Summary
Vasküler disfonksiyon ve fizyolojik mekanizmaları katkı derecesi brakiyal arter akım aracılı dilatasyon, aort nabız dalga hızı ve vasküler endotelyal hücre proteini ifade ölçülerek, kronik böbrek hastalığı olan hastalarda değerlendirilebilir.
Abstract
Kronik böbrek hastalığı (KBH) olan hastaların belirgin olarak genel nüfusa oranla kardiyovasküler hastalık (CVD) riski arttı, ve bu sadece kısmen geleneksel KVH risk faktörleri ile açıklanmaktadır. Vasküler disfonksiyon vasküler endotelyal disfonksiyon (en yaygın endotel bağımlı dilatasyon [EDD] olarak değerlendirilmiştir) ve büyük elastik arterlerin sertleşmesi ile karakterize önemli bir geleneksel olmayan risk faktörüdür. Çeşitli teknikler EDD'nin ve büyük elastik arter sertliği, değerlendirmek için mevcut olsa da en sık, sırasıyla brakiyal arter akım aracılı dilatasyon (FMD BA) ve aort nabız dalga hızı (aPWV) kullanılacak. Vasküler disfonksiyon bu noninvaziv önlemlerin ikisi de ve böbrek hastalığı olmayan hastalarda gelecekteki kardiyovasküler olayların bağımsız belirleyicileri vardır. KBH olan hastalar hem bozulmuş FMD BA göstermek ve aPWV arttı. Iken tarafından kesin mekanizmalar vasküler disfonksiyon deveCKD LOP'lar tam olarak anlaşılmamıştır, artmış oksidatif stres ve nitrik oksit (NO) biyoyararlanım bir sonraki azalma önemli katkıda bulunmaktadır. Oksidatif stres hücresel değişiklikler antekubital damardan, vasküler endotelyal hücrelerin toplanması ve immünofloresan ile oksidatif stres belirteçlerinin protein ekspresyonunu ölçerek değerlendirilebilir. Biz, FMD BA, aPWV ve vasküler endotelyal hücre proteini ifade ölçmek için burada, bu yöntemleri hakkında bir tartışma sağlar.
Introduction
Kronik böbrek hastalığı (KBH) yalnız 1 Amerika Birleşik Devletleri'nde ~ nüfusun% 11.5 etkileyen salgın boyutlarına ulaşmıştır önemli bir halk sağlığı sorunudur. KBH olan hastalarda kardiyovasküler ölüm ya da kardiyovasküler olay riski önemli ölçüde genel nüfusa 2-4 ile karşılaştırıldığında artmaktadır. KBH olan hastalar geleneksel kardiyovasküler risk faktörleri yüksek bir görülme sıklığı gösteren rağmen, bu sadece kardiyovasküler hastalık onların insidansında artış (CVD) 5 kısmını açıklıyor. Vasküler disfonksiyon nefroloji 6-9 tarlada artırılmış tanınmaya önemli bir geleneksel olmayan kardiyovasküler risk faktörüdür.
Birçok değişiklikler büyük olasılıkla arteriyel disfonksiyon gelişimine katkıda ederken, en büyük endişe olanlar arasında en yaygın endotel bağımlı dilatasyon (EDD) olarak değerlendirilen vasküler endotel disfonksiyonu gelişimi, ve la sertleşme olanrge elastik arterlerin 10. Çeşitli teknikler EDD'nin ve büyük elastik arter sertliğini değerlendirmek için var, ama en sık kullanılan sırasıyla brakiyal arter akım aracılı dilatasyon FMD BA ve aort nabız dalga hızı (aPWV) vardır. EDD'nin değerlendirmek için başka sık kullanılan bir tekniktir venöz oklüzyon pletismografisi 11,12 kullanarak asetilkolin gibi farmakolojik ajanlar kol kan akımı tepki ölçülmesidir. Ancak, bu metodoloji FMD BA daha invaziv ve KBH olan hastalarda kontrendike olabilir brakiyal arterin kateterizasyonu gerektirir. Arteriyel sertliği değerlendirmek için alternatif bir teknik olarak bu yaygın olarak kullanılan veya aPWV 13 gibi klinik uç noktaları ile doğrulanmış olmasa da, karotid arter yerel arteriyel uyumu (sertliğin ters) ölçmektir.
KBH olan hastalarda bozulmuş FMD BA 14-16 ve artan aort nabız dalga hızını aP hem göstermekWV 13,17,18, hatta öncesinde diyaliz ihtiyacı için. Önemlisi klinik bakış açısıyla, vasküler disfonksiyonu bu noninvaziv önlemlerin hem CKD 19-21, hem de diğer toplumlarda 22-26 yılında hastalarda hem de gelecekteki kardiyovasküler olaylar ve mortalite için bağımsız risk faktörüdür. Bu teknikler de dahil olmak üzere CKD hastaların CVD riski çeşitli toplumlarda, eğitim uygulanabilir.
