Summary
In vivo transfektion af nøgent DNA ved hydrodynamisk genlevering indføres gener i væv i et dyr med minimal inflammatorisk reaktion. Genereres tilstrækkelige mængder af gen-produkt, således at gen-funktion og regulering samt proteiners struktur og funktion kan analyseres.
Abstract
Effektiv ekspression af transgener in vivo er af afgørende betydning i at studere genfunktioner og udvikle behandlinger for sygdomme. Gennem de seneste år har hydrodynamisk gen levering (HGD) dukket op som en enkel, hurtig, sikker og effektiv metode til at levere transgener i gnavere. Denne teknik er baseret på den kraft, der genereres af hurtig injektion af et stort volumen af fysiologisk opløsning for at forøge permeabiliteten af cellemembraner i perfunderede organer, og levere DNA i celler. En af de vigtigste fordele ved HGD er evnen til at indføre transgener i mammale celler ved anvendelse af nøgent plasmid-DNA (pDNA). Indførelse af et eksogent gen ved hjælp af en plasmid er minimalt besværlig, højeffektive og i modsætning til virale bærere bemærkelsesværdigt sikker. HGD blev oprindeligt anvendt til at levere gener ind i mus, er det nu anvendes til at levere en lang række stoffer, herunder oligonukleotider, kunstige kromosomer, RNA, proteiner og små molekyler til mus, rotterog i et begrænset omfang, andre dyr. Denne protokol beskriver HGD i mus og fokuserer på tre centrale aspekter af den metode, der er afgørende for at udføre proceduren med succes: korrekt isætning af nålen i venen, mængden af indsprøjtning og hastigheden af leverancen. Eksempler er givet for at vise anvendelsen af denne fremgangsmåde til transient ekspression af to gener, der koder secernerede, primat-specifikke proteiner, apolipoprotein LI (APOL-I) og haptoglobin-beslægtet protein (HPR).
Introduction
Siden sin første beskrivelse af Liu et al. Og Zhang et al. Har hydrodynamisk gen levering (HGD) blevet et uvurderligt værktøj til at studere genfunktion i gnaver modelsystemer 1, 2. Teknikken involverer hurtig injektion (5-7 sek), i en stor mængde (8-12% af kropsvægten) opløsning i halevenen af mus for at fremme anvendelsen af plasmid-DNA af cellerne i målorganer 1, 2. Disse betingelser fører til robust genekspression i leveren og mindre genekspression i nyrer, milt, lunge og hjerte.
Injektion af 10 ug pCMV-LacZ plasmid kan transficere så meget som 40% af hepatocytter, hvilket HGD de mest effektive, non-viral, in vivo-genafgivelse metode til dato 1. I modsætning til virale bærere, er pDNA nemt at forberede, ikke fremkalde et immunrespons hos gnavere vært 3 og ikke udgør en sundhedsmæssig risiko ved rekombinerer med udgangeneksogen vira. Hertil kommer, da DNA-molekyler, der leveres af HGD ikke behøver emballage, denne metode er egnet til levering af bakterielle kunstige kromosomer (AKB) så store som 150 kb 4. Andre typer af molekyler, der er blevet leveret af en hydrodynamisk metode omfatter RNA 5-10, morpholinos 11, proteiner 12, 13 og andre små molekyler 12, 14. De fordele og ulemper ved HGD end andre formidlingsmetoder er blevet drøftet i fremragende anmeldelser i litteraturen 15-20 og en række forfattere har givet en detaljeret beskrivelse af proceduren 21-23.
Introduktion transgener i mus ved HGD er sikker og effektiv 1-3, 24 og metoden har været anvendt i rotter med tilsvarende succes 25. Med visse ændringer, har proof-of-concept forsøg udført i kyllinger 26, Rabbit 27 og svin 28, selv om in vivo-anvendelsen af denne teknik i større dyr fortsat en udfordring. Når denne metode anvendes, en anden almindelig begrænsning er, at mange af de tilgængelige mammale ekspressionsvektorer mangler komponenter for at opnå en vedvarende højt niveau af genekspression. Ved hjælp af en pCMV-Luc plasmid, genekspression i målorganer er tydelig så tidligt som ti minutter efter HGD dog den første, højekspressions niveau falder kraftigt i den første uge efter injektion 1. Langsigtet transgenekspression er muligt, afhængigt af promotoren og intron anvendes i plasmid design 3, 24 dog, vedligeholdelse af højt niveau genekspression ofte kræver gentagne injektioner. Af denne grund, kan HGD være mindre egnet til at studere kroniske sygdomme, der er et resultat af langvarig udsættelse for skadelige proteiner eller protein produkter. Med disse begrænsninger, HGD er en usædvanlig kraftfuldt værktøj til at studere potielle rolle af et gen og virkningen af det mutanter in vivo, samt terapeutiske virkninger og regulering af proteiner og til etablering af dyremodeller for sygdommen (for gennemgang, se 15). For eksempel kan HGD bruges til at tildele funktion domæner og aminosyrer i proteiner ved individuelt at indføre forskellige genkonstruktioner i mus, der har de respektive gener slået ud. Desuden kan denne teknik anvendes i ethvert musestamme.
