Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Published: September 3, 2014 doi: 10.3791/51474
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre Dame, 3Molecular Imaging Center, University of Southern California

Summary

אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.

Abstract

כאן אנו פירוט עיצוב, ייצור, ושימוש במכשיר microfluidic להעריך deformability של מספר רב של תאים בודדים באופן יעיל. בדרך כלל, נתונים ל~ 10 2 תאים ניתן לרכוש בתוך ניסוי שעה 1. תכנית ניתוח תמונה אוטומטית מאפשרת ניתוח שלאחר ניסוי יעיל של נתוני תמונה, המאפשר עיבוד להיות שלם בתוך כמה שעות. הגיאומטריה המכשיר שלנו היא ייחודית בכך שתאים חייבים לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה, ובכך לאפשר את העיוות הראשונית והרפיה של תאים בודדים תלוי זמן להיות assayed. תחולתה של שיטה זו לוקמיה פרומיילוציטית (HL-60) התאים באה לידי ביטוי. נהיגה תאים לעוות דרך אילוצי מיקרון בקנה מידה באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ, אנו צופים כי פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים לרגע לחסום את ההתכווצות הראשונה לזמן החציוני של 9.3 אלפיות שניים לפני passaging במהירות רב יותר דרך להצר הבאיונים עם זמן מעבר החציוני של 4.0 אלפיות שניים להתכווצות. בניגוד לכך, (נויטרופילים סוג) שטופל בחומצה רטינואית כל טרנס HL-60 תאים לחסום את ההתכווצות הראשונה רק 4.3 אלפית שניים לפני passaging דרך האילוצים שלאחר מכן עם זמן מעבר החציוני של 3.3 אלפיות שניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טבע viscoelastic של תאים, וסופו של דבר לחשוף את המקורות המולקולריים של התנהגות זו.

Introduction

שינויים בצורת תא הם קריטיים בהקשרים ביולוגיים רבים. לדוגמא, אריתרוציטים ולויקוציטים לעוות דרך נימים שהם קטנים יותר מאשר הקוטר שלהם 1. בגרורות, תאים סרטניים חייבים לעוות דרך פערים צרים ביניים, כמו גם כלי דם מפותלים ורשתות הלימפה זרע באתרים משניים 2. כדי לחקור את ההתנהגות הפיסית של תאים בודדים, מכשירי microfluidic להציג פלטפורמה אידיאלית שיכול להיות מותאם אישית כדי ללמוד מגוון רחב של התנהגויות תאים הכוללים את היכולת שלהם להעביר דרך צרים פערים 3 ולעוות באופן פסיבי באמצעות אילוצי מיקרון בקנה מידה 3 9. Polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירי microfluidic הם שקופים אופטי, המאפשרים לעיוותי תא להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור ונותחו באמצעות כלים לעיבוד תמונה בסיסיים. יתר על כן, מערכים של אילוצים יכולים להיות מוגדרים במדויק, המאפשרים ניתוח של תאים מרובים בו זמנית עםתפוקה שעולה על טכניקות קיימות רבות 10,11.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט לבדיקת deformability תא באמצעות מכשיר microfluidic PDMS 'תא deformer'. המכשיר תוכנן כך שמעבר תאים דרך אילוצים רציפים; גיאומטריה זו היא נפוצה בהקשרים פיסיולוגיים, כגון נימי ריאתי למיטה 12. כדי לאמוד את deformability תא, זמן מעבר מספק מטרי נוחה שנמדד בקלות את הזמן הנדרש לתא יחיד למעבר דרך 4,6 התכווצות אחת. כדי לשמור על ירידה בלחץ קבועה על פני הערוצים המכווצים בזמן מעבר תא, אנו משתמשים בזרימה מונע לחץ. הפרוטוקול שלנו כולל הוראות מפורטות על עיצוב מכשיר וייצור, תפעול מכשיר על ידי-לחץ מונע זרימה, הכנה והדמיה של תאים, כמו גם עיבוד תמונה כדי למדוד את הזמן לתאים כדי לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות. אנו כולליםשני עיצובי מכשיר וקוד עיבוד נתונים חזון כקבצים משלימים. כמדגם מייצג של נתונים, אנו מראים את הזמן מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות כפונקציה של מספר האילוצים passaged. ניתוח של לוח הזמנים לתאים למעבר למרות אילוצים צרים של מכשיר microfluidic יכול לחשוף הבדלים בdeformability של מגוון רחב של סוגי תאים 4,5,13. המכשיר הפגין כאן באופן ייחודי סוקר מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה; עיצוב זה מחקה את הדרך המפותלת שתאים חווים במחזור וגם מאפשרים חיטוט מאפיינים פיזיים נוספים של התאים כגון זמן הרפיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 עיצוב מכשיר microfluidic

הערה: יש עיצוב המכשיר ארבעה אזורים בסיסיים פונקציונליים: נמל כניסה, מסנן תא, מערך התכווצות, ונמל יציאה (איור 1). העיצוב הכללי ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים, עם התאמות קלות לממדים. סיפקו הנה כמה המלצות עיצוב בסיסיות יחד עם פרמטרים נוספים במכשיר, כי הם יעילים לבחירה של שני תאים הראשוניים והנציחו.