Arteriyel disfonksiyon CKD gelişir hangi kesin mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır; Ancak, azalmış nitrik oksit (NO) biyoyararlanım önemli bir katkıda 27-30 ve engelli EDD hem de ortak bir mekanizma ve artmış arteriyel sertlik 10,31 olduğunu. CKD olarak, oksidatif stres artar ve biyo NO 32-34 olarak azaltılmasına katkıda bulunmaktadır. Oksidatif stres antioksidan savunma göre, reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı biyolojik olarak tanımlanır. Fizyolojik uyaranlar, incinflamatuar sinyal luding, oksitleyici enzim sistemlerini geliştirmek süperoksit anyon (O ● 2 -) da dahil olmak üzere, ROS üretmek için (örneğin, oksitleyici enzim NADPH oksidaz.) 35. Süperoksit üretimi nihayetinde bir nitrik oksit (NO) ve biyolojik olarak kullanılabilirliğini azaltmaktadır yol açar.
Endotel disfonksiyonu olay CKD 36 bağımsız bir belirleyicisi olduğu gibi bozulmuş NO biyoyararlanım sırayla, CKD gelişimine katkıda bulunabilir. Bu hayvan veri eNOS inhibisyonu hipertansiyon (sistemik ve glomerular) neden olduğunu gösteren ile tutarlıdır, glomerular iskemi, glomerüloskleroz, ve tubulo-interstisyel yaralanma 37. Nitekim, NO biyoyararlanımını insan CKD 38,39 endotel disfonksiyonu için kilit rol düşündüren, insan hastalığı taklit eden deneysel böbrek hastalığının gelişimi ve ilerlemesinde gerekli görülmektedir azalır.
Vasküler oksidatif stres belirteçleri v değerlendirilebilirbaşlangıçta Colombo ve ark. 40 tarafından geliştirilen ve Seals ark 41-43 modifiye bir teknik kullanarak, insan deneklerle araştırma toplanan endotel hücrelerini ascular. 2 steril J-teller kullanılarak, hücreler antekubital damardan toplanır, geri kazanılır, sabit ve daha sonra pozitif endotel hücreleri olarak tanımlanmış ve immünofloresan kullanılarak ilgi konusu olan proteinlerin ifadesi için analiz edildi.
Biz burada bir) ölçü FMD BA için kullanılabilecek bu yöntemin bir tartışma sağlamak; b) aPWV ölçmek; c) oksidatif stres belirteçlerinin vasküler endotelyal hücre proteini ekspresyonunu ölçer. Odak kronik diyaliz gerektirmeyen, KBH olan hastalar üzerinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Colorado Çoklu Kurumsal Değerlendirme Kurulu (COMIRB) yönergeleri takip eder.
Test Oturum 1. Hazırlık
- Katılımcılar en doğru ölçümler için bu kısıtlamalar takip etmelidir: Gıda ve kafein hızlı 12 saat, egzersiz, sigara, 12 saat kısıtlama, 12 saat kısıtlama ilaçlar uygulanabilir,> 4 yarılanma ömrü kısıtlama mümkünse (bir de mümkün olmayabilir eğer gibi CKD hastalar gibi nüfus), ve menopoz öncesi kadınlarda günde hormonal etkilerini en aza indirmek için menstrüel siklusun 1-7 test edilmelidir.
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 476,8 ml 'de 2 ml 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), heparin (180 USP birim / mg) 0.05 g ve büyük baş hayvan serum albümini, 2.5 g eklenmesiyle ayrışma tampon 500 ml hazırlayın 7.4 'lük pH. Bu birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Ultrason, bilgisayar ve Non-invaziv hemodinamik açınİş İstasyonu (NIHem; arteriyel sertlik ekipman). Bilgisayar R-dalgası tetikleme kutusuna ultrason çıktısı kablolarını bağlayın.
Vasküler Endotel Hücreleri 2. Toplanması ve işlenmesi
- Eğitimli bir hemşire veya doktor toplama gerçekleştirir (2.2-2.5, 2.7 adım) ve araştırmacı teller toplar ve işler (2.6, 2,8-2,19 adımlar)
- , Bir topikal antiseptik ile Antekübital siteyi hazırlık turnike uygulamak, ven bulun, ve 18 G kateter ile kanüle. IV ucunda bir heplock adaptörü yerleştirin.
- Steril eldiven giyin ve sitesi üzerinden steril fenestre perdeler koymak.
- Örtüler üzerinde 2 J-tellerini yerleştirin. Her iki teller "J" şeklinde çözülmek için "J" nin ark çekin.
- Heplock kapağını açmak ve damar yaklaşık 8 cm içine J-teli beslemek. Telini çıkarmadan önce ileri geri birkaç kez itin. Tel üzerinde brüt kan kaçının.
- Onlar bir uyum böylece teller makasla tel kesiciler kullanınDisosiasyon tamponu ~ 30 ml içeren 50 ml konik bir tüp
- Ikinci tel için adımı 2.5 tekrarlayın.
- Ikinci tel için adımı 2.6 tekrarlayın. Islak laboratuvara tüp dönün.
- Forseps bir çift tel bağı ve tüp içindeki teller tutmak, fakat bir çözüm, yukarıda. 10 dakika boyunca, art arda 50 ml konik tüp ayrışma tamponu toplamak için bir motorlu pipetter kullanmak ve tüp içine teller aşırı sıvı silkeleyin sonra, teller durulayın ve titreşime tellerin uzunluğu aşağı çalışır, böylece bırakın.
- 400 x 7 dakika ve 4 ° C için santrifüj
- 100 ml formaldehit çözeltisi + 900 ml PBS ile bir araya folyo kaplı tüp içinde formaldehit çözeltisi hazırlayın.