Denne protokol beskriver HGD i mus med fokus på de tekniske aspekter, der er nødvendige for at opnå en vellykket transfektion: korrekt nål indsættelse i vene, injektionsvolumen og hurtig levering på. Anvendelsen af denne metode er demonstreret i en musemodel af afrikansk trypanosomiasis, en dødelig sygdom for mennesker og husdyr 29, 30. Mens flere arter af trypanosomer forårsage sygdom hos husdyr, kan de fleste ikke forårsage sygdom hos mennesker på grund af medfødte immunforsvar komplekser ibLood kaldet trypanosominfektion lytiske faktorer (TLFs) 29, 31, 32. Disse pore-dannende, high-density lipoprotein (HDL) indeholder to unikke, primat-specifikke proteiner:. HPR, den ligand, hvilket letter optagelsen af TLFs ind trypanosomer og APOL-I, den lytiske komponent 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense er i stand til at inficere mennesker på grund udtryk for en serum modstand-associeret protein (SRA), som binder til og neutraliserer human APOL-I 34, 39. Baboon TLF ikke neutraliseret af SRA grund af sin divergerende APOL-I-protein 40. Som rapporteret tidligere, ved hjælp af en mammal ekspressionsvektor (pRG977), transgen ekspression af bavian TLF komponenter i mus giver beskyttelse mod humane infektionssygdomme trypanosomer 40. De repræsentative data, der præsenteres her viser, hvordan hydrodynamisk genafgivelse kan anvendes til at undersøge de terapeutiske virkninger af et protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter er beskrevet her blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Hunter College, City University of New York.
1. Fremstilling af endotoksin-frit plasmid-DNA
- Pick en enkelt koloni af bakterier indeholdende genet af interesse i en mammal ekspressionsvektor fra en frisk udstrøget selektiv plade.
- Følg anbefalingerne i håndbogen af en kommercielt tilgængelig endotoksinfri plasmidoprensningsproces kit til dyrkning og høst bakterier.
- Renses endotoksinfri plasmid-DNA fra bakterieceller ved at følge protokollen af en kommercielt tilgængelig endotoksin-frit plasmid oprensningskit.
- Brug endotoksinfri plast ware og håndtere DNA med omhu for at sikre, at endotoksin ikke genindført i DNA-prøven efter trin fjernelse.
- Måle koncentrationen af endotoksin-frit plasmid-DNA ved at bestemme dets absorbans ved 260 nm ved anvendelse af en MICRo-volumen UV-spektrofotometer, som beskrevet nedenfor, eller en standard, kuvette-baseret spektrofotometer.
- Rens den nedre og øvre optiske overflader mikroorganismens spektrofotometer prøve retentionssystem som følger. Afpipetteres 1 ul rent deioniseret vand på den nederste optiske system. Luk håndtaget arm og trykke på det et par gange for at bade den øverste optiske system, så åbne håndtaget og tør med en serviet.
- Åbn softwaren af mikro spektrofotometer og vælg nukleinsyrer modulet.
- Placer 1 ml rent demineraliseret vand på den nederste optiske system, sænke håndtaget arm og vælg "initialisere" fra programmet software. Når initialiseringen er færdig, rene både optiske overflader med en væv ..
- Udfør blank måling ved at indlæse en pi endotoksin-fri TE-buffer (10 mM Tris-CI, pH 8,0, 1 mM EDTA) og vælge "blank" fra programmet software. Når blank måling er færdig, rene både optiske overflader med envæv.
- Udfør måling prøve ved at indlæse 1 ml af endotoksinfri DNA-prøve og vælge "foranstaltning" fra programmet software. Optag DNA-koncentrationen. Vurdere DNA renhed ved at registrere Absorbansforholdet 260/280 nm, der vises på skærmen. Eftersom anvendelse af rent DNA (260/280 ratio på 1,8) for HGD er meget ønskeligt at undgå at bruge en DNA-prøve med en 260/280 ratio under 1.7. Når målingen er færdig, skal du rengøre både optiske overflader med en serviet.
2.. Vejning af mus
- Mark mus på en passende måde for stamme. Bemærk: mærkning af halen anbefales ikke til denne procedure.
- Mark mus arter, der har hvid pels (fx Swiss Webster) på ryggen med en sort markør. Genanvende mærker over tid som nødvendigt.
- Arter Mark mus, der har sort pels (f.eks C57BL / 6) efter gehør stansning flere dage i forvejen.
- Mus individua afvejeslly ved forsigtigt at placere dem i et dyr, der vejer gryde eller spand placeret på en digital laboratorium balance. Noterer vægten af hver mus anvendt i forsøget, på dagen for eksperimentet.
3.. Fremstilling af sprøjter
- Forberedelse af injektionen mix
- Mængden af DNA behov ved at antage i 5 - 50 ug endotoksin-frit plasmid-DNA til injektion af hver mus.
- Bestem den optimale mængde af plasmid-DNA eksperimentelt.
- Ved fastsættelsen af DNA, der kræves, overtage injektion af en ekstra mus per gruppe, som korrekt belastning af sprøjterne vil kræve nogle ekstra indsprøjtning mix. For at hjælpe beregninger, overveje følgende eksempel: injicere 4 eksperimentelle og 4. kontrol mus, der hver vejer 25 g, med 50 ug plasmid DNA pr mus. For at bestemme mængden af DNA nødvendig i dette tilfælde, beregne med 5 mus per gruppe: 5 x 50 pg = 250 ug DNA nødvendig for hver gruppe.
- Bestem mængden af saltvand (0,9% natriumchlorid) behov ved at antage 10% af kropsvægten til injektion af hver mus.
- Ifølge det ovennævnte eksempel, injiceres hver 25 g mus med 50 ug plasmid-DNA i 2,5 ml saltvand (2,5 g opløsning).
