Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تقييم وظيفة الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن

Published: June 16, 2014 doi: 10.3791/51478
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

Summary

درجة ضعف الأوعية الدموية والمساهمة الآليات الفسيولوجية يمكن تقييمها في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن عن طريق قياس العضدية الشريان تدفق بوساطة تمدد، الأبهر نبض سرعة الموجة، والأوعية الدموية البطانية التعبير بروتين الخلية.

Abstract

المرضى الذين يعانون من مرض مزمن في الكلى (كد) قد زادت بشكل ملحوظ خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية بالمقارنة مع السكان عامة، ويفسر هذا جزئيا فقط عن عوامل خطر الأمراض القلبية الوعائية التقليدية. ضعف الأوعية الدموية هو عامل خطر غير التقليدية الهامة، والتي تتميز ضعف بطانة الأوعية الدموية (تقييم الأكثر شيوعا في قيمتها تعتمد على البطانة تمدد [EDD]) وتشنج الشرايين مرنة كبيرة. في حين وجود تقنيات مختلفة لتقييم EDD وتصلب الشرايين الكبيرة المرنة، والأكثر شيوعا هي الشريان العضدي بوساطة تدفق للدم (FMD BA) والأبهر سرعة نبض الموجة (aPWV)، على التوالي. كل من هذه التدابير موسع ضعف الأوعية الدموية هي تنبئ مستقلة للأحداث القلب والأوعية الدموية في المستقبل في المرضى الذين يعانون من أمراض الكلى وبدون. المرضى الذين يعانون من كد تثبت على حد سواء ضعف الحمى القلاعية على درجة البكالوريوس، وزيادة aPWV. في حين أن الآليات الدقيقة التي ضعف الأوعية الدموية ديفييشذب في كد وغير مفهومة، وزيادة الاكسدة وانخفاض لاحق في اكسيد النيتريك (NO) التوافر البيولوجي هي المساهمة الهامة. التغيرات الخلوية في الاكسدة يمكن تقييمها من خلال جمع خلايا بطانة الأوعية الدموية من الوريد المرفقية وقياس البروتين التعبير عن علامات الاكسدة باستخدام المناعي. نحن نقدم هنا مناقشة هذه الأساليب لقياس مرض الحمى القلاعية على درجة البكالوريوس، aPWV، والأوعية الدموية البطانية التعبير بروتين الخلية.

Introduction

مرض مزمن في الكلى (كد) هو مصدر قلق كبير للصحة العامة التي وصلت إلى مستويات وبائية، والتي تؤثر ~ 11.5٪ من السكان في الولايات المتحدة وحدها 1. يتم زيادة خطر الموت القلب والأوعية الدموية أو الحدث القلب والأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من كد بكثير بالمقارنة مع عامة السكان 2-4. على الرغم من أن المرضى الذين يعانون من كد تظهر ارتفاع معدل انتشار عوامل الخطر التقليدية القلب والأوعية الدموية، وهذا يفسر جزءا فقط من لهم زيادة حدوث أمراض القلب والأوعية الدموية (الأمراض القلبية الوعائية) 5. ضعف الأوعية الدموية هو عامل خطر غير تقليدية القلب والأوعية الدموية المهم كسب اعتراف متزايد في مجال أمراض الكلى 6-9.

بينما العديد من التغييرات من المرجح أن تسهم في تطوير ضعف الشرايين، من بين تلك الأكثر إثارة للقلق هي تطوير ضعف بطانة الأوعية الدموية، المقررة الأكثر شيوعا في قيمتها تعتمد على البطانة تمدد (EDD)، وتشنج لللاRGE الشرايين مرنة 10. توجد تقنيات مختلفة لتقييم EDD وتصلب الشرايين مرنة كبيرة، ولكن الأكثر شيوعا هي الشريان العضدي بوساطة تدفق تمدد الحمى القلاعية BA الأبهر وسرعة نبض الموجة (aPWV)، على التوالي. آخر تقنية تستخدم عادة لتقييم EDD يتم قياس استجابة الساعد تدفق الدم إلى وكلاء الدوائية مثل أستيل باستخدام الوريدي انسداد تخطيط التحجم 11،12. ومع ذلك، وهذا يتطلب منهجية القسطرة من الشريان العضدي، والتي هي أكثر الغازية من مرض الحمى القلاعية على درجة البكالوريوس، ويمكن بطلان في المرضى الذين يعانون من كد. تقنية بديلة لتقييم تصلب الشرايين هو لقياس الامتثال الشرياني المحلية (معكوس صلابة) من الشريان السباتي، على الرغم من أن هذه ليست كما تستخدم على نطاق واسع أو التأكد من صلاحيتها مع النهاية السريرية كما aPWV 13.

المرضى الذين يعانون من كد تثبت على حد سواء ضعف الحمى القلاعية BA 14-16 الأبهر وزيادة نبض سرعة الموجة ا ف بWV 13،17،18، حتى قبل الحاجة لغسيل الكلى. الأهم من وجهة نظر سريرية، وكلاهما من هذه التدابير موسع ضعف الأوعية الدموية هي تنبئ مستقلة للأحداث القلب والأوعية الدموية في المستقبل على حد سواء والوفيات في المرضى الذين يعانون من كد 19-21، وكذلك في غيرهم من السكان 22-26. هذه التقنيات يمكن تطبيقها على دراسة مختلف السكان المعرضين لخطر الأمراض القلبية الوعائية، بما في ذلك المرضى الذين يعانون من كد.