  1. בחר את רוחב ערוצי מערך התכווצות (איור 1) להיות כ 30-50% מקוטר התא הממוצע; תוצאות זה התכווצות אל תא גודל יחס לעיוות תא משמעותית אבל סתימה מינימאלית. בהתחשב בסוג תא שעד עתה לא נבדק, זה נבון לעצב מגוון רחב של מידות רוחב התכווצות מ ~ 30-50% קוטר התא כדי למצוא את הרוחב האופטימלי. כמו בסוגים רבים של התקני microfluidic, ניתן בדוגמת מעל 120 תבניות הורים מכשיר על חטארקיק GLE 4 אינץ סיליקון, המאפשר מגוון רחב של עיצובי מכשיר שונים להיות מפוברק בתהליך ייצור אחד.
  2. בחר את גובה הערוץ להיות לפחות 50% מקוטר התא; זה מבטיח את התא מוגבל ב2 ממדים. כדי למנוע קריסת ערוץ במהלך מליטה, להבטיח כי יחס היבט הערוץ הוא לא פחות מ1:10 (גובה: רוחב) לאורך כל המכשיר. לערוצים שחייבים לעלות יחס היבט זה, להוסיף הודעות תמיכה למניעת קריסה. הודעות תמיכה בחלל במרחק שהוא לפחות פי שתיים מקוטר התא כדי לא לעכב תא זרימה.
  3. כולל מסנן בנמלי הכניסה כדי להסיר שאריות וdisaggregate צבירי תאים (איור 1). התאם את הגודל ומרווח של הודעות המסנן כך שהמרחק המפריד בין ההודעות הוא שווה בערך לקוטר תא אחד.
    הערה: הגבול התחתון של גודל תכונה נקבע על ידי הרזולוציה שבה המסכה ליתוגרפיה מודפסת. ודא שכל התכונות נמצאות במיל 'מגבלת olution שצוינה על ידי ספק המסכה.

.2 ציוד והכנה

הערה: לפני תחילת כל ניסוי, חייבים להיות מוכנים הפריטים הבאים. סכמטי של כל ההתקנה הוא נתון באיור 1.

  1. לפברק מאסטר המכשיר תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיים לmicromachining יתוגרפי 14,15. ודא את הגובה של תכונות דוגמת באמצעות profilometer.
    הערה: בעוד שיכולים להיות מפוברקים מאסטרים בקלות במתקן חדר נקי, כמה מעבדות פיתחו שיטות ליתוגרפיה זולות לשימוש בסביבה למחצה נקייה 16,17.
  2. הכן את מקור האוויר לזרימת לחץ מונע, באמצעות טנק של אוויר ורצף של רגולטורי אוויר ואביזרים (איור 1 א) דחוסים.
    1. הגדר את טנק אספקת אוויר ורגולטור במדריך.
      הערה: הרכב של 5% CO 2 באוויר שומרת על סביבה דומה ככל incubato תרבית תאים טיפוסיr, אך יכולים לשמש גם תערובות גז אחרות.
    2. הגדר את וסת לחץ נשלטת אלקטרוני בקנה אחד עם הרגולטור במדריך. השתמש בממיר אלקטרו פנאומטי להסדיר ולשמור על ירידה בלחץ יציבה על פני הערוצים, עם תנודות לחץ של פחות מ -2 kPa. השתמש בקוד פשוט נכתב בLabVIEW (מידע נוסף) לקלט הלחץ הרצוי.
      הערה: ממיר אלקטרו פנאומטי משתמשת בלולאת משוב פנימית כדי להתאים את לחץ יציאת שסתום כדי להתאים את הלחץ שצוין על פני מכשיר microfluidic.
    3. הגדרת תא לחץ לנהוג זרימה של ההשעיה התא. להרכיב תא השעיה תא מתוך זרימה סטנדרטית cytometer צינור וכובע במכונה שיוצר חותם לחץ חזק על הצינור.
      הערה: כובע תא לחץ מכיל שני פתחים: כניסה המתחברת למכל האוויר הדחוס, ושקע שדרכו תאים לזרום מהחדר בלחץ לתוך המכשיר (figurדואר 2).
  3. הגדרת מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במצלמה שיש שיעור לשנייה לפחות 100 מסגרות רכישה כדי ללכוד תמונות של התאים זורמים דרך מערך ההתכווצות. ממשק המצלמה עם כרטיס לכידה וידאו ומחשב.
  4. הכן פתרון פעילי שטח המניה של 10% w / w Pluronic F-127 בופר פוספט (PBS) כהוספת כמות קטנה של F127 לפתרון התקשורת הסלולרי יסייע למזער הידבקות תא לקירות PDMS. כדי להכין את פתרון F127, המערבולת וחום בעדינות על 37 מעלות צלזיוס לפרק את F127. לפני שימוש, להעביר את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר. הכן את פתרון השטח מראש כvortexing וסינון יפיק בועות שנמשכות יותר מ 24 שעות.

.3 ייצור מכשיר microfluidic

  1. לפברק בלוק PDMS עם ערוצי microfluidic.
    1. המיקס PDMS ביסודיותיחס ta של 1:10 (w / w) סוכן ריפוי לבסיס.
    2. יוצקים את התערובת על פני אדון המכשיר (שלב 2.1). דגה בצנצנת פעמון עם ואקום שיושם עד לבועות וממולכד תיעלם, או כ 10-20 דקות.
      הערה: לאחר פרק זמן זה, יש עדיין עשויה להיות בועות בממשק האוויר PDMS, וזה נורמלי; אלה בדרך כלל יתפוגגו במהלך אפייה. זה קריטי ביותר כדי להבטיח כי אין בועות שנותרו בסמוך לערוצים.
    3. אופים את מכשיר degassed על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. כדי למנוע ערוצים מקריסה, לאפות את מכשיר לילה לcrosslink נוסף PDMS למכשיר עם מודול אלסטי גבוה שהוא עמיד יותר בפני קריסת ערוץ. עם זאת, הערה שהשתרעה אפייה גם embrittles PDMS ועלולה להוביל לפיצוח כאשר ניקוב חורים (שלב 3.3).
  2. הסר התקני microfluidic מעובש האב. חותך מכשירי microfluidic בודדים מתוך בלוק PDMS עם סכין גילוח ולהסיר את ההתקן מהתורןאה. התחל על ידי בעדינות מרים את פינה אחת של המכשיר; קילוף איטי ועדין, בניגוד להרמה ישר בלוק PDMS, מפחית את הלחץ בשני PDMS והאדון.
  3. חורי אגרוף במכשיר PDMS ליצור יציאות חיבור לגישה בין צינורות וmicrochannels. צור חורים באמצעות ביופסיה, ואגרוף מהצד הערוץ עד לצד החיצוני של המכשיר.
    הערה: ביופסיה עם גודל שעם 0.75 מ"מ יוצרת חורי ממשק שבצורה מושלמת עם polyetheretherketone צינורות (קוטר חיצוני = 1/32 (פיק) "או מ"מ 0.79) או צינורות פוליאתילן (PE-20, קוטר חיצוני = 0.043" מ"מ או 1.09 ). השתמש באור טבעת כדי לעזור לדמיין חורים במכשירים עם תעלות רדודות 18. הקפד הביופסיה היא חדה; לאחר חזר שימוש חוד החנית מקהה והביופסיה צריכה להיות מושלכת והוחלפה.
  4. יש לשטוף את מכשיר PDMS עם isopropanol (כיתה HPLC) כדי להסיר גושי אבק ונתקע של PDMS. הפוך בטוחנוקב ברורים של פסולת על ידי הפניית זרם יציב של isopropanol הטהורה מבקבוק לחיץ דרך החורים. מכה יבשה עם אוויר מסונן. לאחר ניקוי מקום בלוקים PDMS עם ערוצים, עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי נקייה כדי לשמור על ניקיון מכשיר. במידת צורך, מכשירי חנות בצורה זו עד שמליטה.
  5. נקה את מצע הזכוכית על ידי שטיפה עם מתנול (כיתה HPLC), מכה יבשה עם אוויר מסונן, והנח על פלטה חמה C ° 200 ל5-10 דקות כדי להבטיח את הזכוכית היא לגמרי נקייה ויבשה לפני טיפול פלזמה.
    הערה: מצע הזכוכית מהווה את החלק התחתון של כל אחד מערוצים. בדרך כלל שקופיות זכוכית די, שכן מטרת 10X או 20X היא אידיאלית להדמית מספר רב של ערוצים במקביל. להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, להתחבר למכשיר coverslip (# 1.5 עובי).
  6. בונד מכשיר PDMS למצע הזכוכית.
    1. פלזמה חמצן הטיפול בצד הערוץ של גוש PDMS וצד 1 של שקופית זכוכית.
      הערה: With יחידת פריקת כף יד, משתמש בזמן טיפול של 1 דקות, אבל לייעל את זמן טיפול בכל מכשירי פלזמה חמצן.
    2. הנח את צד הערוץ של PDMS על גבי צד המטופלים של הזכוכית מייד לאחר טיפול.
    3. להחזיק יחד עם לחץ קל ל~ 10 שניות כדי לקדם מליטה. אופים את המכשיר כולו בטמפרטורה גבוהה (60-80 ° C) לפחות 15 דקות כדי לשפר את חוזק קשר.

.4 עיוות תאים דרך ערוצים מכווצים

  1. בדוק את מכשיר microfluidic תחת מיקרוסקופ. ודא שהערוצים לא התמוטטו או שבורה וששני חורי הכניסה והיציאה להתחבר ישירות לערוצי המכשיר באמצעות מטרת צריכת חשמל נמוך (10X). לייעד מכשירים פגומים על ידי הבקיע פני השטח של PDMS בסכין גילוח ולא משתמש בם לניסויים.
  2. הכן את דגימות תרבית תאים להיות assayed. תרבות תאים באמצעות תנאים סטנדרטיים.
    1. Fאו דוגמא, תרבות HL-60 תאים בינוניים RPMI-1640 בתוספת 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין ו10% בסרום שור עוברי ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. לתאים חסיד, למסוק אותם על ידי trypsinization וגלול במדיום גידול טרי. השתמש בפרוטוקול trypsinization סטנדרטי; למשל, להוסיף ~ 0.5 מ"ל טריפסין לבקבוק עם 25 אזור תרבות 2 סנטימטר, וresuspend ב~ 30 מ"ל בינוניים טרי. להבדיל HL-60 תאים לתאי נויטרופילים מסוג על ידי כל טרנס רטינואית (אתרא) בריכוז סופי של 5 מיקרומטר לכל 1 x 10 5 תאים / מ"ל כפי שתואר קודם לכן 19,20.
    3. צנטריפוגה התאים XG 300 3 דקות, לשאוב בזהירות את תאי supernatant ו resuspend לצפיפות הסופית המתאימה במדיום תרבות הטרי עם 0.1% v / v F-127.
  3. ספירת התאים באמצעות דלפק קולטר, hemacytometer, או לזרום cytometer. התאם את ההשעיה התא לצפיפות של 1 x 06-5 אוקטובר x 10 הערה: צפיפות התאים וריכוז חומרים פעילי שטח ייתכן שתהיה הצורך לשנות בהתאם את מערכות תא מסוימות; טבלת 1 מספקת תיעוד של ריכוזים ששימשו בעבר של תאים וF-127 לתאים מסוגים שונים.
  4. מניחים השעיה תא בcytometer זרימת צינור ולהתחבר לכובע הלחץ. לפני חיבור הצינור למכשיר microfluidic, להתאים את הלחץ לכ 14-21 kPa וסומק עד ההשעיה התא עולה מקצה הצינור. זה יעזור למזער בועות אוויר בצינור והמכשיר.
  5. הכנס את הקצה של הצינור המכיל את ההשעיה התא לתוך כניסת המכשיר. אם ההתקן הוא ערובה לcoverslip, להניח את המכשיר על משטח שטוח, מוצק כגון הבמה מיקרוסקופ לפני חיבור צינורות; coverslip הוא שביר ועשוי אחרת לשבור.
  6. הכנס חתיכת int צינורותo נמל היציאה והמסלול אותו לתוך צינור ריק לאיסוף פסולת כגון צינור פלקון ריק שהודבק לצד השני של הבמה מיקרוסקופ. לעקביות בהתנגדות fluidic הכוללת של המכשיר בין ניסויים, להבטיח שצינורות הכניסה ויציאה הוא מאותו קוטר ובערך באותו האורך לכל ניסוי.
  7. בעדינות כבש את הלחץ לכ 28 kPa או עד תאים לזרום בצינורות. מקם את המכשיר כך שמספר רב של ערוצים נמצאים בשדה הראייה והם ניצבים לחלק התחתון של המסך. אם המצלמה היא מוגבלת על ידי גודל נתונים, לרכוש קטעי וידאו מרובים כדי ליצור מספר מספיק של נקודות נתונים עצמאיות. התאם את מסגרת השיעור במידת הצורך לפלט נתונים הרצוי. כדי ללכוד את השינויים בצורת תא, להשתמש בהדמיה במהירות גבוהה ב 300 מסגרות לשנייה (fps); כדי למדוד זמני מעבר של תאים, להשתמש שיעורי מסגרת של כ 100 fps.

ניתוח .5 נתונים

  1. פתח את תורן הקובץer_script.m (קובץ נוסף להורדה) ולהפעיל את התכנית.
  2. בחר את הווידאו הראשון שנתח זאת מחלון Windows Explorer שמופיע. ציין את מסגרת הדולר לוידאו שנבחר ולחץ על Enter.
    הערה: דמות תופיע, המנחה את המשתמש לבחור חלון חיתוך מלבני לוידאו הראשון.
  3. בחר חלון שמקיף את כל ערוצים משמאל לימין וחוצה את הערוצים בדיוק מעל הנורה הראשונה של המערך של ערוצים בחלק העליון ותחתון (איור 3).
  4. בחר את אזורי כיווץ מהתמונה החתוכה. להקדיש תשומת לב מיוחדת לשמירה על מרחק פיקסל קבוע בין חלון הגבול העליון ותחתון לכל וידאו שנבחר.
    הערה: חלון הקצה העליון מציין את ההתכווצות העליונה וחלון קצה תחתון מציינת את ההתכווצות התחתונה (איור 4); אילוצי ביניים מקורבים מקלט משתמש זה. בשלב הבא, האלגוריתם מציג את יםegmentation של תאים ל50 המסגרות הראשונות של כל וידאו (איור 5).
  5. צג התמונה השמאלית העליונה (איור 5A) בשיתוף פעולה הדוק כדי לקבוע אם האלגוריתם מדויק איתור תאים; תמונת binarized היא על גבי מקור וידאו כדי להדגים את מיקומם של תאים מזוהים.
    הערה: החלונות השונים, (איורים 5 ב-5D) הם לאבחון קוד ולהפגין וידאו מסגרות לאחר פעולות עיבוד תמונה ספציפיות.
  6. בחר את הווידאו הבא להיות מעובד מחלון Windows Explorer.
    הערה: האלגוריתם יחזור על השלבים 5.2-5.5 עבור כל סרטון וידאו שנבחר.
  7. בחרו באפשרות ביטול פעם אחת את כל הסרטונים הרצויים נוספו דרך החלון של Windows Explorer להורות לפונקציה שרשימת וידאו מלאה.
    הערה: האלגוריתם יבצע את הפעולות שנותרו ללא התערבות משתמש. זה ייקח כ 1-2 שעות, תלוי במספר של קטעי וידאו מעובד וPE מחשבrformance. עם ההשלמה, האלגוריתם יהיה לייצר היסטוגרמה של נתוני זמן המעבר ולשמור את הנתונים בספרייה כקובץ .mat MATLAB וקובץ xls Microsoft Excel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לחקור את deformability סוגי תאים שונים, תאים אנושיים מיאלואידית לוקמיה (HL-60), תאי נויטרופילים מובחנים, תאי הלימפוציטים עכבר, ושורות תאי סרטן השחלות אנושיות (OVCAR8, HEYA8) שלהם הוערכו באמצעות טכניקת microfluidic 'תא deformer'. תוצאות עבור נציג את זמן המעבר של HL-60 תאי HL-60 ונויטרופילים הסוג להראות הזמנים לתא בודד למעבר דרך סדרה של התכווצויות, כפי שמוצגים באיור 6. זמן מעבר נמדד לאוכלוסייה של תאים בודדים ב כל התכווצות 7 מיקרומטר בסדרה של 7 אילוצים בלחץ נהיגה של 28 kPa (איור 6).

כפי שניתן לראות באיור 6, HL-60 תאים באופן זמני לחסום את ההתכווצות הראשונה לזמן החציוני של 9.3 אלפיות שניים לפני passaging דרך האילוצים שלאחר מכן. בניגוד לכך, HL-60 תאי נויטרופילים הסוג לחסום את ההתכווצות הראשונה רק 4.3 msec לפניpassaging. זמן מעבר הקצר יותר של HL-60 התאים עולה בקנה אחד עם moduli אלסטי וצמיג המופחת שלהם, כפי שנקבע על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי 21 וmicropipette שאיפה 22. תוצאות אלה גם עולים בקנה אחד עם הרמות מופחתות של חלבון mechanoregulating, lamin, הקובעות זמני מעבר של תאים דרך פערי מיקרון בקנה מידה 23. ברגע שדרך ההתכווצות הראשונה, מעבר תאים במהירות רב יותר דרך האילוצים שנותרו, 2 עד 7, עם זמן מעבר החציוני של 4.0 msec עבור HL-60 התאים ו3.3 אלפיות שניות לתאי נויטרופילים מהסוג (איור 6). בעוד HL-60 התאים עדיין מפגינים מעט יותר אבל זמני מעבר משמעותיים (C2-C7, p = 1.7E-9), חלוקת זמנים מעבר לאילוצים 2-7 הם כמעט זהות לכל סוג תא. התצפית של זמן המעבר נדרש עוד להתכווצות הראשונה עשויה לשקף כי תאי viscoelastic לא להירגע באופן מלא לo הצורה הראשונית שלהםn ~ לוחות זמני msec אלה. אופן פעולה זה עשוי להיות מוסבר על ידי שינויים מבניים בלתי הפיכים המתפתחים בתוך התא, ולהקל על מעברם דרך פערי מיקרון בקנה המידה שלאחר מכן. חשוב לציין, על ידי השוואת זמן מעבר בין אוכלוסיות תאים, אפילו להתכווצות הראשונה, יכול לחשוף הבדלים בdeformability 23.

איור 1
איור 1 איור סכמטי של הגדרת הניסוי. יש המכשיר 'תא deformer' א בהגדרת הניסוי מראה את החיבורים ההיקפיים B. עיצוב המכשיר 4 אזורים פונקציונליים:. נמל כניסה, מסנן תא, מערך התכווצות, ונמל יציאה. ארכיטקטורה של מכשיר microfluidic מראה התכונות העיקריות שלה; הבלעה מראה תמונת אור מועברת של הערוצים המכווצים. קנה המידה, 10 μ ; מ '.

איור 2
איור 2 ציורי הנדסה לכובע מותאם אישית לחצי תקשורת סלולארי הכלולה בזרימה cytometer צינור.

איור 3
איור 3 הפגנה של כיצד לבחור את האזור של עניין לחיתוך מסגרת וידאו.

איור 4
איור 4 הפגנה של איך לבחור מקומות התכווצות.

"Width =" 51474fig5highres.jpg 500 "/>
איור 5 חלון תצפית המשמש כדי לוודא שהאלגוריתם מזהה כראוי מקומות תא כפי שהם לעבד באמצעות מערך ההתכווצות. תמונת א 'Binarized היא על גבי מקור וידאו כדי להראות את המיקום של תאי תמונת הבדל ב';. תמונה מסוננת כובע התחתון ג; ד חציון מסונן.

איור 6
איור 6 מדידות זמן מעבר נציג כפונקציה של מספר התכווצות. א HL-60 תאים להציג את זמן מעבר ארוך יותר דרך ההתכווצות הראשונה מHL-60 תאים שטופלו אתרא B. (נויטרופילים סוג). השוואה של זמן המעבר הפך (log10) דרך ההתכווצות הראשונה כפי שהוערך באמצעות מבחן Mann-Whitney פרמטרית מגלהההבדל הוא משמעותי, p = 1.47E-5. תאים בדרך כלל מעבר דרך ההתכווצות הראשונה בקצב איטי יותר מאשר אילוצים שלאחר מכן. הנתונים שמוצגים כאן לתאים העוברים דרך 7 אילוצים מיקרומטר רחבים בלחץ נהיגה של 28 kPa. צפיפות תאים, אומר קוטר תא, וריכוז חומרים פעילי שטח מוצגת בטבלת 1 HL-60, N = 77.; HL-60 טופל אתרא, N = 97. תוצאות חזרו על עצמם בניסויים עצמאיים במשך 3 ימים שונים.

איור 7
איור .7 מידע כללי על תסריט MATLAB למדידת זמן המעבר. הלולאה הראשונה דורשת התערבות של משתמש ותצפית ל50 המסגרות הראשונות עבור כל סרטון וידאו. אחרי הלולאה הראשונה, את התכנית כולה תפעל ללא התערבות של משתמש ואופן אוטומטי הידור ונתוני אוכלוסיית חלקות.

גבול e = cellpadding "0" = = רוחב cellspacing "0" "0" = "582"> סוג התא גובה ערוץ (מיקרומטר) התכווצות בערוץ (מיקרומטר) אומר קוטר תא (מיקרומטר) ריכוז תא (תאים / מ"ל) ריכוז חומרים פעילי שטח (כרך%) HL-60 10.2 5, 7, 9 14 ~ 1 x 10 6 F127: 0.1 HL-60 נויטרופילים הסוג 10.2 5, 7, 9 14 ~ 1 x 10 6 F127: 0.1 x; "> OVCAR8 10.2 7, 9 16 ~ 5 x 10 6 F127: 0.1 HEYA8 10.2 7, 9 17 ~ 5 x 10 6 F127: 0.1 הלימפוציטים עכבר 5.5 3, 5 8 ~ 3 x 10 6 F127: 0.33

טבלת 1 בעבר למדה מערכות תא ותנאי ההפעלה שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מספקים הליך ניסיוני מקיף לניתוח העיוות של תאים העוברים דרך ערוצי microfluidic מכווצים באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ. תסריט MATLAB מאפשר עיבוד נתונים אוטומטי (משלימה חומר); גרסה מעודכנת של הקוד נשמר (www.ibp.ucla.edu/research/rowat). באופן רחב יותר, ניתן להתאים את הטכניקות שהוצגו כאן במבחני microfluidic מבוססי תאים רבים, כוללים השפעת cytoskeletal וסוכני התקשות גרעיני 24,23 כמו גם מנסה לאמוד deformability של סוגי תאי סרטן 4,5. צילום יחד עם מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יותר לעיוותי subcellular תמונה, שיטה זו מספקת גישה רבת עוצמה כדי לחקור את תכונות מכאניות של תאים ושינויים המתרחשים במצבים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

תא אוטומטי לעיבוד אלגוריתם

"Jove_content"> ניתן לנתח סרטים שנרכשו עם התערבות של משתמש קטן באמצעות סקריפט MATLAB. האלגוריתם מתואר באיור 7, והקבוצה של פונקציות MATLAB מסופקת במידע המשלים. בקיצור, משתמש הורה כדי לבחור את כל קטעי הווידאו לניתוח; לחתוך כל וידאו לאזור של עניין; ולציין במסגרת שיעור לקבוצה של קטעי וידאו; לאחר מכן, התוכנה באופן אוטומטי תהליכי נתוני וידאו כדי לקבוע את זמן המעבר של כל תא לכל התכווצות. ישנן דרישות מסוימות לתסריט לפעול: תאים צריכים לזרום מהחלק העליון של המסגרת לחלק התחתון של המסגרת בווידאו; עמדת microfluidic המכשיר ותנאי התאורה לא צריכים לשנות במידה ניכרת על משך הזמן של הווידאו; וקטעי וידאו צריך להיות ב.avi פורמט. חשוב לציין, אלגוריתם המעקב כולל תאים ששניהם נכנסים והמעבר בחלון של הקלטת וידאו יחידה, שהם כ 8 שניות הזמן. לכן, כלאובייקטים שיש להם את זמן מעבר ארוך יותר אינם נכללים בניתוח. על ידי ביצוע חיסור רקע, אובייקטים שנמצאים לאורך כל הסרטון יוסרו מהניתוח. הקוד גם מיישם הפסקת גודל נמוכה יותר, שעשוי להיות מוגדרת על ידי המשתמש. הפסקת הגודל לניתוח הווידאו הייתה 5 פיקסלים, שווה ערך לקוטר תא של 2.7 מיקרומטר.

מאז קבצי נתוני וידאו במהירות גבוהה יכולים להיות גדולים למדי (~ MB 500), התכנית היא אינטנסיבי המחשוב. קוד בצורה היעילה ביותר להפעיל באמצעות מחשב שולחני עם לפחות 6 GB של זיכרון RAM ושבבים 64 סיביות עם או כונן קשיח מקומי עם לפחות קיבולת 1 TB או ממשק עם כונן גדול קשיח חיצוני או לשרת נתונים עם USB 3.0 , FireWire, או חיבור Ethernet. הנתונים הוא פלט בפורמט היסטוגרמה להדמיה מהירה של תוצאות; הוא גם נספר כנתונים שמאוחסן בקובץ MATLAB (.mat) נתונים ובגיליון אלקטרוני של Excel.

הקוד שהוא יחסי הציבורesented מספק דרך פשוטה להשוואת אוכלוסיות תאים על ידי ניתוח של זמן המעבר לתאים למעבר בכל התכווצות. לניתוח מפורט יותר, את הקוד ניתן יהיה להאריכו לחקור פרמטרים אחרים כוללים גודל תא, יחס ממדים, כמו גם לוח זמנים רגיעה. מחקרים קודמים חושפים את תלות חלשה רק בגודל תא על זמן מעבר ב6.

החסרונות הקשורים למכשיר

ערוצים חסומים הם מכשול עיקרי בכל זרימת ניסוי. תא הידבקות לקירות המכשיר תפגע בזרימה של תאים דרך הערוצים המכווצים: תאים אפשר לראות למרוח לאורך קירות הערוץ. כדי למנוע הידבקות, טיפול פני השטח נכון עם F-127 הוא חיוני.

מאפייני פני השטח של שינוי PDMS עם זמן לאחר טיפול בפלזמה, אשר הופך PDMS באופן זמני הידרופילי 25,26. במהלך שבוע אחד, משטחי PDMS הידרופילי דה לאטליצור לאנרגיית המשטח הידרופובי הטבעית שלהם; זה יכול לאתגר את הסרת בועות אוויר בצינורות. צריכים ובכך לשמש התקנים תוך שבעה ימים מטיפול פלזמה. והכי חשוב, הזמן שבין טיפול פלזמה וassay deformability צריך להיות עקבי בכל הניסויים.

אמנם יש לנו להבחין בהצלחה פעמים מעבר בין סוגי תאים שונים באמצעות מכשירים מפוברקים עם רצפת זכוכית ושלושה קירות PDMS, יכולים גם להיות מפוברקים מכשירים לכן יש להם מאפייני פני השטח אחידים על כל ארבעת קירות הערוץ 27. מכשיר PDMS יכול להיות קשור למצע זכוכית spincoated בשכבה דקה PDMS: לערבב סוכן הריפוי לבסס ביחס של 1: 5 (w / w), יוצק על תבנית המכשיר, ולרפא עבור 20 דקות על 65 מעלות צלזיוס . בינתיים, spincoat שכבה דקה של 1:20 (w / w) סוכן ריפוי לבסס על גבי מצע הזכוכית; לאפות ב85 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. מניחים את מכשיר PDMS בשקופית מצופה PDMS, ולסיים אפיית הלילהכדי להשלים מליטה. שיטה זו היא גם יקרה אם מכונה פלזמה למליטת זכוכית PDMS אינה זמינה.

חסרונות הקשורים לתא.

תרנגולת הכנת ההשעיה התא, הצפיפות של תאים היא קריטית: אם צפיפות התאים נמוכה מדי, אירועי מעבר תא יהיו נדירים; אם צפיפות התאים גבוהה מדי, יהיה מספר תאי passaging ערוץ אחד בו זמנית, הירידה בלחץ על פני תא בודד לא תהיינה עקבית, וזה יהיה קשה להתוות תאים בודדים עם סקריפט אוטומטי.

בעוד ניסויים מבוצעים בדרך כלל תוך הכנת 30 דקות של השעיות תא, תאים יכולים ליישב לתחתית של תא לחץ על זמנים ארוכים יותר> 30 דקות. כדי להימנע מיישוב על פני תקופות זמן ארוכות יותר, תא הלחץ וצינורות חיבור ניתן לסובב מעת לעת. בניסויים ארוכים יותר, בר ומערבב מגנטי קטן ניתן להוסיף לceהשעיה ll, עם צלחת ומערבבים ממוקמת מתחת לתא הלחץ כדי להתסיס את התאים ולמנוע שיקוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אי לנו ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לויד Ung עבור קלט קונסטרוקטיבי בגרסאות המוקדמות של טכניקה זו, ד"ר ג'רמי Agresti לטיפים לעיצוב כובע לחץ, וד"ר Dongping צ'י על עזרתו בבודת כובע הלחץ. אנו מודים למעבדות של מ 'Teitell ופ Gunaratne למתן מגוון רחב של דגימות תאים לבדיקה. אנו מודים לקרן הלאומית למדע (קריירת פרס DBI-1,254,185), המרכז לסרטן באוניברסיטת UCLA Jonsson, וUCLA הקליני וTranslational Science Institute לתמיכה בעבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant  Fisher Scientific  8409400 Produced by BASF, also available through Sigma
PDMS base and crosslinker Essex Brownell DC-184-1.1 Product commonly named Sylgard 184 Elastomer
Oxygen plasma discharge unit Enercon Dyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) Ted Pella, Inc. 15072
Fingertight Ferrule, 1/32" Upchurch Scientific UP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32 Upchurch Scientific UP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm Valco TPK.515-25M
Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm Becton Dickinson 427406
Pressure regulator Airgas or Praxair
Polyurethane tubing, 5/32” OD McMaster Carr 5648K284
Push-to-connect fittings McMaster Carr 5111K91
Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter Omega IP413-020
16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ National Instruments NI PCI 6225-779295-01
Analog Connector Block-Screw Terminal National Instruments SCB-68-776844-01
LabView System Design Software National Instruments
MATLAB Software The MathWorks, Inc. MATLAB R2012a Code requires the Image Processing Toolbox
Shielded Cable National Instruments SHC68-68

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
  4. Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
  5. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  6. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
  7. Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
  8. Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
  9. Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
  10. Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
  11. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  12. Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
  13. Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
  14. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
  15. Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
  16. Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
  17. Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
  18. Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
  19. Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
  20. Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
  21. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  22. Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
  23. Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
  24. Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
  25. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  26. Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
  27. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 91 מכניקת תא מיקרופלואידיקה זרימה מונע לחץ עיבוד תמונה אבחון תפוקה גבוהה microfabrication
טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoelzle, D. J., Varghese, B. A.,… More

Hoelzle, D. J., Varghese, B. A., Chan, C. K., Rowat, A. C. A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability. J. Vis. Exp. (91), e51474, doi:10.3791/51474 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter