン酸処理（好中球型）HL-60細胞は、3.3ミリ秒の中央値は走行時間とその後のくびれを通して継代前にだけ4.3ミリの最初のくびれを塞ぐ。この方法は、細胞の粘弾性的性質への洞察を提供し、最終的には、この動作の分子の起源を明らかにすることができます。
Introduction
細胞形状の変化は、多くの生物学的状況において重要である。例えば、赤血球および白血球は、独自の1直径よりも小さい毛細血管を変形させる。転移では、癌細胞は、セカンダリサイト2でシードする狭い間質ギャップだけでなく、曲がりくねった血管系とリンパのネットワークを介して変形させる必要があります。個別のセルの物理的挙動を調査するために、マイクロ流体デバイスは、狭い隙間3を通って移動し、受動的にミクロンスケールのくびれ3-9を通じて変形させる能力を含む、細胞挙動の範囲を研究するためにカスタマイズすることができる理想的なプラットフォームを提示します。ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスは、光学顕微鏡を用いて可視化し、基本的な画像処理ツールを用いて分析されるべき細胞の変形を可能にする、光学的に透明である。また、くびれのアレイを正確に同時に複数の細胞の分析を可能にする、定義することができ多くの既存の技術10,11を超えるスループット。
ここでは、「セルフォーマ」PDMSマイクロ流体デバイスを用いて細胞変形能をプロービングするための詳細な実験プロトコルを提示する。デバイスが設計され、順次くびれを通して細胞は継代するように。このジオメトリは、肺毛細血管床12のような生理学的文脈で一般的です。細胞変形能を測定するために、通過時間は容易に単収縮4,6を介して通過する個別の細胞に必要な時間として測定される便利なメトリックを提供する。細胞通過中のくびれチャネルにわたる圧力降下を一定に保つために、圧力駆動流を使用する。私たちのプロトコルは、細胞がくびれ一連の変形させるまでの時間を測定するためのデバイス設計および製造、圧力駆動流によるデバイス動作、細胞の調製およびイメージングだけでなく、画像処理の詳細な手順が含まれています。私たちは、デバイス設計と補助ファイルなどの視覚データ処理コードの両方。データの代表的なサンプルとして、継代くびれの数の関数として収縮一連のセル通過時間を示している。トランジットへの細胞のためのタイムスケールの分析は、マイクロ流体デバイスの狭いくびれ細胞型4,5,13の多様な変形能の違いを明らかにすることができるけれども。ここで実証したデバイスは、一意にミクロンスケールのくびれ一連の細胞輸送を調査。この設計は、細胞が循環中に体験し、また、そのような緩和時間などの細胞の追加の物理的特性をプロービング可能に曲がりくねった経路をエミュレートします。
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Protocol
1マイクロ流体デバイス設計
NOTE：入口ポート、セルフィルタ、狭窄アレイ、及び出口ポート（ 図1）：デバイスの設計は、4つの基本的な機能領域を有している。全体的な設計は、寸法の微調整を、細胞型の広い配列に適用することができる。プライマリおよび不死化細胞の選択のために有効なデバイスパラメータと一緒にいくつかの基本的な設計上の推奨事項は、ここで提供される。
- 平均気泡径の約30〜50％であることがくびれアレイチャネルの幅（ 図1B）を選択し;この有意な細胞変形が、最小の目詰まりの狭窄と細胞のサイズ比をもたらす。以前にテストされていない細胞型を考えると、最適な幅を見つけるために〜30〜50％の細胞直径を収縮幅の範囲を設計することが賢明である。マイクロ流体デバイスの多くのタイプと同様に、120以上のデバイスのマスターモールドは、罪にパターニングすることができる異なるデバイス設計の配列を可能にするGLE 4インチシリコンウェハは、単一の製造プロセスで製造される。
- 細胞直径の少なくとも50％であることが流路高さを選択し;これは、セルが2次元的に閉じ込められるようにします。デバイス全体：接合時のチャネルの崩壊を防止するために、チャネルのアスペクト比1:10（幅、高さ）以上であることを確認してください。このアスペクト比を超えていなければならないチャンネルでは、崩壊を防ぐために支柱を追加します。細胞の流れを妨げないための少なくとも2倍の細胞の直径である距離の空間支柱。
- 破片を除去し、細胞クラスター（ 図1B）を脱凝集する入口ポートにフィルタを含む。ポストを隔てる距離は、一つのセルの直径にほぼ等しくなるように、フィルタのポストのサイズと間隔を調整する。