وغير مفهومة تماما الآليات الدقيقة التي ضعف الشرايين يتطور في كد؛ ومع ذلك، خفضت أكسيد النيتريك (NO) التوافر البيولوجي هو المساهم الحرجة 27-30 وآلية المشتركة لكلا ضعاف EDD وزيادة تصلب الشرايين 10،31. في كد، وزيادة الاكسدة ويساهم في خفض NO التوافر البيولوجي 32-34. يتم تعريف الاكسدة كما التوافر البيولوجي المفرط للأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) نسبة إلى الدفاعات المضادة للأكسدة. المنبهات الفسيولوجية، المؤتمر الوطني العراقيluding إشارات التهابات، وتعزيز نظم الانزيم المؤكسد لإنتاج ROS، بما في ذلك أنيون الفائق (O 2 ● -) (على سبيل المثال، انزيم أوكسيديز NADPH أكسدة.) 35. إنتاج الفائق يؤدي في النهاية إلى يقلل من التوافر البيولوجي من أكسيد النيتريك (NO).

ضعاف NO التوافر الحيوي قد يساهم بدوره في تطوير كد، واختلال وظيفي البطانية هو مؤشرا مستقلا للحادث كد 36. وهذا يتفق مع البيانات الحيوانية مشيرا إلى أن ارتفاع ضغط الدم يؤدي الى تثبيط أنوش (النظامية والكبيبي)، نقص التروية الكبيبي، الكبيبات، وانبوبية الخلالي إصابة 37. في الواقع، يبدو خفض NO التوافر البيولوجي الضرورية لتطور وتقدم مرض الكلى التجريبية التي تحاكي الأمراض التي تصيب البشر، مما يشير إلى الدور الرئيسي لاختلال وظيفي البطانية في كد الإنسان 38،39.

يمكن تقييم علامات الاكسدة الأوعية الدموية في الخامسascular الخلايا البطانية التي تم جمعها من الموضوعات البحثية الإنسان، وذلك باستخدام تقنية ضعت أصلا من قبل كولومبو وآخرون 40 وتعديل الأختام وآخرون 41-43. باستخدام 2 العقيمة J-الأسلاك، يتم جمع الخلايا من الوريد المرفقية، تعافى، ثابتة، وبعد ذلك حددت بشكل إيجابي كما الخلايا البطانية وتحليلها من أجل التعبير عن البروتينات ذات الاهتمام باستخدام المناعي.

نحن نقدم هنا مناقشة هذه المنهجية التي يمكن استخدامها لأ) تدبير الحمى القلاعية BA؛ ب) قياس aPWV؛ ج) قياس الأوعية الدموية البطانية التعبير البروتين خلية من علامات الاكسدة. وينصب التركيز على المرضى الذين يعانون من كد، لا تتطلب غسيل الكلى المزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية كولورادو متعددة مجلس المراجعة المؤسساتي (COMIRB).

1. التحضير لاختبار الدورة

  1. ينبغي للمشاركين اتبع القيود المفروضة على قياسات أدق: 12 ساعة بسرعة من الطعام والكافيين، 12 ساعة من ضبط النفس وممارسة، 12 ساعة ضبط النفس عن التدخين، إن وجدت،> 4 نصف العمر ضبط النفس من الأدوية إذا كان ذلك ممكنا (قد لا يكون ممكنا في وينبغي اختبار السكان مثل المرضى كد)، والنساء قبل انقطاع الطمث في الأيام 1-7 من الدورة الشهرية للحد من التأثيرات الهرمونية.
  2. إعداد 500 مل من العازلة تفارق بإضافة 2 مل من 0.5 M حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 0.05 غرام من الهيبارين (180 وحدة USP / ملغ)، و 2.5 غرام من ألبومين المصل البقري إلى 476.8 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في الرقم الهيدروجيني 7.4. هذا ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  3. بدوره على الموجات فوق الصوتية، والكمبيوتر، والدورة الدموية غير الغازيةمحطة العمل (NIHem، ومعدات تصلب الشرايين). توصيل الكابلات إخراج الموجات فوق الصوتية إلى الكمبيوتر R-موجة مربع الزناد.