- Yavaşça, santrifüj tüpü çıkarmak vakum pompası açmak, emme hortumunun ucuna bir pipet yerleştirmek ve pelet bozmadan kalanı kapalı vakumlama, tüp içinde ~ 400 ml bırakın.
- Folyo ve pipet 1 ml formaldehit çözeltisi içine ile kaplayınörnek düzeltmek için tüp. Tekrar süspansiyon etmeyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Konu ve çalışma ziyareti bilgi etiketleme ve pap kalem ile her slaytta bir oval çizerek 8 slaytlar hazırlayın.
- 15 ml 400 x g'de 5 dakika ve 4 ° C'de PBS, tekrar süspansiyon ve santrifüj Ekle
- Adımı yineleyin 2.15, 12 ml 400 x g'de 6 dakika ve 4 ° C'de PBS, tekrar süspansiyon ve santrifüj eklemek
- Yavaşça, santrifüj tüpü çıkarmak vakum pompası açmak, emme hortumunun ucuna bir pipet yerleştirmek ve pelet bozmadan kalanı kapalı vakumlama, tüp içinde ~ 2 ml bırakın.
- Eşit oval bölgelerde 8 slayt boyunca süspanse ve pipet.
- 5 saat boyunca 37 ° C'de ve sonra, (örnek uzun yıllar iyi olacaktır) analiz için hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın inkübatörü içinde yer.
FMD BA ve aPWV 3. Değerlendirilmesi
- Tek şort içine araştırma konusu değişiklik var ve saat varsessiz, loş, iklim kontrollü odada im / onu yalan yatar.
- Uygun spesifik ultrason ve arteriyel sertlik cihazı için EKG sayısını (bu prosedür Non-İnvaziv hemodinamik Workstation [NIHem] 4 elektrotlar gerektirir arteriyel sertliği ölçmek için kullanır), ve konu üzerinde kan basıncı kolluğu yerleştirin.
- 20 dakika sonra, kan basıncı değerlerini başlar. En az 3 gerçekleştirmek ve ölçümler 5 mmHg dahilinde kadar her okuma arasında 2 dk dinlenme, tekrarlayın.
- Brakiyal arter nabzı palpe ve yazılım programı kullanılarak brakiyal dalga formları kaydetmek için tonometresi yerleştirerek tonometre başlayın.
- , Radyal femoral ve karotis arterler için tekrarlayın.
- Bir mezura (brakiyal, radyal ve karotis) ve özel cetvel / pergeli (femur) kullanarak supersternal çentik bu sitelerin her mesafeyi ölçün.
- Yazılım programını kullanarak karotis-brakial, karotis-radyal, ve karotis-femoral (aPWV) hesaplayın.
- Yermodunu tetiklemek için ayarlanmış bir damar yazılımı ile olekran süreci ve rekor bazal brakiyal arter ultrason görüntüleri ve kan akım hızı ölçümleri en az 10 kardiyak siklus hemen distalinde önkol kan basıncı manşet. Mekanik bir kol arzu edildiği takdirde, ultrason probu sabitlenmesi için de kullanılabilir.
- 250 mmHg önkol kan basıncı şişirin ve zamanlayıcı başlar. Çok hareketsiz kalması katılımcı bilgilendirin.
- Zamanlayıcı 04:45 okuduğunda modu tetiklemek için bir damar yazılım seti ile kayıt hızları başlayın. Tetik 05:00 de manşet bırakın ve saat 05:10 okuduğunda B-mod (çap) görüntüleri kaydetmek için ultrason değiştirin.
- Saat 07:00 okuyana kadar kayda devam.
- Modunu tetiklemek için ayarlanmış bir damar yazılım ile bazal brakiyal arter ultrason görüntüleri rekor en az 10 kardiyak çevrimleri.
- Kişinin kan basıncını ölçünüz. Eğer sistolik kan basıncı> 100 mmHg, konu altında dilaltı nitrogliserin 0.4 mg koyun &# 39; nin dil ve hastanın başka bir kontrendikasyon olmadıkça, zamanlayıcı başlar.
- Saat modunu tetiklemek için damar yazılımı ile 03:00 okuduğunda B-mode (çap images) kaydetmeye başlarsınız.
- Saat 08:00 okuduğunda Kaydı durdur.
- Başlangıca döner kadar kan basıncını izlemek
4. İnsan göbek damarı endotel hücre hazırlanması (HUVEC) Kontrol Slaytlar
- Pasajda 5-6 HUVECler büyümek ve ~% 80 kaynaşma.
- 3 tripsin ml veya ne olursa olsun çanak / şişesi için gerekli olan Trypsinize.
- Tripsin nötralize çözeltisi eşit hacmi kullanılarak tripsin nötralize.
- ~ 5 dakika boyunca 200 x g de santrifüj ve vakum ile tripsin ve nötralize edici bir çözüm çıkarın.
- Yıkamak için ~ 10 ml PBS içinde süspanse edin.
- 200 xg ~ 5 dk santrifüj. PBS çıkarın.
- PBS çıkarın ve 1800 ul PBS + 200 ul formaldehit düzeltmek.
- PBS (~ 10 mi) içerisinde yeniden süspanse edin.
