Summary
في ترنسفكأيشن المجراة من الحمض النووي عارية عن طريق التسليم الجين الهيدروديناميكية يدخل الجينات في الأنسجة حيوان مع الحد الأدنى من الاستجابة الالتهابية. تتولد كميات كافية من الجين المنتج بحيث ظيفة الجين والتنظيم فضلا عن بنية البروتين وظيفة يمكن تحليلها.
Abstract
التعبير كفاءة من الجينات المحورة في الجسم الحي هو من الأهمية بمكان في دراسة وظائف الجينات وتطوير علاجات للأمراض. على مدى السنوات الماضية، والتسليم الجين الهيدروديناميكية (HGD) برز بوصفه وسيلة بسيطة وسريعة وآمنة وفعالة لإيصال الجينات المحورة في القوارض. تعتمد هذه التقنية على القوة الناتجة عن حقن السريع لكمية كبيرة من محلول الفسيولوجية لزيادة نفاذية أغشية الخلايا من الأجهزة perfused وبالتالي تقديم الحمض النووي في الخلايا. واحدة من المزايا الرئيسية لHGD هو القدرة على إدخال الجينات المحورة في خلايا الثدييات باستخدام الحمض النووي البلازميد عاريا (PDNA). إدخال جين الخارجية باستخدام البلازميد هو شاقة الحد الأدنى، كفاءة عالية و، خلافا لناقلات الفيروسية وآمنة بشكل ملحوظ. واستخدمت في البداية لتقديم HGD الجينات في الفئران، ويتم استخدامه الآن لتقديم مجموعة واسعة من المواد، بما في ذلك [أليغنوكليوتيد، الكروموسومات الاصطناعية، RNA، البروتينات والجزيئات الصغيرة في الفئران والجرذانو، إلى درجة محدودة، والحيوانات الأخرى. يصف هذا البروتوكول HGD في الفئران، ويركز على ثلاثة جوانب رئيسية للطريقة التي تعتبر بالغة الأهمية لتنفيذ الإجراء بنجاح: الإدراج الصحيح للإبرة في الوريد، الحقن حجم وسرعة التسليم. يتم إعطاء أمثلة لإظهار تطبيق هذا الأسلوب إلى التعبير عابرة من اثنين من الجينات التي تكود يفرز والبروتينات الرئيسيات محددة، ئي LI (APOL-I) والبروتين المتصلة هابتوغلوبين (HPR).
Introduction
ليو وآخرون. وتشانغ وآخرون، أصبح إيصال الجينات الهيدروديناميكية (HGD) منذ أول وصف من قبل أداة لا تقدر بثمن لدراسة وظائف الجينات في نظم نموذج القوارض 1، 2. والأسلوب الذي ينطوي على حقن السريع (5-7 ثانية) من حجم كبير (8-12٪ من وزن الجسم) من الحل في الوريد ذيل الفئران لتسهيل امتصاص الحمض النووي البلازميد بواسطة خلايا الأعضاء المستهدفة 1، 2. هذه الظروف تؤدي إلى التعبير الجيني قوية في الكبد وأقل التعبير الجيني في الكلى والطحال والرئة والقلب.
حقن 10 ميكروغرام pCMV-LacZ البلازميد يمكن بالنقل بقدر 40٪ من خلايا الكبد، مما يجعل HGD الأكثر كفاءة، غير الفيروسية، في الجسم الحي طريقة إيصال الجينات إلى تاريخ 1. على عكس شركات الطيران الفيروسية، PDNA هي سهلة التحضير، لا تثير استجابة مناعية في المضيف القوارض 3 و لا تشكل مخاطر على الصحة من خلال إعادة مزج مع نهايةogenous الفيروسات. بالإضافة إلى ذلك، منذ جزيئات الحمض النووي التي ألقاها HGD لا تحتاج التعبئة والتغليف، وهذا الأسلوب هو مناسبة لإيصال الكروموسومات البكتيرية المصطنعة (BAC) كبيرة مثل 150 كيلو بايت 4. أنواع أخرى من الجزيئات التي تم تسليمها من خلال طريقة الهيدروديناميكية تشمل الحمض النووي الريبي 5-10، morpholinos 11، والبروتينات 12 و 13 و الجزيئات الصغيرة الأخرى 12 و 14. وقد نوقشت مزايا ومساوئ HGD أكثر من غيرها من طرق التسليم في الاستعراضات ممتازة في الأدب 15-20 وقدمت عددا من الكتاب وصفا تفصيليا للإجراءات 21-23.
إدخال الجينات المحورة في الفئران عن طريق HGD هي آمنة وفعالة 1-3، 24، واستخدمت الأسلوب في الفئران مقارنة مع النجاح 25. مع بعض التعديلات، وقد أجريت إثبات صحة مفهوم التجارب في الدجاج 26، راببت 27 و 28 الخنازير، على الرغم من أن في الجسم الحي تطبيق هذه التقنية في الحيوانات الكبيرة لا تزال تشكل تحديا. عند استخدام هذا الأسلوب، الحد آخر شائع هو أن العديد من ناقلات التعبير الثدييات المتاحة تفتقر إلى المكونات لتحقيق الثابتة، ومستوى عال من التعبير الجيني. باستخدام pCMV لوك البلازميد، التعبير الجيني في الأجهزة المستهدفة هو واضح في وقت مبكر بعد عشر دقائق HGD، ومع ذلك، يسقط الأولية، وارتفاع مستوى التعبير بشكل حاد في الأسبوع الأول بعد الحقن 1. طويلة الأجل التعبير التحوير من الممكن اعتمادا على المروج وإنترون المستخدمة في تصميم البلازميد 3، 24 الحقن ومع ذلك، والحفاظ على التعبير الجيني على مستوى عال في كثير من الأحيان يتطلب المتكررة. لهذا السبب، HGD قد تكون أقل مناسبة لدراسة الأمراض المزمنة التي هي نتيجة التعرض الطويل الأمد للبروتينات ضارة أو منتجات البروتين. مع هذه القيود، HGD هو أداة قوية بشكل استثنائي لدراسة بودور tential من الجينات وتأثير ذلك المسوخ في الجسم الحي، فضلا عن الآثار العلاجية وتنظيم البروتينات وإنشاء نماذج حيوانية من المرض (للمراجعة، انظر 15). على سبيل المثال، HGD يمكن أن تستخدم لتعيين وظيفة إلى مجالات والأحماض الأمينية للبروتينات بشكل فردي عن طريق إدخال مختلف بنيات الجينات في الفئران التي طرقت الجينات المعنية بها. علاوة على ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها في أي سلالة الماوس.