2. جمع وتجهيز الخلايا البطانية الوعائية

  1. ممرضة مدربة أو الطبيب يؤدي جمع (الخطوات 2،2-2،5، 2.7) ويجمع الباحث والعمليات الأسلاك (الخطوات 2.6، 2،8 حتي 2،19)
  2. الإعدادية موقع المرفقية مع موضعي مطهر، وتطبيق وقف النزف، موقع الوريد، ويقني؛ يدخل القنية مع القسطرة G 18. وضع محول heplock على نهاية الرابع.
  3. وضعت على قفازات معقمة ووضع الستائر منوفذة معقمة خلال الموقع.
  4. وضع 2 J-الأسلاك على الستائر. سحب قوس "J" لتفك "ي" شكل من كلا الأسلاك.
  5. إرفع قبعة على heplock وتغذية J-الأسلاك في الوريد حوالي 8 سم. دفع ذهابا وإيابا عدة مرات قبل إزالة الأسلاك. تجنب الدم الإجمالي على السلك.
  6. استخدام قواطع للاسلاك لقص الأسلاك بحيث تناسب في50 مل المخروطية أنبوب يحتوي ~ 30 مل من العازلة تفارق
  7. كرر الخطوة 2.5 لسلك الثاني.
  8. كرر الخطوة 2.6 لسلك الثاني. العودة إلى أنبوب المختبر الرطب.
  9. قفل الأسلاك مع زوج من ملقط وعقد الأسلاك داخل الأنبوب، ولكن قبل الحل. لمدة 10 دقيقة، واستخدام pipetter الآلية لجمع مرارا تفارق العازلة من 50 مل أنبوب مخروطي والافراج عنها لذلك يعمل باستمرار على طول الأسلاك لشطف ويهتز الأسلاك، ثم التخلص من السوائل الزائدة من الأسلاك في أنبوب.
  10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 400 x ج و 4 درجة مئوية.
  11. إعداد الحل الفورمالديهايد في احباط تغطية أنبوب من خلال الجمع بين 100 مل الفورمالديهايد حل + 900 مل PBS.
  12. إزالة أنبوب من أجهزة الطرد المركزي ببطء، بدوره على مضخة فراغ، ضع طرف ماصة على نهاية خرطوم شفط وترك ~ 400 مل في أنبوب، وكنس قبالة بقية من دون إزعاج بيليه.
  13. مع تغطية احباط وماصة 1 مل من محلول الفورمالديهايد فيأنبوب لإصلاح العينة. لا في resuspend. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  14. 8 إعداد الشرائح عن طريق وضع العلامات مع الموضوع والمعلومات زيارة دراسية ورسم شكل بيضاوي على كل شريحة مع القلم حلمة الثدي.
  15. إضافة 15 مل PBS، في resuspend، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج و 4 درجة مئوية.
  16. كرر الخطوة 2.15، إضافة 12 مل PBS، في resuspend، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 400 x ج و 4 درجة مئوية.
  17. إزالة أنبوب من أجهزة الطرد المركزي ببطء، بدوره على مضخة فراغ، ضع طرف ماصة على نهاية خرطوم شفط وترك ~ 2 مل في أنبوب، وكنس قبالة بقية من دون إزعاج بيليه.
  18. في resuspend وماصة بالتساوي على 8 الشرائح في المناطق البيضاوي.
  19. مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعة ثم تخزين في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل (عينات وسوف يكون على ما يرام لسنوات عديدة).

3. تقييم مرض الحمى القلاعية وBA aPWV

  1. يكون تغيير موضوع البحث في شورت المتاح ولها حايم / لها مستلق تكمن في ذلك، الخافت، والمناخ تسيطر غرفة هادئة.
  2. وضع العدد المناسب من تخطيط القلب بالموجات فوق الصوتية للجهاز محددة وتصلب الشرايين (يستخدم هذا الإجراء في الدورة الدموية محطة العمل غير الغازية [NIHem] لقياس تصلب الشرايين، الأمر الذي يتطلب 4 أقطاب)، والكفة ضغط الدم على الموضوع.
  3. بعد 20 دقيقة، تبدأ قراءات ضغط الدم. أداء لا يقل عن 3، وكرر حتى القياسات هي ضمن 5 ملم زئبقي، يستريح 2 دقيقة بين كل قراءة.
  4. بدء قياس توتر بواسطة التلمس لنبض الشريان العضدي، ووضع مقياس التوتر لتسجيل الطول الموجي العضدية باستخدام برنامج حاسوبي.
  5. تكرار للشرايين شعاعي، والفخذ السباتي.
  6. قياس المسافة إلى كل من هذه المواقع من الدرجة supersternal باستخدام شريط قياس (العضدية، وشعاعي السباتي) والحاكم مخصص / الفرجار (الفخذ).
  7. حساب السباتي-العضدية، السباتي، شعاعي، والسباتي الفخذ (aPWV) باستخدام برنامج حاسوبي.
  8. مكانالساعد ضغط الدم الكفة فقط البعيدة لعملية الزج وسجل على الأقل 10 دورات القلب من صور الموجات فوق الصوتية الشريان العضدي خط الأساس وقياسات سرعة تدفق الدم، مع البرمجيات الأوعية الدموية تعيين لتحريك الوضع. A ذراع ميكانيكية يمكن استخدامها لتحقيق استقرار مسبار الموجات فوق الصوتية اذا شئت.
  9. تضخيم الساعد ضغط الدم الكفة إلى 250 ملم زئبقي ويبدأ الموقت. إرشاد المشاركين على البقاء لا يزال جدا.
  10. بدء تسجيل سرعات مع مجموعة البرمجيات الأوعية الدموية يؤدي إلى وضع عندما يقرأ الموقت 04:45. الزناد الافراج عن صفعة في الساعة 5:00 وتغيير الموجات فوق الصوتية لتسجيل B-وضع (قطر) الصور عند الساعة 5:10 يقرأ.
  11. مواصلة تسجيل حتى يقرأ على مدار الساعة 7:00.
  12. سجل على الأقل 10 دورات القلب من خط الأساس الصور الشريان العضدي بالموجات فوق الصوتية مع البرمجيات الأوعية الدموية تعيين لتحريك الوضع.
  13. تأخذ ضغط الدم الشخص المعني. إذا كان ضغط الدم الانقباضي> 100 ملم زئبقي، وضع 0.4 ملغ من النتروجليسرين تحت اللسان تحت موضوع و# 39؛ ق اللسان ويبدأ الموقت، إلا إذا كان المريض لديه موانع أخرى.
  14. بدء تسجيل B-واسطة (صور قطر) عند الساعة 3:00 يقرأ مع البرنامج الأوعية الدموية تعيين لتحريك الوضع.
  15. إيقاف التسجيل عند الساعة 8:00 يقرأ.
  16. مراقبة ضغط الدم حتى يعود إلى خط الأساس