- Ved fastsættelsen af saltvand kræves for en hel gruppe af mus, overtage injektion af en ekstra mus per gruppe til at give mulighed for korrekt læsning af sprøjter. I betragtning af eksperimentet givet, beregnes mængden af saltvand er nødvendig for 5 mus i hver gruppe: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml saltvand i hver gruppe (eller 25 ml i alt). Bemærk: Hvis mus inden for samme koncern, er ikke den samme vægt (mere end 10% forskel i kropsvægt), forberede injektionen blander separat.
- Brug konserveringsmiddel og endotoxin-fri, sterilt saltvand, der er blevet godkendt til humant brug, i 10 ml, flere hætteglas.
- Anvendelse af en 20-gauge nål (0,9 mm x 25 mm) er fastgjort til en luer-lock spidsen af en 20 ml sprøjte,trække væsken fra saltholdige hætteglas og tømme sprøjter ind i en 50 ml konisk rør. For at hjælpe nøjagtig pipettering af saltvand under forberedelsen af de DNA-saltvand injektion mix, indsamle mere saltvand end nødvendigt til injektion af alle mus i eksperimentet. For ovenstående eksperiment trække saltvand fra 3, 10 ml hætteglas (i alt cirka 30 ml), selv om den beregnede mængde af saltvand nødvendig for eksperimentet er kun 25 ml.
- Pipette beregnede mængde af DNA i en anden 50 ml konisk rør. Pas på ikke at røre ved siden af røret med pipetten organ for at undgå indførelse af endotoksin. Ifølge eksempel pipette 250 ug af kontrol og 250 ug af eksperimentel plasmid-DNA i separate koniske rør.
- Tilføj den nødvendige mængde saltvand til DNA ved anvendelse af en serologisk pipette. I betragtning af den prøve eksperimentet, pipette 12,5 ml saltvand til hver af masterblandingerne (eksperimentel og kontrol).
- Lad alle løsninger til at nåstuetemperatur før injektion.
- Mængden af DNA behov ved at antage i 5 - 50 ug endotoksin-frit plasmid-DNA til injektion af hver mus.
- Fremstilling af sprøjter
- For hver mus, fylde en steril, 3 ml, sprøjte luer-lock med DNA-saltvand mix ved hjælp af en steril, 20-gauge kanyle (0,9 mm x 25 mm). Sørg for at undgå luftbobler. Undgå anvendelse af højere volumen sprøjter som strømningshastigheden af injektion ikke kan styres meget godt, og det er vanskeligt at manipulere store sprøjter i den ene hånd. Skub overskydende DNA-saltvand blanding tilbage i den koniske rør, da dette kan være genbruges.
- Skift nålen til en steril, 27-gauge nål. Kanylen fyldes med væske helt uden at indføre luftbobler. Juster lydstyrken af DNA-saltvand mix som beregnes på grundlag af vægten af musen.
- Lad ikke-reducerede kanylen røre ved nogen ikke-steril overflade. Hvis det er nødvendigt, kanyler kan gen-udjævnede ved hjælp af én-hånds teknik: placere hætten på et fladt underlag, indfør kanylen, uden at holde cap med den anden hånd og pres udjævnede nålmod en fast genstand at sikre hætten på nålen. Sprøjterne er nu klar til hale-vene injektioner.
4.. Hydrodynamisk DNA levering
- Bemærk at bedøve mus kan reducere levedygtighed. Undgå at udføre HGD i et rum, der er for koldt, da dette også vil reducere levedygtighed. Hvis rummet har en omgivende temperatur på 20 ° C, eller hvis du bruger anæstesi, placer mus på en varmepude ved 37 ° C efter procedure for at undgå tab af dyr. Hvis du bruger anæstesi, sikre, at mund og snude af musen er uhindret mens de er på varmepude og observere musen, indtil den er kommet sig fuldstændigt. Må ikke tilbageholde mad eller vand fra musene før HGD.
- Varm mus for at udvide blodkarrene.
- Placer musebur (med strøelse inkluderet) på en varmepude i 5 minutter, således at temperaturen af strøelse er omtrent 38-39 ° C. Temperaturen bør være lav nok til at holde musene på varmepude enforlænget periode.
- Alternativt, skal du placere musen i en dorsal adgang restrainer med minimal tilbageholdenhed. Varm halen af musen til 1 min ved forsigtigt at holde det med et stykke gaze vædet i varmt vand. Tillad musen til at re-position, hvis det er nødvendigt. Tør halen med en serviet for at tørre.
- Alternativt varm mus ved at anbringe bur under en varmelampe for ikke mere end 2 min. Hvis du bruger en varmelampe, udvise forsigtighed for at undgå overophedning af musen.
- Stor-volumen haleveneinjektion
- Immobilisere en dorsal adgang fastholdelsesanlæg på en flad overflade ved laboratorie tape.
- Holding i halen ved at placere musens forsigtigt ind i restrainer og sæt stikket. Brug så lidt tilbageholdenhed, som nødvendigt for at holde halen immobiliseret. Sørg for, at musen trækker vejret frit.
- Hvis musen er i alvorlig nød på noget tidspunkt under proceduren, fjerne musen fra restrainer straks og lad den hvile.
- Anbring musen såen af de laterale caudale vener er synlig. Find de laterale caudale vener ved at kigge lige ned på bagsiden af musen: den røde linje i midten af halen er en arterie, medens de blå linjer på hver side af halen er de laterale caudale vener.