يصف هذا البروتوكول HGD في الفئران مع التركيز على الجوانب الفنية اللازمة لتحقيق النجاح ترنسفكأيشن: غرز الإبرة الصحيح في الوريد، الحقن حجم وسرعة التسليم. ويتجلى في تطبيق هذا الأسلوب في نموذج الفأر من داء المثقبيات الأفريقي، وهو مرض قاتل للبشر والماشية 29، 30. بينما عدة أنواع من المثقبيات يسبب مرض في الماشية، ومعظم لا يمكن أن تسبب المرض لدى البشر بسبب المركبات المناعية الفطرية في بlood تسمى عوامل التحللي المثقبيات (TLFs) 29، 31، 32. تشكيل هذه المسام، والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL) تحتوي على اثنين فريدة من نوعها، الرئيسيات محددة البروتينات: HPR، يجند، مما يسهل امتصاص TLFs في المثقبيات، وAPOL-I، المكون التحللي 31، 33-38 المثقبية البروسية الروديسية قادر على إصابة البشر بسبب التعبير عن المقاومة المرتبطة البروتين مصل (SRA) التي تربط لويحيد الإنسان APOL-I 34، 39. لم يتم تحييد البابون TLF بواسطة حساب الاحتياطي الخاص نظرا لاختلاف APOL-I البروتين 40. كما ذكرت سابقا، وذلك باستخدام ناقلات التعبير الثدييات (pRG977)، والتعبير المعدلة وراثيا من البابون مكونات TLF في الفئران تمنح حماية ضد المثقبيات للعدوى الإنسان 40. إظهار بيانات تمثيلية المقدمة هنا كيف يمكن تطبيق إيصال الجينات الهيدروديناميكية لدراسة الآثار العلاجية للبروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب وصفها هنا من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام كلية هانتر، جامعة مدينة نيويورك.
1. إعداد الحمض النووي البلازميد خالية من الذيفان الداخلي
- اختيار مستعمرة واحدة من البكتيريا التي تحتوي على الجينات في المصالح في ناقلات التعبير الثدييات من لوحة انتقائية يشوبه طازجة.
- متابعة التوصيات وجدت في كتيب من المتاحة تجاريا خالية من الذيفان الداخلي عدة تنقية البلازميد لزراعة وحصاد البكتيريا.
- تنقية البلازميد الحمض النووي خالية من الذيفان الداخلي من الخلايا البكتيرية عن طريق اتباع بروتوكول المتاحة تجاريا خالية من الذيفان الداخلي عدة تنقية البلازميد.
- استخدام خالية من الذيفان الداخلي البلاستيك وير والتعامل مع الحمض النووي مع الحرص على ضمان عدم إعادة عرض أن الذيفان الداخلي في عينة من الحمض النووي بعد خطوة الإزالة.
- قياس تركيز الحمض النووي البلازميد خالية من الذيفان الداخلي من خلال تحديد الامتصاصية أعمالها في 260 نانومتر باستخدام ميكرس حجم طيفي للأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح أدناه أو معيار، معمل القائم كفيت.
- تنظيف السطوح البصرية السفلي والعلوي من النظام الاحتفاظ عينة معمل الصغرى على النحو التالي. ماصة 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات نظيفة على النظام البصري أقل. إغلاق ذراع الرافعة واضغط عليها عدة مرات ليستحم النظام البصري العلوي، ثم ذراع مفتوحة ونظيفة يمسح بمنديل.
- افتح البرنامج من معمل الصغرى وحدد الوحدة النمطية الأحماض النووية.
- وضع 1 ميكرولتر ماء منزوع الأيونات نظيفة على النظام البصري أقل، وانخفاض ذراع الرافعة وحدد "تهيئة" من برنامج البرنامج. مرة واحدة هو تهيئة السطوح كاملة ونظيفة سواء البصرية بمنديل ..
- أداء القياس فارغة عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من الذيفان الداخلي خالية من TE العازلة (10 ملي تريس، الكلورين، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) واختيار "على بياض" من برنامج البرنامج. مرة واحدة ويتم قياس فارغة، السطوح النظيفة سواء البصرية معالأنسجة.
- أداء قياس عينة عن طريق تحميل 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي خالية من الذيفان الداخلي واختيار "تدبير" من برنامج البرنامج. تسجيل تركيز الحمض النووي. تقييم نقاء الحمض النووي من خلال تسجيل نسبة الامتصاصية 260/280 نانومتر التي تظهر على الشاشة. منذ استخدام الحمض النووي النقي (260/280 نسبة 1.8) لHGD مرغوب فيه للغاية، وتجنب استخدام عينة الحمض النووي مع نسبة 260/280 1.7 أدناه. مرة واحدة ويتم قياس، وتنظيف كل السطوح البصرية بمنديل.
2. وزن الفئران
- علامة الفئران في المناسبة بطريقة لسلالة. ملاحظة: بمناسبة الذيل لا ينصح لهذا الإجراء.
- أنواع الماوس علامة أن يكون الفراء الأبيض (مثل بستر السويسرية) على ظهورهم مع علامة سوداء. تطبيق علامات بمرور الوقت حسب الضرورة.
- الأنواع التي لها علامة الماوس الفراء الأسود (على سبيل المثال C57BL / 6) عن طريق الأذن اللكم عدة أيام مقدما.
- وزن الفئران individuaLLY عن طريق وضعها برفق في وزنها عموم الحيوان أو دلو وضعها على ميزان المختبرات الرقمية. تسجيل وزن كل فأر استخدمت في التجربة، في يوم من التجربة.
3. إعداد الحقن
- إعداد مزيج الحقن
- حساب كمية الحمض النووي التي يحتاجها افتراض 5-50 ميكروغرام خالية من الذيفان الداخلي الحمض النووي البلازميد لحقن كل فأر.
- تحديد المبلغ الأمثل من الحمض النووي البلازميد تجريبيا.
- عند تحديد كمية الحمض النووي المطلوبة، افترض حقن الماوس إضافية واحدة لكل مجموعة، والتحميل الصحيح للمحاقن وسوف تتطلب بعض مزيج حقن إضافية. للمساعدة في العمليات الحسابية، والنظر في المثال التالي: 4 حقن فئران التجارب و 4 السيطرة، تزن كل منها 25 غرام، مع 50 ميكروغرام البلازميد الحمض النووي في الماوس. لتحديد كمية الحمض النووي المطلوب في هذه الحالة، وحساب مع 5 الفئران في كل مجموعة: 5 × 50 = 250 ميكروغرام ميكروغرام DNA اللازمة لكل مجموعة.
- تحديد كمية من المياه المالحة (0.9٪ كلوريد الصوديوم) التي يحتاجها افتراض 10٪ من وزن الجسم لحقن كل فأر.
- وفقا للمثال أعلاه، وضخ كل 25 ز الفأر مع 50 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 2.5 مل المالحة (2.5 غرام من المواد السائلة).