4. إعداد الإنسان الوريد السري البطانية الخلية (HUVEC) الشرائح تحكم

  1. تنمو HUVECs لمرور 5-6 و ~ 80٪ confluency.
  2. يعرض للتريبسين مع 3 مل من التربسين أو كل ما هو ضروري للطبق / القارورة.
  3. تحييد التربسين باستخدام حجم مساو من محلول التربسين تحييد.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق ~ وإزالة التربسين وحل تحييد قبل فراغ.
  5. ~ resuspend في 10 مل PBS لغسل.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج ~ 5 دقائق. إزالة برنامج تلفزيوني.
  7. إزالة برنامج تلفزيوني والإصلاح في عام 1800 ميكرولتر PBS + 200 ميكرولتر الفورمالديهايد.
  8. resuspend في برنامج تلفزيوني (~ 10 مل).
  9. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج ~5 دقائق. إزالة برنامج تلفزيوني، resuspend في حجم مناسب لإضافة 200 ميكرولتر ~ لكل شريحة.
  10. مخزن الشرائح في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل (عينات وسوف يكون على ما يرام لسنوات عديدة).

5. تلون الخلايا البطانية الوعائية

  1. تأخذ الشرائح من -80 ° C الفريزر وانتظر 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (هذا الإجراء هو مجموعة من 10 الشرائح، بما في ذلك واحدة تحكم HUVEC الشريحة).
  2. يمحو المياه الزائدة مع مهمة حساسة مسح (لا تلمس وسط الشريحة).
  3. إعادة ترطيب الشرائح بإضافة PBS غيرت إلى كل شريحة وتركها لمدة 10 دقيقة.
  4. في حين أن الشرائح واقفا، وإعداد 5٪ مصل حمار وغيرها من الحلول.
    1. إعداد 5٪ المصل حمار بإضافة 300 ميكرولتر من المصل حمار إلى 5،700 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني المتغيرة (لدرجة الحموضة من 7.4) لمدة تصل إلى 10 الشرائح (زيادة هذا المبلغ للمزيد).
    2. تمييع الأجسام المضادة الأولية من الاهتمام في 1،000 ميكرولتر من 5٪ مصل. على سبيل المثال، nitrotyrosine وNADPHأوكسيديز (1:300 و1:1،500) يمكن أن تستخدم كعلامات الاكسدة.
    3. إعداد AF568 الثانوية عن طريق تمييع 5 ميكرولتر من AF568 إلى 1،500 μll من 5٪ مصل.
    4. إعداد VE كادهيرين عن طريق تمييع 2 ميكرولتر من VE كادهيرين إلى 1،000 ميكرولتر من 5٪ مصل.
    5. إعداد AF488 عن طريق تمييع 5 ميكرولتر من VE كادهيرين إلى 1،000 ميكرولتر من 5٪ مصل.
    6. إبقاء AF568، VE كادهيرين وAF488 تحت احباط من خلال العملية برمتها ومن ثم وضع على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية الثلاجة أثناء إعداد الشرائح.
  5. بعد 10 دقيقة من الإماهة، والشرائح الجافة مع مهمة حساسة قضاء.
  6. إضافة 5٪ المصل حمار لمدة 60 دقيقة، ووضع قطعة من فيلم البارافين البلاستيك فوق منطقة دائري لضمان تغطية كاملة للمادة الكيميائية.
  7. تجاهل الفيلم البارافين البلاستيك والشرائح الجافة مع مهمة حساسة قضاء. لا يغسل. إضافة الأجسام المضادة الأولية لمدة 60 دقيقة، ووضع قطعة من فيلم البارافين البلاستيك فوق منطقة دائري لضمانتغطية كاملة للمادة الكيميائية.
  8. تجاهل الفيلم البارافين البلاستيك، وشطف مع برنامج تلفزيوني غيرت من زجاجة بخ ونقع في الأعمدة الشريحة لمدة 5 دقائق. في حين أن الشرائح وتمرغ، نقلها إلى غرفة مظلمة. العمل في الظلام لجميع الخطوات المتبقية.
  9. الشرائح الجافة مع Kimwipes، إضافة AF568 (الضد الثانوية) لمدة 45 دقيقة، ووضع قطعة من فيلم البارافين البلاستيك فوق منطقة دائري لضمان تغطية كاملة للمادة الكيميائية. تغطية من الضوء.
  10. تجاهل الفيلم البارافين البلاستيك في حاوية نفايات بيولوجية. شطف مع برنامج تلفزيوني غيرت من زجاجة بخ، ومن ثم نقع في الأعمدة لمدة 5 دقائق.
  11. الشرائح الجافة مع Kimwipes، ثم يضاف VE كادهيرين لمدة 60 دقيقة، ووضع قطعة من فيلم البارافين البلاستيك فوق منطقة دائري لضمان تغطية كاملة للمادة الكيميائية. تغطية من الضوء.
  12. تجاهل الفيلم البارافين البلاستيك في حاوية نفايات بيولوجية. شطف مع برنامج تلفزيوني غيرت من زجاجة بخ، ومن ثم نقع في الأعمدة لمدة 5 دقائق.
  13. الشرائح الجافة معمهمة حساسة القضاء، إضافة AF488 لمدة 30 دقيقة ووضع قطعة من فيلم البارافين البلاستيك فوق منطقة دائري لضمان تغطية كاملة للمادة الكيميائية. تغطية من الضوء.
  14. تجاهل الفيلم البارافين البلاستيك في حاوية نفايات بيولوجية. شطف مع برنامج تلفزيوني غيرت من زجاجة بخ، ومن ثم نقع في الأعمدة لمدة 5 دقائق.
  15. الشرائح الجافة مع مهمة حساسة مسح وتسمح الشرائح لتجف لمدة 20 دقيقة. تغطية من الضوء.
  16. إضافة قطرة واحدة فقط من fluoroshield تصاعد المتوسطة مع 4 '، 6 diamidino-2-phenylindole هيدروكلوريد (دابي) إلى كل شريحة وتغطية كل مع انزلاق الغطاء.
  17. وضع الشرائح في 4 درجات مئوية الثلاجة مغطاة احباط. يحتاج التصوير أن تكتمل في غضون 48 ساعة.

6. التصوير وتحليل الخلايا البطانية الوعائية

  1. إعداد المجهر لتصوير الخلايا البطانية الملون وفقا لمواصفات محددة المجهر. فني واحد أعمى يجب تحليل أي بروتين معين عن الخفافيشالفصل من الخلايا.
  2. مسح الشرائح بشكل منهجي. تحديد الخلايا البطانية التي كتبها تلطيخ إيجابية لVE كادهيرين وتأكيد سلامة النووية عن طريق تلطيخ إيجابية للدابي.
  3. صورة 30 خلايا لكل شريحة لتحليلها لاحقا. تكرار لكل شريحة في الدفعة الملون، بما في ذلك HUVEC.
  4. تحليل كثافة تلطيخ للالأجسام المضادة الأولية ذات الاهتمام باستخدام البرمجيات النوعية.
  5. لتقليل تأثير التباس ممكن من الاختلافات في كثافة تلطيخ بين جلسات تلطيخ مختلفة، والقيم التقرير بأنه نسبة التعبير البروتين في الخلايا البطانية التي تم جمعها لنفس البروتين التعبير في HUVEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكميا الحمى القلاعية BA كما تغير الذروة في قطر الشريان العضدي التالية تبيغ رد الفعل. وبالتالي، تتم مقارنة في بقية القطر لقطر بعد انتهاء فترة 5 دقائق ضغط الدم الكفة انسداد (الشكل 1). لوحة ويظهر صورة الموجات فوق الصوتية ممثل الشريان العضدي، وفريق B يعرض الرسم البياني للتغيير R-موجة بوابات في القطر من الإفراج الكفة إلى 2 دقيقة التالية، كما تم الحصول عليها باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا. كما تغير غالبا ما تكون ضئيلة جدا (في الشكل 1 التغيير هو 4.8٪)، ويمكن الفروق الصغيرة في القياس يكون لها آثار كبيرة على النتائج. ينصح بشدة استخدام البرمجيات المتاحة تجاريا الكشف عن الحافة الآلي للتقليل من التحيز والخطأ المحتملة في قياس 44،45. كما التحفيز للتمدد أثناء تبيغ رد الفعل قد تختلف بين الجماعات أو ظروف يجري مقارنة، يجب أن يحسب معدل القص باستخدام تدفق الدم دوبلرالسرعات، والحمى القلاعية BA ينبغي تعديل الفروق عند الاقتضاء 46،47.

يتم احتساب aPWV مع الحد الأدنى من المدخلات المشغل من قبل معظم النظم المتاحة تجاريا، بما في ذلك NIHem تستخدم في أبحاثنا. تتم مقارنة R-موجة ECG إلى "قدم" من الموجي في موقع معين ويتم حساب فارق التوقيت (الشكل 2) لالشريان السباتي (لوحة A) والشريان الفخذي (لوحة B). وتستخدم القياسات مسافة بالتزامن مع فروق التوقيت لحساب السرعة. aPWV يشير إلى سرعة بين الشريان السباتي إلى الشريان الفخذي (أي. على طول الشريان الأورطي).

تحليل مناعي للخلايا بطانة الأوعية الدموية يمكن أن توفر أدلة الخلوية من مستوى الإجهاد التأكسدي. لحساب الفروق في كثافة تلطيخ بين جلسات تلطيخ، ومستوى مضان من بروتين معين لكل موضوع على حدة (ممثل معهد العالم العربي غيس هو مبين في الشكل (3) لوحة A) وبالمقارنة مع الشريحة مضان من السيطرة HUVEC (صور ممثل هو مبين في الشكل 3 لوحة B). وبالتالي، يمكن مقارنة الاختلافات في بروتين تعبير إما بين المجموعات أو عبر الشروط (على سبيل المثال، خلال دراسة التدخل).

الشكل 1
الشكل 1. الممثل العضدية الأساس قطر الشريان تم الحصول عليها خلال تقييم الشريان العضدي بوساطة تدفق للدم (FMD BA). أ) في مريض يعانون من مرض الكلى المزمن (كد). ويرد B) R-موجة التغيير بوابات في القطر من الإفراج الكفة إلى 2 دقيقة التالية بيانيا، كما تم الحصول عليها باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا.الهدف = "_blank"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. نتائج الممثل الطباعة التدريجي من تقييم aPWV في المريض مع كد. A) تأخير الوقت من R-موجة ECG إلى سفح الشريان السباتي، B) تأخير الوقت من R-موجة ECG إلى سفح الشريان الفخذي (Tfoot)، مضافين مع الموجي السباتي. إظهار كل اللوحات أيضا المسافات إدخالها من الدرجة فوق القص إلى مواقع منها (ويمثلها إلكتروني D؛ في سم). ويرد قيمة aPWV حساب في لوحة B (ويمثلها الحروف PWV؛ في سم / ثانية). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. </ ع>

الرقم 3
الرقم 3. صور الممثل من البروتين التعبير. A) دابي (سلامة النووية، أزرق)، VE كادهيرين (تحديد إيجابية الخلايا البطانية؛ الأخضر) انزيم أوكسيديز NADPH أكسدة (بروتين من الفائدة؛ الحمراء) من الخلايا التي تم جمعها من مريض يعانون من كد B) ولالسري الخلايا البطانية الوريد الإنسان (HUVEC) السيطرة الشريحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحصول على نتائج دقيقة لمرض الحمى القلاعية وBA aPWV يتطلب الحصول على صور الموجات فوق الصوتية عالية الجودة والطول الموجي الضغط، على التوالي. المركزية لهذا هو التدريب المناسب والمستمر واستخدام كل تقنية من قبل المشغل 44. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان للسيطرة على العديد من المتغيرات الخارجية التي قد تؤثر على النتائج ممكن عن طريق توحيد جلسة الاختبار (على سبيل المثال، قبل 12 ساعة بسرعة، والمناخ تسيطر الغرفة، الخ) 44،45. كما ذكر أعلاه، ينصح بشدة استخدام تجاريا R-موجة بوابات البرمجيات اقتناء والبرمجيات الحافة الكشف للحد من التحيز والخطأ المحتملة في قياس 44،45. عندما تنخفض قيمة الحمى القلاعية على درجة البكالوريوس، وهذا يمكن أن يكون إما بسبب ضعف NO الإفراج عن البطانة أو بسبب ضعف استجابة العضلات الملساء في الأوعية الدموية على صدر NO. يدار تحت اللسان النتروجليسرين للسيطرة على استجابة على نحو سلسطبقة الخلايا العضلية إلى الخارجية أكسيد النيتريك المانحة، من أجل أن نخلص إلى أن أي انخفاض في مرض الحمى القلاعية BA تقتصر على قدرة بطانة الأوعية الدموية لإنتاج أكسيد النيتريك 44،45.

كما هو قياس السرعة، وقياسات دقيقة لكلا المسافة والزمن حاسمة. ويستند البروتوكول التي وصفناها على المنهجية المستخدمة في دراسة فرامنغهام القلب 24. استخدام الفرجار أثارت بدلا من شريط قياس يحسن دقة قياس المسافة من الدرجة فوق القص إلى شريان الفخذ خلال اتخاذ مسار مباشر بدلا من قياس إمكانات أكثر من البدانة في منطقة البطن. واضح "القدم" لالموجي نظيفة هو ضرورة مطلقة لحساب فارق التوقيت من R-موجة ECG إلى دفعة في موقع القياس (انظر الشكل 2).

في حين أن التقنيات البديلة المتاحة لتقييم كل وظيفة بطانة الأوعية الدموية وعتصلب البكتيرية، مرض الحمى القلاعية على درجة البكالوريوس وaPWV على حد سواء التي تستخدم عادة في الأبحاث السريرية لأنها غير الغازية، وأنشأ كذلك نتائج سيط. بالإضافة إلى ذلك، فإنها يتم التحقق من صحة بشكل جيد في مختلف السكان والتنبؤية هي بشكل مستقل من الأحداث القلب والأوعية الدموية والوفيات 19-26. وبالتالي، فإنها يمكن أن تستخدم نقاط النهاية البديلة في الدراسات السريرية تقييم فعالية للتدخل للحد من مخاطر القلب والأوعية الدموية في مجموعة سكانية معينة، مثل المرضى الذين يعانون من كد. لا يطلب تعديل هذه التقنيات لدراسة تحديدا المرضى الذين يعانون من كد، بالمقارنة مع غيرهم من السكان المعرضين لخطر الأمراض القلبية الوعائية.

ومع ذلك، هناك قيود المهم على حد سواء الحمى القلاعية BA aPWV والتي تستحق المناقشة. الحمى القلاعية BA يقيم وظيفة بطانة الأوعية الدموية من الشريان قناة كبيرة (الشريان العضدي)، وبالتالي لا يوفر وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة مؤشر البطانية. وهناك تقنية منفصلة باستخدام وريدي انسداد plethysmography هو أكثر ملاءمة لتقييم هذا الأخير. ومع ذلك، وهذا يتطلب منهجية القسطرة من الشريان العضدي، والتي هي أكثر الغازية من مرض الحمى القلاعية على درجة البكالوريوس، ويمكن بطلان في المرضى الذين يعانون من كد. بالإضافة إلى ذلك، قياس مرض الحمى القلاعية BA يتطلب تدريب مطول ومحددة لكي يتم أداء جيدا. يوفر aPWV فهرس كبيرة تصلب الشريان المرنة، والتي قد تختلف عن تصلب الشرايين المحلية (مثل الشريان السباتي). تقنية بديلة لتقييم تصلب الشرايين هو لقياس الامتثال الشرياني المحلية (معكوس صلابة) من الشريان السباتي، على الرغم من أن هذه ليست كما تستخدم على نطاق واسع أو التأكد من صلاحيتها مع النهاية السريرية كما aPWV 13. بالإضافة إلى ذلك، مساهمة NO كعامل محدد من تصلب الأبهر قد تختلف من السرير الوعائي 48. الماضي، وهناك يفند المحتملة لتفسير كل من مرض الحمى القلاعية وBA aPWV التي تحتاج أن تقاس إحصائيا وتعديلها حسب الاقتضاء ل، بما في ذلك خط الأساس دiameter ومعدل القص لمرض الحمى القلاعية BA 45، ومعدل ضربات القلب وضغط الدم لaPWV 49.