- ~ 200 x g'de santrifüj5 dak. Slayt başına ~ 200 ul eklemek için uygun bir hacimde PBS, tekrar süspansiyon çıkarın.
- -80 ° C'de saklayın slaytlar analiz için hazır olana kadar (örnekler uzun yıllar boyunca iyi olacak).
Vasküler Endotel Hücreleri 5. Boyama
- -80 ° C dondurucu üzerinden slaytlar alın ve (bu işlem bir HUVEC kontrol slayt dahil, 10 slaytlar bir parti için), oda sıcaklığında 5 dakika bekleyin.
- Hassas bir görev silme (slayt merkezini dokunmayın) ile aşırı su silin.
- Her bir slayt değiştirilmiş PBS eklenerek slaytlar yeniden hidrat ve 10 dakika boyunca bırakın.
- Slaytlar ayakta iken,% 5 eşek serumu ve diğer çözümler hazırlar.
- Kadar 10 slaytların (7.4 arasında bir pH değerine kadar) değiştirilmiş PBS 5700 ul eşek serumu 300 ul ekleyerek% 5 eşek serumu hazırlayın (Daha fazla bilgi için bu miktar artış).
- % 5 serum 1000 ul ilgi duyulan birincil antikor seyreltin. Örneğin, nitrotirozin ve NADPH içinoksidaz (1:300 ve 1:1,500) oksidatif stres belirteçleri olarak kullanılabilir.
- % 5 serum 1.500 μll için AF568 5 ul seyreltilmesi ile ikincil AF568 hazırlayın.
- Hazırlama 2 ul seyreltilmesiyle cadherin VE% 5 serum 1000 ul VE kaderin.
- 5 ul seyreltilmesiyle AF488 hazırlanması% 5 serum 1000 ul VE kaderin.
- AF568 tutmak, tüm süreç boyunca folyo altında kaderin ve AF488 VE ve slaytları hazırlarken daha sonra 4 ° C'de buzdolabında rocker üzerine yerleştirin.
- Rehidrasyon 10 dakika sonra, hassas bir görev ile kuru slaytlar silin.
- 60 dakika boyunca% 5 eşek serumu ilave edin ve kimyasal tam kapsama sağlamak için daire içine alınan alanın üzerinde plastik filmin parafın bir parça yerleştirin.
- Hassas bir görev ile plastik parafin film ve kuru slaytlar atın silin. Yıkamayın. 60 dakika için primer antikor ilave edin ve sağlamak için daire içine alınan alanın üzerinde plastik filmin parafın bir parça yerkimyasal tam kapsama.
- Fışkırtma şişesinden değiştirilmiş PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca slayt sütunlar emmek, plastik parafin filmi atın. Slaytlar sırılsıklam olsa da, karanlık bir odaya taşıyabilirsiniz. Kalan tüm adımlar için karanlıkta çalışın.
- Kimwipes Kuru slaytlar, 45 dakika boyunca AF568 (sekonder antikor) ekleyin ve kimyasal tam kapsama sağlamak için daire içine alınan alanın üzerinde plastik filmin parafın bir parça yerleştirin. Işıktan örtün.
- Biohazard çöp bidonuna plastik parafin filmi atın. Fışkırtma şişesinden değiştirilmiş PBS ile durulayın ve daha sonra 5 dakika boyunca sütunlar içinde bekletin.
- Kimwipes Kuru slaytlar, daha sonra 60 dakika boyunca eklemek kaderin VE ve kimyasal tam kapsama sağlamak için daire içine alınan alanın üzerinde plastik filmin parafın bir parça yerleştirin. Işıktan örtün.
- Biohazard çöp bidonuna plastik parafin filmi atın. Fışkırtma şişesinden değiştirilmiş PBS ile durulayın ve daha sonra 5 dakika boyunca sütunlar içinde bekletin.
- Kuru slaytlarhassas bir görev 30 dakika AF488 ekleyebilir ve kimyasal tam kapsama sağlamak için daire içine alan üzerinde plastik parafin film bir parça yer, silin. Işıktan örtün.
- Biohazard çöp bidonuna plastik parafin filmi atın. Fışkırtma şişesinden değiştirilmiş PBS ile durulayın ve daha sonra 5 dakika boyunca sütunlar içinde bekletin.
- Hassas bir görev ile Kuru slaytlar silin ve slaytlar 20 dakika kurumasını bekleyin. Işıktan örtün.
- Her bir slayt 4 ile orta montaj fluoroshield tek bir damla ',6-diamidino-2-fenilindol hidroklorür (DAPI) ekleyin ve bir kayar kapak ile birlikte kapsar.
- Folyo ile kaplanmış 4 ° C buzdolabında slaytlar yerleştirin. Görüntüleme 48 saat içinde tamamlanması gerekmektedir.
6.. Görüntüleme ve Vasküler Endotel Hücreleri Analizi
- Özel mikroskop özelliklerine göre lekeli endotel hücreleri görüntüleme için mikroskop hazırlayın. Bir tek kör teknisyeni bir yarasa için herhangi bir protein analiz etmelidirhücre ch.
- Sistematik slaytları tarayın. Kaderin VE ve DAPI için pozitif boyanması ile nükleer bütünlüğünü doğrulamak için pozitif boyanması ile endotel hücreleri tanımlamak.
