Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Оценка функции сосудов у больных с хронической болезнью почек

Published: June 16, 2014 doi: 10.3791/51478
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Division of Renal Diseases and Hypertension, University of Colorado, Denver, 2Department of Integrative Physiology, University of Colorado, Boulder

Summary

Степень сосудистой дисфункции и способствуя физиологические механизмы могут быть оценены у пациентов с хроническим заболеванием почек, измеряя плечевой потока опосредованного расширение артерии, аорты скорости распространения пульсовой волны, а выражение эндотелия сосудов белка клетки.

Abstract

Пациенты с хроническим заболеванием почек (ХБП) значительно увеличили риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) по сравнению с населением в целом, и это лишь частично объясняется традиционными факторами риска ССЗ. Сосудистая дисфункция является важным нетрадиционные фактором риска, характеризуется сосудистой дисфункции эндотелия (чаще всего оценивается как нарушения эндотелий-зависимой дилатации [EDD]) и ужесточение крупных упругих артерий. Хотя существуют различные методы для оценки EDD и большой жесткости эластичной артерии, наиболее часто используемый в плечевой поток-опосредованной дилатации артерии (FMD BA) и аортальный скорость пульсовой волны (aPWV), соответственно. Оба этих неинвазивных мер сосудистой дисфункции являются независимыми прогностическими факторами будущих сердечно-сосудистых событий у пациентов с и без заболевания почек. Пациенты с ХБП продемонстрировать как нарушение ящуром бакалавра, и увеличение aPWV. Хотя точные механизмы, по которым сосудистая дисфункция развиLOPS в CKD не полностью понял, увеличилось окислительный стресс и последующее снижение оксида азота (NO) биодоступность вносят важный вклад. Клеточные изменения в окислительном стрессе может быть оценена путем сбора сосудистых эндотелиальных клеток из локтевой вены и измерения экспрессии белка маркеров окислительного стресса с помощью иммунофлюоресценции. Мы предоставляем здесь обсуждение этих методов для измерения ящуром BA, aPWV и выражение эндотелия сосудов белка клетки.

Introduction

Хроническая болезнь почек (ХБП) является серьезной проблемой общественного здравоохранения, которая достигла масштабов эпидемии, влияя ~ 11,5% населения только в 1 США. Риск сердечно-сосудистой смерти или сердечно-сосудистых событий у пациентов с ХБП значительно увеличивается по сравнению с общей популяцией 2-4. Хотя пациенты с ХБП демонстрируют высокую распространенность традиционных сердечнососудистых факторов риска, это только объясняет часть повышенной их 5 случаев сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Сосудистая дисфункция является важным нетрадиционных сердечно-сосудистых факторов риска набирает все большее признание в области нефрологии 6-9.

Хотя многие изменения, скорее всего способствуют развитию артериальной дисфункции, среди тех, наибольшую озабоченность являются развитие сосудистой дисфункции эндотелия, чаще всего оценивается как нарушения эндотелий-зависимой дилатации (EDD), и ужесточение в Лос-АнджелесеRGE упругие артерии 10. Существуют различные способы, чтобы оценить ПДР и большой жесткости упругих артерии, но наиболее часто используются плечевой артерии поток-опосредованной дилатации ящура BA и аорты скорость распространения пульсовой волны (aPWV) соответственно. Еще одним часто используемым методом для оценки ПДР измеряет предплечья ответ приток крови к фармакологических агентов, таких как ацетилхолин использованием венозного окклюзии плетизмографию 11,12. Тем не менее, эта методология требует катетеризации в плечевой артерии, которая является более чем инвазивные ящура BA и может быть противопоказан пациентам с ХБП. Альтернативный метод для оценки артериальной жесткости является для измерения локальной артериальное соответствие (обратную жесткости) сонной артерии, хотя это и не так широко используется или подтверждена с клиническими конечными точками, как aPWV 13.

Пациенты с ХБП продемонстрировать как нарушение ящуром BA 14-16 и увеличение аорты скорости распространения пульсовой волны аРWV 13,17,18, еще до нуждающихся в диализе. Важно с клинической точки зрения, оба эти неинвазивных мер сосудистой дисфункции являются независимыми прогностическими факторами будущих сердечно-сосудистых событий и смертности как у пациентов с ХБП 19-21, а также в других группах населения 22-26. Эти методы могут быть применены к изучению различных популяций, подверженных риску сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе у пациентов с ХБП.