注：フィーチャーサイズの下限はリソグラフィマスクが印刷される解像度によって設定される。すべての機能は解像度の範囲内であることを確認してくださいマスク供給者によって指定されたolution制限。
2。サプライと準備
注：いずれかの実験を開始する前に、次の項目が用意されなければならない。全体のセットアップの概略図を図1に示す。
- リソグラフィ微細加工14,15のための標準的な技術を使用してデバイス·マスタを作製する。プロフィルを用いてパターンの機能の高さを確認してください。
注：マスターを容易にクリーンルーム施設で製造することができるが、いくつかの研究室は、半クリーン環境16,17における使用のための安価なリソグラフィ方法を開発した。 - 圧縮空気と空気レギュレータおよび付属品（ 図1A）の配列のタンクを使用して、圧力駆動流のための空気源を準備します。
- 空気供給タンクと手動調整器を設定します。
注：空気中に5％の組成はCO 2は 、典型的な細胞培養incubatoと同様の環境を維持しますrは、他のガス混合物を使用することもできる。 - インライン手動レギュレータと電子制御式圧力調整器を設定します。 2未満キロパスカルの圧力変動で、調整し、チャネル間で安定した圧力降下を維持するために、電空変換器を使用してください。入力に所望の圧力をLabVIEWで書かれた簡単なコード（補足情報）を使用します。
注：電空変換器は、マイクロ流体デバイス間で所定の圧力に一致するようにバルブ出口圧力を調整するために内部帰還ループを使用しています。 - 細胞懸濁液の流れを駆動するために加圧室を設定する。チューブ標準的なフローサイトメーターとチューブの圧力気密シールを作成し、機械加工されたキャップの外に細胞懸濁液チャンバーを組み立てます。
注：細胞が装置内に加圧室から流出それを通して圧縮空気タンクに接続し、入口、および出口（Figur：圧力室キャップは、2つのオリフィスを含んでいるE 2）。
- 空気供給タンクと手動調整器を設定します。
- くびれアレイを流れる細胞の画像を捕捉する秒当たり少なくとも100フレームの取得速度を有するカメラを装着した倒立顕微鏡を設定する。ビデオキャプチャカードとコンピュータとカメラをインターフェイス。
- 細胞培地溶液にF127を少量添加するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で/ wのプルロニックF-127の10％wストック界面活性剤溶液を調製PDMSの壁への細胞接着を最小限にするために役立つ。 F127を溶解させ、37℃で穏やかにF127溶液を、ボルテックスし、熱を調製した。使用前に、室温で0.2μmのシリンジフィルターとストアに溶液を通過させる。以上の24時間持続する泡を生成しますボルテックスおよびフィルタリングなど事前に界面活性剤溶液を調製します。
3マイクロ流体デバイスの製造
- マイクロ流体チャネルを有するPDMSブロックを製作。
- ミックスPDMS徹底的に1:10 taの比（w / w）のベースに硬化剤。
- デバイスのマスター（ステップ2.1）上の混合物を注ぐ。真空を適用しながらベルジャー内ドガ閉じ込められた気泡が消えるまで、または約10〜20分。
注：この後、まだ正常な空気-PDMS界面で気泡があるかもしれない。これらは通常、焼成時に消費します。これは、チャネルに隣接する残存気泡がないことを確実にするために最も重要である。 - 4時間65℃で、脱気したデバイスを焼く。崩壊チャンネルを防止するために、更なるチャンネルの崩壊に対してより耐性が高い弾性率を有するデバイスのためのPDMSを架橋するために、一晩デバイスを焼く。しかし、ベーキング拡張ノートも、PDMSを脆化さとホール（ステップ3.3）を打ち抜く際にクラックが発生する場合があります。
- マスターモールドからマイクロ流体デバイスを削除します。かみそりの刃でPDMSブロックのうちの個別のマイクロ流体デバイスをカットし、マストからデバイスを削除えー。優しくデバイスの一角をリフトオフすることから始めます。遅いと穏やかな剥離が、まっすぐにPDMSブロックを持ち上げるとは対照的に、PDMSおよびマスターの両方のストレスを軽減します。
- チューブとマイクロチャネル間のアクセスのための接続ポートを作成するために、PDMSデバイスに穴をパンチ。生検パンチを使用して穴を作成し、デバイスの外側に至るチャンネル側からパンチ。