- عند تحديد كمية من المياه المالحة المطلوبة للحصول على مجموعة كاملة من الفئران، افترض حقن فأرة إضافية لكل مجموعة للسماح للتحميل السليم للمحاقن. دراسة التجربة معين، حساب كمية من المياه المالحة اللازمة ل5 الفئران في كل مجموعة: 5 × 2.5 = 12.5 مل مل المالحة لكل مجموعة (أو 25 مل المجموع). ملاحظة: إذا الفئران ضمن المجموعة ذاتها ليست هي نفس الوزن (الفرق أكثر من 10٪ في وزن الجسم)، وإعداد حقن يمزج بشكل منفصل.
- استخدام المواد الحافظة وخالية من الذيفان الداخلي، ملحي معقم التي تمت الموافقة للاستخدام البشري، في 10 مل، قوارير متعددة الاستخدامات.
- باستخدام إبرة عيار 20 (0.9 ملم × 25 ملم) تعلق على معلومات سرية بالتركيبة خصلة من حقنة 20 مل،سحب السائل من قوارير المياه المالحة وإفراغ الحقن في أنبوب مخروطي 50 مل. للمساعدة pipetting لدقيقة من المياه المالحة خلال إعداد يمزج حقن الحمض النووي المالحة، وجمع أكثر ملوحة مما يجب لحقن جميع الفئران في التجربة. للتجربة أعلاه، سحب المياه المالحة من 3، 10 مل قارورة (أي ما مجموعه حوالي 30 مل) حتى لو كان المبلغ المحسوب من المياه المالحة اللازمة للتجربة فقط 25 مل.
- ماصة المبلغ المحسوب من الحمض النووي في 50 مل أنبوب مخروطي مختلفة. والحرص على عدم لمس الجانب من الأنبوب مع الجسم ماصة لتجنب إدخال الذيفان الداخلي. وفقا لسبيل المثال، ماصة 250 ميكروغرام من السيطرة و 250 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد التجريبية في أنابيب مخروطية منفصلة.
- إضافة المبلغ المطلوب من المياه المالحة على الحمض النووي باستخدام ماصة المصلية. دراسة التجربة العينة، ماصة 12.5 مل المالحة إلى كل من يمزج الرئيسي (التجريبية والضابطة).
- السماح لجميع الحلول للوصول إلىدرجة حرارة الغرفة قبل الحقن.
- حساب كمية الحمض النووي التي يحتاجها افتراض 5-50 ميكروغرام خالية من الذيفان الداخلي الحمض النووي البلازميد لحقن كل فأر.
- إعداد الحقن
- لكل الماوس، وملء العقيمة، 3 مل، بالتركيبة قفل حقنة مع مزيج الحمض النووي المالحة باستخدام العقيمة، إبرة عيار 20 (0.9 مم × 25 مم). الحرص على تجنب فقاعات الهواء. تجنب استخدام المحاقن حجم العالي ومعدل تدفق الحقن لا يمكن السيطرة عليها بشكل جيد للغاية، وأنه من الصعب التعامل مع المحاقن أكبر في يد واحدة. إخراج أي مزيج الحمض النووي المالحة الزائد مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي لأن هذا قد يكون إعادة استخدامها.
- تبديل إبرة معقمة ل، 27 عيار إبرة. ملء الإبرة مع السائل تماما دون إدخال فقاعات الهواء. ضبط مستوى الصوت من مزيج الحمض النووي المالحة كما تحسب على أساس الوزن من الفأرة.
- لا تسمح الإبرة لم يسبق لهم اللعب للمس أي سطح غير معقمة. إذا لزم الأمر، والإبر يجوز إعادة توج باستخدام تقنية بيد واحدة: وضع غطاء على سطح مستو، أدخل الإبرة دون التمسك الغطاء مع جهة أخرى والضغط على إبرة توجضد كائن شركة لتأمين الغطاء على الإبرة. الحقن هي الآن جاهزة للحقن الوريد الذيل.
4. تسليم الحمض النووي هيدرودينامي
- ملاحظة أن الفئران قد يقلل من جدوى التخدير. تجنب إجراء HGD في غرفة باردة جدا، وهذا سوف يقلل أيضا من قدرتها على البقاء. إذا كانت الغرفة لديها درجة حرارة الغرفة من 20 درجة مئوية أو إذا كان استخدام التخدير، وضع الفئران على وسادة التدفئة وضعت في 37 ° C الإجراء آخر لتجنب فقدان أي الحيوانات. إذا باستخدام التخدير، والتأكد من أن الفم والخطم من الفأرة هي حين دون عائق على لوحة الحرارة ومراقبة الماوس حتى يتعافى تماما. لا تحجب الغذاء أو المياه من الفئران قبل HGD.
- تدفئة الفئران لتمدد الأوعية الدموية.
- وضع القفص الماوس (مع تضمين الفراش) على وسادة الحرارة لمدة 5 دقائق حتى يتسنى للحرارة الفراش ما يقرب من 38-39 درجة مئوية. يجب أن تكون درجة الحرارة منخفضة بما فيه الكفاية للحفاظ على الفئران على منصة الحرارة لفترة ممتدة.
- بدلا من ذلك، ضع الماوس إلى كابح الوصول الظهرية مع الحد الأدنى من ضبط النفس. تدفئة ذيل الماوس لمدة 1 دقيقة من خلال عقد برفق بقطعة من الشاش المبللة بالماء الدافئ. السماح الماوس لإعادة الموقف، إذا لزم الأمر. مسح الذيل بمنديل لتجف.
- بدلا من ذلك، عن طريق وضع الماوس دافئ قفص تحت مصباح الحرارة لمدة لا تزيد عن 2 دقيقة. إذا باستخدام مصباح الحرارة، وتوخي الحذر لتجنب ارتفاع درجة حرارة الماوس.
- كبيرة الحجم حقن الوريد الذيل
- شل على وصول كابح الظهرية على سطح مستو بواسطة شريط المختبر.
- عقد من ذيله، ضع الماوس برفق في كابح وتضاف المكونات. استخدام أقل قدر من ضبط النفس الضروري للحفاظ على الذيل يجمد. تأكد من أن الماوس يتنفس بحرية.
- إذا كان الفأر هو في محنة شديدة في أي لحظة أثناء الإجراء، وإزالة الماوس من كابح على الفور والسماح لها للراحة.
- ضع الماوس حتىواحد من الأوردة الذيلية الوحشي مرئيا. تحديد موقع الأوردة الذيلية الجانبية من خلال النظر لأسفل على التوالي في الجزء الخلفي من الماوس: الخط الأحمر على التوالي في منتصف الذيل هو الشريان، في حين أن خطوط زرقاء على جانبي الذيل هي عروق الذيلية الجانبية.
- مسح ذيل الماوس تماما مع مسحة الكحول.