Точные механизмы, посредством которых артериальная дисфункция развивается при ХБП не полностью понял; Однако восстановленный оксид азота (NO) биодоступность является критическим фактором 27-30 и общий механизм как нарушения EDD и повышенное артериальное жесткость 10,31. В CKD, окислительный стресс увеличивается и способствует снижению в ближайшие биодоступность 32-34. Окислительный стресс определяется как чрезмерное биодоступности активных форм кислорода (АФК) по отношению к антиоксидантной защиты. Физиологические стимулы, вклЛУДИНГ воспалительный сигнализацию, способствуют ферментных систем окислителя для производства АФК, в том числе супероксиданиона (O 2 ● -) (например, окислитель фермент NADPH оксидазы.) 35. Производство супероксида в конечном счете приводит к уменьшает биодоступность оксида азота (NO).

Нарушение NO биодоступность не может, в свою очередь способствовать развитию ХБП, как дисфункция эндотелия является независимым предиктором падающего CKD 36. Это согласуется с данными о том, что животное Енос торможение вызывает гипертензию (системное и клубочковой), клубочковой ишемия, гломерулосклероз и тубуло-интерстициальный травмы 37. Действительно, снижение NO биодоступность не представляется необходимой для развития и прогрессирования экспериментальной заболевания почек, который имитирует человеческую болезнь, предполагая, ключевую роль для эндотелиальной дисфункции в человеческой CKD 38,39.

Маркеры сосудистой окислительного стресса могут быть оценены в версииascular эндотелиальные клетки, собранные из объектов исследования, используя метод изначально разработанный Коломбо и др.. 40, а модифицированный Уплотнения и др. 41-43. Использование 2 стерильные J-провода, клетки собирают из локтевой вены, восстановленные, фиксированный, а затем идентифицированы как эндотелиальные клетки и анализировали на экспрессию белков, представляющих интерес с помощью иммунофлюоресценции.

Мы предоставляем здесь обсуждение этой методологии, которая может использоваться в) меры ящура BA; б) измерения aPWV; в) измерить эндотелия сосудов экспрессию белка клеток маркеров окислительного стресса. Основной упор делается на пациентов с ХБП, не требуя хроническому диализу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол следует рекомендациям Колорадо Multiple Совета по биомедицинской этике (COMIRB).

1. Подготовка к испытанию сессии

  1. Участники должны выполнить следующие ограничения для наиболее точных измерений: 12 час быстрый из пищи и кофеина, 12 ч воздержание от физических упражнений, 12 час сдержанности от курения, если это применимо,> 4 полураспада сдержанность от лекарств, если это возможно (может не быть возможным в Население таких как пациенты с ХБП), и до менопаузы женщины должны быть проверены в дни 1-7 менструального цикла, чтобы минимизировать гормональных влияний.
  2. Приготовления 500 мл буфера диссоциации путем добавления 2 мл 0,5 М этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), 0,05 г гепарина (180 USP единиц / мг) и 2,5 г бычьего сывороточного альбумина в 476,8 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в рН 7,4. Это можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев.
  3. Включите ультразвука, компьютер, и неинвазивной гемодинамическихРабочая станция (NIHem; артериальная жесткость оборудование). Подключите кабели вывода ультразвук, чтобы окна триггера Р-волны компьютера.

2. Сбор и обработка эндотелиальных клеток сосудов

  1. Медсестра или врач выполняет сбор (шаги 2.2-2.5, 2.7) и исследователь собирает и обрабатывает провода (шаги 2.6, 2.8-2.19)
  2. Подготовьте локтевой сайт с актуальной антисептическое, наложить жгут, найти вены, и вводить иглу с 18 G катетера. Поместите адаптер heplock на конце IV.
  3. Наденьте стерильные перчатки и положил стерильные окончатые шторы на сайте.
  4. Место 2 J-провода на шторы. Потяните дугу "J", чтобы размотать "J" форму с обеих проводов.
  5. Открывать в heplock и кормить J-провод в вены около 8 см. Нажмите и обратно несколько раз, прежде чем снимать проволоку. Избегайте валовой кровь на проводе.
  6. Используйте кусачки, чтобы отрезать провода, чтобы они плотно в50 мл коническую трубку, содержащий ~ 30 мл диссоциации буфера
  7. Повторите шаг 2,5 для второго провода.
  8. Повторите шаг 2,6 для второго провода. Вернуться трубку к мокрой лаборатории.
  9. Захватите провода с парой щипцов и удерживайте провода внутри трубки, но над раствором. Для 10 мин, использовать моторизованный пипеттором неоднократно собирать буфер диссоциации от 50 мл коническую трубку и отпустите его, чтобы он работает по всей длине проводов для полоскания и вибрировать провода, то избавиться от лишней жидкости из проводов в трубку.
  10. Центрифуга в течение 7 минут при 400 мкг в и 4 ° С.
  11. Подготовьте раствор формальдегида в фольге покрыты трубы путем объединения 100 мл раствора формальдегида + 900 мл PBS.
  12. Медленно снимите трубку от центрифуги, включите вакуумный насос, разместить пипетки на конце всасывающего шланга и оставить ~ 400 мл в трубке, пылесосить от остальной, не нарушая гранул.
  13. Накрыть фольгой и пипетки 1 мл раствора формальдегида втрубка для закрепления образца. Не ресуспендируйте. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  14. Подготовьте 8 слайдов по маркировке с субъектом и информации ознакомительную поездку и рисунок овал на каждом слайде с мазок пера.
  15. Добавьте 15 мл PBS, ресуспендируют и центрифуг в течение 5 мин при 400 х г и 4 ° С.
  16. Повторите шаг 2.15, добавить 12 мл PBS, ресуспендируют и центрифуг в течение 6 мин при 400 х г и 4 ° С.
  17. Медленно снимите трубку от центрифуги, включите вакуумный насос, разместить пипетки на конце всасывающего шланга и оставить ~ 2 мл в трубке, пылесосить от остальной, не нарушая гранул.
  18. Ресуспендируйте и пипетки равномерно по 8 слайдов в овальных зонах.
  19. Место в инкубаторе при 37 ° С в течение 5 часов и затем хранить при -80 ° С до готовности для анализа (образцы будет хорошо в течение многих лет).