注：0.75ミリメートル内径穴を作成し、そのインターフェイスを完全エーテルエーテルケトンとエーテルケトン（PEEK）、チューブ（外径= 32,1 "または0.79ミリメートル）またはポリエチレンチューブ（PE-20、外径= 0.043"または1.09ミリメートルと生検パンチ）。浅いチャネル18を備えたデバイスに穴を視覚化するためにリングライトを使用してください。生検パンチがシャープであることを確認してください。繰り返し使用した後に刃先が鈍くや生検パンチは廃棄、交換する必要があります。 - PDMSのほこりや提出チャンクを除去するためにイソプロパノール（HPLCグレード）でPDMSデバイスをすすぐ。ことを確認してくださいパンチ穴は貫通穴スクイーズボトルから純粋なイソプロパノールの安定した流れを向けることによってデブリの明確である。ろ過された空気で乾燥ブロー。洗浄後、チャンネルの場所PDMSブロックは、デバイスの清浄度を維持するためのクリーンなペトリ皿に表向き。ボンディングまで、この形で、店のデバイスが必要な場合。
- メタノール（HPLCグレード）を洗浄することにより、ガラス基板を清掃し、濾過空気でブロー乾燥し、ガラスは、プラズマ処理の前に完全に清潔で乾燥していることを確認するために5〜10分間、200℃のホットプレート上に置きます。
注：ガラス基板は、各チャネルの底部を形成する。 10Xまたは20Xの目的は、並列に複数のチャネルを画像化するために理想的であるので、典型的にはガラススライドは、十分である。高解像度イメージングのために、カバースリップ（＃1.5厚さ）にデバイスを接着する。 - ガラス基板にPDMSデバイスを接着。
- 酸素プラズマは、チャネルPDMSブロックの側面とガラススライドの1側面を扱う。
注：Wハンドヘルド排出部番目、1分の処理時間を使用するが、各酸素プラズマ装置のための処理時間を最適化する。 - 処理直後のガラスの処理面の上にPDMSのチャンネル側に配置します。
- 結合を促進するために〜10秒間軽い圧力と一緒に持ってください。結合強度を改善するために、少なくとも15分間、高温（60〜80℃）で、装置全体焼く。
- 酸素プラズマは、チャネルPDMSブロックの側面とガラススライドの1側面を扱う。
4。くびれチャンネルを通して細胞を変形させる
- 顕微鏡下でマイクロ流体デバイスを調べます。チャンネルが崩壊したり、壊れていないことを確認し、両方の入口と出口の穴が低消費電力目標（10X）を使用して、デバイスのチャネルに直接接続すること。かみそりの刃でPDMSの表面を採点することによって欠陥デバイスを指定し、実験のために利用していない。
- 細胞培養試料を調製するアッセイされる。標準的な条件を用いて培養細胞。
- Fまたは、例えば、37℃で5％CO 2インキュベーター中で1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液および10％ウシ胎児血清を補充したRPMI-1640培地中で培養するHL-60細胞。
- 接着細胞の場合は、新鮮な増殖培地中のトリプシン処理および再懸濁することにより、それらを収穫。標準のトリプシン処理プロトコルを使用します。例えば、25cm 2の培養面積を有するフラスコに〜0.5ミリリットルのトリプシンを追加して、〜30ミリリットル新鮮な培地を再懸濁。以前19,20に記載されているように1×10 5細胞/ mlあたり5μMの最終濃度で、全トランスレチノイン（ATRA）による好中球系細胞へのHL-60細胞を分化する。
- 遠心3分間300×gで細胞を慎重に0.1％（v / v）のF-127を含む新鮮な培養培地中で適切な最終密度に再懸濁した細胞上清を吸引除去する。
- コールターカウンター、血球計を用いて細胞を数えるか、フローサイトメーター。 1×10 6×10 5個の密度に細胞懸濁液を調整
- チューブフローサイトメーターで細胞懸濁液を置き、圧力キャップに接続します。細胞懸濁液は、チューブの先端から出てくるまでは、マイクロ流体デバイスにチューブを接続する前に、約14〜21キロパスカルの圧力とフラッシュを調整します。これはチューブと、デバイス内の気泡を最小限に抑えるのに役立ちます。
- デバイスの入口に細胞懸濁液を含むチューブの先端を挿入します。デバイスは、カバースリップに接着されている場合は、配管を接続する前に、そのような顕微鏡ステージなどの平らな固体表面上に置か;カバーガラスは壊れやすく、それ以外の場合は破損する可能性があります。
- チューブのintの部分を挿入します廃棄物収集のための空のチューブに出口や経路をOなどの顕微鏡ステージの側面にテープで留め、空のファルコンチューブなど。実験間のデバイスの全体の流体抵抗値の一貫性を保つために、入口と出口のチューブが各実験の同じ直径とほぼ同じ長さであることを確認してください。