- استخدام اليد غير الحقن، وعقد ذيل بإحكام بين السبابة والوسطى بحيث يمر ذيل تحت السبابة، على الوسط والأصابع الثالث وتحت الإصبع الصغير. تسمح الإبهام لتظل حرة للتحرك. (الشكل 1A)
- باستخدام ناحية أخرى، ومسح المنطقة المراد حقنها مرة أخرى مع مسحة الكحول. تسمح المنطقة لتجف.
- التقط حقنة محملة اليد الحقن والاحتفاظ بها من قبل برميل بين الإبهام وغيرها من أربعة أرقام. لا التمسك المكبس.
- وضع مواز حقنة لالذيل، حيث يشير الإبرة نحو الجسم من الفأرة وشطبة (مائلة حافة) من الإبرة مواجهة.
- ادخال الإبرة في الوريد الذيل. المضي قدما في حقن فقط إذا كان موجودا في الوريد بشكل صحيح، وهو ما يتضح من الإبرة في انزلاق مع عدم وجود المقاومة. علما بأن عمق غرز الإبرة هو مسألة تفضيل شخصي ومع ذلك، لا ينصح الإدراج الكامل بسبب زيادة خطر القص من الوريد. تجنب تحريك الإبرة.
- باستخدام الإبهام من اليد عقد الذيل، وتغلق على محور الإبرة ومركز الصحافة ضد الذيل لعقد إبرة في الموقف. لا تنطبق ضغط شديد وليس التمسك رمح الإبرة، وهذه سوف تعيق تدفق السائل في الوريد. عقد ذيل مع السبابة فضفاضة عند هذه النقطة حتى لا تعوق حقن (الشكل 1A).
- إعادة وضع اليد عقد حقنة بحيث السبابة والاصبع الوسطى والتمسك شفة والإبهام على نهاية المكبس (الارقام ..ه 1A).
- اضغط لأسفل على الغواص في واحد، حركة مستمرة وحقن حجم الكامل للسيولة في 6-8 ثانية.
- إزالة الإبرة من الوريد ووقف النزيف من خلال تطبيق ضغط لطيف على ذيل بمنديل.
- إزالة الماوس من كابح ومكان الماوس في قفص الانتعاش وضعت على رأس وسادة التدفئة (يجب أن يكون الفراش 37-38 درجة مئوية). إذا كانت الغرفة هي حقن الباردة، هذه الخطوة هو أمر حاسم لبقاء الماوس. التمسك ذيل الماوس حتى يتوقف النزيف تماما.
- مراقبة الماوس لمدة 1 ساعة بعد الولادة الحمض النووي الهيدروديناميكية. فترة أولية من يلهث والجمود أمر طبيعي نظرا لعدم انتظام ضربات القلب المؤقتة الناجمة عن HGD ولكن تأكد من أن الماوس يظهر علامات على الانتعاش في حوالي 5 دقائق. إذا كان التنفس من الفأرة يصبح ضحل جدا، والتدليك بلطف البطن من الفأرة لتسهيل التنفس. نلاحظ أن معدل التعافي قد تتأثر قليلا من سلالة الماوس المستخدمة.
- عودة الماوسإلى القفص الإسكان وضمان أن الفأر لديه وفرة من الغذاء والماء.
- كبيرة الحجم الذيل الوريد الحقن باستخدام وضع اليد البديلة
- ضع مؤشر الفأرة إلى كابح والاستعداد للحقن عن طريق اتباع الخطوات 4.3.1 4.3.5 من خلال، كما هو موضح سابقا.
- راحة اليد غير الحقن على سطح مستو مع أربعة أصابع عازمة في زاوية تسعين درجة. يجب الأصابع (كل ما عدا الإبهام) راحة على رأس كل منهما الآخر، وخلق منصة. عقد ذيل الماوس بين الإبهام وتوجيه أصابع الاتهام (الشكل 1B).
- باستخدام ناحية أخرى، ومسح المنطقة المراد حقنها مرة أخرى مع مسحة الكحول. تسمح المنطقة لتجف.
- الاستيلاء على حقنة مع اليد الحقن والاحتفاظ بها من قبل شفة ونهاية المكبس، وعلى استعداد للحقن.
- استكمال إجراءات باتباع هذا البروتوكول من خلال خطوة خطوة 4.3.9 4.3.17، كما هو موضح سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الموضع الصحيح من الإبرة في الوريد ذيل الماوس (كما هو موضح في الشكل رقم 1) هو شرط أساسي لتقديم بنجاح التحوير من قبل ترنسفكأيشن مقرها الهيدروناميكا. في كثير من الأحيان الجزء الأكثر تحديا للتقنية، ومع ذلك، هو الإبقاء على إبرة داخل الوريد الذيل دون حركة بحيث يمكن أن يتم تسليم وحدة التخزين بالكامل من الحقن خلال مدة 6-8 ق. أخطاء طفيفة خلال عملية الحقن قد يؤدي إلى انخفاض كبير كفاءة ترنسفكأيشن والبروتين التعبير. وبالتالي، لا بد من رصد نجاح HGD لكل تجربة. إذا كان البروتين المعدلة وراثيا ذات الاهتمام يصعب اكتشاف من قبل لطخة غربية بسبب عدم وجود الأجسام المضادة الحساسة، كما في حالة البابون APOL-I، يمكن رصد كفاءة الحقن عن طريق الحقن المشترك من البلازميد يحمل الجين لبروتين أن هو كشفها بسهولة. في التجربة هو مبين في الشكل 2، تم حقن الفئران مع 50ميكروغرام من البلازميد يحمل واحدة من ثلاث 6XHIS تفاضلي الموسومة البابون الجينات APOL-I و 50 ميكروغرام من البلازميد آخر (نفس التصميم ناقلات التعبير) التي كانت تحمل البابون HPR (bHPR، معلم). وكان الهدف الرئيسي من هذه التجربة لتقييم ما إذا كانت إضافة علامة 6XHIS في المواقع المختارة تسلسل يتداخل مع معالجة صحيحة وإفراز البابون APOL-I البروتين. إذا ومع ذلك، إضافة العلامة يعطل لطي الصحيح، وبالتالي إفراز البروتين، يصبح من الصعب تحديد ما إذا كان فقدان البروتين التعبير وقعت بسبب ضعف معالجة أو غير ناجحة HGD. وعلاوة على ذلك، ونظرا لعدم وجود الأجسام المضادة حساسة بما فيه الكفاية، والكشف المباشر للقرد البابون APOL-I في transfected البلازما الماوس من الصعب حتى في حالة وجود إيصال الجينات ناجحة (على النحو الذي يحدده حماية الفئران ضد تحديا المثقبيات المعدية الإنسان). في هذه التجربة، تم تناول هذه القضايامن خلال إضافة مبلغ يعادل البابون HPR البلازميد إلى خليط APOL-I HGD لتكون بمثابة حقن تحكم بديلة. كما هو موضح في الشكل، وأعرب عن غاية البابون HPR في البلازما كلها تقريبا من الفئران transfected مشيرا إلى أن HGD كانت ناجحة. قطرات طفيفة في مستويات التعبير، كما رأينا في واحدة من اثنين من الفئران في مجموعة bAPOL-I 6XHIS 1 في الشكل 2A، عموما تعزى إلى انخفاض صغير جدا (1-2) في سرعة الحقن. في الشكل 2B، أول عينة البلازما حارة 1 (في مجموعة bAPOL-I 6XHIS 3) يدل على غياب كامل للبروتين تعبير يدل على HGD فشلت. في معظم الحالات، ويرجع ذلك إلى الحقن غير مكتملة من حجم كامل للسيارة تسليم هذه. منذ هذه التجربة يؤكد نجاح HGD في جميع الحالات ولكن يمكن الآن واحدة، وتأثير 6XHIS وضع علامات على bAPOL-I إفراز يتم تقييمها من قبل طخة مناعية مضادة لل6XHIS (الشكل 2C و D). كما رأينافي الشكل 2D، كانت المجموعة الوحيدة من الفئران التي لديها مستويات يمكن اكتشافها من البروتين 6xHIS الموسومة في البلازما الخاصة بهم مجموعة 3. أكد نمط التعبير البروتين داخل هذه المجموعة يتم حقن أحد الفئران في هذه المجموعة لم يوفق. الغياب الكامل للبروتينات 6xHIS كشفها في المجموعات 1 و 2 (الشكل 2C) يؤكد أهمية بما في ذلك البروتين التتبع في مزيج الحقن لمراقبة نجاح HGD. دون النظر في مستويات البلازما من bHPR (الشكل 2A وباء)، ويمكن بسهولة أن يساء تفسيرها البيانات من الشكل 2C و D كما فشل HGD في مجموعات 1 و 2.