- Daha sonra analiz için slayt başına görüntü 30 hücreleri. HUVEC'e dahil, lekeli toplu iş her slayt için tekrarlayın.
- Niteliksel bir yazılımı kullanarak, ilgi konusu birincil antikor için boyama yoğunluğunu analiz eder.
- Farklı boyama oturumları, HUVEC aynı protein ekspresyonu için toplanan endotel hücrelerinde protein ifade oranı olarak rapor değerleri arasındaki yoğunluk boyama farklılıklar olası etkisini minimize etmek için karıştırıcı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FMD BA reaktif hiperemi aşağıdaki brakiyal arter çapı tepe değişiklik olarak ölçülür. Böylece, bekleme durumunda çap, 5 dakika tansiyon manşet oklüzyon döneminde (Şekil 1) sona ermesinden sonra çapına karşılaştırılır. Panel A brakiyal arterin temsili bir ultrason görüntüsünü gösterir, ve piyasada mevcut yazılımı kullanılarak elde Panel B, aşağıdaki 2 dakika manşet sürümünden çapı R-dalgası kapılı bir değişim grafiğini görüntüler. Değişim (Şekil 1'de değişim% 4.8) çoğunlukla oldukça az olduğu gibi, ölçüm küçük farklılıklar sonuçları üzerinde büyük etkileri olabilir. Piyasada mevcut otomatik kenar algılama yazılım kullanımı son derece ölçümü 44,45 önyargı ve potansiyel hatayı en aza indirmek için tavsiye edilir. Reaktif hiperemi sırasında dilatasyon için uyaran grupları veya karşılaştırılan durumlar arasında fark edebileceğiniz gibi, kayma hızı Doppler kan akışını kullanılarak hesaplanmalıdırhızları ve FMD BA 46,47 uygulanabilir farklar için ayarlanabilir olmalıdır.
aPWV Araştırmamızda kullanılan NIHem dahil olmak üzere çoğu piyasadan temin sistemleri, minimal operatör girişi ile hesaplanır. ECG'nin R-dalgası belirli bir yerde dalga "ayak" karşılaştırılır ve zaman farkı karotid arter (Panel A) ve femoral artere (Panel B) (Şekil 2) hesaplanır. Mesafe ölçümleri bir hız hesaplamak için zaman farkları ile bağlantılı olarak kullanılır. aPWV (yani. aort boyunca) femoral artere karotid arter arasında hız anlamına gelir.
Vasküler endotelyal hücrelerin immünofloresan analizi, oksidatif stres seviyesinin, hücresel bir kanıt sağlayabilir. Boyama seansları arasında boyama yoğunluğu farklılıkları hesaba katılması için, her bir denek (Örnek ima için belirli bir proteinin floresan seviyesinin Şekil 3 Panel A) 'da gösterilen ges HUVEC kontrol slayt (Örnek görsel Şekil 3 Panel B'de gösterilen) flüoresansı ile karşılaştırılır. Bu nedenle, protein ifadesindeki farklar (bir müdahale çalışma sırasında, örneğin) gruplar arasında veya durumların arasında ya da karşılaştırılabilir.
Brakiyal arter akım aracılı dilatasyon (FMD BA) değerlendirilmesi sırasında elde edilen Şekil 1.. Temsilcisi bazal brakiyal arter çapı. Piyasada bulunabilen yazılımlar kullanılarak elde edilen A) kronik böbrek hastalığı (KBH) olan bir hastada. Aşağıdaki 2 dakika manşet sürümden çapı B) R-dalga kapılı değişim, grafik olarak gösterilmiştir.target = "_blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
KBH olan bir hastada aPWV değerlendirilmesi gelen Şekil 2.. Temsilcisi sonuçları çıktısı. A) karotis arter ayak EKG R-dalga Zaman gecikmesi, femoral arter (tfoot) ayağına EKG R-dalgası B) zaman gecikmesi, karotis dalga ile kaplattı. Her iki panel de ilgili sitelere suprasternal itibaren girilen mesafeleri gösterir (D harfi ile temsil edilmektedir; cm). Hesaplanan aPWV değeri panel B gösterilir (harfler PWV tarafından temsil; cm / sn). , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. </ P>
Şekil 3.. Protein ifade Temsilcisi görüntüler. A) DAPI (nükleer bütünlük, mavi), pozitif endotel hücre kimlik (kaderin VE; CKD B ile bir hastadan toplanan hücreleri) ve bir insan göbek damarı endotel hücre için kırmızı), yeşil) oksitleyici enzim NADPH oksidaz çıkar (protein (HUVEC) kontrol slayt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FMD BA ve aPWV için doğru sonuçlar elde edilmesi sırasıyla, yüksek kaliteli ultrason görüntüleri ve basınç dalga şekilleri elde gerektirir. Bu merkezi operatörü 44 her tekniğin uygun ve sürekli eğitim ve kullanımıdır. Buna ek olarak, bu test oturumu (örneğin önceki 12 saat hızlı, iklim kontrollü odası, vb) 44,45 standartlaştırılması ile mümkün sonuçlarını etkileyebilecek birçok dış değişkenler için kontrol etmek önemlidir. Yukarıda belirtildiği gibi, ticari olarak R-dalgası Geçitli toplama yazılımı ve kenar algılama yazılımı kullanımı son derece ölçümü 44,45 önyargı ve potansiyel hatayı en aza indirmek için tavsiye edilir. FMD BA bozulduğu zaman, bu durum endotel NO salınımını bozulmuş veya nedeniyle HAYIR yayınlandı vasküler düz kasların düşüklüğüne tepki ya olabilir. Nitrogliserin pürüzsüz yanıt kontrol etmek için uygulanırFMD BA herhangi bir değer düşüklüğü nitrik oksit 44,45 üretmek için damar endotel yeteneği özgü olduğu sonucuna amacıyla bir dışsal nitrik oksit donör kas hücre tabakası.