- Tør halen af musen grundigt med en spritserviet.
- Brug af ikke-indsprøjtning hånd, holde halen fast mellem pege-og langfinger, så halen passerer under pegefingeren over langfinger og ringfinger og under lillefingeren. Lad tommelfingeren frit kunne bevæge sig. (Figur 1A)
- Brug den anden side, skal du tørre det område, der skal injiceres igen med en spritserviet. Lad området tørre.
- Afhente læsset sprøjte med injektion hånd og hold det tønden mellem tommelfinger og de andre fire cifre. Må ikke holde på stemplet.
- Placer sprøjten parallelt med halen med nålen pegende mod kroppen på musen ogfacet (skrå kant) af nålen opad.
- Stik nålen ind halevenen. Fortsæt med injektion, hvis venen er placeret korrekt, hvilket er tydeligt fra nålen glider i uden modstand. Bemærk, at dybden af nål indsættelse er et spørgsmål om personlig præference dog fuld indsættelse ikke anbefales på grund af en øget risiko for klipning af venen. Undgå at flytte nålen.
- Brug tommelfingeren på halen-bedrift hånd, lukke på navet af nålen, og tryk hub mod halen til at holde nålen på plads. Ikke for hårdt pres og ikke holde på nåleskaft, da disse vil hindre strømning af væske ind i venen. Hold halen med pegefingeren løst på dette tidspunkt, så de ikke hindrer injektion (figur 1A).
- Re-placere sprøjten-bedrift hånd, så pegefingeren og langfinger holder på flangen og tommelfinger er på enden af stemplet (Figure 1A).
- Tryk ned på stemplet i én kontinuerlig bevægelse og injicere den fulde mængde af væske i 6-8 sek.
- Fjern kanylen fra venen og stoppe blødningen ved at tilføre et let pres på halen med en serviet.
- Fjern musen fra harpiksstopperen og sted mus i et opsving bur anbragt oven på en varmepude (strøelse skal være 37-38 ° C). Hvis injektionen er koldt i rummet, er dette trin er afgørende for muse overlevelse. Hold fast i halen af musen, indtil blødningen stopper helt.
- Overhold musen i 1 time efter hydrodynamisk DNA levering. En indledende periode med stønnende og immobilitet er normalt på grund af den midlertidige arytmi forårsaget af HGD men sørg for, at musen viser tegn på bedring i ca 5 min. Hvis vejrtrækningen på musen bliver overordentlig overfladisk, blidt massere maven af musen for at lette vejrtrækningen. Bemærk, at satsen for helbredelsen kan blive lidt påvirket af muse-stamme.
- Return mustil boliger bur og sikre, at mus har en rigelig forsyning af mad og vand.
- Stort volumen haleveneinjektion hjælp af en alternativ håndstilling
- Placer musen i restrainer og forberede til injektion ved at følge trin 4.3.1 gennem 4.3.5, som tidligere beskrevet.
- Hvil ikke-indsprøjtning hånd på en flad overflade med fire fingre bøjet i en halvfems graders vinkel. Fingrene (alle undtagen tommelfinger) skal hvile oven på hinanden, hvilket skaber en platform. Hold halen af musen mellem tommel-og pege-finger (figur 1B).
- Brug den anden side, skal du tørre det område, der skal injiceres igen med en spritserviet. Lad området tørre.
- Grib sprøjte med injektion hånd og hold det flangen og enden af stemplet, klar til injektion.
- Fuldføre proceduren ved at følge denne protokol fra trin 4.3.9 gennem trin 4.3.17, som tidligere beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt placering af nålen i halevenen af mus (som illustreret i figur 1) er en forudsætning for en vellykket levering af et transgen af hydrodynamik baseret transfektion. Ofte den mest udfordrende del af teknikken er imidlertid fastholdelse af nålen i halevenen uden bevægelse, således at hele mængden af injektionen kan leveres inden for 6-8 s periode. Mindre fejl under injektion kan resultere i stærkt reduceret transfektionseffektivitet og proteinekspression. Derfor er det bydende nødvendigt at overvåge succes HGD for hvert forsøg. Hvis det transgene protein af interesse er vanskeligt at påvise ved western blot på grund af manglen af følsomme antistoffer, som i tilfælde af bavian APOL-I, injektion effektivitet kan overvåges ved co-injektion af et plasmid, der bærer et gen for et protein, er let kan påvises. I eksperimentet vist i figur 2, blev musene injiceret med 50ug af et plasmid, der bærer en af tre forskelligt 6XHIS tagged bavian APOL-I gener og 50 ug af en anden plasmid (samme ekspressionsvektor design), der var lastet med bavian HPR (bHPR, ukodet). Det primære mål med dette forsøg var at vurdere, hvorvidt tilføjelsen af en 6XHIS-tag ved de valgte sekvens steder interfererer med korrekt behandling og sekretion af bavian APOL-I-protein. Hvis imidlertid tilsætningen af etiketten forstyrrer den korrekte foldning og dermed udskillelse af proteinet, bliver det vanskeligt at afgøre, om tab af protein ekspression opstået på grund af forringet forarbejdning eller mislykket HGD. Desuden, på grund af mangel på tilstrækkeligt følsomme antistoffer er vanskeligt direkte påvisning af bavian APOL-I i transficerede museplasma selv i tilfælde af en vellykket genafgivelse (som bestemt ved beskyttelsen af mus mod en human-infektiøs trypanosominfektion udfordring). I dette eksperiment blev disse emnerved tilsætning af en ækvivalent mængde af bavian HPR plasmid til APOL-I HGD blandingen for at tjene som et surrogat injektion kontrol. Som vist i figuren, blev bavian HPR stærkt udtrykt i plasmaet