HGD ناجحة من البابون مكونات TLF1 bAPOL-I وbHPR، ويعطي الفئران المقاومة للطفيليات المثقبيات البروسية البروسية-SRA المعدية الإنسان (TBB-SRA، وهو ما يعادل مختبر T. الروديسية) 40. هو هذه المقاومة بسبب التعبير المعدلة وراثيا من bAPOL-I <م />، وحقن bHPR وحده لا يوفر الحماية ضد الطفيليات المعدية الإنسان. لتقييم ما إذا كانت المتغيرات 6XHIS الموسومة من bAPOL-I لا تزال قادرة على العمل كما البروتينات التحللي، وقد تم الطعن الفئران التي تلقت كل من bAPOL-I وbHPR بواسطة HGD مع 5000 TBB-SRA الطفيليات يومين بعد الولادة الجينات. كما رأينا في الشكل 3، استسلمت الفئران في مجموعة 6XHIS 2 للإصابة في وقت مبكر جدا، في حين أن معظم الفئران في مجموعات 1 و 3 قيد الحياة طالما أن السيطرة الإيجابية معلم bAPOL-I. (البابون APOL-I حماية جزئية في هذه السلالة الماوس.) ولما كان التعبير التحوير ضمن المجموعة 2 عالية عالميا، والافتقار إلى الحماية في هذه الفئران قد تفسر بشكل صحيح كما فقدان bAPOL-I وظيفة التحللي بسبب العلامة 6XHIS في ذلك الموقف. يجب توخي الحذر، مع ذلك، أن من السابق لأوانه (يوم 7) الموت على فأرة الحاسوب ضمن مجموعة 3 لا يساء تفسيرها، كما لا حقن هذا الفأر بنجاح مع الجينات المحورة (انظر الشكل2B لدى عودتهم، حارة 1). في ضوء البيانات المجمعة من الشكلين 2 و 3، فإننا نستنتج أن bAPOL-I يمكن الموسومة في موقف 3 (في مجموعة 6xHIS 3) من دون آثار سلبية، في حين أن علامات هذا البروتين في موقف 2 (في مجموعة 6xHIS 2) يعطل التحللي لها وظيفة. في مجموعة 6xHIS 1، في حين أن البيانات توحي الحماية كان عدد من الفئران غير كافية للحصول على بيانات هامة. يجب أن يتم تنفيذ تحليلات القدرة على تحديد عدد من الفئران المطلوبة لكل تجربة. في حين يبدو من نقص البروتين يمكن كشفها في البلازما الماوس من الفريق 1 قد يبدو مناقضا للنمط الحماية رأينا في الشكل 3، لاحظ أن مكافحة 6xHIS صمة عار السلبية الغربي في هذه المجموعة قد يكون نتيجة لعدم الكشف بسبب تجهيز البروتين بدلا من نقص في التعبير الجيني. في المجموعة 1، وإضافة العلامة 6xHIS قريبة بعد الموقع انشقاق من الببتيد إشارة توقع. البابون APOL-I تسلسل الأحماض الأمينية يحتوي على predicte إضافيةد بروتين موقع انشقاق ما يقرب من 20 الأحماض الأمينية من موقع انشقاق من الببتيد إشارة 40. وبالتالي، فمن الواضح أن bAPOL-I في هذه الفئران ويفرز وظيفية حتى الآن فقدت العلامة 6xHIS اللازمة للكشف بها. مما يدل على أهمية HIS علامة التنسيب.
APOL-I يقتل المثقبيات الأفريقي عن طريق تشكيل المسام في الغشاء الطفيلي يحلول 36، 37. المتغيرات الطبيعية من الإنسان APOL-I، وجدت في الأشخاص الذين يعانون من أصل أفريقي الأخيرة، وقد ارتبطت بقوة مع مرض الكلى في الأمريكيين من أصل أفريقي، على الرغم من أن آلية تلف الكلى هو غير واضح حتى الآن 41، 42. منذ HGD النتائج في أعلى التعبير الجيني في الكبد، أردنا أن التحقيق إذا الإنسان APOL-I أو البديل لها تسلسل الاصطناعية يسبب ضررا في هذا الجهاز. تحقيقا لهذه الغاية، تم حقن الفئران مع 50 ميكروغرام من WT-I APOL الإنسان أو حمض أميني واحد متحولة الاصطناعية المخصصة لق K4.To تقييم تلف الكبد، قمنا بقياس ناقلة اسبارتاتي (AST) مستويات في الماوس البلازما التي تم جمعها في يوم 2 بعد الحقن. بما يتفق مع وظيفتها التحللي، WT-I APOL الإنسان يؤدي إلى ارتفاع مستويات المصل AST (الشكل 4A) بالمقارنة مع الفئران التي حقن المياه المالحة. في المقابل، تسبب حقن متحولة K4، والذي يختلف في حمض أميني واحد فقط، وإطلاق سراح AST القليل جدا. اختلافات في تلف الكبد من غير المرجح أن يكون تعزى إلى مستويات البروتين التعبير، ومستويات البروتين K4 تعادل أو تفوق تلك من WT-I APOL الإنسان (الشكل 4B). فحص الكبد من الفئران HGD جمع 5 أيام بعد الحقن يدل على أن الإنسان WT-I APOL يسبب نخر الأنسجة محدودة مع تسلل بلعم المعتدلة (الشكل 5B) بالمقارنة مع الفئران التي حقن المياه المالحة التي تظهر الأنسجة الكبد طبيعية (الشكل 5A، والمناطق الأرجواني) . تؤكد البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق قياس مستويات البلازما AST، حقن K4 في نفس البلازميد backgالجولة كما يظهر WT الأنسجة الكبد طبيعية (الشكل 5C).
الشكل 1. توضيحات من ناحية المواقف لHGD. A.) وقد بدأ المركز 1. الموصى جهة يمكنها من تحقيق أقصى قدر من السرعة وحقن لتجنب حركة الإبرة بعد الحقن. السهم يشير إلى الحركة واقترح من الإبهام بعد إدخال الإبرة في الوريد. الإبهام يجب لشل حركة الإبرة من خلال عقد بلطف محور ضد ذيل الماوس. من ناحية عقد الحقنة يجب تعديل أوضاعها لتكون قادرة على الضغط لأسفل على الغواص قبل الحقن. B.) الموقع 2. ينصح هذا الموقف إذا كان يجب أن يتم حقن الوريد الذيل من أقرب إلى قاعدة الذيل بسبب تكرار الحقن. مرة واحدة يتم إدخال الإبرة في الوريد، وهذا الموقف لا يحتاج إلى يد الفراءتعديلات ذر.
الشكل 2 تحليل لطخة غربية من البلازما التي تم جمعها من خمسة أسابيع من العمر، والإناث، بستر السويسرية (SW) حقن الفئران مع مزيج من اثنين من البلازميدات منفصلة: 50 ميكروغرام البابون HPR و 50 ميكروغرام من تفاضلي 6XHIS الموسومة البابون الجينات APOL-I. تم حقن الفئران مع سيارة المالحة سيطرة سلبية. للتأكد من نجاح HGD، ويظهر هذه التجربة مستويات البلازما تعميم من البروتين البابون HPR، والبابون APOL-I من الصعب اكتشافها. تم جمع عينات البلازما الماوس حللت 2 أيام آخر HGD والبروتين مستويات التعبير من قبل لطخة غربية (المخفف البلازما 1:20) على 10٪ من المواد الهلامية بولي أكريلاميد تريس، جليكاين تحت تغيير طبيعة وظروف غير الحد. تم الكشف عن HPR باستخدام الأجسام المضادة ضد الأرنب بولكلونل هابتوغلوبين الإنسان (HP)، الذي ريكو أيضاgnizes البابون HPR. الموسومة bAPOL-I تم الكشف باستخدام الأجسام المضادة ضد الأرنب بولكلونل علامة 6xHIS. الأوزان الجزيئية للسيطرة 6XHIS البروتينات شملت 40 و 50 كيلو دالتون. A.) يبين لوحة مثالا للتحليل لطخة غربية من البروتين يفرز (HPR) عندما تم حقن جميع الفئران في المجموعة بنجاح. لاحظ التعبير البروتين عالية بشكل موحد في ثاني مجموعته الموسومة (bAPOL-I 6XHIS المجموعة 2)، حيث كان حقن ناجحة للغاية. في المجموعة الأولى (bAPOL-I 6XHIS المجموعة 1)، بروتين تعبير من أحد الفئران هي بارزة لكنها خفضت إلى حد ما، على الأرجح بسبب انخفاض سرعة الحقن. يظهر B.) لوحة مثالا على مستويات بروتين تعبير عندما كان واحدا من حقن (في bAPOL-I 6XHIS المجموعة 3) ناجحة. يوضح جيم) لوحة على أهمية بما في ذلك البروتين التتبع (bHPR) لمراقبة نجاح HGD عندما كشف عن البروتين من الفائدة (bAPOL-I) غير مؤكد. على الرغم من النجاح مؤكدة HGD في bAPOL-I
الرقم 3. بقاء الفئران معربا عن البابون المتغيرات APOL-I 6XHIS والبابون HPR. العمر خمسة أسابيع، والإناث، بستر السويسرية الفئران تلقت 50 ميكروغرام من كل اثنين من البلازميدات منفصلة HGD في نفس حقن المزيج. الفئران المستخدمة في هذه التجربة تتوافق مع البلازما تحليلها في الشكل 2. في يوم 2 بعد الحقن، وأصيب الفئران مع 5000 للعدوى الطفيليات البشرية TBB-SRA وتم رصد الطفيل. عندما وصلت الطفيل 10 9 الطفيليات / مل، والموت الرحيم الفئران. وكان البقاء على قيد الحياة تختلف اختلافا كبيرا عن السيطرة المالحة حيث أشارت (* - P <0.05، دخولاختبار رتبة). الماوس بقاء على التحدي الطفيلي هو مثال عن كيفية نجاح HGD تؤثر البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب اللاحقة. عندما يتم حقن البابون APOL-I بنجاح، ويفرز المنتج الجيني في الدم الماوس حيث يتم تناوله من قبل ويقتل المثقبيات للعدوى الإنسان. ويبين المنحنى بقاء الفئران التي حقنت مع 6xHIS علامة الإصدار 3 من البابون APOL-I كانت محمية بشكل كبير ضد TBB-SRA. والوفاة المبكرة فقط في هذه المجموعة يتوافق مع الماوس التي لم يتم حقنها بنجاح مع البلازميد يحمل التحوير (انظر الشكل 2). ينبغي استبعاد هذا الفأر من تحليل البقاء على قيد الحياة كما بقائها على التحدي الطفيلي لا ينسب إلى الاختلافات من التحوير تلقت ولكن إلى فشل توصيل الجينات.
الرقم 5. إجراء تبديل حمض أميني واحد في APOL-I تسلسل النتائج في مستويات مختلفة من أمراض الأنسجة. يوضح الشكل أكباد الفئران التي تلقت الحقن SW الهيدروديناميكية السيارة المالحة (A)، 50 ميكروغرام الإنسان WT-I APOL (B)، أو 50 ميكروغرام من البديل متحولة الاصطناعية من APOL-I، K4 (C). أزيلت كبد في يوم 5 بعد الحقن والمجهزة للالهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ. وترد أمثلة ممثل من نفس الفئران يعاير لمستويات AST في الشكل 4. وحات (DF) تظهر أمثلة إضافية للمناطق التي تضررت في الفئران WT. بؤر نخر في لوحات (B)، (DF) يتم وضع علامة مع مستطيلات سوداء وتتضخم. السهام البيضاء في هذه اللوحات تشير إلى مناطق تسلل البلاعم. للمقارنةتتميز الأنسجة الطبيعية من منطقة ممثل الكبد من حقن المركبات المالحة الماوس عن طريق مستطيل أزرق فاتح ويتم تكبير أيضا. لوحات (B) و (D) هي صور ممثل من نفس WT الماوس، في حين وحات (E) و (F) هي من اثنين من الفئران WT مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عندما يقوم بشكل صحيح، HGD هو وسيلة آمنة وفعالة بشكل ملحوظ التسليم التحوير. الخطوات الحاسمة لنجاح HGD هي: 1) تسليم كمية مناسبة من الحمض النووي في كمية كبيرة من المركبات المالحة 2) في الوريد ذيل الفأر 3) في أقل من 8 ثوان.