أحد الاعتبارات الهامة في جمع خلايا بطانة الأوعية الدموية وتقليل الدم على J-الأسلاك، وبعد ذلك على الشرائح، مثل أن الخلايا البطانية ويمكن تحديد الحد الأدنى مع خلايا الدم الحمراء تداخل في الصور. ويمكن تحقيق هذا مع التدريب على الأسلوب السليم وكذلك غسل كافية عندما يتعافى الخلايا. عند تحليل الشرائح، فمن الأهمية بمكان أن مضان يمكن قياسها كميا بموضوعية والصور واضحة، من دون الكثير من الخلفية أو التداخل مع الخلايا الأخرى. تعظيم الاستفادة من التخفيفات لتلطيخ وتقنية للتحليل المجهري قبل تحليل عينات الدراسة هي الخطوات الرئيسية. من المذكرة، والعائد خلية من هذه التقنية هو ~ 600 خلايا بطانة الأوعية الدموية في جمع مبلغ كاف من إجمالي مرنا متاح لقياس التعبير الجيني، مما يحد من التحقيق جهدنا لimmunoflتلطيخ uorescent من البروتينات المثيرة للاهتمام.

بالإضافة إلى التقنيات المعروضة لتقييم الاكسدة الأوعية الدموية، وتعميم أو علامات البول يمكن استخدامها لتقييم الاكسدة 12،50. ومع ذلك، فإنها قد تكون أقل تعكس مستوى الاكسدة محددة لمستوى بطانة الأوعية الدموية. باستخدام هذه العلامات بالتزامن مع التقنيات المعروضة قد توفر أفضل دليل على المستوى العام للالاكسدة.

قدمنا ​​لمحة عامة عن الطرق التي يمكن استخدامها لقياس مرض الحمى القلاعية على درجة البكالوريوس، aPWV، والأوعية الدموية البطانية التعبير بروتين الخلية. هذه التقنيات هي مناسبة ليس فقط للمرضى الذين يعانون من كد، ولكن أيضا في الشعوب الأخرى في زيادة خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية. بشكل جماعي، لأنها توفر نظرة ثاقبة ضعف الأوعية الدموية البطانية، تصلب الشرايين الكبيرة المرنة، والمساهمة الآليات الفسيولوجية، بما في ذلك الاكسدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر نينا Bispham للحصول على المساعدة الفنية لها. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (12POST11920023)، والمعاهد الوطنية للصحة (K23DK088833، K23DK087859).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J-wire St. Jude 404584 2 per collection
Disposable shorts (MediShorts) Quick Medical 4507
Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) Cardiovascualr Engineering N/A Includes custom ruler.  An alternate system is the Sphygmocor
Ultrasound G.E. Model: Vivid7 Dimension We use a G.E., but there are many companies and models
Vascular software (Vascular Imager)  Medical Imaging Applications N/A
R-wave trigger box Medical Imaging Applications N/A custom made
Rapid Cuff Inflation System Hokanson Model: Hokanson E20
Forearm blood pressure cuff Hokanson N/A custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder 
HUVECs Invitrogren C-015-5C
Donkey serum Jackson 017-000-121
Pap pen Research Products International 195505
VE Cadherin Abcam ab33168
AF568 Life Technologies A11011 depends on specifications of microscpe 
AF488 Life Technologies A11034 depends on specifications of microscpe 
Nitrotyrosine antibody  Abcam ab7048
NADPH oxidase antibody Upstate 07-001
DAPI  Vector H-1200
Delicate task wipe (Kimwipe)  Fisher Scientific 06-666-A
Plastic paraffin film (parafilm)  Fisher Scientific 13-374-10
Confocal microscope  Olympus Model: FV1000 FCS/RICS many options exist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
  2. Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
  3. Parfrey, P. S., Harnett, J. D. Cardiac disease in chronic uremia. Pathophysiology and clinical epidemiology. Asaio J. 40, 121-129 (1994).
  4. Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation. 116, 85-97 (2007).
  5. Sarnak, M. J., et al. Cardiovascular disease risk factors in chronic renal insufficiency. Clin Nephrol. 57, 327-335 (2002).
  6. Kendrick, J., Chonchol, M. B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease. Nat Clin Pract Nephrol. 4, 672-681 (2008).
  7. Bellasi, A., Ferramosca, E., Ratti, C. Arterial stiffness in chronic kidney disease: the usefulness of a marker of vascular damage. Int J Nephrol. 2011, (2011).
  8. vander Zee, S., Baber, U., Elmariah, S., Winston, J., Fuster, V. Cardiovascular risk factors in patients with chronic kidney disease. Nat Rev Cardiol. 6, 580-589 (2009).
  9. Malyszko, J. Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 411, 1412-1420 (2010).
  10. Lakatta, E. G., Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease. Circulation. 107, 139-146 (2003).
  11. Seals, D. R., Jablonski, K. L., Donato, A. J. Aging and vascular endothelial function in humans. Clin Sci (Lond). 120, 357-375 (2011).
  12. Jablonski, K. L., et al. Dietary sodium restriction reverses vascular endothelial dysfunction in middle-aged/older adults with moderately elevated systolic blood pressure. J Am Coll Cardiol. 61, 335-343 (2013).
  13. Briet, M., et al. Arterial stiffness and enlargement in mild-to-moderate chronic kidney disease. Kidney Int. 69, 350-357 (2006).
  14. Thambyrajah, J., et al. Abnormalities of endothelial function in patients with predialysis renal failure. Heart. 83, 205-209 (2000).
  15. Ghiadoni, L., et al. Effect of acute blood pressure reduction on endothelial function in the brachial artery of patients with essential hypertension. J Hypertens. 19, 547-551 (2001).
  16. Yilmaz, M. I., et al. The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 47, 42-50 (2006).
  17. Wang, M. C., Tsai, W. C., Chen, J. Y., Huang, J. J. Stepwise increase in arterial stiffness corresponding with the stages of chronic kidney disease. Am J Kidney Dis. 45, 494-501 (2005).
  18. Shinohara, K., et al. Arterial stiffness in predialysis patients with uremia. Kidney Int. 65, 936-943 (2004).
  19. Karras, A., et al. Large artery stiffening and remodeling are independently associated with all-cause mortality and cardiovascular events in chronic kidney disease. Hypertension. 60, 1451-1457 (2012).
  20. Pannier, B., Guerin, A. P., Marchais, S. J., Safar, M. E., London, G. M. Stiffness of capacitive and conduit arteries: prognostic significance for end-stage renal disease patients. Hypertension. 45, 592-596 (2005).
  21. Yilmaz, M. I., et al. Vascular health, systemic inflammation and progressive reduction in kidney function; clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes. Neprhol Dial Transplant. 26, 3537-3543 (2011).
  22. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated aortic pulse wave velocity, a marker of arterial stiffness, predicts cardiovascular events in well-functioning older adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  23. Tanaka, H., DeSouza, C. A., Seals, D. R. Absence of age-related increase in central arterial stiffness in physically active women. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18, 127-132 (1998).
  24. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  25. Yeboah, J., Crouse, J. R., Hsu, F. C., Burke, G. L., Herrington, D. M. Brachial flow-mediated dilation predicts incident cardiovascular events in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. 115, 2390-2397 (2007).
  26. Shechter, M., et al. Long-term association of brachial artery flow-mediated vasodilation and cardiovascular events in middle-aged subjects with no apparent heart disease. Int J Cardiol. 134, 52-58 (2009).
  27. Baylis, C. Nitric oxide deficiency in chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 294, (2008).
  28. Wever, R., et al. Nitric oxide production is reduced in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vasc. 19, 1168-1172 (1999).
  29. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. J Am Soc Nephrol. 15, 1983-1992 (2004).
  30. Hasdan, G., et al. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 61, 586-590 (2002).
  31. Chue, C. D., Townend, J. N., Steeds, R. P., Ferro, C. J. Arterial stiffness in chronic kidney disease: causes and consequences. Heart. 96, 817-823 (2010).
  32. Dupont, J. J., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. Ascorbic acid or L-arginine improves cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. J Appl Physiol. 111, (2011).
  33. Oberg, B. P., et al. Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease. Kidney Int. 65, 1009-1016 (2004).
  34. Cachofeiro, V., et al. Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease. Kidney Int Suppl. (111), (2008).
  35. Vila, E., Salaices, M. Cytokines and vascular reactivity in resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, (2005).
  36. Perticone, F., et al. Endothelial dysfunction and subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. Circulation. 122, 379-384 (2010).
  37. Zatz, R., Baylis, C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension. 32, 958-964 (1998).
  38. Nakagawa, T., Johnson, R. J. Endothelial nitric oxide synthase. Contrib Nephrol. 170, 93-101 (2011).
  39. Muller, V., Tain, Y. L., Croker, B., Baylis, C. Chronic nitric oxide deficiency and progression of kidney disease after renal mass reduction in the C57Bl6 mouse. Am J Nephrol. 32, 575-580 (2010).
  40. Colombo, P. C., et al. Biopsy coupled to quantitative immunofluorescence: a new method to study the human vascular endothelium. J Appl Physiol. 92, 1331-1338 (2002).
  41. Donato, A. J., Black, A. D., Jablonski, K. L., Gano, L. B., Seals, D. R. Aging is associated with greater nuclear NFkappaB, reduced IkappaBalpha, and increased expression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans. Aging Cell. 7, 805-812 (2008).
  42. Donato, A. J., et al. Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans: relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappaB. Circ Res. 100, 1659-1666 (2007).
  43. Jablonski, K. L., Chonchol, M., Pierce, G. L., Walker, A. E., Seals, D. R. 25-Hydroxyvitamin D deficiency is associated with inflammation-linked vascular endothelial dysfunction in middle-aged and older adults. Hypertension. 57, 63-69 (2011).
  44. Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
  45. Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
  46. Donald, A. E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol. 51, 1959-1964 (2008).
  47. Widlansky, M. E. Shear stress and flow-mediated dilation: all shear responses are not created equally. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296, (2009).
  48. Stewart, A. D., Millasseau, S. C., Kearney, M. T., Ritter, J. M., Chowienczyk, P. J. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension. 42, 915-918 (2003).
  49. Lantelme, P., Mestre, C., Lievre, M., Gressard, A., Milon, H. Heart rate: an important confounder of pulse wave velocity assessment. Hypertension. 39, 1083-1087 (2002).
  50. Jablonski, K. L., Seals, D. R., Eskurza, I., Monahan, K. D., Donato, A. J. High-dose ascorbic acid infusion abolishes chronic vasoconstriction and restores resting leg blood flow in healthy older men. J Appl Physiol. 103, 1715-1721 (2007).

Tags

الطب، العدد 88، مرض مزمن في الكلى، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، بوساطة تدفق للدم، المناعي، والإجهاد التأكسدي، نبض سرعة الموجة
تقييم وظيفة الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jablonski, K. L., Decker, E.,… More

Jablonski, K. L., Decker, E., Perrenoud, L., Kendrick, J., Chonchol, M., Seals, D. R., Jalal, D. Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (88), e51478, doi:10.3791/51478 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter