Summary
Bu mikron çaplı daralması bir düzeni sekansından geçerken hücre için gereken süreden daha ölçmek için mikroflüidik bazlı analiz göstermektedir.
Abstract
Burada verimli bir şekilde tek tek hücrelerin çok sayıda deforme değerlendirilmesi için ayrıntılı bir mikroakışkan cihazın tasarımı, imalat, ve Kullanım. Tipik olarak, 10 ~ 2 hücreleri için veriler, 1 saat deney içinde elde edilebilir. Otomatik bir görüntü analiz programı ile birkaç saat içinde tamamlanması için olanak sağlama, görüntü verilerinin etkili deney sonrası analiz sağlar. Bizim cihaz geometri hücreleri böylece, ilk ve tek tek hücrelerin deformasyon zamana bağlı gevşeme denenecek sağlayan mikron çaplı boğumların bir dizi deforme gerekmesi açısından benzersizdir. Insan promiyelositik lösemi (HL-60) hücreleri, bu yöntemin uygulanabilirliği gösterilmiştir. Basınçla çalışan akışı kullanılarak mikron çaplı daralması vasıtasıyla deforme hücrelerin sürüş, insan promiyelositik (HL-60) hücreleri kısa bir süre sonra tazyik boyunca daha hızlı bir şekilde pasaj önce 9.3 msn bir ortalama süre boyunca birinci daralma tıkanmıştır gözlemlemekdaralma başına 4.0 msn medyan transit süre ile iyonları. Tersine, all-trans retinoik asit ile tedavi edilmiş (nötrofil tipi) HL-60 hücreleri 3.3 msn bir ortalama geçiş zamanı ile hemen boğumlar boyunca pasaj önce veya 4.3 ms için birinci daralma tıkamak. Bu yöntem hücrelerin viskoelastik doğası içgörü sağlamak ve sonuçta bu davranışın moleküler kökenlerini ortaya çıkarabilir.
Introduction
Hücre şeklinde değişikliklere çok biyolojik bağlamlarda kritik önem taşımaktadır. Örneğin, eritrositler ve lökositler kendi çapından daha küçük olan 1 kılcal kısımlar boyunca deforme olurlar. Metastaz kanser hücrelerinin ikincil siteler 2 de tohum dar interstisyel boşluklar yanı sıra dolambaçlı damar ve lenfatik ağlar aracılığıyla deforme gerekir. Tek tek hücrelerin fiziksel davranış prob için, mikrofluidik cihazlar yeteneklerine dar boşluklar 3 aracılığıyla göç ve pasif mikron çaplı daralmaları 3 ile 9 deforme dahil hücre davranışları bir dizi çalışma özelleştirilebilir ideal bir platform sunuyoruz. Polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan cihazlar, hücre deformasyonlar ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve temel görüntü işleme araçları kullanılarak analiz edilmesi sağlanarak, optik şeffaf. Ayrıca, boğumların dizileri tam bir ile eş zamanlı olarak birden fazla hücre analiz sağlayarak, tanımlanabilirBirçok mevcut teknikleri 10,11 aşıyor çıktı.
Burada 'Hücre Deformer' PDMS mikroakışkan cihazı kullanılarak hücre deformablite sondalama için detaylı bir deneysel protokol mevcut. Cihaz tasarlanmış sıralı daralması vasıtasıyla hücreler pasaj şekilde karıştırılır; Bu geometri 12 yatak pulmoner kılcal gibi fizyolojik ortamlarda, yaygındır. Hücre deforme ölçmek için, geçiş zamanı kolaylıkla tek bir daralma 4,6 transit için tek bir hücre için gereken süre olarak ölçülen, uygun bir ölçü sağlar. Hücre taşıma sırasında daralmış kanalları boyunca sabit bir basınç düşüşü korumak için, biz basınç tahrikli akış kullanın. Bizim protokol hücreleri daralmaları bir dizi deforme için zamanı ölçmek için basınç tahrikli akış, hazırlanması ve hücre görüntüleme yanı sıra görüntü işleme ile cihaz tasarımı ve imalatı, cihazın çalışması hakkında detaylı talimatları içerir. Biz dahilCihaz tasarımları ve ek dosyaları gibi görme veri işleme kodu hem de. Verilerin temsil edici bir örneği olarak, pasajlama boğumların sayısının bir fonksiyonu olarak daralması, bir dizi hücre geçiş süresini gösterir. Transit hücreler için zaman çizelgesi analizi bir mikroakışkan cihazın dar büzülmesina hücre tipleri 4,5,13 çeşitli deformabilitesi farklılıkları ortaya olsa. Burada gösterilen cihaz benzersiz mikron çaplı daralmaları bir dizi hücre geçişi araştırmaz; Bu tasarım hücreler dolaşıma deneyim ve aynı zamanda gevşeme zamanı gibi hücrelerin ek fiziksel özelliklerini sondalama sağlayan dolambaçlı bir yol benzetilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroakışkan Cihaz Tasarımı
NOT: giriş kapısı, hücre filtre, daralma dizi ve çıkış portu (Şekil 1): cihaz tasarım dört temel fonksiyonel bölgeleri vardır. Genel tasarım boyutları için küçük ayarlamalar ile, hücre tiplerinin geniş bir dizi uygulanabilir. Hem birincil hem ölümsüzleştirdi hücrelerin bir seçim için geçerli olan cihaz parametreleri ile birlikte bir kaç temel tasarım önerileri burada sağladı.