- 静かに約28キロパスカルの圧力を立ち上げるか、細胞がチャネルを通って流れるまで。複数のチャネルが視野にあり、画面の下部に垂直であるように、デバイスの位置を決めます。カメラは、データサイズによって制限されている場合は、独立したデータポイントの十分な数を生成するために、複数の動画を取得する。所望のデータ出力のために必要に応じてフレームレートを調整します。毎秒300フレーム（fps）での高速イメージングを使用して、細胞形状の変化をキャプチャするには、細胞の通過時間を測定するために、およそ100コマのフレームレートを使用する。
5。データ解析
- ファイルマストを開きer_script.m（ダウンロード補足ファイル）、プログラムを実行します。
- 表示されるWindowsエクスプローラのウィンドウから分析すべき最初のビデオを選択します。選択されたビデオのフレームレートを指定し、Enterキーを押します。
注：図は、それは最初のビデオのための長方形のトリミングウィンドウを選択するようにユーザに促す表示されます。 - 左から右へのすべてのチャネルを包含し、ちょうど上部と下部（ 図3）でのチャンネルの配列の最初の電球の上のチャネルと交差するウィンドウを選択します。
- トリミングされた画像からくびれ領域を選択します。選択されたすべてのビデオのための上部と下部のウィンドウ境界の間の固定ピクセル距離を維持するために特別な注意を払ってください。
注：トップウィンドウの端が最上位のくびれを指定し、下部のウィンドウの端を一番下のくびれ（ 図4）を指定します。中間くびれは、このユーザー入力から近似される。次に、アルゴリズムは、sが表示され各ビデオの最初の50フレームのための細胞のegmentation（ 図5）。 - アルゴリズムは正確に細胞を配置しているかどうかを判断するために密接に左上の画像（ 図5A）を監視する。値化画像が識別されたセルの位置を示すためにソースビデオに重畳される。
注：異なるウィンドウ（ 図5B-5D）をコード診断のためであり、特定の画像処理後のビデオフレームを実証する。 - Windowsエクスプローラのウィンドウから次に処理するビデオを選択します。
注：このアルゴリズムは、選択された各ビデオのためのステップ5.2〜5.5を繰り返します。 - [キャンセル]を選択し、一度、すべての目的のビデオは、ビデオリストが完成し、関数に指示するWindowsエクスプローラのウィンドウを経由して追加されました。
注：このアルゴリズムは、ユーザーの介入なしに残りの操作を実行します。これは、処理されたビデオとコンピュータのPEの数に応じて約1〜2時間かかりますrformance。完了すると、アルゴリズムは、通過時間データのヒストグラムが生成されますし、MATLAB .MATファイルおよびMicrosoft Excelの.xlsファイルとしてディレクトリ内のデータを保存します。
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Representative Results
異なる細胞型、ヒト骨髄性白血病細胞（HL-60）、分化した好中球細胞、マウスリンパ球細胞、およびヒト卵巣癌細胞系（OVCAR8、HEYA8）の変形性を調査するために「セルフォーマ 'マイクロ流体技術を用いて評価される。 図6に示すように、HL-60および好中球型HL-60細胞の通過時間のための代表的な結果は、くびれの一連通過する単一の細胞のための時間スケールを示す。トランジット時間は、個別の細胞集団で測定する28キロパスカル（ 図6）の駆動圧で7くびれの系列の各7μmの収縮。
図6に示すように、HL-60細胞は一時的に、その後のくびれを通して継代前に9.3ミリ秒の時間の中央値の最初のくびれを塞ぐ。対照的に、好中球型HL-60細胞は、以前にのみ4.3ミリ秒の最初の狭窄を塞ぐ継代。原子間力顕微鏡21とマイクロピペット吸引22によって決定されたHL-60細胞の短い通過時間は、それらの還元弾性及び粘性モジュラスと一致している。これらの結果は、ミクロンスケールのギャップ23を介して、細胞の通過時間を決定mechanoregulatingタンパク質、ラミンA、レベルの低下と一致している。いったん最初のくびれを通して、HL-60細胞のための4.0ミリ秒と好中球型細胞のための3.3ミリ秒の中央値は通過時間との2から7までの残りのくびれを経て、より迅速に細胞の輸送、（ 図6）。 HL-60細胞はまだ少し長く示すが、有意な通過時間（C2-C7はp = 1.7E-9）が、狭窄部2-7の通過時間の分布は、各細胞型についてほぼ同一である。最初の狭窄のために必要な長い通過時間の観察は、粘弾性細胞は完全にその初期形状oをに緩和しないことを反映してもよいnはこれらの〜ミリ秒の時間スケール。この動作は、セル内の開発、およびその後のミクロンスケールのギャップを介してその通過を容易に不可逆的な構造変化によって説明することができる。重要なことは、細胞集団間の通過時間を比較することによっても、最初の狭窄のために、それらの変形23の違いを明らかにすることができる。