Ölçüm bir hız gibi, mesafe ve zaman hem de hassas ölçümler kritiktir. Tarif ettiğimiz protokol Framingham Kalp çalışmasında 24 istihdam metodolojiye dayanmaktadır. Yerine bir mezura daha kaldırdı pergel kullanımı oldukça abdominal obezite üzerinde potansiyel ölçüm daha doğrudan bir yol alarak femoral arter suprasternal mesafe ölçüm doğruluğunu artırır. Temiz bir dalga net bir "ayak" ölçüm yerinde darbe (bkz. Şekil 2) için EKG R-dalga saat farkı hesaplanması için kesinlikle gereklidir.
Alternatif teknikler endotel fonksiyonunu ve ar hem de değerlendirmek için mevcut olmakla birlikteBu non-invaziv ve iyi aracı sonuçları olarak kurulan çünkü malzememiz sertlik, FMD BA ve aPWV yaygın klinik araştırmalarda kullanılan her ikisi de. Buna ek olarak, onların da çeşitli nüfuslar arasında doğrulanmış ve kardiyovasküler olaylar ve mortalite 19-26 bağımsız öngörü vardır. Bu nedenle, bu tür CKD olan hastalarda olduğu gibi, belirli bir popülasyondaki kalp ve damar riskini azaltmak için bir müdahale için gerekli etkinliğini değerlendiren klinik çalışmalarda vekil uç nokta olarak kullanılabilir. CVD riski diğer popülasyonları ile karşılaştırıldığında bu tekniklerin modifikasyonu, özellikle CKD olan hastalar çalışma için gerekli değildir.
Ancak, FMD BA ve aPWV bu hak tartışma iki önemli sınırlamalar vardır. FMD BA böylece mikrovasküler endotel fonksiyonu bir dizin sağlamaz, büyük bir kanal arter (brakiyal arter) vasküler endotel fonksiyonunu değerlendirir. Venöz oklüzyon plethysm kullanarak ayrı bir tekniktirgraf yok ikincisi değerlendirmek daha uygundur. Ancak, bu metodoloji FMD BA daha invaziv ve KBH olan hastalarda kontrendike olabilir brakiyal arterin kateterizasyonu gerektirir. Buna ek olarak, FMD BA ölçümü de yapılmalıdır amacıyla uzun ve özel eğitim gerektirir. aPWV (örneğin, karotid arter gibi) lokal arter sertlik farklılık büyük esnek arter sertliğinin bir dizin sağlar. Arteriyel sertliği değerlendirmek için alternatif bir teknik olarak bu yaygın olarak kullanılan veya aPWV 13 gibi klinik uç noktaları ile doğrulanmış olmasa da, karotid arter yerel arteriyel uyumu (sertliğin ters) ölçmektir. Buna ek olarak, aort sertliğinin bir belirleyicisi olarak NO katkısı vasküler yatağın 48 göre değişebilir. Son bazal d dahil olmak üzere uygun olduğu için ölçüldü ve istatistiksel olarak ayarlanabilir gerek FMD BA ve aPWV hem yorumuna potansiyel boşa vardıriameter ve kesme FMD BA 45 oranı ve kalp hızı ve aPWV 49 için kan basıncı.
Vasküler endotel hücrelerinin toplanması önemli bir husus, endotel hücreleri görüntüleri üste minimal kırmızı kan hücreleri ile tespit edilebilir, öyle ki, J-telleri kan en aza indirilmesi ve daha sonra slaytlar üzerinde edilir. Hücreleri geri kazanılması, bu teknik uygun için eğitim hem de yeterli yıkama ile elde edilebilir. Slaytları analiz ederken, bu floresan objektif sayısal ve görüntüler diğer hücrelerle çok arka planda veya çakışma olmadan, açık olması önemlidir. Önce çalışma örneklerinin analizi boyama ve mikroskopi analizi için teknik için dilüsyonlarının Optimizasyonu önemli adımlardır. Önemli olan, bu tekniğin hücre verimi ~ toplama 600, vasküler endotelyal hücreler, toplam mRNA miktarı yetersiz böylece immunofl için prob sınırlayan, gen ekspresyonunu ölçmek için kullanılabilir olduğunuilgi konusu olan proteinlerin uorescent boyama.
, Damar oksidatif stres değerlendirilmesi dolaşan ya da idrar işaretleri için sunulan tekniklerin yanı sıra oksidatif stres 12,50 değerlendirmek için de kullanılabilir. Ancak, vasküler endotel seviyesine özgü oksidatif stres seviyesinin daha az yansıtıcı olabilir. Sunulan teknikleri ile bağlantılı olarak, bu belirteçler kullanılarak oksidatif stres genel durumu en iyi bir gösterge sağlayabilir.
Biz, FMD BA, aPWV ve vasküler endotelyal hücre proteini ifade ölçmek için kullanılabilecek yöntemler hakkında genel bir bakış sağladı. Bu teknikler CKD olan hastalar için, sadece uygun, ama aynı zamanda kalp-damar hastalığı riski diğer nüfus bulunmaktadır. Topluca, vasküler endotelyal fonksiyon bozukluğu, büyük elastik arter sertliği ve oksidatif stres gibi fizyolojik mekanizmaları, katkı içgörü sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar onu teknik yardım için Nina Bispham teşekkür ederim. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (12POST11920023) ve NIH (K23DK088833, K23DK087859) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| J-wire | St. Jude | 404584 | 2 per collection |
| Disposable shorts (MediShorts) | Quick Medical | 4507 | |
| Non-invasive hemodynamic workstation (NIHem) | Cardiovascualr Engineering | N/A | Includes custom ruler. An alternate system is the Sphygmocor |
| Ultrasound | G.E. | Model: Vivid7 Dimension | We use a G.E., but there are many companies and models |
| Vascular software (Vascular Imager) | Medical Imaging Applications | N/A | |
| R-wave trigger box | Medical Imaging Applications | N/A | custom made |
| Rapid Cuff Inflation System | Hokanson | Model: Hokanson E20 | |
| Forearm blood pressure cuff | Hokanson | N/A | custom cuff with 6.5 x 34 cm bladder |
| HUVECs | Invitrogren | C-015-5C | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| Pap pen | Research Products International | 195505 | |
| VE Cadherin | Abcam | ab33168 | |
| AF568 | Life Technologies | A11011 | depends on specifications of microscpe |
| AF488 | Life Technologies | A11034 | depends on specifications of microscpe |
| Nitrotyrosine antibody | Abcam | ab7048 | |
| NADPH oxidase antibody | Upstate | 07-001 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| Delicate task wipe (Kimwipe) | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Confocal microscope | Olympus | Model: FV1000 FCS/RICS | many options exist |
References
- Levey, A. S., et al. A new equation to estimate glomerular filtration rate. Ann Intern Med. 150, 604-612 (2009).
- Foley, R. N., Parfrey, P. S., Sarnak, M. J. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. J Am Soc Nephrol. 9, (1998).
- Parfrey, P. S., Harnett, J. D. Cardiac disease in chronic uremia. Pathophysiology and clinical epidemiology. Asaio J. 40, 121-129 (1994).
- Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. Chronic kidney disease: effects on the cardiovascular system. Circulation. 116, 85-97 (2007).
- Sarnak, M. J., et al. Cardiovascular disease risk factors in chronic renal insufficiency. Clin Nephrol. 57, 327-335 (2002).
- Kendrick, J., Chonchol, M. B. Nontraditional risk factors for cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease. Nat Clin Pract Nephrol. 4, 672-681 (2008).
- Bellasi, A., Ferramosca, E., Ratti, C. Arterial stiffness in chronic kidney disease: the usefulness of a marker of vascular damage. Int J Nephrol. 2011, (2011).
- vander Zee, S., Baber, U., Elmariah, S., Winston, J., Fuster, V. Cardiovascular risk factors in patients with chronic kidney disease. Nat Rev Cardiol. 6, 580-589 (2009).
- Malyszko, J. Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 411, 1412-1420 (2010).
- Lakatta, E. G., Levy, D. Arterial and cardiac aging: major shareholders in cardiovascular disease enterprises: Part I: aging arteries: a "set up" for vascular disease. Circulation. 107, 139-146 (2003).
- Seals, D. R., Jablonski, K. L., Donato, A. J. Aging and vascular endothelial function in humans. Clin Sci (Lond). 120, 357-375 (2011).
- Jablonski, K. L., et al. Dietary sodium restriction reverses vascular endothelial dysfunction in middle-aged/older adults with moderately elevated systolic blood pressure. J Am Coll Cardiol. 61, 335-343 (2013).
- Briet, M., et al. Arterial stiffness and enlargement in mild-to-moderate chronic kidney disease. Kidney Int. 69, 350-357 (2006).
- Thambyrajah, J., et al. Abnormalities of endothelial function in patients with predialysis renal failure. Heart. 83, 205-209 (2000).
- Ghiadoni, L., et al. Effect of acute blood pressure reduction on endothelial function in the brachial artery of patients with essential hypertension. J Hypertens. 19, 547-551 (2001).
- Yilmaz, M. I., et al. The determinants of endothelial dysfunction in CKD: oxidative stress and asymmetric dimethylarginine. Am J Kidney Dis. 47, 42-50 (2006).
- Wang, M. C., Tsai, W. C., Chen, J. Y., Huang, J. J. Stepwise increase in arterial stiffness corresponding with the stages of chronic kidney disease. Am J Kidney Dis. 45, 494-501 (2005).
- Shinohara, K., et al. Arterial stiffness in predialysis patients with uremia. Kidney Int. 65, 936-943 (2004).
- Karras, A., et al. Large artery stiffening and remodeling are independently associated with all-cause mortality and cardiovascular events in chronic kidney disease. Hypertension. 60, 1451-1457 (2012).
- Pannier, B., Guerin, A. P., Marchais, S. J., Safar, M. E., London, G. M. Stiffness of capacitive and conduit arteries: prognostic significance for end-stage renal disease patients. Hypertension. 45, 592-596 (2005).
- Yilmaz, M. I., et al. Vascular health, systemic inflammation and progressive reduction in kidney function; clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes. Neprhol Dial Transplant. 26, 3537-3543 (2011).
- Sutton-Tyrrell, K., et al. Elevated aortic pulse wave velocity, a marker of arterial stiffness, predicts cardiovascular events in well-functioning older adults. Circulation. 111, 3384-3390 (2005).
- Tanaka, H., DeSouza, C. A., Seals, D. R. Absence of age-related increase in central arterial stiffness in physically active women. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 18, 127-132 (1998).
- Mitchell, G. F., et al. Arterial stiffness and cardiovascular events: the Framingham Heart Study. Circulation. 121, 505-511 (2010).
- Yeboah, J., Crouse, J. R., Hsu, F. C., Burke, G. L., Herrington, D. M. Brachial flow-mediated dilation predicts incident cardiovascular events in older adults: the Cardiovascular Health Study. Circulation. 115, 2390-2397 (2007).
- Shechter, M., et al. Long-term association of brachial artery flow-mediated vasodilation and cardiovascular events in middle-aged subjects with no apparent heart disease. Int J Cardiol. 134, 52-58 (2009).
- Baylis, C. Nitric oxide deficiency in chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 294, (2008).
- Wever, R., et al. Nitric oxide production is reduced in patients with chronic renal failure. Arterioscler Thromb Vasc. 19, 1168-1172 (1999).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. J Am Soc Nephrol. 15, 1983-1992 (2004).
- Hasdan, G., et al. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 61, 586-590 (2002).
- Chue, C. D., Townend, J. N., Steeds, R. P., Ferro, C. J. Arterial stiffness in chronic kidney disease: causes and consequences. Heart. 96, 817-823 (2010).
- Dupont, J. J., Farquhar, W. B., Townsend, R. R., Edwards, D. G. Ascorbic acid or L-arginine improves cutaneous microvascular function in chronic kidney disease. J Appl Physiol. 111, (2011).
- Oberg, B. P., et al. Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease. Kidney Int. 65, 1009-1016 (2004).
- Cachofeiro, V., et al. Oxidative stress and inflammation, a link between chronic kidney disease and cardiovascular disease. Kidney Int Suppl. (111), (2008).
- Vila, E., Salaices, M. Cytokines and vascular reactivity in resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, (2005).
- Perticone, F., et al. Endothelial dysfunction and subsequent decline in glomerular filtration rate in hypertensive patients. Circulation. 122, 379-384 (2010).
- Zatz, R., Baylis, C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension. 32, 958-964 (1998).
- Nakagawa, T., Johnson, R. J. Endothelial nitric oxide synthase. Contrib Nephrol. 170, 93-101 (2011).
- Muller, V., Tain, Y. L., Croker, B., Baylis, C. Chronic nitric oxide deficiency and progression of kidney disease after renal mass reduction in the C57Bl6 mouse. Am J Nephrol. 32, 575-580 (2010).
- Colombo, P. C., et al. Biopsy coupled to quantitative immunofluorescence: a new method to study the human vascular endothelium. J Appl Physiol. 92, 1331-1338 (2002).
- Donato, A. J., Black, A. D., Jablonski, K. L., Gano, L. B., Seals, D. R. Aging is associated with greater nuclear NFkappaB, reduced IkappaBalpha, and increased expression of proinflammatory cytokines in vascular endothelial cells of healthy humans. Aging Cell. 7, 805-812 (2008).
- Donato, A. J., et al. Direct evidence of endothelial oxidative stress with aging in humans: relation to impaired endothelium-dependent dilation and upregulation of nuclear factor-kappaB. Circ Res. 100, 1659-1666 (2007).
- Jablonski, K. L., Chonchol, M., Pierce, G. L., Walker, A. E., Seals, D. R. 25-Hydroxyvitamin D deficiency is associated with inflammation-linked vascular endothelial dysfunction in middle-aged and older adults. Hypertension. 57, 63-69 (2011).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
- Donald, A. E., et al. Methodological approaches to optimize reproducibility and power in clinical studies of flow-mediated dilation. J Am Coll Cardiol. 51, 1959-1964 (2008).
- Widlansky, M. E. Shear stress and flow-mediated dilation: all shear responses are not created equally. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 296, (2009).
- Stewart, A. D., Millasseau, S. C., Kearney, M. T., Ritter, J. M., Chowienczyk, P. J. Effects of inhibition of basal nitric oxide synthesis on carotid-femoral pulse wave velocity and augmentation index in humans. Hypertension. 42, 915-918 (2003).
- Lantelme, P., Mestre, C., Lievre, M., Gressard, A., Milon, H. Heart rate: an important confounder of pulse wave velocity assessment. Hypertension. 39, 1083-1087 (2002).
- Jablonski, K. L., Seals, D. R., Eskurza, I., Monahan, K. D., Donato, A. J. High-dose ascorbic acid infusion abolishes chronic vasoconstriction and restores resting leg blood flow in healthy older men. J Appl Physiol. 103, 1715-1721 (2007).