hos næsten alle de transficerede mus, hvilket indikerer, at HGD var vellykket. Mindre fald i ekspressionsniveauer, som det ses i et af de to mus i bAPOL-I 6XHIS gruppe 1 figur 2A er generelt tilskrives en meget lille reduktion (1-2 r) i injektion hastighed. I figur 2B første plasmaprøve bane 1 (bAPOL-I 6XHIS gruppe 3) viser en fuldstændig mangel på protein-ekspression indikerer et mislykket HGD. I de fleste tilfælde er det på grund af ufuldstændig injektion af den fulde volumen af varevogn. Da dette eksperiment bekræfter succesen HGD i alle tilfælde, men en, virkningen af 6XHIS tagging på bAPOL-I sekretion kan nu vurderes af en anti-6XHIS immunoblot (figur 2C og D). Som det sesi figur 2D, er den eneste gruppe af mus, der havde påviselige niveauer af 6xHIS-mærket protein i deres plasma gruppe 3. Proteinet ekspressionsmønster i denne gruppe bekræftede, at indsprøjtning af én af musene i denne gruppe var mislykkedes. Den fuldstændige mangel på påviselige 6xHis proteiner i gruppe 1 og 2 (figur 2C) understreger vigtigheden af at inddrage et sporstof protein i injektion mix til at overvåge succes HGD. Uden at overveje plasmaniveauerne af bHPR (figur 2A og B), kan data fra figur 2C og D let blive misforstået som et svigt af HGD i gruppe 1 og 2..
Vellykket HGD af bavian TLF1 komponenter bAPOL-I og bHPR giver mus modstand mod menneske-infektiøse trypanosoma brucei brucei-SRA parasitter (TBB-SRA, et laboratorium svarer til T. b.. Rhodesiense) 40.. Denne modstand er på grund af den transgene ekspression af bAPOL-I </ Em>, som injektion af bHPR alene giver ingen beskyttelse mod menneske-infektiøse parasitter. At vurdere, om 6XHIS-mærkede varianter af bAPOL-Jeg er stadig i stand til at fungere som lytiske proteiner blev mus, der modtog både bAPOL-I og bHPR af HGD udfordret med 5000 TBB-SRA parasitter to dage efter gen-levering. Som det ses i figur 3, mus i 6XHIS gruppe 2 bukkede under for infektion meget tidligt, mens de fleste mus i gruppe 1 og 3 overlevede så længe umærkede bAPOL-I positiv kontrol. (Baboon APOL-I giver delvis beskyttelse i denne mus stamme.) Da transgen ekspression i gruppe 2 var universelt høj, kan den manglende beskyttelse i disse mus tolkes korrekt som tab af bAPOL-I lytiske funktion på grund af den 6XHIS tag på det position. Pleje skal dog taget, at den for tidlige (dag 7) død af en mus i gruppe 3 ikke misfortolkes, da denne mus ikke lykkedes injiceret med transgenerne (se figure 2B, bane 1). På baggrund af kombinerede data fra figur 2 og 3, konkluderer vi, at bAPOL-I kan mærkes i position 3 (6xHIS gruppe 3) uden negative virkninger, mens kodning af dette protein i position 2 (6xHIS gruppe 2) forstyrrer dens lytiske funktion. I 6xHIS gruppe 1, mens data tyder på beskyttelse antallet af mus var utilstrækkelig til at opnå signifikante data. Power analyser skal udføres for at bestemme antallet af mus, der kræves for hvert forsøg. Selv den tilsyneladende mangel på detekterbar protein i mus plasma fra gruppe 1 kan virke selvmodsigende beskyttelse, der ses i figur 3, bemærkes, at en negativ anti 6xHIS western blot i denne gruppe kan være et resultat af en manglende detektering grund protein forarbejdning frem end en mangel på genekspression. I gruppe 1 blev 6xHIS tag tilføjet tæt efter spaltningsstedet af det forudsagte signalpeptid. Bavian APOL-I-aminosyresekvensen indeholder en yderligere predicted proteolytisk spaltningssted cirka 20 aminosyrer fra kløvningssted signalpeptidet 40. Derfor er det klart, at bAPOL-I i disse mus udskilles og funktionelt mistet 6xHIS tag nødvendige for dets detektion. Således illustrerer betydningen af HIS tag placering.
APOL-I dræber afrikanske trypanosomer af poredannelse i parasit lysosom membran 36, 37. Naturlige varianter af humant APOL-I, der findes i mennesker med nyere afrikansk afstamning, har været stærkt forbundet med nyresygdom i afroamerikanere, selv om den mekanisme for nyreskader er endnu uklart 41, 42. Da HGD resulterer i højeste genekspression i leveren, ønskede vi at undersøge, om human APOL-I eller dens syntetisk sekvens variant forårsager skade i dette organ. Til dette formål blev mus injiceret med 50 ug WT human APOL-I eller en enkelt aminosyre syntetisk mutant udpeget ets K4.To vurdere leverskader, målte vi aspartattransaminase (AST) niveauer i museplasma opsamlet på dag 2 efter injektion. I overensstemmelse med sin lytiske funktion, WT human APOL-I forårsager en forøgelse af serum AST niveauer (figur 4A) sammenlignet med saltvandsinjicerede mus. I modsætning hertil injektion af mutant K4, der adskiller sig kun en aminosyre, forårsagede meget lidt AST frigivelse. Forskelle i leverskader er usandsynligt, at kunne tilskrives niveauer af protein udtryk, som K4 protein niveauer er tilsvarende eller højere end WT human APOL-I (figur 4B). Undersøgelse af lever fra HGD mus indsamlet 5 dage efter injektion viser, at menneskers WT APOL-I forårsager begrænset vævsnekrose med moderat makrofaginfiltration (figur 5B) sammenlignet med saltvandsinjicerede mus, der udviser normal lever histologi (figur 5A, violette områder) . Bekræftelse af data opnået ved at måle plasma ASAT niveauer, K4 injiceret i samme plasmid backgrunde som WT viser normal leverhistologien (figur 5C).
