Summary
रीढ़ की हड्डी transection के बाद, वयस्क zebrafish छह सप्ताह के बाद चोट से कार्यात्मक वसूली है. लार्वा पारदर्शिता और तेजी से वसूली का लाभ लेने के लिए, हम लार्वा रीढ़ की हड्डी transecting के लिए एक तरीका मौजूद है. Transection के बाद, हम 3 दिनों के बाद चोट से 2 दिनों के बाद चोट से शुरू संवेदी वसूली का निरीक्षण, और सी मोड़ आंदोलन.
Abstract
स्तनधारी कारण चोट के स्तर के नीचे axonal regrowth की कमी के साथ ही रीढ़ की न्यूरोजेनेसिस reinitiate करने में असमर्थता के लिए रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद संवेदी और मोटर वसूली में असफल. हालांकि, यहां तक कि रीढ़ की हड्डी की पूरी transection के बाद संवेदी और कार्यात्मक वसूली दोनों zebrafish Danio rerio निशंक सहित कुछ anamniotes. वयस्क zebrafish 6 सप्ताह के बाद चोट से संवेदी और मोटर वसूली के साथ, रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद उत्थान के अध्ययन के लिए एक स्थापित मॉडल जीव है. पारदर्शी लार्वा zebrafish में उपलब्ध पुनर्योजी प्रक्रिया के vivo विश्लेषण के लाभ के रूप में अच्छी तरह से वयस्क में आनुवंशिक उपकरण सुलभ नहीं लेते हैं, हम रीढ़ की हड्डी transection के बाद उत्थान का अध्ययन करने के लार्वा zebrafish का उपयोग करें. यहाँ हम reproducibly और पुष्टि लार्वा रीढ़ की हड्डी transecting के लिए एक विधि का प्रदर्शन. Transection के बाद, हमारे डेटा 2 दिनों के बाद चोट (डीपीआई) में संवेदी वसूली शुरुआत से पता चलता है, बुद्धिज 3 डीपीआई और 5 डीपीआई से मुक्त तैराकी की बहाली द्वारा detectable सी मोड़ आंदोलन. इस प्रकार हम रीढ़ की हड्डी में चोट के बाद वसूली के अध्ययन के लिए वयस्क zebrafish के लिए एक साथी के उपकरण के रूप में लार्वा zebrafish का प्रस्ताव.
Introduction
मानव रीढ़ की हड्डी को प्रमुख आघात के कारण अक्सर axons regrow या neurogenesis 1,2 reinitiate करने में असमर्थता के लिए, स्थायी पक्षाघात और चोट के स्तर के नीचे सनसनी के नुकसान में यह परिणाम है. स्तनधारियों के विपरीत, तथापि, सैलामैंडर और zebrafish (Danio rerio) सहित anamniotes भी पूरा रीढ़ की हड्डी transection 3,4 के बाद मजबूत वसूली दिखा.
वयस्क zebrafish रीढ़ की हड्डी में चोट 5-7 निम्नलिखित वसूली की प्रक्रिया के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है. पूरा रीढ़ की हड्डी transection के बाद, संवेदी और लोकोमोटिव समारोह के reestablishment 6 सप्ताह के बाद चोट 8 से वयस्क zebrafish में मनाया जाता है. विवो में पुनर्योजी प्रक्रिया की जांच करने के लिए, हम पारदर्शी लार्वा zebrafish 9 में बदल गया.
यहाँ हम एक 5 दिनों के बाद निषेचन (DPF) लार्वा zebrafish USI की रीढ़ की हड्डी आड़ा काट करने के लिए एक विधि प्रस्तुतभट्ट से संशोधित एक स्केलपेल के रूप में एक beveled microinjection पिपेट, एनजी एट अल. 10 इस विधि उच्च throughput, कम मृत्यु दर, और reproducibility का समर्थन करता है. अभ्यास के साथ, 300 लार्वा / घंटा transected किया जा सकता है, और 98.75% 0.72% ± 3,600 से अधिक पशुओं, सहित लेनदेनों के 6 महीने, 7 दिनों के बाद चोट (डीपीआई) जब तक जीवित रहे. हमारे आंकड़े के रूप में अच्छी तरह से संवेदी और हरकत की तेजी से वसूली से पता चलता है: 1 डीपीआई पर, घायल मछली की सभी आंदोलन केवल छाती पर का कवच पंख हरकत से प्रेरित है. हालांकि, लार्वा 2 डीपीआई द्वारा transection को सुई स्पर्श दुम टंगस्टन का जवाब करने के लिए शुरू, 3 डीपीआई द्वारा सी मोड़ आंदोलन पैर जमाने, और 5 डीपीआई 11 से हिंसक तैराकी प्रदर्शित करते हैं. Acetylated ट्यूबिलिन के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग करना, हम axons 1 डीपीआई पर चोट साइट से अनुपस्थित रहे हैं कि इस बात की पुष्टि की है, लेकिन 5 डीपीआई द्वारा चोट साइट को पार कर गया है. हम इस प्रोटोकॉल चोट के बाद रीढ़ की हड्डी में axonal regrowth और neurogenesis के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान तकनीक प्रदान करेगा.
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Protocol
Zebrafish मानक प्रक्रियाओं के अनुसार उठाया और नस्ल थे; प्रयोगों यूटा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.
सर्जरी प्लेट्स के 1. तैयारी
- निर्माता के निर्देशों का पालन, 60 मिमी पेट्री डिश और 184 Sylgard सिलिकॉन elastomer किट का उपयोग सर्जरी प्लेटें बनाओ. आधा भरा से अधिक नहीं बर्तन भरें और भाजन करने के लिए अनुमति देते हैं. स्टोर कमरे के तापमान पर कवर किया.
Micropipettes के 2. तैयारी
- हीटिंग और microinjection सुई बनाने के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर एक micropipette खींचने में पतली दीवार borosilicate केशिका टयूबिंग खींच कर micropipettes बनाना.
- एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, संदंश के साथ व्यास में लगभग 200 माइक्रोन तक micropipette की नोक बंद तस्वीर.
- बेवल टूटा 25 डिग्री पर एक दूसरे beveling द्वारा पीछा 35 ° करने के लिए शुरू में एक microgrinder, साथ बढ़त. टिप तेज और एसएमओ है सुनिश्चित करेंअन्य संगठनों के. स्टोर मिट्टी की एक छोटी राशि पर एक पेट्री डिश में beveled micropipette समाप्त हो गया.
Zebrafish लार्वा के 3. तैयारी
- सर्जरी से पहले 7 दिन, पुरुष और महिला zebrafish के संभोग टैंक की स्थापना की.
- रोशनी अधिकतम उपज सुनिश्चित करने के लिए आने पर 3 घंटे के बाद, अगली सुबह भ्रूण लीजिए. Knu3, 28.5 डिग्री सेल्सियस पर क्रमबद्ध करें निषेचित भ्रूण 100/100 मिमी प्लेट E3 के 25 एमएल में: ऐसी टीजी (EGFP elevl3) के रूप में एक ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइन का उपयोग अगर Wildtype का उपयोग करते हैं, के आधार पर क्रमबद्ध 28.5 डिग्री सेल्सियस पर E3 के 25 एमएल में भ्रूण 25/100 मिमी प्लेट निषेचित
- एक संवाददाता लाइन का उपयोग करते हैं, तो 48 HPF पर फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति के लिए भ्रूण स्क्रीन. पहचान भ्रूण 28.5 डिग्री सेल्सियस पर E3 के 25 एमएल में 25/100 मिमी प्लेट की एक घनत्व में परिपक्व करने की अनुमति दें
- लार्वा 5 DPF रहे हैं, E2 + 10 मिलीग्राम / एल Gentamycin सल्फेट (जी एस) + Tricaine साथ Sylgard कवर द्वारा सर्जरी थाली तैयार करते हैं.
- एक 100 मिमी पेट्री जिले को 25 मिलीलीटर E2 + जी एस जोड़कर वसूली पकवान तैयार करेंज.
- एक साथ तीन swabs टेप से स्केलपेल तैयार करें. यह तीन grooves के साथ एक त्रिकोणीय उपकरण के रूप में होगा.
- खांचे में से एक में यह टेप से swabs पर एक तैयार micropipette माउंट.
- E2 + जी एस के साथ स्पष्ट एक 1ml सिरिंज और पूर्व swabs पर बढ़ते करने के लिए एक 27 जी सुई का उपयोग कर जब तक फ्लश micropipettes, reusing हैं.
4. सर्जरी
- Tricaine के साथ एक समय (25 मछली) में लार्वा की 1 प्लेट anesthetize. वे अब स्पर्श प्रतिक्रिया का प्रदर्शन जब मछली पर्याप्त anesthetized हैं. यह स्केलपेल उन्हें छू लेती है, अन्यथा वे चिकोटी जाएगा, मछली पूरी तरह से सर्जरी से पहले anesthetized हैं कि महत्वपूर्ण है. सर्जरी एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे किया जाता है.
- सर्जरी की थाली के लिए लार्वा स्थानांतरण.
- यह स्केलपेल पकड़े हाथ करने के लिए अपनी पीठ निकटतम के साथ अपने पक्ष पर झूठ है, ताकि अधिक से अधिक वृद्धि के तहत, एक समय में एक लार्वा घुमाएगी.