على الرغم من أن عملية الحقن لا يمكن إنكاره في حد ذاته يتطلب بعض البراعة اليدوية، ونجاح هذا الإجراء ست الثانية في كثير من الأحيان يكمن في إعداد دقيق للتجربة. كمية PDNA اللازمة لتحقيق أقصى قدر من التعبير الجيني قد تختلف اختلافا كبيرا تبعا لالبلازميد المستخدمة والجينات أن أعرب لذلك، ينبغي تحديد المبلغ الأمثل من الحمض النووي ليتم حقنه تجريبيا لكل تطبيق. بالنسبة للفئران، ومجموعة الحمض النووي الموصى بها في العام هو 5-50 ميكروغرام، والتي تتجاوز التعبير الجيني قد تصل إلى الهضبة. في أيدينا، حقن 50 ميكروغرام pRG977 تحمل إما APOL-I أو HPR الجين يؤدي إلى مستويات عالية من circulatinز مستويات البروتين في اليومين الأول والثاني إضافة HGD. مستويات الدم من كل من البروتينات تقلل بشكل كبير خلال اليومين القادمين حتى مستويات البروتين تنخفض المستويات التي يمكن اكتشافها حول يوم 10 (38 وبيانات غير منشورة). وينبغي تسليم المبلغ الأمثل من الحمض النووي في حل ما يعادل الفسيولوجية ل8-12٪ من وزن الجسم من الماوس 1، 2. في حين أن معظم الباحثين، بما في ذلك لنا، واستخدام المياه المالحة باعتبارها وسيلة الحقن، وقد استخدم الحل رينغر لHGD مع نجاح مماثلة 2. ملاحظة، أنه في حين أنه ليس من الضروري لأداء HGD في بيئة معقمة، لا بد من تجنب التلوث الذيفان الداخلي من الحل حقن في جميع أنحاء الداخلي. تحقيقا لهذه الغاية، يجب أن يكون محلول ملحي تستخدم لحقن نقاء أعلى وينبغي إعداد الحمض النووي ليتم حقنه باستخدام عدة المتاحة تجاريا التي تزيل الذيفان الداخلي. خطوة تحضيرية هامة أخرى هي حذرا وزنها من الفئران. منذحجم الحقن هو أحد الجوانب الحاسمة لنجاح HGD، فمن المهم للتأكد من أن الماوس ليس تحت مداوي ولا الإفراط مداوي مع المياه المالحة. نتائج الخطأ السابق في ترنسفكأيشن الأمثل، في حين أن هذا الأخير في وفاة ممكن من الحيوان. لمزيد من ضمان سلامة الحيوانات، ونحن نوصي تحميل المحاقن مع إبرة صغيرة عيار لتجنب إدخال فقاعات الهواء الصغيرة التي يصعب التخلص منها. HGD يجب أن يتم تنفيذ مع 27 - إبرة مقياس كما هو موضح في البروتوكول.
يتم حقن الصحيح سهلت إلى حد كبير إذا الأوردة الذيلية واضحة للعيان. توسيع الأوعية الدموية عن طريق التسخين لطيف من الماوس قد تساعد تصور الأوردة إذا كان كابح مع الذيل إضاءة غير متوفر. وضع القفص الماوس على وسادة الحرارة لبضع دقائق أو عقد الذيل مع الحارة، عمل قطعة قماش مبللة جيدا في أيدينا. إذا باستخدام مصباح الحرارة، لا بد من توخي الحذر الشديد عدم ارتفاع درجة حرارة الفئران. نجد أن لناجي على مصباح الحرارة يسبب التوتر لا داعي لها الفئران وعدم الراحة، وبالتالي، ينبغي تجنبها. مسح الذيل مع 70٪ من الإيثانول الذي يعمل التصور من خلال زيادة التباين بين الوريد الذيل والجلد. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية أيضا لتجنب التلوث الجرثومي خلال الحقن. بعد الانتهاء من إعداد الماوس للحقن، ويمكن حقن الوريد الذيل باستخدام إما واحدة من ناحية المواقف الموصوفة في هذا البروتوكول. ملاحظة، أنه في حين أن موقف 2 يبدو أسهل وأكثر وضوحا، فإنه قد يكون أكثر صعوبة لحقن حجم كامل من السائل دون تحريك حقنة. في المقابل، وإنشاء موقف إبرة جيدة باستخدام الأسلوب الأول هو أكثر تعقيدا ومع ذلك، بمجرد عقد محور إبرة آمن ضد الذيل، نادرا ما يفشل الحقن. ويوصى الأسلوب الأول أيضا الحد الأقصى للسرعة، على الرغم من ترنسفكأيشن الناجح هو ممكن باستخدام إما موقف اليد.
سرعة الموصى بها من HGD حقن الفئران في 6-8 ثانية، على الرغم منوتشير العديد من الكتاب أن حقن أسرع تسفر عن نتائج أفضل حتى 1، 12. نتائج الحقن البطيء في تخفيض ملحوظ التعبير الجيني. ومع ذلك، فإن السبب الأكثر شيوعا لنقص كاملة في التعبير الجيني هو عدم تسليم حجم كامل من الحقن. يحدث هذا عندما يتم نقل إبرة، بعد أن بدأت الحقن. صحيح وضعه، ويدخل إبرة في الوريد مع عدم وجود المقاومة. للتأكد من أن يتم إدخال الإبرة في الوريد بشكل صحيح، يمكن للمرء أن حقن كمية صغيرة جدا (100 ميكرولتر) السائل في الوريد قبل الحقن الكامل. إذا الضغط على أسفل على المكبس يجتمع مع المقاومة المدقع، والإبرة في موقف خاطئ والسائل يدخل الأنسجة الذيل. إذا كانت إبرة يترك الوريد منتصف الحقن، تصحيح HGD فاشلة قد يكون حاول بعد سمح الماوس للراحة لبضع ساعات. إعادة حقن بعد عدم كفاية بقية يسبب الضيق للماوس، وربما يؤدي إلى فقدان pressur الهيدروديناميكيةه من خلال فتح الجرح الأول في ذيل الماوس. إذا تكرار الحقن ضرورية، ويمكن حقن الفأر مع حجم الكامل من المياه المالحة (وكمية من الحمض النووي) إما أقرب إلى قاعدة الذيل في نفس الوريد أو في الوريد المقابل. HGD التالية، ينبغي مراعاة الماوس في قفص وضعها على وسادة الحرارة لمدة ساعة واحدة على الأقل. يسبب HGD زيادة حادة في ضغط داخل الأوعية الدموية مما أدى إلى عدم انتظام حاد في وظيفة القلب، وتوسيع الكبد، واضطراب في المسام غشاء خلايا الكبد، والجيوب نافذي 12، 14، 43. على الرغم من مضاعفة حجم الدم في بضع ثوان، والفئران تحمل HGD بشكل ملحوظ. يعود معدل ضربات القلب إلى طبيعتها في 2 دقيقة والضغط داخل الأوعية الدموية، مما يقلل بسرعة بعد وقت قصير من الحقن، وتقترب مستويات القاعدية في 3 دقائق 12، 43. خلايا الكبد تعطلت ختم في أقل من 2 دقيقة ويعود حجم الكبد الموسعالى حجمه الطبيعي في 30 دقيقة تليها استعادة وظيفة جيباني؛ شبه جيبي في ما يقرب من 24 ساعة 43. بينما تستخدم العديد من الباحثين التخدير بنجاح، في أيدينا، والتخدير isofluorane تفاقم الضائقة التنفسية من الفئران بسبب HGD. نجد أن الفئران تخدير يستغرق وقتا أطول للتعافي وأحيانا تتطلب الإنعاش من أجل البقاء. إذا حقن مجموعة كبيرة من الفئران باستخدام التخدير، قد يكون من الضروري أن يكون شخص إضافي في غرفة مخصصة للإشراف على رفاهية الحيوانات تتعافى. بدون تخدير، وحتى بعد تكرار الحقن، البقاء على قيد الحياة هو الفأر 100٪ والانتعاش مرة أقل من 5 دقائق.
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لتقديم مجموعة واسعة من الجزيئات إلى الكبد الماوس. باستخدام بروتين يفرز APOL-I كمثال، أظهرنا كيف يمكن استخدام HGD لإنشاء نموذج الفأر ودراسة وظيفة البروتين واقية. عند المقارنة بين وظيفة الجين المنتجات المختلفة، وsucceينبغي تقييم SS من HGD كلما أمكن ذلك. للبروتينات يفرزها، فمن السهل لمراقبة مستويات التعبير من خلال تحليل البلازما باستخدام الماوس لطخة غربية (أرقام 2 و 4B). ومن المهم بصفة خاصة لضمان نجاح HGD عندما يعاير متغيرات طبيعية أو تركيبية من البروتين العلاجي، والكفاءة ترنسفكأيشن يمكن تؤثر بشدة نتيجة المرض (الشكلين 2 و 3). يتم إعطاء أمثلة لإظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن توسيعها لتحليل تلف الكبد الناجم عن APOLI، وهو بروتين لتشكيل المسام (أرقام 4 و 5). تسلسل المتغيرات من APOL-I في نفس البلازميد نتيجة الخلفية في لمحات الضرر مختلفة بشكل ملحوظ. هذا يشير إلى أن تلف الأنسجة ويرتبط مع وظيفة البروتين وليس ناقلات التعبير أو الصدمة من حقن نفسه. تجدر الإشارة إلى أنه في أيدينا، ومستويات AST مرتفعة عالميا في يوم 1 بعد الحقن (لا تظهر البيانات). في يوم 2، ومع ذلك، ومستويات AST من الفئران فيjected بمحلول ملحي العودة إلى وضعها الطبيعي والخلافات بين المتغيرات الجينات يمكن تمييز بسهولة (الشكل 4). بعد يوم 3 بعد الحقن، AST قياس في جميع العلاجات العودة إلى المستوى القاعدي بهم (لا تظهر البيانات). منذ الأنسجة نخرية والتهاب في الكبد واضحة أطول من زيادة عابرة في AST، تلف الكبد بسبب التعبير الجيني المستمر يمكن تقييم أكثر موثوقية، وإن كان نوعيا، من خلال تلطيخ للكبد جمعها في يوم 5 بعد الحقن. الأمثلة الواردة تبين أن المتغيرات من APOL-I التي تسبب زيادة إطلاق AST 2 أيام بعد الحقن يؤدي أيضا إلى تلف الكبد أكثر استدامة وفقا لتقييم تلطيخ مع هيماتوكسيلين ويوزين.
توصيل الجينات الهيدروديناميكية يسمح للتحليل السريع للالتعبير الجيني في الجسم الحي. فإنه يتطلب بناء بسيط من الجين قيد الدراسة في ناقلات التعبير حقيقية النواة والقدرة على تنفيذ الحقن على النحو المبين أعلاه. جيل من transgeالفئران شركة الاستثمارات الوطنية باستخدام أشكال أخرى من إيصال الجينات، مثل ناقلات lentiviral المؤتلف المستمدة من HIV-1 أو المؤتلف الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية، تتطلب خبرة أكثر تخصصا من ذلك بكثير. ومع ذلك، ميزتها هو مستمر التعبير الجيني، على الرغم من أن التعبير الجيني الفيروسي غالبا ما يسبب استجابة التهابية بسبب المضيف الاستشعار عن عدوى فيروسية والاستجابة 15-19. وعلاوة على ذلك، فإن النواقل الفيروسية لديهم قدرة محدودة التعبئة والتغليف، وبالتالي، محدودة في حجم الجينات، في حين تسلسل كروموسوم البكتيريا الصناعي من 150KB وقد استخدمت بنجاح في HGD 4. بعد اتقان هذه التقنية، يمكن للمستخدم بالنقل أي الحمض النووي ([كدنا] أو gDNA أو RNA) في الجسم الحي واتبع إنتاج البروتين والعواقب البيولوجية. البروتين يمكن أن يكون داخل الخلايا، غشاء ملزمة أو خارج الخلية؛ يمكن الموسومة أو تعديل في الحامض النووي ومستوى حمض بالتالي الأمينية. الأهم من ذلك، وهذا هو أسلوب سريع جدا ومباشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر ليو شيا (Regeneron صيدلة) ليعلمنا هذا الأسلوب في البداية HGD والدكتور راسيل طومسون (كلية ألبرت اينشتاين للطب) للتوجيه المستمر له في مختلف جوانب التكنولوجيا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كلية هانتر، جامعة مدينة نيويورك بدء الأموال والجائزة NSF الخبز IOS-1249166. نشكر NYULMC التشريح المرضي مركز كور NYUCI دعم غرانت، المعاهد الوطنية للصحة / NCI 5 P30CA16087-31 لالأنسجة في كبد الفأر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al.
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D.
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D.
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