3. Оценка ящура БА и aPWV

  1. Есть исследования изменения объекта в одноразовых трусах и имеют чим / ее ложь спине в тихом, тусклом, климат-контролем комнате.
  2. Поместите необходимое количество ЭКГ для конкретного ультразвука и артериальной жесткости устройства (эта процедура использует неинвазивной гемодинамики Рабочая станция [NIHem] для измерения жесткости артерий, что требует 4 электродов) и манжету для измерения кровяного давления на теме.
  3. Через 20 мин начинают чтения кровяного давления. Выполните по крайней мере 3, и повторять, пока измерения не будут равны 5 мм рт.ст., отдыхая 2 мин между каждым чтением.
  4. Начните тонометрии пальпацией для импульса в плечевой артерии и размещения тонометр для записи плечевого сигналов с помощью программного обеспечения.
  5. Повторите эти действия для радиальных, бедренных и сонных артерий.
  6. Измерьте расстояние к каждому из этих сайтов от supersternal выемку с помощью ленты мера (плечевого, радиальное и сонной) и пользовательские линейка / суппорт (бедренной).
  7. Рассчитать сонной-плечевой, сонной-радиальный и сонной-бедренной (aPWV) с помощью программного обеспечения.
  8. Местоманжеты предплечья кровяное давление просто дистальнее процессе локтевого отростка и записи не менее 10 сердечных циклов из базовых плечевой артерии ультразвуковых изображений и измерения скорости кровотока, с сосудистым программного обеспечения, установленного в режим запуска. Механический рычаг может быть использован, чтобы стабилизировать ультразвуковой зонд, при желании.
  9. Накачать предплечья манжету до 250 мм рт.ст. и начать таймер. Поручить участника оставаться неподвижно.
  10. Начните скорости записи с сосудистым набор программного обеспечения в режим запуска, когда таймер читает 4:45. Отпустить манжету в 5:00 и изменить ультразвук для записи B-режим (диаметр) изображения, когда часы читает 5:10.
  11. Продолжить запись, пока часы не читает 7:00.
  12. Запись по крайней мере 10 сердечных циклов базовых плечевого ультразвуковых артерии изображений с сосудистой программного обеспечения, установленного в режим запуска.
  13. Возьмите кровяное давление субъекта. Если систолическое артериальное давление> 100 мм рт.ст., разместить 0,4 мг нитроглицерина сублингвально под тему &# 39; ы язык и начать таймер, если пациент не имеет еще одно противопоказание.
  14. Начните запись B-режим (изображения диаметре), когда часы читает 3:00 с сосудистой программного обеспечения, установленного в режим запуска.
  15. Остановить запись, когда часы читает 8:00.
  16. Монитор артериального давления, пока не вернется к исходному уровню

4. Подготовка пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) Контроль Слайды

  1. Расти HUVECs прохождению 5-6 и ~ 80% слияния.
  2. Trypsinize с 3 мл трипсина или то, что необходимо для посудомоечной / колбу.
  3. Нейтрализации системы трипсин с помощью равного объема трипсин нейтрализующего раствора.
  4. Центрифуга при 200 мкг в течение ~ 5 мин и снять трипсин и нейтрализующий раствор с помощью вакуума.
  5. Ресуспендируют в ~ 10 мл PBS, чтобы вымыть.
  6. Центрифуга при 200 XG ~ 5 мин. Удалить PBS.
  7. Удалить PBS и исправить в 1800 мкл PBS + 200 мкл формальдегида.
  8. Ресуспендируют в PBS (~ 10 мл).
  9. Центрифуга при 200g ~5 мин. Удаление PBS, ресуспендируют в соответствующем объеме добавить ~ 200 мкл на слайд.
  10. Храните горки в -80 ° С до готовности для анализа (образцы не будет хорошо в течение многих лет).