- वे Sylgard पर आराम है, ताकि स्थिति, संदंशलार्वा की चौड़ाई से अधिक angled.
- संदंश की बाहों में से एक के खिलाफ कांच स्केलपेल ताल्लुक़, यकीन पृष्ठरज्जु के उदर बढ़त कटौती से परे नहीं जा रहा है, गुदा ताकना के स्तर पर लार्वा के पृष्ठीय पार्श्व चेहरे में कटौती. रीढ़ की हड्डी तोड़ स्केलपेल ट्विस्ट.
- शेष लार्वा से दोहराएँ.
नोट: एक लार्वा bleeds अगर, यह सर्जरी से ठीक नहीं होगा. तुरंत सर्जरी थाली से लार्वा को हटाने और Tricaine अधिक मात्रा के माध्यम से यह euthanize.
- लार्वा के बैच पर सर्जरी के पूरा होने पर, स्थानांतरण वसूली की थाली के लिए जानवरों घायल हो गए. इस संज्ञाहरण के समाशोधन का समर्थन है.
- सावधानी: स्थानांतरण के घायल लार्वा एकत्रित करते हैं, वे पहले सिर या पूंछ एकत्र कर रहे हैं सुनिश्चित करें: लार्वा झुकने से चोट साइट तनाव नहीं है.
नोट: सर्जरी के लिए इस्तेमाल सभी उपकरणों micropipettes सहित, पुन: उपयोग किया जा सकता है.
- सावधानी: स्थानांतरण के घायल लार्वा एकत्रित करते हैं, वे पहले सिर या पूंछ एकत्र कर रहे हैं सुनिश्चित करें: लार्वा झुकने से चोट साइट तनाव नहीं है.
5. वसूली
- ट्रेडफिनansfer वसूली थाली से 25/plate के घनत्व पर 25 मिलीलीटर E2 + जी एस से भरा 100 मिमी प्लेट को लार्वा घायल हो गए. एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ठीक करने के लिए अनुमति दें.
- बीमार और मरे हुए जानवरों को हटाने, दैनिक प्लेटों की जाँच करें. Coleps (मीठे पानी प्रोटोजोआ) मीडिया में दिखाई दे रहे हैं जब तक मीडिया को मत बदलो. मीडिया से बदल रहा है, एक नई प्लेट को मछली स्थानांतरण नहीं है; इसके बजाय, जितना संभव हो उतना मीडिया को हटाने और नए मीडिया के साथ एक ही थाली में बाढ़. Coleps जनसंख्या कम करने के लिए आवश्यक के रूप में दोहराएँ.
- पीसा हुआ भून भोजन की एक छोटी राशि के साथ दैनिक खिलाओ.
नोट: लाइव भोजन (जैसे, paramecia या रोटीफर्स) वे हरकत बरामद करने के बाद जब तक घायल लार्वा को खिलाया नहीं किया जा सकता. अन्यथा, लाइव भोजन चोट साइट उपनिवेश और लार्वा को मार डालेगा.
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Representative Results
चोट स्थल के आसपास के ऊतकों को नुकसान की गंभीरता को कम करने के लिए, micropipette के उचित beveling महत्वपूर्ण है. चित्रा 1 ए एक सही ढंग से beveled टिप से पता चलता है. बहुत संकीर्ण है कि एक टिप (चित्रा 1C) के बजाय ऊतक काटने से त्वचा से दूर नज़र करने के लिए जाता है, जबकि बहुत व्यापक है कि एक टिप (चित्रा 1 बी) का उपयोग करना, कारण पृष्ठीय महाधमनी nicking की वृद्धि की संभावना के उच्च मौत में परिणाम जाता है.
, 1 डीपीआई पर zebrafish.: चित्रा 2A एक लाइव टीजी (EGFP elevl3) की एक पूरी तरह से transected रीढ़ की हड्डी से पता चलता है रीढ़ की हड्डी की कल्पना करने के लिए knu3: इस तकनीक का अभ्यास करने के लिए, यह इस तरह टीजी (EGFP elevl3) के रूप में एक संवाददाता लाइन का उपयोग करने के लिए लाभप्रद है . मछली सह होने: चित्रा 2B 3dpi पर ही जीवित मछली से पता चलता है, जबकि -2 सी और 2 डी (EGFP dbx1a) तय टीजी में 3 डीपीआई पर चोट साइट के उच्च आवर्धन दिखाने के आंकड़ेmplete (चित्रा -2) या अधूरा (चित्रा 2 डी) रीढ़ की हड्डी transection. रीढ़ की हड्डी (पीले तीर) के उदर बढ़त के साथ न्यूरॉन लेबलिंग से सटे क्षेत्र पर ध्यान दें.
स्केलपेल किनारों की चित्रा 1. तुलना करें. एक सर्जरी के लिए उपयुक्त एक सही ढंग से beveled micropipette टिप से पता चलता है. यह आकार में आसानी से पुनः उपयोग के लिए साफ किया जाता है. बी एक 5 DPF लार्वा पर सर्जरी के लिए भी व्यापक एक beveled micropipette टिप से पता चलता है. सी भी संकीर्ण है कि एक टिप का एक उदाहरण है. इस आकार को पुन: उपयोग के लिए साफ करने के लिए बहुत मुश्किल है, और बजाय काटने की transection की एक काटने का कार्य कार्रवाई को बढ़ावा देने के लिए जाता है: डी. Lesioning उपकरण विधानसभा का कार्टून. तीन 6 "swabs एक py में नेस्ट रहे हैंआकार और एक साथ टेप ramidal. स्केलपेल तीन swabs द्वारा गठित खांचे में से एक में टिकी हुई है, और जगह में टेप कर लिया है.
.. मछली विवो में 1 डीपीआई (ए) और 3dpi (बी) पर: चित्रा 2 पूर्ण transection सत्यापित किया जा रहा फ्लोरिसेंट confocal माइक्रोस्कोपी छवि लाइव टीजी (EGFP elavl3) के लिए इस्तेमाल किया गया था. बी सी - - पूरा transection पुष्टि करने के लिए निम्न छवि के ढेर तो एक के रूप में दिखाया (rsbweb.nih.gov) अधिकतम तीव्रता के अनुमानों (MaxZ) उत्पन्न करने के लिए ImageJ में प्रोसेस किया गया Huc / डी डी शो MaxZ अनुमानों टीजी (dbx1a लेबल.: पूरा रीढ़ की हड्डी transection (सी) या अधूरा transection (डी) के साथ 3 डीपीआई पर EGFP) मछली.पीले तीर चोट साइट की पहचान, डी = पृष्ठीय, आर = व्याख्यान चबूतरे वाला. = 100 माइक्रोन स्केल बार.
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Discussion
शुरू में इस तकनीक को सीखना है, जब हम एक ही सत्र में कोई अधिक 50-100 से लेनदेन के प्रयास की सलाह देते हैं. इस तकनीक के माहिर के बाद, हम प्रति घंटा 300 भ्रूण को ऊपर आड़ा काट करने में सक्षम हैं; हालांकि, throughput के इस स्तर साप्ताहिक अभ्यास के कुछ महीनों की आवश्यकता है. हम भी एक पत्रकार लाइन के साथ अभ्यास और अधूरा रीढ़ की हड्डी transection की घटनाओं में कम से कम 1% से कम है जब तक पूरा transection की पुष्टि करने की सलाह देते हैं.
वयस्क zebrafish में रीढ़ की हड्डी transection चोट के बाद axonal regrowth और neurogenesis के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और मजबूत तकनीक है. लार्वा जीव में इस विश्लेषण ले जाकर, हम vivo में वसूली की जांच करने में सक्षम हैं. इसके अतिरिक्त, हम भी, जैसे, पुनर्योजी प्रक्रिया में Tcf7l1a 12 विभिन्न जीनों की भूमिका की जांच करने के लिए वयस्क zebrafish में उपलब्ध नहीं आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग करने में सक्षम हैं.
मूलतः डीघायल जानवरों 2 डीपीआई द्वारा चोट साइट के लिए दुम को छूने के लिए एक प्रतिक्रिया दिखाने के लिए, और axons 5 डीपीआई द्वारा चोट साइट को पार कर गया है: रीढ़ की हड्डी transection निम्नलिखित न्यूरोजेनेसिस अध्ययन करने के लिए eveloped, इस तकनीक को भी संवेदी समारोह की वसूली की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम पशुपालन के लिए यूटा विश्वविद्यालय zebrafish सुविधा के लिए आभारी हैं. आरआईडी एनआईएच R56NS053897 द्वारा समर्थित है, और LKB HHMI मेड में-ग्रैड पहल द्वारा समर्थित एक predoctoral प्रशिक्षु था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm Petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| PDMS, Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00 mm, ID 0.78 mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| Disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10 mg/ml, store at -20 °C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| Cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1 ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 G needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20 °C |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1 L); store at RT | |||
| 17.5 g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90 g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90 g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41 g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12 g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10 ml); make fresh, discard extra | |||
| 0.35 g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1 L); store at RT | |||
| 50 ml 20x E2 | |||
| 2 ml fresh 500x NaCO3 | |||
References
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