実験装置の模式図1図。 。入口ポート、セルフィルタ、くびれアレイ及び出口ポート：A.「セルフォーマ」周辺接続を示す実験セットアップでデバイスBのデバイス設計は、4機能領域を持っています。その主な特徴を示すマイクロ流体デバイスのアーキテクチャ;挿入図は、くびれのチャネルの透過光画像を示している。スケール、10μ ;メートル。
カスタムキャップのための図2。エンジニアリング図面は、チューブ、フローサイトメーターに含まれる細胞培地を加圧する 。
ビデオ·フレーム·トリミングのための関心領域を選択する方法の3デモンストレーション図。
くびれの場所を選択する方法の4デモンストレーション図。
51474fig5highres.jpg "幅=" 500 "/>
図5観測窓は、彼らが狭窄アレイを介して処理するようなアルゴリズムが適切にセル位置を識別していることを確認するために使用。 。A.二値画像は、細胞の位置を表示するようにソースビデオに重畳されたB.差画像である。C.ボトムハットフィルタ処理された画像を、Dの中央値は、濾過した。
くびれ数の関数として6。代表通過時間の測定図。 A. HL-60細胞はB. ATRAで処理したHL-60（好中球型）の細胞よりも第一のくびれを通って長い通過時間を示す。ノンパラメトリックマンホイットニー検定を用いて評価し、第1狭窄部を介して形質転換された経過時間（log10の）の比較が明らかに差はp = 1.47E-5有意である。細胞通常、最初のくびれを通る通過よりもゆっくりその後のくびれ。データは28キロパスカルの駆動圧力で7μmの幅のくびれを通して通過細胞についてここに示されています。セル密度、セル径、および界面活性剤濃度を表1に与えられている意味HL-60、N = 77; ATRAで処理したHL-60、N = 97の結果は、異なる3日間にわたって独立した実験で繰り返した。
通過時間を測定するためのMATLABスクリプトの図7の概要。最初のループは、各ビデオの最初の50フレームのため、ユーザーの介入との観測が必要です。最初のループの後、全体のプログラムはユーザーの介入なしで実行し、自動的にコンパイルされ、人口データをプロットします。
表1は、従来の細胞系およびその動作条件を検討した。
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Discussion
ここでは、圧力駆動流を使用してくびれたマイクロ流体チャネルを通して通過する細胞の変形を分析するための総合的な実験手順を提供する。 MATLABスクリプトは、自動データ処理（補足資料）を可能にし、コードの更新バージョン（維持されているwww.ibp.ucla.edu/research/rowat ）。より広義に、ここに提示技術は、細胞骨格の影響、核硬化剤24,23、ならびに癌細胞タイプ4,5の変形能をアッセイすることを含む、多くの細胞ベースのマイクロ流体アッセイに適合させることができる。画像の細胞内変形をより高解像度の顕微鏡検査と一緒になって、この方法は、細胞の機械的特性および生理学的および病理学的状態で発生する変化を研究するための強力なアプローチを提供します。
自動セル処理アルゴリズム
図7に概説されており、MATLAB関数のセットを補足設けられている。簡単に説明すると、ユーザは、分析するためにすべての動画を選択するように指示される。関心領域のための各ビデオをトリミング。やビデオのセットのフレームレートを指定します。その後、ソフトウェアは自動的に各狭窄のための各セルの通過時間を決定するためにビデオデータを処理する。動作させるためのスクリプトための一定の要件があります。細胞は、ビデオ内のフレームの下部に、フレームの上から流れるべき。マイクロ流体デバイスの位置と照明条件は、ビデオの持続時間にわたって大きく変化してはならない。やビデオをaviファイル形式にする必要があります。重要なことに、追跡アルゴリズムは、両方が約8秒である単一のビデオ録画の時間窓に入力し、継代細胞を含む。したがって、いずれのより長い輸送時間を持つオブジェクトは、分析から除外される。バックグラウンド減算を行うことにより、映像全体にわたって存在しているオブジェクトが分析から除外されている。コードは、ユーザが設定していてもよい低級サイズのカットオフを、実装しています。ビデオ分析のためのサイズのカットオフは2.7ミクロンの気泡径に相当する5ピクセル、だった。