Figur 1.. Illustration af håndstillinger for HGD. A.) Position 1. Anbefalet håndstilling for at opnå maksimal indsprøjtning hastighed og for at undgå nål bevægelse efter injektionen er påbegyndt. Pilen angiver den foreslåede bevægelse af tommelfingeren efter indføring af kanylen i venen. Tommelfingeren skal immobilisere nålen ved forsigtigt at holde navet mod halen af musen. Den hånd, der holder sprøjten skal flyttes for at kunne trykke ned på stemplet før injektion. . Anbefales Denne position B) Position 2, hvis haleveneinjektion skal udføres tættere på haleroden på grund af gentagne injektioner. Når nålen er indsat i en vene, denne håndstilling behøver ingen pelsther justeringer.
Figur 2 Western blot-analyse af plasma indsamlet fra fem uger gamle, female Swiss Webster (SW) mus injiceret med en blanding af to separate plasmider:. 50 ug bavian HPR og 50 ug differentielt 6XHIS mærkede bavian APOL-I gener. Mus blev injiceret med saltvand køretøj som negativ kontrol. For at bekræfte succes HGD viser dette forsøg, de cirkulerende plasmaniveauer af bavian HPR protein som bavian APOL-I er vanskelig at opdage. Mus plasmaprøver blev indsamlet 2 dage efter HGD og protein-ekspressionsniveauer blev analyseret ved western blot (plasma fortyndet 1:20) på 10% Tris-Glycin-polyacrylamidgeler under denaturerende, ikke-reducerende betingelser. HPR blev detekteret ved anvendelse af et kanin polyklonalt antistof mod human haptoglobin (HP), der også recognizes bavian HPR. Tagged bAPOL-I blev påvist under anvendelse af et kanin-polyklonalt antistof mod et 6xHIS tag. Molekylvægte af kontrollen 6xhis proteiner inkluderet er 40 og 50 kDa. A.) Panelet viser et eksempel på Western blot-analyse af et udskilt protein (HPR), når alle mus i en gruppe blev injiceret med succes. Bemærk den ensartet høj protein udtryk i den anden HIS-tagged gruppe (bAPOL-I 6XHIS gruppe 2), hvor injektion var meget vellykket. I den første gruppe (bAPOL-I 6XHIS Gruppe 1), protein ekspression fra en af musene er fremtrædende, men noget reduceret, sandsynligvis på grund af reduceret hastighed af injektionen. B.) Panel viser et eksempel på protein udtryk niveauer, når en af injektioner (i bAPOL-I 6XHIS gruppe 3) var forgæves. C) Panelet viser betydningen af at medtage et sporstof protein (bHPR) at overvåge succes HGD når påvisning af proteinet af interesse (bAPOL-I) er usikker. Trods den bekræftede succesen HGD i bAPOL-I
Figur 3.. Overlevelse af mus udtrykker bavian APOL-I 6xhis varianter og bavian HPR. Fem uger gamle, female Swiss Webster mus modtog 50 ug af hver af to separate plasmider ved HGD i samme injektion mix. Mus anvendt i dette eksperiment svarer til plasmaet analyseres i fig. 2. På dag 2 post-injektion blev musene inficeret med 5000 humane infektionssygdomme TBB-SRA parasitter og parasitæmi blev overvåget. Når parasitemia nåede 10 9 parasitter / ml blev mus aflivet. Overlevelse var signifikant forskellig fra saltvand kontrol hvor det er angivet (* - P <0,05, log-rank test). Mus overlevelse på parasit udfordring er et eksempel på, hvordan succes HGD påvirker data fra de efterfølgende eksperimenter. Når bavian APOL-I injiceres korrekt, skyldes genproduktet udskilles i museblod, hvor det er taget op af og dræber menneske-infektiøse trypanosomer. Overlevelsen kurven viser, at mus injiceret med 6xHIS tag version 3 af bavian APOL-Jeg var signifikant beskyttet mod TBB-SRA. Den eneste for tidlig død i denne gruppe svarer til mus, der ikke var lykkedes injiceret med plasmid, der bærer transgenet (se figur 2). Denne mus bør udelukkes fra analysen overlevelse som dens overlevelse på parasit udfordring ikke kan tilskrives forskelle i transgenet modtaget, men at den manglende gen-levering.
Fig. 5. En enkelt aminosyresubstitution i APOL-I-sekvens resulterer i forskellige niveauer af vævs patologi. Figuren viser lever fra SW mus, der modtog hydrodynamiske injektioner af saltvand køretøjet (A), 50 ug humant WT APOL-I (B) eller 50 ug af et syntetisk mutant variant af APOL-I, K4 (C). Levere blev fjernet på dag 5 efter injektion og forarbejdet til hematoxylin og eosin-farvning. Repræsentative eksempler er vist i den samme mus analyseret for AST niveauer i Figur 4.. Panels (DF) viser yderligere eksempler på beskadigede områder i WT mus. Nekrose foci i paneler (B), er (DF) er markeret med sorte rektangler og er udvidet. Hvide pile i disse paneler peger på områder af makrofaginfiltration. Til sammenligningNormale væv fra et repræsentativt område af leveren en saltvandsbærer injicerede mus er markeret med en lyseblå rektangel og er også udvidet. Paneler (B) og (D) er repræsentative billeder fra samme WT mus, mens paneler (E) og (F) er fra to forskellige WT mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når de udføres korrekt, HGD er et bemærkelsesværdigt sikker og effektiv middel til transgen levering. De kritiske trin til vellykket HGD er: 1) at levere den rigtige mængde af DNA i et stort volumen saltvand køretøjet 2) i halevenen på musen 3) på mindre end 8 sekunder.
Selv om processen med selve injektionen unægtelig kræver nogle håndelag, succesen af denne seks-anden procedure ofte ligger i omhyggelig forberedelse af forsøget. Mængden af pDNA nødvendig for at opnå maksimal genekspression kan variere meget afhængig af den anvendte plasmid, og genet, der skal udtrykkes derfor bør den optimale mængde af DNA, der skal injiceres bestemmes eksperimentelt for hvert program. For mus er den anbefalede DNA området i almindelighed er 5-50 ug, hvorover genekspression kan nå et plateau. I vores hænder, injektion af 50 ug pRG977 transporterer enten APOL-I eller HPR-genet fører til høje niveauer af circulating protein niveauer i de to første dage efter HGD. Blodets indhold af begge proteiner falde betydeligt i løbet af de næste par dage, indtil protein niveauet falder under påviselige niveauer omkring dag 10 (38 og upublicerede data). Den optimale mængde af DNA skal leveres i en fysiologisk opløsning, der svarer til 8-12% af kropsvægten af mus 1, 2. Mens de fleste forskere, herunder os, bruge saltvand som injektion køretøj har Ringers opløsning blevet brugt til HGD med sammenlignelig succes 2. Bemærk, at mens det ikke er nødvendigt at udføre HGD i et sterilt miljø, er det nødvendigt at undgå endotoksinkontaminering injektionsopløsningen hele proceduren. Til dette formål bør den anvendte saltopløsning til injektioner være af fineste renhed og DNA'et, der skal injiceres, bør fremstilles under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit, der fjerner endotoksin. Et andet vigtigt forberedende skridt er nøje afvejning af mus. Davolumen injektion er en af de kritiske aspekter af vellykket HGD, er det vigtigt at sørge for, at musen er hverken under-doseret eller over-doseret med saltvand. Den tidligere fejl resulterer i suboptimal transfektion, mens sidstnævnte i den mulige dyrets død. For yderligere at sikre sikkerheden for de dyr, anbefaler vi at indlæse sprøjter med lille kanyle for at undgå at indføre små luftbobler, som er svære at slippe af med. HGD bør udføres med en 27 - gauge nål som beskrevet i protokollen.
Korrekt injektion er blevet betydeligt nemmere, hvis de caudale vener er klart synlige. Dilatere blodkar ved forsigtig opvarmning af musen kan støtte visualisering af venerne hvis harpiksstopperen med en hale-illuminator er ikke tilgængelig. Lægger musebur på en varmepude i et par minutter eller holde halen med en varm, våd klud fungerer godt i vores hænder. Hvis du bruger en varme-lampe, skal man udvise ekstrem forsigtighed for ikke at overophede mus. Vi finder, at vining en varme-lampe forårsager mus unødig stress og ubehag, og derfor bør undgås. Aftørrer hale med 70% ethanol hjælper yderligere med visualisering ved at forøge kontrasten mellem halevenen og huden. Dette trin er også afgørende for at undgå bakteriel forurening under indsprøjtning. Når musen er parat til injektion kan halevenen injiceres ved hjælp af enten en af håndstillinger beskrevet i denne protokol. Bemærk, at mens position 2 synes lettere og mere ligetil, kan det være vanskeligere at injicere den fulde volumen af væske uden at flytte sprøjten. I modsætning hertil oprettelse god nål position ved hjælp af første metode er mere besværlig men når kanylemuffen holdes sikkert mod halen, injektion sjældent mislykkes. Den første metode anbefales også til maksimal hastighed, selv om en vellykket transfektion er mulig ved hjælp af enten håndstilling.
Den anbefalede hastighed HGD injektion i mus er 6-8 sek, selvommange forfattere peger på, at hurtigere injektioner give endnu bedre resultater 1, 12. Langsom injektion resulterer i markant reduceret genekspression. , Den mest almindelige årsag til en fuldstændig mangel på genekspression er dog ikke til at levere den fulde mængde af injektion. Dette sker, når nålen bevæges, efter injektionen blev påbegyndt. Korrekt placeret, nålen ind i venen uden modstand. For at kontrollere, at nålen er indsat i venen korrekt, kan man indsprøjte en meget lille mængde (100 ul) væske ind i venen, før fuld indsprøjtning. Hvis du trykker ned på stemplet møder ekstrem modstand, nålen er i den forkerte position, og væsken ind i halen væv. Hvis nålen forlader venen mid-injektion, korrektion af tabt HGD kan forsøges efter musen fik lov til at hvile i et par timer. Re-injektion efter utilstrækkelig hvile forårsager lidelse til musen og kan resultere i tab af hydrodynamisk pressure ved at åbne den første sår på halen af musen. Hvis gentagne injektioner er nødvendige, kan musen injiceres med den fulde mængde saltvand (og mængden af DNA) enten tættere på haleroden i samme vene eller i den kontralaterale vene. Efter HGD bør mus observeres i et bur anbragt på en varmepude i mindst en time. HGD forårsager en kraftig stigning i intravaskulær pres resulterer i en akut uregelmæssighed af hjerte-funktion, lever ekspansion, og en afbrydelse af membranporerne af leverceller, sinusoids og fenestrae 12, 14, 43.. Trods en fordobling af deres blodvolumen i et par sekunder, mus tåle HGD bemærkelsesværdigt godt. Puls vender tilbage til normal i 2 min og den intravaskulære tryk, som falder hurtigt hurtigt efter injektion, tilgange basale niveauer i 3 min 12, 43. De forstyrrede hepatocytter reseal på mindre end 2 min og de udvidede leverstørrelse afkasttil normal størrelse i 30 minutter efterfulgt af inddrivelse af sinusoid funktion i cirka 24 timer 43. Mens mange forskere bruger anæstesi med succes, i vores hænder, isofluoran anæstesi forværrer åndedrætsbesvær af mus på grund af HGD. Vi finder, at bedøvede mus tage længere tid at komme sig og lejlighedsvis kræver genoplivning for overlevelse. Hvis indsprøjte en stor gruppe af mus ved hjælp af anæstesi, kan det være nødvendigt at have i rum dedikeret en ekstra person til at føre tilsyn med trivsel i bedring dyr. Uden bedøvelse, selv efter gentagne injektioner, mus overlevelse er 100%, og restitutionstid er mindre end 5 minutter.
Protokollen beskrevet her kan anvendes til at levere en lang række molekyler til muselever. Brug af det secernerede protein APOL-I som et eksempel viste vi, hvordan HGD kunne anvendes til at etablere en musemodel og studere funktionen af et beskyttende protein. Når man sammenligner funktionen af forskellige genprodukter, er success af HGD bør vurderes, når det er muligt. For udskilte proteiner, er det let at overvåge ekspressionsniveauerne ved at analysere museplasma hjælp western blot (figur 2 og 4B). Det er særlig vigtigt at sikre succes HGD når analyse naturlige eller syntetiske varianter af et terapeutisk protein, som transfektionseffektiviteten kan alvorligt påvirke sygdommen resultat (figur 2 og 3). Eksempler er givet for at vise, hvorledes denne metode kan udvides til at analysere leverskader forårsaget af APOLI, som er et poredannende protein (figur 4 og 5). Sekvensvarianter af APOL-I i det samme plasmid baggrund resultere i markant forskellige skader profiler. Dette antyder, at vævsskade er forbundet med protein-funktion og ikke ekspressionsvektoren eller traumer af selve injektionen. Det skal bemærkes, at i vores hænder, AST niveauer er universelt højt på dag 1 efter injektion (data ikke vist). På dag 2 dog AST niveauer af mus iProjected med saltvand tilbagevenden til normal og forskelle mellem genvarianter er let skelnelige (figur 4). Ved dag 3 efter injektion AST målt i alle behandlinger vende tilbage til deres basale niveau (data ikke vist). Da nekrotisk væv og inflammation i leveren er tydeligt længere end en forbigående stigning i AST, kan leverskader grundet langvarig genekspression vurderes mere pålideligt, end kvalitativt ved farvning af leverne opsamlet på dag 5 efter injektion. De eksempler viser, at varianter af APOL-jeg, at forårsage en øget frigivelse af AST 2 dage efter injektion også resultere i mere vedvarende leverskader som vurderet ved farvning med hæmatoxylin og eosin.
Hydrodynamisk genlevering giver mulighed for hurtig analyse af gen-ekspression in vivo. Det kræver den enkle konstruktion af genet under undersøgelse i en eukaryot ekspressionsvektor og evnen til at udføre injektionen som beskrevet ovenfor. Generering af transgenic mus ved brug af andre former af gen-levering, såsom rekombinante lentivirale vektorer afledt fra HIV-1 eller rekombinante adenoassocierede virale vektorer kræver meget mere specialiseret ekspertise. Imidlertid er deres fordel vedvarende genekspression, selv virusgenekspression ofte forårsager en inflammatorisk respons på grund af værten sensing en virusinfektion og reagere 15-19. Desuden de virale vektorer har en begrænset emballage evne, og derfor er begrænset i gen størrelse, mens AKB af 150KB er blevet anvendt med succes i HGD 4.. Efter beherske denne teknik, kan brugeren transficere helst nukleinsyre (cDNA eller gDNA eller RNA) in vivo og følge produktionen af protein og de biologiske konsekvenser. Proteinet kan være intracellulært, membranbundet eller ekstracellulære; det kan mærkes eller modificeres på nukleinsyre og dermed aminosyreniveau. Vigtigst er det, dette er en meget enkel og hurtig teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) for oprindelig undervise os HGD teknik og Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) for hans stadige vejledning i forskellige aspekter af teknologien. Dette arbejde blev finansieret af Hunter College, CUNY opstart midler, og NSF Brød pris IOS-1.249.166. Vi takker NYULMC Histopathology Core NYUCI Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 til histologi på muselevere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al.
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D.
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D.
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