5. Окрашивание эндотелиальных клеток сосудов

  1. Возьмите слайды из -80 ° C морозильник и ждать 5 мин при комнатной температуре (эта процедура для выпечки 10 слайдов, в том числе один HUVEC управления слайде).
  2. Вытрите лишнюю воду с нежным задачи уничтожить (не прикасайтесь центр слайде).
  3. Re-гидрат слайды, добавив изменен PBS к каждому слайду и оставить их в течение 10 мин.
  4. В то время как слайды стоя, подготовить 5% осла сыворотки и другие решения.
    1. Подготовьте 5% осла сыворотки путем добавления 300 мкл осла сыворотки 5700 мкл измененной PBS (до рН 7,4) на срок до 10 слайдов (увеличить эту сумму в течение более).
    2. Развести первичное антитело интереса в 1000 мкл 5% сыворотки. Например, нитротирозина и NADPHоксидазы (1:300 и 1:1,500) могут быть использованы в качестве маркеров окислительного стресса.
    3. Подготовка вторичного AF568 путем разбавления 5 мкл AF568 в 1500 μll 5% сыворотки.
    4. Подготовка В.Е. кадгерина путем разбавления 2 мкл В.Е. Cadherin 1000 мкл 5% сыворотки.
    5. Подготовка AF488 путем разбавления 5 мкл В.Е. Cadherin 1000 мкл 5% сыворотки.
    6. Держите AF568, В.Е. кадгерина и AF488 под фольгой через весь процесс, а затем поместить на рокера в 4 ° C холодильнике при подготовке слайдов.
  5. После 10 мин регидратации, сухие горки с нежным задачи протрите.
  6. Добавить 5% осла сыворотки в течение 60 мин и поместите кусок пластиковой парафиновой пленки над кружил области в целях обеспечения полного охвата химических веществ.
  7. Откажитесь от пластиковой парафиновой пленки и сухие слайды с тонким задачи протрите. Не стирать. Добавить первичного антитела в течение 60 мин и поместить часть пластмассовой парафиновой пленки в кружок над площадью, чтобы обеспечитьполный охват химического вещества.
  8. Откажитесь от пластиковой парафиновой пленки, промыть измененной PBS от пульверизатор и замочить в колонках слайд в течение 5 мин. В то время как слайды замачивания, переместить их в темной комнате. Работа в темноте в течение всех оставшихся шагов.
  9. Сухие слайды с Kimwipes, добавить AF568 (вторичные антитела) в течение 45 мин и поместите кусок пластиковой парафиновой пленки над кружил области в целях обеспечения полного охвата химических веществ. Обложка от света.
  10. Откажитесь от пластиковой парафиновой пленки в контейнер для биологически опасных отходов. Промойте с измененной PBS от пульверизатор, а затем замочить в колонках в течение 5 мин.
  11. Сухие слайды с Kimwipes, затем добавить В.Е. Cadherin в течение 60 мин и поместите кусок пластиковой парафиновой пленки над кружил области в целях обеспечения полного охвата химических веществ. Обложка от света.
  12. Откажитесь от пластиковой парафиновой пленки в контейнер для биологически опасных отходов. Промойте с измененной PBS от пульверизатор, а затем замочить в колонках в течение 5 мин.
  13. Сухие слайды сделикатная задача протрите, добавьте AF488 в течение 30 мин и поместите кусок пластиковой парафиновой пленки над кружил области в целях обеспечения полного охвата химических веществ. Обложка от света.
  14. Откажитесь от пластиковой парафиновой пленки в контейнер для биологически опасных отходов. Промойте с измененной PBS от пульверизатор, а затем замочить в колонках в течение 5 мин.
  15. Сухие горки с нежным задачи протрите и позволяют слайды высохнуть в течение 20 мин. Обложка от света.
  16. Добавьте одну каплю только из fluoroshield монтажную среду с 4 ', гидрохлорид 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для каждого слайда и охватывают каждый с покровным стеклом.
  17. Поместите слайды в 4 ° C холодильник, покрытой фольгой. Изображений должна быть завершена в течение 48 часов.