高速ビデオデータファイル（〜500メガバイト）かなりすることができるので、プログラムは計算集約的である。コードが最も効率的に、少なくとも6 GBのRAM、およびローカルハードディスクに少なくとも1 TBの容量を持つドライブまたはいずれかと64ビットのチップセットを搭載したデスクトップコンピュータを使用して実行され、USB 3.0を持つ大規模な外付けハードドライブやデータサーバとインタフェース、のFireWire、またはイーサネット接続。データは、結果の迅速な可視化のためのヒストグラム形式で出力され;それはまた、MATLAB（.MAT）データファイルとExcelスプレッドシートに格納されたデータとして表にされている。
広報のコードesentedは、各狭窄を通過する細胞のための通過時間を分析することによって細胞集団を比較する簡単な方法を提供する。より詳細な分析のために、コードは、セルサイズ、アスペクト比、ならびに緩和時間スケールを含む他のパラメータを調査するために拡張することができる。以前の研究は、通過時間6上の細胞の大きさの弱い依存性を明らかにする。
デバイス関連の落とし穴
閉塞されたチャンネルは、任意の流動実験では大きな障害である。装置の壁への細胞接着は、くびれチャネルを介して細胞のフローを損なうであろう：細胞がチャネル壁に沿って不鮮明にすることが観察されてもよい。付着を防止するために、F-127との適切な表面処理が必須である。
25,26 PDMSが一時的に親水性のレンダリングプラズマ処理後の経時変化PDMSの表面特性。一週間の間に、親水性のPDMS表面をゆっくりと解除それらの天然の疎水性表面エネルギーに生成する。これは、チャネルを介して気泡の除去に挑戦することができる。デバイスは、このように、プラズマ処理の7日以内に使用する必要があります。最も重要なのは、プラズマ処理、変形性アッセイとの間の時間は、すべての実験全体で一貫している必要があります。
私たちは正常にガラス床三PDMS壁に製造されたデバイスを使用して、異なる細胞型の間の通過時間を区別しているが、彼 らはすべての4つのチャネル壁27上に均一な表面特性を持っているので、デバイスも作製することができる。 PDMSデバイスは、薄いPDMS層をスピンコーティングガラス基板に接合することができる：5（w / w）のデバイス型に注ぎ、65℃で20分間硬化：1の割合でベースに硬化剤を混合する。一方、1:20薄層をスピンコート（w / w）のガラス基板上にベースに硬化剤; 4分間85℃で焼く。 PDMSで被覆されたスライドにPDMSデバイスを配置し、一晩焼付塗装接合を完了します。ガラス-PDMS結合プラズマ装置が利用できない場合、この方法も有用である。
電池関連の落とし穴。
細胞懸濁液を調製鶏、細胞の密度が重要である：細胞密度が低すぎると、細胞通過イベントが頻繁になる。細胞密度が高すぎると、同時に単一のチャネルを継代する複数のセルが存在する、単セルを横切る圧力降下が一致しないであろう、そしてそれは、自動化スクリプトを使用して個別のセルの輪郭を描くことは困難である。
実験は、典型的に製造される細胞懸濁液の30分以内に行われている間、細胞は> 30分より長い時間にわたって圧力室の底に沈降することができる。より長い期間にわたって沈降を避けるために、圧力室と接続するチューブを定期的に回転させることができる。長い実験のために、小さな磁気撹拌棒は、CEに加えることができる細胞を攪拌し、沈降を防止するために、圧力室の下方に位置する攪拌プレートとllの懸濁液。
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Disclosures
著者らは、開示することは利害関係はありません。
Acknowledgments
著者らはこの技術の初期のバージョンでは建設的な入力のためにロイドウンを承認したいと思い、圧力キャップを製造する際に彼の助けのための圧力キャップのデザインのヒント博士ジェレミーアグレスティ、博士東平チー。私たちは、テストのための細胞サンプルのさまざまなを提供するための、M Teitell及びP. Gunaratneの研究室に感謝しています。私たちは、この作業を支援するための国立科学財団（CAREER賞DBI-1254185）、UCLAジョンソン総合がんセンター、UCLAの臨床およびトランスレーショナル科学研究所に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
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