- Ortalama hücre çapı yaklaşık olarak% 30-50 olduğu bir daralma dizi kanalı (Şekil 1B) genişliğini seçin; Önemli hücre deformasyon ama az tıkanmaya bu daralma-hücre boyutu oranı sonuçları. Daha önce test edilmemiş bir hücre tipini göz önüne alındığında, bu ~% 30-50 den optimum genişliğini bulmak için hücre çapı daralma genişlikleri bir dizi tasarım için ihtiyatlı olduğunu. Microfluidic cihazlar birçok türde olduğu gibi, 120'den fazla cihaz master kalıpları bir günah üzerinde desenli olabilirFarklı cihaz tasarımları bir dizi sağlayan gle 4 inç silikon gofret, tek bir imalat sürecinde imal edilecek.
- Hücre çapı, en az% 50 olması, kanal yüksekliği seçin; Bu hücre, 2 boyutta sınırlı olmasını sağlar. (: Genişlik yükseklik) cihazın boyunca birleştirme sırasında kanal çöküşü önlemek için, kanal boy oranı az 01:10 den olduğundan emin olun. Bu boy oranını aşması çökmesini önlemek için destek mesajları eklemeniz gerekir kanallar için. Hücre akışını kesmeyecek şekilde en az iki hücre çapı olan bir mesafede alanı destek çubukları.
- Hücre kümeleri (Şekil 1B) enkaz kaldırmak ve parçalamak için giriş limanlarında bir filtre içerir. Mesaj ayıran mesafe bir hücre çapına hemen hemen eşit olduğu, böylece, filtre mesaj boyut ve aralığa ayarlayın.
NOT: özelliği büyüklüğünün alt sınırı litografi maskesi yazdırılma kararı ile ayarlanır. Tüm özellikler res içinde olduğundan emin olunmaske tedarikçi tarafından belirtilen lere sınırı.
2. Malzemeleri ve Hazırlık
NOT: Herhangi bir deney başlamadan önce, aşağıdaki öğelerin hazırlanması gerekir. Tüm bir düzeneğin şematik Şekil 1 'de verilmiştir.
- Taşbaskı mikroişleme 14,15 standart teknikler kullanılarak cihaz ana imal. Bir profilometre kullanarak desenli özelliklerin yüksekliğini doğrulayın.
NOT: ustaları kolayca temiz oda tesisinde imal edilebilir olsa da, bazı laboratuvarlar yarı temiz bir ortamda 16,17 kullanım için ucuz litografi yöntemleri geliştirmiştir. - Basınçlı hava, basıncın regüle ve bağlantı parçaları (Şekil 1A) dizisinin bir tank kullanılarak basınçla çalışan akışı için hava kaynağını hazırlayın.
- Bir hava besleme tankı ve elle regülatörü ayarlayın.
Not: havada% 5 CO2 gibi bir bileşim, tipik bir hücre kültürü incubato edilene benzer bir ortam sağlarR, ama diğer gaz karışımları da kullanılabilmektedir. - Manuel regülatör ile in-line elektronik kontrollü regülatör ayarlayın. Az 2 kPa basınç dalgalanmalarına, düzenleyen ve kanallar boyunca sabit bir basınç düşüşü korumak için bir elektro-pnömatik dönüştürücü kullanın. Girişine LabVIEW yazılmış basit bir kod (Ek Bilgi) istenilen basınç kullanın.
NOT: elektro-pnömatik dönüştürücü mikroakışkan cihaz üzerinde belirtilen basınç maç için vana çıkış basıncını ayarlamak için bir iç geribildirim döngüsü kullanır. - Hücre süspansiyonunun akışı sürmek için basınçlı bir bölme ayarlayın. Boru standart bir akış sitometresi ile boru üzerinde bir basınç geçirmez bir mühür oluşturan bir makine kapağının üzerinden bir hücre süspansiyonu odasının birleştirin.
Not: (Figür hücreler cihazın içine basınçlı bölmeden aktıkları bir basınçlı hava tankı bağlanan bir girişi ve bir çıkışı: basınç bölmesi kapağı, iki menfez ihtiva etmektedire 2).
- Bir hava besleme tankı ve elle regülatörü ayarlayın.
- Daralma dizi akan hücrelerin görüntüleri yakalamak için saniyede en az 100 kare bir kazanım oranına sahip bir kamera ile donatılmış bir inverted mikroskop ayarlayın. Bir video yakalama kartı ve bir bilgisayar ile kamera arayüzü.
- PDMS duvarlara hücre yapışmasını en aza indirmek için yardımcı olur, hücre ortamı çözeltisine F127 küçük bir miktarının ilave edilmesi gibi, Pluronic F-127 ağ / fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS)% 10 ağırlık arasında bir yüzey aktif madde stok çözelti hazırlayın. F127 çözündürülmesi için yavaşça 37 ° C F 127 çözeltisi, girdap ve ısı hazırlamak. Kullanmak 0.2 um şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltisinin, ve oda sıcaklığında saklayın önce. Fazla 24 saat boyunca devam edecek kabarcıklar oluşturur vorteks ve filtreleme peşin olarak yüzey aktif madde çözeltisi hazırlayın.
3. Mikroakışkan Cihaz İmalatı
- Microfluidic kanalları ile PDMS blok Üretiyor.
- Mix PDMS iyice1:10 ta oranı (w / w) tabanına sertleştirme maddesi.
- Cihaz master (Adım 2.1) üzerine karışımı dökün. Entrapped kabarcıklar kadar uygulanan vakum ile bir fanus içinde Degas kaybolur, ya da yaklaşık 10-20 dk.
NOT: Bu süre sonunda, normal olması, hava-arayüzü PDMS, en kabarcıklar olabilir; Bu genellikle pişirme sırasında dağılacaktır. Bu kanallara bitişik hiçbir kalan kabarcıkların yok olmasını sağlamak için en çok önemlidir. - 4 saat 65 ° C'de gazı giderilmiş cihazı pişirilir. Çöken kanalları engellemek için, daha fazla kanal çökmeye karşı daha fazla dirençli olan daha yüksek bir elastik modüle sahip olan bir cihaz için PDMS çapraz bağlanması için gece boyunca fırında cihazı. Ancak, pişirme genişletilmiş notu da PDMS embrittles ve delikleri (3.3 Adım) delme sırasında çatlamalara yol açabilir.
- Ana kalıp mikroakışkan aygıtları çıkarın. Bir jilet ile PDMS blok üzerinden bireysel microfluidic cihazlar kesin ve direkte aygıtı kaldırıner. Yavaşça cihazın bir köşesini kaldırarak başlayın; düz yukarı PDMS bloğunu kaldırma aksine yavaş ve nazik soyma, PDMS ve usta hem stresi azaltır.
- PDMS cihazın Punch delik tüp ve mikrokanalların arasındaki erişimi için bağlantı noktaları oluşturmak için. Biyopsi zımbası ile delik oluşturmak ve cihazın dış tarafına doğru kanal taraftan punch.
NOT: Bir 0.75 mm delik çapına sahip bir biyopsi yumruk polietereterketon ile mükemmel delikleri (PEEK) boru (dış çapı = 1/32 "veya 0.79 mm) veya polietilen boru (PE-20, dış çapı = 0.043" veya 1.09 mm bu arabirim oluşturur ). Sığ kanalları 18 ile cihazlarda delik görselleştirmek yardımcı olmak için bir halka ışık kullanın. Biyopsi yumruk keskin olduğundan emin olun; sonra kesme kenarı dulls tekrar tekrar kullanılması ve biyopsi yumruk atılır ve değiştirilmesi gerekir. - PDMS toz ve teslim parçalarını kaldırmak için izopropanol (HPLC saflıkta) ile PDMS cihaz durulayın. Emin olunaçılmış delikler deliklerden sıkmak şişe saf izopropanolün akışı yönlendirerek enkaz açıktır. Filtrelenmiş hava ile kurutma. Temizlikten sonra, kanalları yer PDMS blok cihaz temizliğini korumak için temiz bir Petri kabındaki kadar yüz. Bağlama kadar bu formda depolamak cihazları da temin etmektedir.
- , Metanol (HPLC kalitesinde) ile durulama cam yüzeyin temizliği filtrelenmiş hava ile kurutma ve cam plazma tedavi öncesi tamamen temiz ve kuru olduğundan emin olmak için 5-10 dakika için 200 ° C ocak üzerine yerleştirin.
NOT: cam substrat her bir kanalın alt oluşturur. 10X veya 20X objektif paralel birden çok kanal görüntüleme için ideal olduğundan Tipik bir cam slayt, yeterlidir. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, bir lamel (# 1.5 kalınlığında) cihazı bağ. - Cam alt-tabakaya bağlanması PDMS cihaz.
- Oksijen plazma kanal PDMS bloğunun yana ve bir cam slayt 1 tarafa tedavi.
NOT: Welle tutulan bir deşarj ünitesinin inci, 1 dakikalık bir zaman kullanarak tedavi, ancak her oksijen plazma düzeneği için olan bir tedavi süresini optimize eder. - Işlemden hemen sonra camın muameleli taraf üzerine PDMS kanal yan.
- Için hafif bir basınç ~ ile birlikte yapışmasını sağlayan 10 saniye tutun. En az 15 dakika boyunca yüksek bir sıcaklıkta (60-80 ° C), tüm cihaz fırında bağ gücünü artırmak için.
- Oksijen plazma kanal PDMS bloğunun yana ve bir cam slayt 1 tarafa tedavi.
4. daraltılmış Kanalları aracılığıyla Hücreleri deformasyonlara
- Bir mikroskop altında mikroakışkan cihazı kontrol edin. Kanallar çöktü veya kırık olmadığından emin olun ve her iki giriş ve çıkış delikleri düşük güç objektif (10X) ile cihaz kanalları doğrudan bağlayın. Bir jilet ile PDMS yüzeyini puanlama tarafından arızalı cihazları tayin ve deneyler için bunları kullanmayın.
- Hücre kültürü numuneleri hazırlamak denenecek. Standart koşullar kullanılarak kültür hücreleri.
- Fya da, örneğin, 37 ° C'de CO2 inkübatör içinde% 5,% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu ve% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde kültür HL-60 hücreleri.
- Yapışık hücreler için, taze büyüme ortamına, tripsinizasyon ve tekrar süspansiyon ile hasat. Standart trypsinization protokolü kullanın; , örneğin, 25 cm2 kültür alanı olan bir şişeye ~ 0.5 mi tripsin ekleyin ve ~ 30 ml taze ortam içerisinde yeniden süspanse edin. Daha önce tarif edildiği gibi 1 19,20 x 10 5 hücre / ml 5 uM'lik bir nihai konsantrasyonda, all-trans retinoik (ATRA) ile nötrofil tipi hücreler içine, HL-60 hücreleri ayırt edebilecektir.
- Santrifüj 3 dakika boyunca 300 x g'de hücreler, dikkatli bir şekilde 0.1% h / h, F-127 ile taze kültür ortamında uygun nihai yoğunluk için süpernatan aspire ve süspansiyon hücreleri.
- Coulter sayacı, Hemasitometre hücreleri saymak, ya da akış sitometresini. 1 x 10 x 10 6 ila 5 arasında bir yoğunluğa hücre süspansiyonu ayarlama
Not: Hücre yoğunluğu ve yüzey aktif madde konsantrasyonu, belirli bir hücre sistemlerine bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir Tablo 1 farklı hücre tiplerinin hücre ve F-127 önceden kullanılan konsantrasyonlarının bir kaydını sağlar. - Borunun bir akış sitometresinde hücre süspansiyonu yerleştirilir ve basınç kapağı bağlanır. Hücre süspansiyonu borunun ucundan çıkana kadar mikroakışkan cihaza bir bağlantı tüpü önce, yaklaşık 14-21 kPa basınç ve çalkalama ayarlayın. Bu boru ve aygıt hava kabarcıklarını azaltmaktadır.
- Cihazın girişine hücre süspansiyonu ihtiva eden boru ucu takın. Cihaz, bir lamel bağlıdır, bu tür bir bağlantı tüpü önce, mikroskop aşamasının gibi düz ve katı bir yüzey üzerinde yerleştirilmiş olduğundan; lamel kırılgan olduğu ve aksi takdirde kırılabilir.
- Boru int bir parça takınatık toplama için boş bir tüp içine çıkış ağzının ve mesafe de o bu şekilde, mikroskop aşamasının tarafına bantlanmış boş bir Falcon tüpüne gibi. Deneyler arasında, cihazın genel akışkan direnç tutarlılık için, giriş ve çıkış boruları her bir deney için, aynı çapta ve yaklaşık olarak aynı uzunlukta olduğundan emin olun.
- Yavaşça yaklaşık 28 kPa veya hücreleri kanallarda aktığı kadar basıncı artırmak. Birden fazla kanal görüş alanında bulunmaktadır ve ekranın alt kısmına dik olacak şekilde konumlandırın cihazı. Kamera veri boyutu ile sınırlı ise, bağımsız veri noktaları yeterli sayıda üretmek için birden fazla videoları kazanır. İstediğiniz veri çıkışı için gerekli kare hızını ayarlayın. Saniyede 300 kare (fps) yüksek hızda görüntüleme kullanmak, hücre şekli değişiklikleri yakalamak için; , hücrelerin transit sürelerini ölçmek yaklaşık 100 fps kare hızları kullanmak için.
5. Veri Analizi
- Mast dosya açmaer_script.m (İndirilebilir Ek Dosya) ve programı çalıştırın.
- Ilk video seçin görünen Windows Gezgini penceresinden analiz edilecek. Seçilen video için kare hızını belirtin ve enter tuşuna basın.
NOT: Bir rakamın ilk video için bir dikdörtgen kırpma pencere seçmek için kullanıcıya sorar görünecektir. - Soldan sağa tüm kanalları kapsar ve sadece üst ve alt (Şekil 3) en kanalların dizinin ilk ampulün yukarıda kanalları ile kesişen bir pencere seçer.
- Kırpılmış görüntü daralma bölgeleri seçin. Seçilen her video için üst ve alt pencere sınırı arasındaki sabit bir piksel mesafeyi korumak için özel dikkat gösterin.
NOT: Üst pencere kenarı üstteki daralma ve alt pencere kenarı belirten alttaki daralma (Şekil 4) belirtir; ara büzülmesina Bu kullanıcı girişi yaklaştırılır. Daha sonra, algoritma s görüntülerher videonun ilk 50 kare için hücrelerin egmentation (Şekil 5). - Algoritma doğru hücreleri bulma olup olmadığını belirlemek için yakından sol üst görüntü (Şekil 5A) izlemek; Bir ikilileştirilmiş görüntü tespit hücrelerin yerini göstermek için kaynak video bindirilir.
NOT: farklı pencereler (Şekil 5B-5D) kodu tanı için ve belirli görüntü işleme operasyonları sonrası video kareleri göstermektedir. - Sonraki videoyu seçin Windows Gezgini penceresinden işlenecek.
NOT: tekrarlayacak algoritma seçilen her video için 5.2-5.5 adımları. - Iptal seçeneğini kez tüm istenen videoları video listesi tamamlandığında fonksiyonunu talimat Windows Gezgini penceresinde yoluyla ilave edilmiştir.
NOT: algoritma kullanıcı müdahalesi olmadan kalan işlemleri gerçekleştirecektir. Bu işlenmiş video ve bilgisayar pe sayısına bağlı olarak yaklaşık 1-2 saat sürerrformance. Tamamlandığında, algoritma transit süresi verilerin bir histogram üretecek ve MATLAB .mat dosyası ve bir Microsoft Excel xls dosyası olarak dizine verileri kaydetmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı hücre tipleri, insan miyeloid lösemi hücreleri (HL-60), nötrofil farklılaşmış hücreleri, fare lenfosit hücreleri ve insan yumurtalık kanseri hücre hatları (OVCAR8, HEYA8) 'nin deforme araştırılması' Hücre deformer 'mikroakışkan tekniği kullanılarak değerlendirilir. Şekil 6'da gösterildiği gibi HL-60 ve nötrofil tipinde HL-60 hücrelerinin geçiş süresi için tipik sonuçlar, boğumların bir dizi geçiş için tek bir hücre için gereken süreden daha göstermektedir. Geçiş süresi tek tek hücrelerden oluşan bir popülasyon olarak için ölçüldüğü 28 kPa (Şekil 6) bir tahrik basınçta 7 daralması bir seri olarak 7 um daralma.
Şekil 6'da gösterildiği gibi, HL-60 hücreleri daha sonra geçici olarak daralması vasıtasıyla pasaj önce 9.3 msn bir medyan süre için birinci daralma tıkamak. Buna karşılık, nötrofil tipi HL-60 hücreleri, sadece 4.3 milisaniye boyunca birinci daralma öncesi tıkamakPasajlanması. 21 atomik kuvvet mikroskopisi ve aspirasyon 22 mikropipet ile belirlendiği gibi HL-60 hücrelerinin kısa geçiş süresi, indirgenmiş Esneme ve zor akışlılık modülleri ile tutarlıdır. Bu sonuçlar aynı zamanda mikron çaplı boşlukları 23 nolu hücre geçiş süresini belirlemek mechanoregulating protein lamin A şekilde azalmış olan düzeyleri ile uyumludur. Bir kere, ilk kanaldan, HL-60 hücreleri için 4.0 ms ve nötrofil tipi hücreleri için 3.3 msn bir ortalama geçiş zamanı olan 2-7 kalan boğumlar boyunca daha hızlı bir şekilde hücre transit, (Şekil 6). HL-60 hücreleri yine de biraz daha uzun bir gösterir ama edilmesi önemli geçiş süreleri (C2-C7 p = 1.7E-9), boğumların 2-7 taşıma süresine dağılımı her hücre tipi için hemen hemen aynıdır. İlk daralma için gerekli uzun transit süresinin gözlem viskoelastik hücreler tamamen onların ilk şekli o kadar dinlenmek yok ki yansıtabilir, n, ~ ms zaman ölçekleri. Bu davranış aynı zamanda hücre içinde geliştirmek ve sonraki mikron çaplı boşluklar yoluyla geçişini kolaylaştırmak geri dönüşümsüz yapısal değişiklikler ile açıklanabilir. Önemlisi, hatta ilk daralma için, hücre popülasyonlar arasında geçiş karşılaştırarak zaman, onların deformabilitesi 23 farklılıkları ortaya çıkarabilir.
Deney düzeneği 1. şematik gösterimini Şekil. . Giriş portu, hücre filtre, daralma dizi ve çıkış bağlantı noktası: A. 'Hücre deformer' çevre bağlantılarını gösteren deney düzeneği aygıt B. cihaz tasarım 4 fonksiyonel bölgeleri vardır. Onun ana özelliklerini gösteren mikroakışkan cihazın Mimarlık; Içerlek ş bir kanal geçen ışık bir görüntü gösterir. Skala, 10 μ M.
Özel kapağı için Şekil 2. Mühendislik çizimleri tüp sitometresindeki akışında yer hücre ortamı basınç için.
Video çerçeve kırpma ilgi bölgeyi seçmek için nasıl 3. gösterilmesi Şekil.
Daralma yerleri seçmek için nasıl 4. gösterilmesi Şekil.
51474fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 5. Gözlem penceresi, daralma dizi aracılığıyla işlemek gibi algoritma düzgün hücre konumları tanımlar doğrulamak için kullanılır. . A. ikilileştirilmiş görüntü hücrelerin yerini göstermek için kaynak Videoda B. Farkı görüntü edilir; C. Alt şapka filtre görüntü; D. Medyan süzülür.
Şekil daralma sayısının bir fonksiyonu olarak 6. Temsilcisi geçiş zamanı ölçümleri. C. HL-60 hücreleri B ATRA ile tedavi edilmiş HL-60 (nötrofil tipi) hücrelere göre birinci kanaldan daha uzun bir geçiş süresi sergiler. Mann-Whitney testi kullanılarak değerlendirilmiştir olarak birinci kanaldan transforme geçiş süresi (log 10) üzerinde bir karşılaştırması,anlamlı bir fark vardır, p = 1.47E-5. Hücreler tipik olarak, ilk kanaldan geçiş daha yavaş sonraki kısıtlamalardan oluşur. Veri 28 kPa bir sürüş basınçta 7 mikron çapında daralmaları transit geçiş hücreler için burada gösterilir. . Hücre yoğunluğu, hücre çapı, yüzey aktif madde ve ortalama konsantrasyon, HL-60, Tablo 1 'de verilmiştir, n = 77 vardır; ATRA ile-işlenmiş HL-60, K = 97. 3 Sonuçlar, farklı günlerde boyunca bağımsız deneyde tekrarlandı.
Transit zamanı ölçmek için MATLAB komut 7. Genel Bakış Şekil. İlk ilmek her video için ilk 50 kare için kullanıcı müdahalesi ve gözlem gerektirir. İlk döngü sonra, tüm program kullanıcı müdahalesi olmadan çalıştırmak ve otomatik derler ve araziler nüfus verileri olacaktır.
Tablo 1. Daha önce hücre sistemleri ve onların çalışma koşullarını okudu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada basınç tahrikli akışını kullanarak büzüldü microfluidic kanallardan transit hücrelerinin deformasyonu analiz etmek için kapsamlı bir deneysel prosedür sağlar. MATLAB komut otomatik veri işleme (Ek Malzeme) sağlar; kod güncelleştirilmiş bir sürümü (korunur www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Daha genel olarak, burada sunulan teknikler sitoskeletal etkisi ve nükleer sertleştirme ajanlan 24,23 hem de kanserli hücre tiplerinde 4,5 arasında deforme tahlil dahil olmak üzere birçok hücre bazlı tahlillerde mikroakışkan uyarlanabilir. Görüntü hücre içi deformasyonlara daha yüksek çözünürlük mikroskobu ile birlikte ele alındığında, bu yöntem, hücrenin, mekanik özellikleri ve fizyolojik ve patolojik durumlarda meydana gelen değişiklikleri incelemek için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır.
Otomatik Hücre İşleme Algoritması
Algoritma, Şekil 7'de özetlenmiştir ve MATLAB fonksiyonların grubu Ek bilgiler temin edilmektedir. Kısaca, kullanıcı analiz etmek tüm videoları seçmek için talimat; ilgi bölge için her bir videoyu kırpmak; ve videolar kümesi için bir kare hızı belirlemenizi; sonra, yazılım otomatik olarak her daralma için her hücrenin geçiş süresini belirlemek için video veri işler. Çalıştırmak için komut için belli şartlar vardır: hücreler video çerçevesinin alt çerçevenin üst akmalıdır; mikroakışkan cihaz konumu ve video süresi boyunca kayda değer değişiklik olmamalıdır aydınlatma koşulları; ve videolar avi formatında olmalıdır. Önemli olarak, izleme algoritması ikisi de yaklaşık 8 saniye olan tek bir video kayıt, bir zaman penceresi içinde girip pasaj hücreleri içerir. Bu nedenle, herhangi birdaha uzun bir geçiş süresi var nesneleri analiz dışında tutulmuştur. Çıkarımı yapılması sureti ile, tüm video boyunca mevcut olan nesneler analiz kaldırılır. Kod aynı zamanda, kullanıcı tarafından ayarlanabilir bir alt kesme büyüklüğüne, uygular. Video analizi için boyut kesilmesi 2.7 um'lik bir hücre çapına eşdeğer 5 piksel oldu.
Yüksek hızlı görüntü veri dosyaları (~ 500 MB) büyükçe olabilir bu yana, programı yoğun hesaplama olduğunu. Kod en verimli, en az 6 GB RAM ve yerel bir sabit en az 1 TB kapasiteli sürücü veya biriyle bir 64-bit chipset ile bir masaüstü bilgisayar kullanarak çalışan bir USB 3.0 ile büyük bir dış sabit disk veya veri sunucusu ile arabirim , FireWire veya Ethernet bağlantısı. Veri sonuçlarının hızla görselleştirme için bir histogram formatında çıkış; o da bir MATLAB (.mat) veri dosyası ve bir Excel elektronik depolanan veri olarak tablolaştırılmıştır.
Pr koduesented her kanaldan kanalına hücreler için geçiş süresi analizi ile hücre popülasyonlarının karşılaştırmak için basit bir yol sağlar. Daha detaylı analiz için, kod hücre boyutu, en boy oranı, yanı sıra dinlenme zaman çizelgesi dahil olmak üzere diğer parametreleri araştırmak için uzatılabilir. Önceki çalışmalar transit süresi 6 hücre boyutu sadece zayıf bir bağımlılığı ortaya.
Cihaz ile ilgili Tuzaklar
Tıkalı kanallar herhangi bir akım deneyde önemli bir engel vardır. Cihaz duvarlara Hücre yapışması, tahditli kanallardan hücrelerinin akışını yavaşlatır olacaktır: hücreler, kanal duvarları boyunca dışarı lekelenmesine gözlenebilir. Yapışmasını önlemek için, F-127 ile düzgün yüzey işleme esastır.
25,26 geçici hidrofilik hale PDMS, plazma ile muamele, sonra bir zaman PDMS değişim yüzey özellikleri. Bir hafta boyunca, hidrofil PDMS zeminlerde yavaş dedoğal hidrofobik yüzey enerjisi üretir; Bu kanallardan hava kabarcıklarının çıkartılmasını meydan okuyabilirsiniz. Cihazlar ve böylece plazma muamelesinin yedi gün içinde kullanılmalıdır. En önemlisi, plazma muamelesi ve deforme olabilirlik tahlilinde arasındaki zaman bütün deneylerde tutarlı olmalıdır.
Başarılı bir cam zemin üç PDMS duvarları ile imal edilen cihazlar kullanılarak farklı hücre tipleri arasında, geçiş süresini ayırt olsa da her dört kanal duvarları 27, düzgün bir yüzey özelliklerine sahiptir, bu yüzden cihazlar da imal edilebilir. PDMS cihaz, ince PDMS tabaka ile spincoated bir cam substrata bağlanabilir: 5 (a / a), cihazın kalıp üzerine dökün ve 65 ° C'de 20 dakika boyunca tedavi: 1 bir oranda temel için sertleştirme maddesi karışımı . Bu arada, 01:20 ince bir tabaka spincoat (a / a) cam taban maddeye tabanına sertleştirme maddesi; 4 dakika boyunca 85 ° C 'de fırında. PDMS kaplı slayt üzerinde PDMS cihaz yerleştirin ve gece pişirme bitirmekbağ tamamlayın. Cam-PDMS yapıştırma için bir plazma makinesi mevcut değilse, bu yöntem de değerlidir.
Hücreye-ilişkin tuzaklar.
Hücre süspansiyonunun hazırlanması tavuk, hücre yoğunluk önemlidir: Hücre yoğunluğu çok düşükse, hücre geçiş etkilere nadir olacaktır; Hücre yoğunluğu çok yüksek ise, orada aynı anda tek bir kanal pasaj birden fazla hücre, tek bir hücre sırası boyunca basınç düşüşü de uygun değildir olacak olacak ve otomatik bir komut ile tek tek hücrelerin tanımlamak için zor olacaktır.
Deneyler tipik olarak, hücre süspansiyonları, 30 dakika içinde hazırlanmaktadır uygulanırken, hücreler,> 30 dakika daha uzun süre boyunca basınç odasının dibe olabilir. Daha uzun süreler boyunca çökelme önlemek için, basınç odası ve bağlantı boruları periyodik olarak döndürülebilir. Uzun deneyleri için, küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ce eklenebilirHücreleri ve ajite oturmasını önlemek için olan basınç bölmesinin altına yerleştirilmiş bir karıştırma plakası ile ll süspansiyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar, bu tekniğin erken sürümlerinde yapıcı girişi için Lloyd ung kabul etmek istiyorum, basınç kapağını imalatı yaptığı yardım için basınçlı kap tasarım ipuçları için Dr Jeremy Agresti, ve Dr Dongping Qi. Biz test için hücre örneklerinin çeşitli sağlayan M. Teitell ve P. Gunaratne laboratuvarlarında minnettarız. Biz bu çalışmayı desteklemek için Ulusal Bilim Vakfı (KARİYER Ödül DBI-1.254.185), UCLA Jonsson Kapsamlı Kanser Merkezi'nde ve Klinik UCLA ve Translational Bilim Enstitüsü müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M.
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