6. Изображений и анализ эндотелиальных клеток сосудов

  1. Подготовьте микроскоп для работы с изображениями окрашенных эндотелиальные клетки в соответствии с требованиями конкретного микроскопом. Один ослеплен техник должен проанализировать любой конкретный белок для летучей мышич клеток.
  2. Сканирование слайдов систематически. Определить эндотелиальные клетки на положительное окрашивание для VE Cadherin и подтвердите ядерной целостность положительное окрашивание для DAPI.
  3. Image 30 клеток на слайде для последующего анализа. Повторите эти действия для каждого слайда в окрашенных партии, в том числе HUVEC.
  4. Анализ интенсивность окрашивания для первичного антитела интереса с использованием качественного программного обеспечения.
  5. Чтобы свести к минимуму возможное, смешанное воздействие различий в окраске интенсивности между различными сессиями окрашивания, значения в отчете, как соотношение экспрессии белка в собранных эндотелиальных клеток в той же экспрессии белка в HUVEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FMD BA количественно как пик изменению диаметра плечевой артерии следующей реактивной гиперемии. Таким образом, диаметр в покое по сравнению с диаметром после окончания периода 5 мин манжета кровяное давление окклюзии (рис. 1). Панель показан репрезентативный ультразвуковое изображение плечевой артерии, а панель В отображает график изменения закрытом R-волны диаметром от манжеты выпуска в 2 мин следующей, полученного с использованием коммерчески доступного программного обеспечения. Как изменение часто довольно минимальны (На рисунке 1 изменение составляет 4,8%), небольшие различия в измерении может иметь большое влияние на результаты. Использование коммерчески доступного программного обеспечения обнаружения автоматизированная края настоятельно рекомендуется свести к минимуму смещение и потенциальную ошибку в измерения 44,45. Как стимул для замедления во время реактивной гиперемии могут отличаться между группами или условий сравниваемых, скорость сдвига следует рассчитывать, используя поток крови Доплераскоростей и ящур BA следует с поправкой на разницу, когда применимым 46,47.

aPWV рассчитывается с минимальной мощностью оператора большинством имеющихся в продаже систем, в том числе NIHem используется в нашем исследовании. R-волна ЭКГ по сравнению с "пешком" формы волны на данном сайте и разница во времени рассчитывается (рис. 2) для сонной артерии (Панель А) и бедренной артерии (Панель В). Измерения расстояния используются в сочетании с временных разниц, чтобы вычислить скорость. aPWV относится к скорости между сонной артерии к бедренной артерии (т.е.. вдоль аорты).

Иммунофлуоресцентного анализа сосудистых эндотелиальных клеток может обеспечить сотовой доказательства уровне окислительного стресса. Для учета различий в окрашивания интенсивности между окрашивания сессий, уровень флуоресценции данного белка для каждого отдельного субъекта (представитель ИМА ГЭС показано на рисунке 3 панель А) по сравнению с флуоресценции контрольной слайд HUVEC (представительные изображения показано на рисунке 3 панели B). Таким образом, различия в экспрессии белка можно сравнить либо между группами или по условиям (например, во время интервенционного исследования).

Рисунок 1
Рисунок 1. Представитель базовый плечевой диаметр артерии, полученные в ходе оценки потока опосредованной дилатации плечевой артерии (ящур BA). А) У пациента с хроническим заболеванием почек (ХБП). Б) Р-волны закрытого изменение диаметра от манжеты выпуска до 2 мин после графически показано, как получены с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель результаты печати из оценки aPWV у пациента с ХБП. А) Время задержки от R-волны ЭКГ к подножию сонной артерии, В) время задержки от R-волны ЭКГ к подножию бедренной артерии (TFOOT), обложил сонной волны. Обе панели также показывают введенные расстояния от супрастернальные ступень до соответствующих сайтов (обозначается буквой D; в см). Расчетное значение aPWV показан на панели B (обозначена буквами СПВ, в см / сек). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. </ Р>

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель изображения экспрессии белка. A) DAPI (ядерный целостность; синий), В.Е. кадгерин (положительный эндотелиальных клеток идентификации; зеленый) окислитель фермент NADPH-оксидаза (представляющий интерес белок, красный) из клеток, собранных от пациента с CKD б) и в течение пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) управления слайд.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Получить точные результаты для ящура БА и aPWV требуется приобретения высококачественных ультразвуковых изображений и сигналов давления, соответственно. Центральное место в это уместно и продолжал обучение и использование каждого метода оператором 44. Кроме того, очень важно, чтобы контролировать столько внешних переменных, которые могут повлиять на результаты, как это возможно путем стандартизации тестирования сессии (например, предварительное 12 HR быстро, климат-контроль комната и т.д.) 44,45. Как уже упоминалось выше, использование коммерчески R-волны закрытого программного обеспечения сбора и программного обеспечения от края обнаружения рекомендуется минимизировать смещение и потенциальную ошибку в измерения 44,45. Когда ящур BA нарушается, это может быть либо из-за не нарушена Нет Релиз от эндотелия или вследствие нарушения отзывчивости гладких мышцах сосудов к НЕТ освобожден. Нитроглицерина сублингвально вводят для контроля за отзывчивость гладкаяслой клеток мышцы экзогенного донор окиси азота, для того, чтобы заключить, что любое ухудшение в ящура BA специфичен к способности эндотелия сосудов с образованием оксида азота 44,45.

Как измерение скорости, точные измерения расстояния и времени имеют решающее значение. Протокол мы описали основан на методологии, применяемой в исследовании Framingham Heart 24. Использование привлеченных суппортами, а не рулеткой улучшает точность измерения расстояния от супрастернальные ступень до бедренной артерии, взяв прямой путь, а не потенциального измерения над абдоминального ожирения. Ясное "нога" из чистой формы сигнала является абсолютно необходимым для расчета разницы во времени с R-волны ЭКГ на импульс в области измерения (см. Рисунок 2).

В то время как альтернативные методы доступны для оценки как функции эндотелия и арриала жесткость, ящур BA и aPWV оба широко используется в клинических исследованиях, потому что они неинвазивным и зарекомендовал себя как посредников результатов. Кроме того, они хорошо проверены в различных популяциях и независимым предиктором сердечно-сосудистых событий и смертности 19-26. Таким образом, они могут быть использованы в качестве суррогатных конечных точек в клинических исследованиях по оценке эффективности для вмешательства, чтобы уменьшить риск сердечно-сосудистых в данной популяции, например, у пациентов с ЦП. Модификация этих методов не требуется специально изучать пациентов с ХБП, по сравнению с другими группами населения, подверженных риску сердечно-сосудистых заболеваний.

Тем не менее, существуют серьезные ограничения для обеих ящура БА и aPWV, что заслуга обсуждения. Ящур BA оценивает эндотелия сосудов функцию большого трубопровода артерии (плечевой артерии), таким образом, не дает индекс функции микрососудов эндотелия. Отдельный метод с использованием венозного окклюзии plethysmграфия лучше подходит для оценки последнего. Тем не менее, эта методология требует катетеризации в плечевой артерии, которая является более чем инвазивные ящура BA и может быть противопоказан пациентам с ХБП. Кроме того, измерение ящура BA требует длительной и специальной подготовки для того, чтобы быть выполнена хорошо. aPWV обеспечивает индекс большой жесткости упругих артерии, которая может отличаться от местной артериальной жесткости (например, сонной артерии). Альтернативный метод для оценки артериальной жесткости является для измерения локальной артериальное соответствие (обратную жесткости) сонной артерии, хотя это и не так широко используется или подтверждена с клиническими конечными точками, как aPWV 13. Кроме того, вклад NO как детерминант аорты жесткости может варьироваться в зависимости от сосудистого русла 48. Последний, есть потенциальные смешивает к трактовке как ящура БА и aPWV, что нужно быть измерены и статистически с поправкой на по мере необходимости, в том числе базового гiameter и скорости сдвига для ящура BA 45, и частота сердечных сокращений и кровяное давление для aPWV 49.

Важным моментом в коллекции сосудистых эндотелиальных клеток является минимизация кровь на J-проводов, а затем на слайдах, например, что эндотелиальные клетки могут быть идентифицированы с минимальными эритроцитов перекрывающихся в образах. Это может быть достигнуто с обучением для правильной технике, а также адекватной промывки при восстановлении клеток. При анализе слайды, очень важно, чтобы флуоресценции может быть объективно количественно и образы ясны, без особого фона или перекрытия с другими клетками. Оптимизация разведений для окрашивания и методика анализа микроскопии до анализа образцов исследования являются ключевыми шагами. Следует отметить, что выход клеток этого метода является ~ 600 сосудистые эндотелиальные клетки в коллекции, недостаточное количество общей мРНК доступен для измерения экспрессии генов, тем самым ограничивая нашу зонд immunoflлюминесцентных окрашивание белков, представляющих интерес.

В дополнение к методам, представленным для оценки сосудистого окислительного стресса, циркулирующих или маркеры мочи может быть использован для оценки окислительного стресса 12,50. Однако, они могут быть менее отражает уровень окислительного стресса конкретной уровню сосудистого эндотелия. Используя эти маркеры в сочетании с методами, представленными может обеспечить лучшую индикацию общего уровня окислительного стресса.

Мы представили обзор методов, которые можно использовать для измерения ящуром BA, aPWV и выражение эндотелия сосудов белка клетки. Эти методы подходят не только для пациентов с ХБП, но и в других группах населения с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний. В общем, они дают представление сосудистой дисфункции эндотелия, большой жесткости упругих артерии и способствует физиологические механизмы, в том числе окислительного стресса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Нина Bispham для ее технической помощи. Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца (12POST11920023), и НИЗ (K23DK088833, K23DK087859).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
J-wire St. Jude 404584 2 per collection
Disposable shorts (MediShorts) Quick Medical 4507
Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) Cardiovascualr Engineering N/A Includes custom ruler.  An alternate system is the Sphygmocor
Ultrasound G.E. Model: Vivid7 Dimension We use a G.E., but there are many companies and models
Vascular software (Vascular Imager)  Medical Imaging Applications N/A
R-wave trigger box Medical Imaging Applications N/A custom made
Rapid Cuff Inflation System Hokanson Model: Hokanson E20
Forearm blood pressure cuff Hokanson N/A custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder 
HUVECs Invitrogren C-015-5C
Donkey serum Jackson 017-000-121
Pap pen Research Products International 195505
VE Cadherin Abcam ab33168
AF568 Life Technologies A11011 depends on specifications of microscpe 
AF488 Life Technologies A11034 depends on specifications of microscpe 
Nitrotyrosine antibody  Abcam ab7048
NADPH oxidase antibody Upstate 07-001
DAPI  Vector H-1200
Delicate task wipe (Kimwipe)  Fisher Scientific 06-666-A
Plastic paraffin film (parafilm)  Fisher Scientific 13-374-10
Confocal microscope  Olympus Model: FV1000 FCS/RICS many options exist 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
  2. Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
  3. Parfrey, P. S., Harnett, J. D. Cardiac disease in chronic uremia. Pathophysiology and clinical epidemiology. Asaio J. 40, 121-129 (1994).
  4. Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation. 116, 85-97 (2007).
  5. Sarnak, M. J., et al. Cardiovascular disease risk factors in chronic renal insufficiency. Clin Nephrol. 57, 327-335 (2002).
  6. Kendrick, J., Chonchol, M. B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease. Nat Clin Pract Nephrol. 4, 672-681 (2008).
  7. Bellasi, A., Ferramosca, E., Ratti, C. Arterial stiffness in chronic kidney disease: the usefulness of a marker of vascular damage. Int J Nephrol. 2011, (2011).
  8. vander Zee, S., Baber, U., Elmariah, S., Winston, J., Fuster, V. Cardiovascular risk factors in patients with chronic kidney disease. Nat Rev Cardiol. 6, 580-589 (2009).
  9. Malyszko, J. Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 411, 1412-1420 (2010).
  10. Lakatta, E. G., Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease. Circulation. 107, 139-146 (2003).
  11. Seals, D. R., Jablonski, K. L., Donato, A. J. Aging and vascular endothelial function in humans. Clin Sci (Lond). 120, 357-375 (2011).
  12. Jablonski, K. L., et al. Dietary sodium restriction reverses vascular endothelial dysfunction in middle-aged/older adults with moderately elevated systolic blood pressure. J Am Coll Cardiol. 61, 335-343 (2013).
  13. Briet, M., et al. Arterial stiffness and enlargement in mild-to-moderate chronic kidney disease. Kidney Int. 69, 350-357 (2006).
  14. Thambyrajah, J., et al. Abnormalities of endothelial function in patients with predialysis renal failure. Heart. 83, 205-209 (2000).
  15. Ghiadoni, L., et al. Effect of acute blood pressure reduction on endothelial function in the brachial artery of patients with essential hypertension. J Hypertens. 19, 547-551 (2001).
  16. Yilmaz, M. I., et al. The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 47, 42-50 (2006).
  17. Wang, M. C., Tsai, W. C., Chen, J. Y., Huang, J. J. Stepwise increase in arterial stiffness corresponding with the stages of chronic kidney disease. Am J Kidney Dis. 45, 494-501 (2005).
  18. Shinohara, K., et al. Arterial stiffness in predialysis patients with uremia. Kidney Int. 65, 936-943 (2004).
  19. Karras, A., et al. Large artery stiffening and remodeling are independently associated with all-cause mortality and cardiovascular events in chronic kidney disease. Hypertension. 60, 1451-1457 (2012).
  20. Pannier, B., Guerin, A. P., Marchais, S. J., Safar, M. E., London, G. M. Stiffness of capacitive and conduit arteries: prognostic significance for end-stage renal disease patients. Hypertension. 45, 592-596 (2005).
  21. Yilmaz, M. I., et al. Vascular health, systemic inflammation and progressive reduction in kidney function; clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes. Neprhol Dial Transplant. 26, 3537-3543 (2011).
  22. Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated aortic pulse wave velocity, a marker of arterial stiffness, predicts cardiovascular events in well-functioning older adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
  23. Tanaka, H., DeSouza, C. A., Seals, D. R. Absence of age-related increase in central arterial stiffness in physically active women. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18, 127-132 (1998).
  24. Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
  25. Yeboah, J., Crouse, J. R., Hsu, F. C., Burke, G. L., Herrington, D. M. Brachial flow-mediated dilation predicts incident cardiovascular events in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. 115, 2390-2397 (2007).
  26. Shechter, M., et al. Long-term association of brachial artery flow-mediated vasodilation and cardiovascular events in middle-aged subjects with no apparent heart disease. Int J Cardiol. 134, 52-58 (2009).
  27. Baylis, C. Nitric oxide deficiency in chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 294, (2008).
  28. Wever, R., et al. Nitric oxide production is reduced in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vasc. 19, 1168-1172 (1999).
  29. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. J Am Soc Nephrol. 15, 1983-1992 (2004).
  30. Hasdan, G., et al. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 61, 586-590 (2002).
  31. Chue, C. D., Townend, J. N., Steeds, R. P., Ferro, C. J. Arterial stiffness in chronic kidney disease: causes and consequences. Heart. 96, 817-823 (2010).
  32. Dupont, J. J., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. Ascorbic acid or L-arginine improves cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. J Appl Physiol. 111, (2011).
  33. Oberg, B. P., et al. Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease. Kidney Int. 65, 1009-1016 (2004).
  34. Cachofeiro, V., et al. Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease. Kidney Int Suppl. (111), (2008).
  35. Vila, E., Salaices, M. Cytokines and vascular reactivity in resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, (2005).
  36. Perticone, F., et al. Endothelial dysfunction and subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. Circulation. 122, 379-384 (2010).
  37. Zatz, R., Baylis, C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension. 32, 958-964 (1998).
  38. Nakagawa, T., Johnson, R. J. Endothelial nitric oxide synthase. Contrib Nephrol. 170, 93-101 (2011).
  39. Muller, V., Tain, Y. L., Croker, B., Baylis, C. Chronic nitric oxide deficiency and progression of kidney disease after renal mass reduction in the C57Bl6 mouse. Am J Nephrol. 32, 575-580 (2010).
  40. Colombo, P. C., et al. Biopsy coupled to quantitative immunofluorescence: a new method to study the human vascular endothelium. J Appl Physiol. 92, 1331-1338 (2002).
  41. Donato, A. J., Black, A. D., Jablonski, K. L., Gano, L. B., Seals, D. R. Aging is associated with greater nuclear NFkappaB, reduced IkappaBalpha, and increased expression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans. Aging Cell. 7, 805-812 (2008).
  42. Donato, A. J., et al. Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans: relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappaB. Circ Res. 100, 1659-1666 (2007).
  43. Jablonski, K. L., Chonchol, M., Pierce, G. L., Walker, A. E., Seals, D. R. 25-Hydroxyvitamin D deficiency is associated with inflammation-linked vascular endothelial dysfunction in middle-aged and older adults. Hypertension. 57, 63-69 (2011).
  44. Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
  45. Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
  46. Donald, A. E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol. 51, 1959-1964 (2008).
  47. Widlansky, M. E. Shear stress and flow-mediated dilation: all shear responses are not created equally. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296, (2009).
  48. Stewart, A. D., Millasseau, S. C., Kearney, M. T., Ritter, J. M., Chowienczyk, P. J. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension. 42, 915-918 (2003).
  49. Lantelme, P., Mestre, C., Lievre, M., Gressard, A., Milon, H. Heart rate: an important confounder of pulse wave velocity assessment. Hypertension. 39, 1083-1087 (2002).
  50. Jablonski, K. L., Seals, D. R., Eskurza, I., Monahan, K. D., Donato, A. J. High-dose ascorbic acid infusion abolishes chronic vasoconstriction and restores resting leg blood flow in healthy older men. J Appl Physiol. 103, 1715-1721 (2007).

Tags

Медицина выпуск 88 хроническое заболевание почек эндотелиальные клетки поток-опосредованной дилатации иммунофлюоресценции окислительный стресс скорость пульсовой волны
Оценка функции сосудов у больных с хронической болезнью почек
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jablonski, K. L., Decker, E.,… More

Jablonski, K. L., Decker, E., Perrenoud, L., Kendrick, J., Chonchol, M., Seals, D. R., Jalal, D. Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease. J. Vis. Exp. (88), e51478, doi:10.3791/51478 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter