Summary
Мы демонстрируют Microfluidics основе анализа измерить временные рамки для клеток к транзиту через последовательность микронного масштаба перетяжек.
Abstract
Здесь мы подробно на проектирование, изготовление и использование микрофлюидном устройства для оценки деформируемости большого количества отдельных клеток в эффективным образом. Как правило, данные за ~ 10 2 клеток могут быть приобретены в рамках эксперимента на 1 час. Автоматизированная программа анализа изображения позволяет проводить эффективный анализ после эксперимента данных изображения, что позволяет обработку на полноту в течение нескольких часов. Наша геометрии устройство уникально тем, что клетки должны деформироваться через серию микронного масштаба сужений, тем самым позволяя начальная деформация и зависит от времени релаксации отдельных клеток, которые будут проанализированы. Применимость этого метода к человеческой промиелоцитарного лейкоза (HL-60) клеток демонстрируется. Вождение клетки деформироваться через микронного масштаба перетяжек с использованием потока давления приводом, заметим, что человек промиелоцитарного (HL-60) клетки моментально закрывают первую сужение для средней продолжительностью 9,3 мс до пассажей быстрее через последующей сужаютионы с медианой времени пролета 4,0 мс в сужении. В отличие от этого, полностью транс-ретиноевой кислоты, обработанных (нейтрофилов-тип) HL-60 клетки закрывают первую сужение для всего 4,3 мс, прежде чем пассирования через последующие сужений со средним временем пролета 3,3 мсек. Этот метод может дать представление о вязкоупругой природы клеток, и в конечном итоге выявить молекулярные истоки такого поведения.
Introduction
Изменения формы клеток имеют решающее значение в многочисленных биологических контекстах. Например, эритроциты и лейкоциты деформации через капилляры, которые меньше, чем их собственный диаметром 1. В метастазов, раковые клетки должны деформироваться в узких интерстициальных пробелов, а также извилистый сосудистой и лимфатической сетей, чтобы отобрать в средних сайтов 2. Чтобы исследовать физическое поведение отдельных клеток, микрофлюидных устройства представляют собой идеальную платформу, которую можно настроить для изучения ряд клеточных поведения в том числе их способности мигрировать через узкие щели 3 и пассивно деформироваться через микронного масштаба перетяжек 3- 9. Полидиметилсилоксан (PDMS) микрофлюидных устройства оптически прозрачны, что позволяет клеточные деформации быть визуализированы с помощью световой микроскопии и проанализированы с помощью базовых инструментов обработки изображений. Кроме того, массивы перетяжек может быть точно определены, что позволяет анализ нескольких ячеек одновременно спропускная что превосходит многие существующие методы 10,11.
Здесь мы представляем подробный экспериментальный протокол для зондирования клеток деформируемость используя микрожидкостных устройств 'Сотовый Deformer' PDMS. Устройство предназначено так, чтобы клетки проход через последовательных сужений; Эта геометрия является общей в физиологических условиях, таких как легочный капиллярный слой 12. Чтобы оценить клеточный деформируемость, время прохождения обеспечивает удобный метрику, который легко измерить как время, необходимое для отдельной клетки транзита через одну сужения 4,6. Для поддержания постоянной перепад давления на суженных каналов во время транспортировки клеток, мы используем поток давления приводом. Наш протокол содержит подробные инструкции по конструкции прибора и изготовления, эксплуатации устройства от давления приводом потока, подготовки и визуализации клеток, а также обработки изображений для измерения времени для клетки деформироваться через серию перетяжек. Мы включаемоба проекта устройств и код обработки данных видение в качестве вспомогательных файлов. В репрезентативной выборке данных, мы показываем время сотовый транзитный через серию перетяжек в зависимости от количества перетяжек пассированными. Анализ временных сроков для клеток к транзита хотя узкие перетяжки из микрофлюидном устройства может выявить различия в деформируемости различных типов клеток 4,5,13. Устройство показали, здесь однозначно обследует транзитной камере через серию микронного масштаба сужений; Этот дизайн эмулирует извилистый путь, что клетки испытать в обращении, а также позволяет зондирования дополнительные физические характеристики клеток, таких как время релаксации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Микрожидкостных Дизайн устройства
ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция устройства состоит из четырех основных функциональных областей: Заход в порт, ячейка фильтра, сужение массива, и выход порта (рисунок 1). Общий дизайн может применяться для широкого круга типов клеток, с незначительными изменениями в размерах. При условии, здесь несколько основных рекомендаций дизайн наряду с параметрами устройств, которые являются эффективными для выбора начальной и иммортализованных клеток.
- Выберите ширину сужение массива каналов (Рисунок 1В), составит около 30-50% от среднего диаметра клеток; Это сужение-клетка размер соотношение результатов в значительной деформации клеток, но минимальной засорения. Учитывая тип клеток, что ранее не было проверено, это разумно, чтобы спроектировать спектр сужения ширины от ~ 30-50% диаметра клеток, чтобы найти оптимальную ширину. Как и во многих видах микрофлюидных устройств, более 120 устройств мастер формы могут быть с рисунком на грехгле 4 дюйма кремниевой пластины, что позволяет множество различных конструкций устройства, чтобы быть изготовлены в одном процессе изготовления.
- Выбор высоты канала, по крайней мере 50% от диаметра клеток; это обеспечивает клеток ограничена в 2 размеров. Для предотвращения коллапса канала во время склеивания, не убедиться, что соотношение сторон канала составляет не менее 1:10 (высота: ширина) на протяжении всего устройства. Для каналов, которые должны превышать этот пропорции, добавить поддержку сообщения для предотвращения краха. Поддержка пространство сообщений на расстоянии, что, по меньшей мере в два раза диаметр ячейки, чтобы не препятствовать потоку клеток.
- Включите фильтр в портах въезда для удаления мусора и разбивке клеточных кластеров (Рисунок 1б). Настройте размер и расстояние между столбами фильтров так, чтобы расстояние разделения сообщения приблизительно равна одному диаметру клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нижний предел размера элемента установлен постановлением, при которой литография маска печатной. Убедитесь, что все функции в пределах разрешенииспособность по ограничение определено поставщиком маски.
2. Поставки и подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом любой эксперимент, следующие пункты должны быть готовы. Схема всей установки приведена на рисунке 1.
- Изготовление ведущего устройства с использованием стандартных методов для литографических микрообработке 14,15. Проверьте высоту узорных особенностей использованием профилометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как мастера можно легко изготовлены в чистых помещениях объекта, некоторые лаборатории разработали недорогие методы литографии для использования в полу-чистой окружающей среде 16,17. - Подготовьте источник воздуха для потока давления приводом, с помощью танка сжатого воздуха и последовательности регуляторов воздуха и фитингов (Рисунок 1А).
- Настраивать бак подачи воздуха и ручной регулятор.
ПРИМЕЧАНИЕ: состав 5% СО 2 в воздухе поддерживает подобную среду в качестве типичного для культивирования клеток incubatoR, но и другие газовые смеси могут быть также использованы. - Настраивать регулятор электронным управлением давления в линии с ручным регулятором. Используйте электропневматический преобразователь для регулирования и поддержания стабильного падения давления между каналами, с колебаниями давления менее 2 кПа. Используйте простой код, написанный на LabVIEW (дополнительную информацию) для ввода нужного давления.
ПРИМЕЧАНИЕ: электро-пневматический преобразователь использует внутренний контур обратной связи для регулировки давления на выходе клапана совпадения указанного давления на микрожидкостных устройств. - Установка герметичной камере для управления потоком суспензии клеток. Сборка клеточной суспензии из камеры стандартного проточного цитометра трубки и обработанной колпачком, который создает герметичного уплотнения на трубе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камера давления крышка содержит два отверстия: входное отверстие, которое подключается к нагнетатель и выход, через который клетки вытекают из герметичной камере в устройство (FigurE 2).
- Настраивать бак подачи воздуха и ручной регулятор.
- Настройка инвертированного микроскопа, оснащенного камерой, которая имеет частоту дискретизации не менее 100 кадров в сек для захвата изображения клеток, проходящих через массив сужения. Интерфейс камеры с карты видеозахвата и компьютером.
- Подготовка исходного раствора ПАВ из 10% вес / вес Pluronic F-127 в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), как добавление небольшого количества F127 в клетки носителя раствором поможет минимизировать адгезию клеток к PDMS стен. Для приготовления раствора F127, вихрь и тепло осторожно при 37 ° С, чтобы растворить F127. Перед использованием пройти раствора через шприцевой фильтр 0,2 мкм и хранить при комнатной температуре. Подготовьте раствор ПАВ заранее как вортексе и фильтрации будет генерировать пузырьки, которые будут сохраняться в течение более чем 24 часов.
3 Микрожидкостных Изготовление устройства
- Изготовление PDMS блок с микроканалов.
- Mix PDMS тщательноСоотношение TA 1:10 (вес / вес) отвердителя на базу.
- Вылейте смесь на ведущего устройства (этап 2.1). Дега в колпаком с прикладной вакууме до захваченных пузырьков исчезают, или около 10-20 мин.
Примечание: По истечении этого времени, могут все еще быть пузырьков на поверхности раздела воздух-PDMS, который является нормальным; они, как правило, рассеивается во время выпечки. Это наиболее важно обеспечить, чтобы там не осталось пузырьков, прилегающих к каналам. - Выпекать дегазированного устройства при 65 ° С в течение 4 часов. Для предотвращения каналов от коллапса, испечь устройство на ночь для дальнейшего сшивания PDMS для устройства с более высоким модулем упругости, который более устойчив к краху канала. Тем не менее, отмечают, что продлен выпечки также охрупчивает в PDMS и может привести к растрескиванию при пробивки отверстий (шаг 3,3).
- Удалить микрофлюидных устройств от главного плесени. Вырезать отдельные микрофлюидных устройств из PDMS блока с лезвием бритвы и удалите устройство с мачтыэ. Начните осторожно отрывая один угол устройства; медленный и нежный шелушение, в отличие от подъема PDMS блок вертикально вверх, уменьшает нагрузку на обеих PDMS и мастера.
- Проделайте отверстия в устройстве PDMS, чтобы создать порты подключения для доступа между трубой и микроканалов. Создание отверстий с помощью биопсии удар, и удар со стороны канала, через к внешней стороне устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия удар с 0,75 мм калибр создает отверстия, интерфейс отлично с полиэфирэфиркетон (PEEK) трубки (наружный диаметр = 1/32 "или 0,79 мм) или полиэтиленовых труб (ПЭ-20, наружный диаметр = 0,043" или 1,09 мм ). Используйте кольцо света, чтобы помочь себе отверстия в устройствах с мелкими каналами 18. Убедитесь, что биопсия удар резкий; после многократного использования передний край притупляет и биопсия удар следует снять и заменить. - Промойте устройство PDMS с изопропанол (ВЭЖХ) для удаления пыли и поданные куски PDMS. Убедитесь, чтоперфорированные отверстия свободно от мусора, направляя устойчивый поток чистого изопропанола от гибкую бутылку через отверстия. Продуйте отфильтрованного воздуха. После очистки, место PDMS блоки с каналами лицевой стороной вверх в чистую чашку Петри для поддержания чистоты устройства. При необходимости, хранить устройства в таком виде до склеивания.
- Очистите стеклянную подложку путем промывки метанолом (ВЭЖХ), просушите отфильтрованного воздуха, и разместить на 200 ° C плите в течение 5-10 мин, чтобы обеспечить стекло полностью чистой и сухой перед плазменной обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: стеклянная подложка образует дно каждого канала. Обычно предметное стекло достаточно, так как 10X или 20X цель идеально подходит для работы с изображениями нескольких каналов параллельно. Для повышения визуализации резолюции, скрепить устройство к покровного (# 1.5 толщины). - Бонду устройство PDMS к стеклянной подложке.
- Кислород плазменной лечить сторону канала блока PDMS и 1 сторону предметного стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: WIth единицы разряда ручного, использовать время обработки 1 мин, но оптимизировать время лечения для каждого аппарата кислородной плазмы. - Поместите сторону канала PDMS поверх обработанной стороны стекла сразу же после обработки.
- Держите вместе с легким нажимом на ~ 10 сек для продвижения склеивание. Выпекать всего устройства при повышенной температуре (60-80 ° С) в течение по крайней мере 15 минут, чтобы улучшить прочность соединения.
- Кислород плазменной лечить сторону канала блока PDMS и 1 сторону предметного стекла.
4 Деформирующий клетки через суженные каналов
- Осмотрите микрожидкостных устройств под микроскопом. Убедитесь, что каналы не рухнул или сломан, и что оба впускные и выпускные отверстия подключить непосредственно в каналы устройств с помощью цели малой мощности (10x). Назначить неисправные устройства, забив поверхности PDMS с бритвой и не использовать их для экспериментов.
- Подготовка образцов клеточных культур, чтобы быть проанализированы. Культуры клеток с использованием стандартных условий.
- Fили пример, культуры HL-60 клеток в среде RPMI-1640 с добавлением 1% раствора пенициллин-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки в 5% CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Для адгезивных клеток, собирают их обработки трипсином и ресуспендируют в свежей среде роста. Используйте стандартный протокол трипсинизации; например, добавить ~ 0,5 мл трипсина в колбу с 25 см 2 области культуры, и ресуспендируйте в ~ 30 мл свежей среды. Дифференцировать HL-60 клеток в клетки нейтрофилов типа на полностью транс-ретиноевой (ATRA) в конечной концентрации 5 мкМ на 1 х 10 5 клеток / мл, как ранее описано 19,20.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 3 мин, тщательно аспирации супернатант и ресуспендируют клетки в соответствующий конечной плотности в свежей культуральной среде с 0,1% об / об F-127.
- Граф клеток с использованием счетчика частиц, гемацитометра или проточного цитометра. Регулировка клеточной суспензии до плотности 1 × 10 6 до 5 х 10
- Поместите клеточной суспензии в проточной цитометрии трубы и подключить к крышке давления. Перед подсоединением трубки к микрофлюидного устройства, отрегулировать давление до приблизительно 14-21 кПа и на одном уровне, пока суспензию клеток не выходит из кончика трубки. Это поможет свести к минимуму пузырьки воздуха на трубки и устройства.
- Вставьте кончик трубки, содержащей суспензию клеток в входе в устройство. Если устройство связывается с покровным, поместить устройство на ровную твердую поверхность, например, на столике микроскопа Перед подключением трубки; покровное является хрупким и может в противном случае разорвать.
- Вставьте кусок междунар трубO выходное отверстие и способа его в пустой трубке для сбора отходов, таких как пустой трубки сокола приклеенный к стороне столике микроскопа. Для последовательности в общей жидкостной устойчивости устройства между экспериментами, гарантировать, что на входе и выходе трубки имеет тот же диаметр и примерно такой же длины для каждого эксперимента.
- Осторожно нарастить давление около 28 кПа или до клетки течь через каналы. Установите устройство таким образом, чтобы несколько каналов в поле зрения и перпендикулярно к нижней части экрана. Если камера ограничена размером данных, приобретают несколько видео, чтобы создать достаточное количество независимых точек данных. Регулировка частоты кадров, как необходимую для желаемого вывода данных. Для захвата изменений в формы клеток, использовать высокую изображений скорости в 300 кадров в сек (кадров в секунду); для измерения транзитные времена клеток, использовать частоту кадров примерно 100 кадров в секунду.
Анализ 5. данных
- Откройте файл Master_script.m (Доступно для скачивания Справочная файла) и запустите программу.
- Выберите первый видео для анализа из окна Проводника Windows, которое появляется. Укажите частоту кадров для выбранного видео и нажмите клавишу ВВОД.
ПРИМЕЧАНИЕ: фигура будет казаться, что предлагает пользователю выбрать прямоугольное окно обрезки для первого видео. - Выберите окно, которое охватывает все каналы слева направо и пересекает каналы чуть выше первой лампочки массива каналов в верхней и нижней (рисунок 3).
- Выберите сужений регионы от обрезанного изображения. Обратите особое внимание на поддержание фиксированное расстояние пикселя между верхней и нижней границей окна для каждого видео выбранной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний край окна определяет верхний сужение и нижний край окна определяет самый нижний сужение (рисунок 4); промежуточные перетяжек аппроксимируются от этого пользователя ввода. Далее, алгоритм отображает Segmentation клеток в течение первых 50 кадров каждого видео (Рисунок 5). - Монитор верхний левый изображение (Рисунок 5A) тесно для определения, если алгоритм точного размещения клеток; бинаризуется изображение накладывается на исходном видео, чтобы продемонстрировать расположение выявленных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные окна, (рисунки 5B-5D) предназначены для диагностики кода и продемонстрировать видеокадры после определенных операций по обработке изображений. - Выбор следующего видео для обработки из окна Проводника Windows.
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм будет повторять шаги 5.2-5.5 для каждого видео выбранной. - Выберите отменить, как только все необходимые видеофайлы были добавлены через окно Проводника Windows поручить функцию, что список видео является полной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм будет выполнять оставшиеся операции без вмешательства пользователя. Это займет около 1-2 ч в зависимости от количества видео обработанных и компьютерных реrformance. После завершения, алгоритм будет производить гистограмму данных временных транзитных и сохранить данные в каталоге как .mat файл MATLAB и .xls файла Microsoft Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для исследования деформируемости различных типов клеток, миелоидных лейкозных клеток человека (HL-60), дифференцированных нейтрофилов клеток, мыши лимфоцитами и яичников линий раковых клеток человека (OVCAR8, HEYA8) оцениваются с помощью микрофлюидных технику в «ячейку Deformer '. Представитель результаты времени прохождения HL-60 и нейтрофилов типа HL-60 клеток показывают временную шкалу для одной клетки к транзиту через серию перетяжек, как показано на рисунке 6. Транзитное время измеряется для населения отдельных клеток в каждый 7 мкм сужение в серии 7 сужений на движущей давлении 28 кПа (рис.6).
Как показано на рисунке 6, HL-60 клеток, временно закрывают первую сужение на медиане времени 9,3 мсек до пассирования через последующие сужений. В отличие от этого, нейтрофилов типа HL-60 клетки закрывают первую сужение для всего 4,3 мсек передпассирование. Чем короче время перехода из HL-60 клеток согласуется с их сокращением упругих и вязких модулей, как определяли методом атомно-силовой микроскопии 21 и пипетки аспирации 22. Эти результаты также согласуются с пониженными уровнями в mechanoregulating белка, ламина А, определяющих сроки транзита клеток через микронных зазоров 23. После того, как через первую сужения, клетки транзит быстрее через оставшиеся перетяжек, от 2 до 7, со средним временем пролета 4,0 мс для HL-60 клеток и 3,3 мс для клеток нейтрофилов типа (Рисунок 6). В то время как HL-60 клетки все еще демонстрируют несколько дольше, но значительные времена перехода (С2-С7, р = 1.7E-9), распределение по времени прохождения сужений 2-7 почти идентичны для каждого типа клеток. Наблюдение за длительное время транзита, необходимого для первого сужения может отражать, что вязкоупругие клетки не полностью расслабиться в исходное формы Oп эти ~ мс временные рамки. Такое поведение также может быть объяснено необратимых структурных изменений, которые развиваются внутри клетки, и для облегчения их транзит через последующих пробелов микронного масштаба. Важно отметить, что, сравнивая время прохождения среди клеточных популяций, даже в первый сужения, можно выявить различия в их деформируемости 23.
Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментальной установки. . Устройство А. "клетка Deformer 'в экспериментальной установки с указанием периферийных соединений Б. Конструкция устройства имеет 4 функциональные области: Заход в порт, ячейка фильтра, сужение массива, и выход порта. Архитектура микрожидкостных устройств, показывая ее основные особенности; вставке показана передающейся светлый образ суженного каналов. Масштабные, 10 μ ; М.
Рисунок 2 Инженерные чертежи для пользовательского крышкой для повышения давления клеточную среду, содержащиеся в проточной цитометрии трубки.
Рис.3 Демонстрация, как выбрать интересующую область для видеокадра обрезки.
Рис.4 Демонстрация, как выбрать места сужения.
51474fig5highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 5 Окно Наблюдение используется для проверки того, что алгоритм определяет местоположение клеток как они обрабатывают по массиву сужения. А. бинаризуется изображение накладывается на исходном видео, чтобы показать расположение клеток B. Разница изображение;. C. Нижняя хет фильтрованное изображение; D. Медиана фильтруют.
Рис.6 Представительства измерения времени транзита в зависимости от числа сужения. A. HL-60 клеток демонстрируют более длиннее время перехода через первый сужения, чем Б. ATRA обработанных HL-60 клеток (нейтрофилов-типа). Сравнение времени преобразуется прохода (log10) через первый сужения, как оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни показываетРазница существенная, р = 1.47E-5. Клетки обычно транзитные через первый сужения медленнее, чем последующие перетяжек. Данные показали здесь для клеток транзитом через 7 мкм-широких перетяжек на движущей давлении 28 кПа. Плотность клеток, средний диаметр клеток и концентрацию поверхностно-активного вещества, приведены в таблице 1 HL-60, N = 77.; ATRA обработке HL-60, N = 97. Результаты были воспроизведены в независимых экспериментах в течение 3 разные дни.
Рисунок 7. Обзор сценария MATLAB для измерения времени. Первый цикл требует вмешательства пользователя и наблюдение за первые 50 кадров для каждого видео. После первого цикла, вся программа будет работать без вмешательства пользователя и автоматически компилирует и данные участки населения.
Таблица 1 Ранее изучал клеточные системы и условий их эксплуатации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предлагаем комплексную экспериментальную процедуру для анализа деформации клеток транзитом через суженные микроканалов используя поток давления приводом. Сценарий MATLAB позволяет автоматизированную обработку данных (дополнительного материала); Обновленная версия кода поддерживается ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). В более широком смысле, методы, представленные здесь, могут быть адаптированы во многих клеточных основе микрофлюидальных анализов, в том числе эффекта цитоскелета и ядерной жесткости агентов 24,23, а также анализируя деформируемость типов раковых клеток 4,5. Взятые вместе с более высоким разрешением микроскопии для изображения субклеточных деформаций, этот метод обеспечивает мощный подход к изучению механических свойств и изменения, которые происходят в физиологических и патологических состояний клеток.
Автоматическая сотовый Алгоритм обработки
рисунке 7, и множество функций MATLAB предоставляется в качестве дополнительной информации. Вкратце, пользователь получает указание, чтобы выбрать все видео анализировать; обрезать все видео для интересующей области; и указать частоту кадров для множества видео; После этого программа автоматически обрабатывает видеоданные для определения времени прохождения каждой ячейки для каждой сужения. Существуют определенные требования для сценария, чтобы работать: клетки должны вытекать из верхней части рамы к нижней части рамы в видео; Микрожидкостных положение устройства и условия освещения не должно заметно измениться в течение срока действия видео; и видео должно быть в формате .avi. Важно отметить, что алгоритм отслеживания включает в себя клетки, которые как войти и проход в временном окне одной записи видео, что составляет примерно 8 сек. Таким образом, любойобъекты, которые имеют более длительное время транзитного исключены из анализа. При выполнении вычитание фона, объекты, которые присутствуют на протяжении всего видео удаляются из анализа. Код также реализует нижней границы размера, который может быть установлен пользователем. Отсечки размер для видеоанализа было 5 пикселей, что эквивалентно диаметром ячейки 2,7 мкм.
Так как файлы данных видео высокоскоростные может быть значительная (~ 500 МБ), программа вычислений. Код наиболее эффективно работать с помощью настольного компьютера, по крайней мере 6 Гб оперативной памяти и 64-разрядной чипсета либо с локального жесткого диска, по меньшей мере емкостью 1 ТБ или сопряжено с большим внешний жесткий диск или сервер данных с USB 3.0 , FireWire, или соединение Ethernet. Данные выводятся в формате гистограммы для быстрого визуализации результатов; он также сведены в таблицу в качестве данных, которые хранятся в .mat () файла данных MATLAB и в электронной таблице Excel.
Код, который является прesented обеспечивает простой способ сравнить клеточных популяций на основе анализа времени прохождения для клеток прохождением через каждого сужения. Для более детального анализа, код может быть продлен исследовать другие параметры, включая размер ячейки, соотношение сторон, а также релаксации сроки. Предыдущие исследования показали, только слабую зависимость размера ячейки на время перехода 6.
Ловушки устройств, связанных с
Окклюзированной каналы серьезным препятствием в любом эксперименте потока. Клеточной адгезии к стенкам устройства будет ухудшать поток клеток через суженные каналы: клетки можно наблюдать намазать вдоль стенок канала. Для предотвращения прилипания, собственно обработка поверхности с F-127 является существенным.
Поверхностные свойства PDMS изменения с течением времени после плазменной обработки, что делает в PDMS временно гидрофильные 25,26. В течение одной недели, гидрофильные поверхности PDMS медленно дегенерировать в их естественной энергии гидрофобной поверхности; это может оспорить удаление пузырьков воздуха через каналы. Устройства должны таким образом быть использован в течение семи дней плазменной обработки. Самое главное, что время между плазменной обработки и деформируемости анализа должно быть одинаковым во всех экспериментах.
В то время как мы успешно отличать время транзита между различными типами клеток, использующих приборы, изготовленные со стеклянным полом и трех PDMS стен, устройства также могут быть изготовлены таким образом, они имеют единые свойства поверхности на всех четырех стенах 27 каналов. ПДМС устройство может быть связан с стеклянной подложке spincoated с тонким слоем PDMS: смешать отвердитель в основу в соотношении 1: 5 (вес / вес), заливают на форму устройства, и вылечить в течение 20 мин при 65 ° С . Между тем, spincoat тонкий слой 1:20 (вес / вес) отвердителя на базу на стеклянную подложку; выпекать при температуре 85 ° С в течение 4 мин. Поместите устройство PDMS на PDMS покрытием слайд, и закончить выпечки ночьдля завершения склеивание. Этот метод также имеет важное значение, если плазма машина для стекла PDMS связи не доступна.
Сотовые связанных подводные камни.
Курица подготовка суспензии клеток, плотность клеток имеет решающее значение: если плотность клеток является слишком низкой, транзитной камере события будет редко; Если плотность клеток является слишком высокой, то будет несколько ячеек пассирования один канал одновременно, падение давления на одной клетки, не будет соответствовать, и это будет трудно разграничить отдельные клетки с автоматизированной сценария.
В то время как эксперименты, как правило, осуществляется в течение 30 мин клеточных суспензий готовится, клетки могут оседать на дне камеры под давлением в течение более длительных времен> 30 мин. Чтобы избежать урегулирования в течение более длительных периодов времени, камера давления и подключения трубки можно периодически поворачивается. Для более длительных опытах, небольшой магнитной мешалкой могут быть добавлены к СЕLL подвеска, с магнитной мешалки, расположенной под барокамере агитировать клетки и предотвратить оседание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов по раскрытию.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность Ллойд Унг для конструктивный вклад в ранних версиях этой техники, доктор Джереми Агрести для капитализации давление советы дизайна, и д-р Dongping Ци за помощь в изготовлении герметичную крышку. Мы благодарны лабораториях М. Teitell и П. Gunaratne для предоставления разнообразных клеточных образцов для тестирования. Мы благодарны поддержке Национального научного фонда (КАРЬЕРА Award DBI-1254185), в UCLA Jonsson Всесторонний Онкологический центр, и UCLA клинической и поступательной науке Института за поддержку этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| Polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| Polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit, 250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| MATLAB Software | The MathWorks, Inc. | MATLAB R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
References
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
