Summary
In vivo transfectie van naakt DNA door hydrodynamische gen delivery introduceert genen in het weefsel van een dier met minimale ontstekingsreactie. Voldoende hoeveelheden genproduct zodanig dat gen functie en regulering en eiwitstructuur en functie kunnen worden geanalyseerd gegenereerd.
Abstract
Efficiënte expressie van transgenen in vivo is van cruciaal belang bij het bestuderen van genfunctie en het ontwikkelen van behandelingen voor ziekten. In de afgelopen jaren heeft hydrodynamische genaflevering (HGD) ontpopt als een eenvoudige, snelle, veilige en effectieve methode voor het leveren van transgenen in knaagdieren. Deze techniek is gebaseerd op de kracht die door de snelle injectie van een groot volume van fysiologische oplossing om de permeabiliteit van celmembranen van geperfundeerde organen te vergroten en daarmee leveren van DNA in cellen. Een van de belangrijkste voordelen van dysplasie is de mogelijkheid om transgenen te introduceren in zoogdiercellen met naakt plasmide DNA (pDNA). Het introduceren van een exogeen gen met behulp van een plasmide is minimaal moeizaam, zeer efficiënte en, in tegenstelling tot virale dragers, opmerkelijk veilig. HGD werd aanvankelijk gebruikt om genen in muizen, wordt nu gebruikt om een breed scala van stoffen, waaronder oligonucleotiden, kunstmatige chromosomen, RNA, eiwitten en kleine moleculen in muizen, ratten leverenen, in beperkte mate, andere dieren. Dit protocol beschrijft HGD in muizen en richt zich op drie belangrijke aspecten van de methode die kritisch zijn voor het uitvoeren van de procedure met succes zijn: correct inbrengen van de naald in de ader, het volume van de injectie en de snelheid van levering. Voorbeelden worden gegeven aan de toepassing van deze werkwijze tonen voor de transiënte expressie van twee genen die uitgescheiden, primaat-eiwitten coderen, apolipoproteine LI (APOL-I) en haptoglobine-verwant eiwit (HPR).
Introduction
Sinds de eerste beschrijving van Liu et al.. En Zhang et al.., Hydrodynamische genaflevering (HGD) is uitgegroeid tot een waardevol instrument voor het bestuderen van gen-functie in knaagdier modelsystemen 1, 2. De techniek omvat de snelle injectie (5-7 seconden) van een groot volume (8-12% lichaamsgewicht) oplossing in de staartader van muizen om de opname van plasmide DNA door de cellen van doelorganen 1, 2 vergemakkelijken. Deze omstandigheden leiden tot sterke genexpressie in de lever en minder genexpressie in de nieren, milt, long en hart.
Injectie van 10 ug pCMV-lacZ plasmide transfecteren maar liefst 40% van hepatocyten, waardoor dysplasie de meest efficiënte, niet-virale, in vivo gentherapie methode tot heden 1. In tegenstelling tot de virale dragers, pDNA is gemakkelijk te bereiden, niet een immuunrespons in het knaagdier gastheer 3 uitlokken en geen risico voor de gezondheid kunnen opleveren doordat recombineren met eindogenous virussen. Bovendien, omdat de DNA-moleculen door dysplasie geleverde niet verpakking nodig is deze werkwijze geschikt voor de levering van bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) zo groot als 150 kb 4. Andere soorten moleculen die door een hydrodynamisch werkwijze zijn geleverd omvatten RNA 5-10, morpholinos 11, eiwitten 12, 13 en andere kleine moleculen 12, 14. De voor-en nadelen van HGD opzichte van andere aflevering methoden zijn in uitstekende recensies besproken in de literatuur 15-20 en een aantal auteurs hebben een gedetailleerde beschrijving van de procedure 21-23.
Introductie van transgenen in muizen door HGD is veilig en effectief 1-3, 24 en de methode is gebruikt bij ratten met een vergelijkbaar succes 25. Bij bepaalde wijzigingen, proof-of-concept-experimenten zijn uitgevoerd bij kippen 26, rab uitgevoerdDe bits 27 en 28 varkens, hoewel de in vivo toepassing van deze techniek in grotere dieren blijft een uitdaging. Deze meetmethode, een gemeenschappelijke beperking is dat veel van de beschikbare zoogdierlijke expressievectoren niet de componenten tot een blijvende, hoge genexpressie. Met een pCMV-Luc plasmide genexpressie in de doelorganen is merkbaar vanaf tien minuten na HGD echter de aanvankelijk, hoog expressieniveau daalt scherp in de eerste week na injectie 1. Langdurige transgenexpressie is mogelijk, afhankelijk van de promotor en intron gebruikt in plasmide design 3, 24 echter, het onderhoud van high-level genexpressie vereist vaak herhaalde injecties. Daarom kan dysplasie minder geschikt chronische ziekten die het gevolg zijn van langdurige blootstelling aan schadelijke eiwitten of producten bestuderen. Met deze beperkingen, HGD is een uitzonderlijk krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de potentieel rol van een gen en het effect ervan mutanten in vivo, evenals de therapeutische effecten en regulatie van eiwitten en de vaststelling van diermodellen van de ziekte (zie voor 15). Bijvoorbeeld kan dysplasie worden gebruikt om functie aan domeinen en aminozuren van eiwitten door afzonderlijk introduceren verschillende genconstructen in muizen die de respectieve genen uitgeschakeld. Verder kan deze techniek worden gebruikt in elke muizenstam.
Dit protocol beschrijft HGD in muizen met een focus op de technische aspecten die nodig zijn om een succesvolle transfectie bereiken: de juiste naald inbrengen in de ader, injectie volume en de snelheid van levering. De toepassing van deze methode wordt gedemonstreerd in een muismodel van Afrikaanse trypanosomiasis, een fatale ziekte bij mensen en dieren 29, 30. Terwijl verschillende soorten trypanosomen veroorzaken ziekte bij vee, kunnen de meeste niet ziekte veroorzaken bij de mens als gevolg van immuuncomplexen aangeboren blood genoemd trypanosome lytische factoren (TLFs) 29, 31, 32. Deze porievormende, high-density lipoproteïnen (HDL) bevat twee unieke, primaat-eiwitten. HPR, het ligand, die de opname van TLFs in trypanosomen vergemakkelijkt en APOL-I, de lytische component 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense is in staat om mensen te besmetten als gevolg van de expressie van een serum-resistentie geassocieerde eiwit (SRA) dat bindt aan en neutraliseert de menselijke APOL-I 34, 39. Baviaan TLF wordt niet geneutraliseerd door SRA vanwege de uiteenlopende APOL-I-eiwit 40. Zoals eerder gemeld, met een zoogdierexpressievector (pRG977), transgene expressie van baviaan TLF componenten in muizen bescherming biedt tegen humane infecties trypanosomen 40. De representatieve hier gepresenteerde gegevens demonstreren hoe hydrodynamische gentherapie worden toegepast om de therapeutische werking van een eiwit te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten die hier beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Hunter College, City University van New York.
1. Bereiding van endotoxinen plasmide-DNA
- Sla een kolonie van bacteriën die het gen van belang in een zoogdierlijke expressievector van een vers uitgestreken selectieve plaat.
- Volg de aanbevelingen in het handboek van een commercieel verkrijgbare endotoxinevrij plasmidezuivering kit voor het kweken en oogsten van bacteriën.
- Zuiver het endotoxine vrij plasmide-DNA van bacteriële cellen door de protocol van een commercieel verkrijgbare endotoxinen plasmide zuiveringskit.
- Gebruik endotoxine-vrij plastic ware en handvat DNA met zorg om ervoor te zorgen dat endotoxine wordt niet opnieuw ingebracht in het DNA-monster na de verwijdering stap.
- Meet de concentratie van endotoxine vrij plasmide-DNA door het bepalen van de absorptie bij 260 nm met behulp van een MICRo-volume UV spectrofotometer zoals hieronder beschreven of standaard-kuvet gebaseerde spectrofotometer.
- Maak de onderste en bovenste optische oppervlakken van de micro spectrofotometer monster retentie systeem als volgt. Pipetteer 1 ui schoon gedemineraliseerd water op de onderste optische systeem. Sluit de hendel arm en tik er een paar keer naar de bovenste optische systeem baden, open vervolgens de hendel en maak hem schoon met een tissue.
- Open de software van de micro spectrofotometer en selecteer de nucleïnezuren module.
- Plaats 1 ui schoon gedemineraliseerd water op de onderste optische systeem, laat de hendel arm en selecteer "initialiseren" van het programma software. Zodra de initialisatie is voltooid, schoon beide optische oppervlakken met een tissue ..
- Voer blanco meting door het laden 1 ui endotoxinen TE-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) en "leeg" te selecteren in het programma software. Zodra blanco meting is gedaan, schoon beide optische oppervlakken met eenweefsel.
- Voer monster meting door het laden van 1 pl van endotoxine-vrij DNA-monster en te kiezen voor "meten" van het programma software. Noteer de DNA-concentratie. Beoordelen DNA zuiverheid door het opnemen van de absorptie verhouding 260/280 nm die op het scherm verschijnt. Aangezien het gebruik van zuiver DNA (260/280 verhouding van 1,8) voor dysplasie is zeer wenselijk, vermijd het gebruik van een DNA-monster met een 260/280 ratio onder 1.7. Zodra de meting is gedaan, schoon beide optische oppervlakken met een tissue.
2. Wegen van muizen
- Mark muizen in een wijze van de stam. Opmerking: het markeren van de staart wordt niet aanbevolen voor deze procedure.
- Mark muis soorten die witte vacht (bv. Zwitserse Webster) hebben op hun rug met een zwarte stift. Reapply merken na verloop van tijd als nodig is.
- Mark muis soorten die zwarte vacht (bv. C57BL / 6) hebben op het gehoor ponsen meerdere dagen van tevoren.
- Weeg muizen individuatielly door ze voorzichtig te plaatsen in een dier met een gewicht van pan of emmer geplaatst op een digitale laboratorium balans. Noteer het gewicht van elke muis gebruikt in het experiment, de dag van het experiment.
3. Bereiding van spuiten
- Bereiding van de injectie mix
- Bereken de hoeveelheid DNA die nodig is door uitgaande 5-50 ug endotoxinen plasmide DNA voor het injecteren van elke muis.
- Bepaal de optimale hoeveelheid plasmide DNA experimenteel.
- Bij het bepalen van de hoeveelheid DNA vereist veronderstellen injectie van een extra muizen per groep, zoals een goede plaatsing van de injectiespuiten zal extra injectie mix nodig. Om berekeningen te helpen, overweeg het volgende voorbeeld: injecteren 4 experimentele en 4 controle muizen, elk met een gewicht van 25 g, met 50 ug plasmide DNA per muis. Om de hoeveelheid DNA moeten in dit geval bepalen rekenen met 5 muizen per groep: 5 x 50 ug = 250 pg DNA nodig voor elke groep.
- Bepaal de hoeveelheid zoutoplossing (0,9% natriumchloride) nodig door aan te nemen 10% van het lichaamsgewicht voor de injectie van elke muis.
- Volgens het bovenstaande voorbeeld, injecteer elk 25 g muis met 50 ug plasmide DNA in 2,5 ml zoutoplossing (2,5 g oplossing).
- Bij het bepalen van de hoeveelheid zoutoplossing die voor een hele groep muizen, nemen injectie van een extra muis per groep zorgen voor een goede plaatsing van de spuiten. Gezien het experiment gegeven Bereken de hoeveelheid zout die nodig is voor 5 muizen in elke groep: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml zoutoplossing per groep (of 25 ml totaal). Opmerking: Als muizen binnen dezelfde groep zijn niet hetzelfde gewicht (meer dan 10% verschil in lichaamsgewicht), bereiden injectie mengt apart.
- Gebruik conserveermiddel-en endotoxine-vrij, steriele zoutoplossing die is goedgekeurd voor menselijk gebruik, in 10 ml, meervoudig gebruik flesjes.
- Met behulp van een 20-gauge naald (0,9 mm x 25 mm) bevestigd aan een luer-lock tip van een spuit 20 ml,de vloeistof uit zoute flacons trekken en leeg het spuiten in een 50 ml conische buis. Om nauwkeurige pipetteren zoutoplossing helpen tijdens de bereiding van het DNA-zoutoplossing voor injectie mengsels verzamel zouter dan nodig voor het injecteren van alle muizen in het experiment. Voor bovenstaand experiment, trekken zoutoplossing van 3, 10 ml flesjes (in totaal ongeveer 30 ml), zelfs indien de berekende hoeveelheid zout die nodig is voor het experiment slechts 25 ml.
- Pipetteer de berekende hoeveelheid DNA in een andere 50 ml conische buis. Verzorgen de zijkant van de buis niet aan te raken met de pipet lichaam om introductie van endotoxine voorkomen. Volgens het voorbeeld, pipet 250 ug controle en 250 ug experimentele plasmide DNA in afzonderlijke conische buizen.
- Voeg de vereiste hoeveelheid zoutoplossing om het DNA met behulp van een serologische pipet. Gezien de monster experiment pipet 12,5 ml zoutoplossing om alle mastermengsels (experimentele en controle).
- Laat alle oplossingen te bereikenkamertemperatuur voorafgaand aan injectie.
- Bereken de hoeveelheid DNA die nodig is door uitgaande 5-50 ug endotoxinen plasmide DNA voor het injecteren van elke muis.
- Bereiding van spuiten
- Voor elke muis, vult een steriele 3 ml, luerlockspuit met het DNA-zout mengsel met een steriele 20-gauge naald (0,9 mm x 25 mm). Zorg om luchtbellen te voorkomen. Gebruik groter volume spuiten het debiet van de injectie niet goed kan worden gecontroleerd, en het is moeilijk om grotere spuiten manipuleren met een hand. Verwijder overtollig DNA-zout mengsel terug in de conische buis kan worden hergebruikt.
- Zet de naald in een steriele, 27-gauge naald. Vul de naald met vloeistof volledig zonder de invoering van luchtbellen. Het volume van de DNA-zout mengsel, berekend op basis van het gewicht van de muis.
- Sta niet toe dat de afgetopte naald aan een niet-steriel oppervlak aanraakt. Indien nodig, naalden opnieuw kunnen worden afgedekt met behulp van de eenhandige techniek: plaats de dop op een vlakke ondergrond, steek de naald, zonder vast te houden aan de dop met de andere hand en druk op de beschermde naaldtegen een stevig voorwerp om de dop te beveiligen op de naald. De spuiten zijn nu klaar voor-staart ader injecties.
4. Hydrodynamische DNA levering
- Merk op dat verlamming muizen levensvatbaar kan verminderen. Vermijd het uitvoeren van HGD in een kamer die is te koud, want dit zal ook levensvatbaarheid verminderen. Als de kamer heeft een omgevingstemperatuur van 20 ° C of bij gebruik van verdoving, plaatst de muizen op een verwarming pad ingesteld op 37 ° C na de procedure tot verlies van dieren te voorkomen. Bij gebruik van anesthesie, ervoor zorgen dat de mond en neus van de muis zijn vrij, terwijl op de warmte pad en let op de muis totdat hij volledig is hersteld. Geen voedsel of water niet onthouden van de muizen voorafgaand aan de HGD.
- Verwarm de muizen om de bloedvaten te verwijden.
- Plaats de muis kooi (met beddengoed inclusief) een warmte pad gedurende 5 minuten, zodat de temperatuur van de bedden ongeveer 38-39 ° C. De temperatuur moet laag genoeg zijn om de muizen op de warmte pad te houden voor een wordenverlengde periode.
- Als alternatief kunt u de muis in een toegang dorsale restrainer minimale beperking. Warm de staart van de muis gedurende 1 minuut door het voorzichtig vast te houden met een stuk gaas bevochtigd in warm water. Laat muis herpositioneren indien nodig. Veeg de staart met een tissue om te drogen.
- Als alternatief warm muis door het plaatsen van de kooi onder een warmtelamp voor niet meer dan 2 minuten. Bij gebruik van een warmtelamp, voorzichtig om oververhitting van de muis te voorkomen.
- Groot-volume staartaderinjectie
- Immobiliseren een dorsale toegang restrainer op een plat oppervlak door laboratorium tape.
- Houden bij de staart, plaatst u de muis voorzichtig in de restrainer en steek de stekker. Gebruik slechts beperking als nodig om de staart houden geïmmobiliseerd. Zorg ervoor dat de muis vrij kan ademen.
- Als de muis is in grote nood verkeren op enig moment tijdens de procedure, verwijdert u de muis uit de restrainer onmiddellijk en laat het rusten.
- Plaats de muis zoeen van de laterale caudale aderen zichtbaar is. Zoek de laterale caudale aderen door te kijken recht naar beneden aan de achterkant van de muis: de rode lijn in het midden van de staart is een slagader, terwijl de blauwe lijnen aan weerszijden van de staart zijn de laterale caudale aderen.
- Veeg de staart van de muis grondig met een alcoholdoekje.
- Met behulp van de niet-injecterende hand de staart strak tussen de wijs-en middelvinger, zodat de staart loopt onder de wijsvinger, over het midden en de derde vingers en onder de pink. Laat de duim om vrij te bewegen blijven. (Figuur 1A)
- Gebruik Anderzijds veeg het gebied opnieuw te worden geïnjecteerd met een alcohol. Laat gebied droog is.
- Pak de geladen spuit met het injecteren met de hand en houd hem bij het vat tussen de duim en de andere vier cijfers. Niet vasthouden aan de zuiger.
- Plaats de spuit parallel aan de staart met de naald naar het lichaam van de muis ende schuine (schuine rand) van de naald naar boven.
- Steek de naald in de staart ader. Ga door met de injectie indien de ader juist bevindt, die blijkt uit de naald glijdt zonder weerstand. Merk op dat de diepte van de naald inbrengen is een kwestie van persoonlijke voorkeur is echter volledig inbrengen niet aanbevolen vanwege een verhoogd risico op het scheren van de ader. Vermijd het verplaatsen van de naald.
- Met de duim van de staart die hand, sluiten op de naaf van de naald en druk hub tegen de staart om de naald in positie te houden. Geen overmatige druk toe te passen en niet vasthouden naald as, omdat deze de doorstroming van de vloeistof in de ader belemmeren. Houd de staart met de wijsvinger losjes op dit punt dus als injectie (Figuur 1A) niet belemmeren.
- Re-positie van de spuit die hand zodat de wijsvinger en middelvinger zijn bedrijf op de flens en de duim op het uiteinde van de zuiger (Figure 1A).
- Aandrukt zuiger in een continue beweging en injecteer het volledige volume van de vloeistof in 6-8 sec.
- Verwijder de naald uit ader en het bloeden te stoppen door het toepassen van lichte druk op de staart met een tissue.
- Verwijder de muis uit de restrainer en plaats muis in een herstel kooi geplaatst op de top van een verwarmingselement (strooisel moet 37-38 ° C zijn). Als de injectie kamer koud, deze stap is essentieel voor muizen overleven. Vasthouden aan de staart van de muis tot bloeden stopt helemaal.
- Let op de muis gedurende 1 uur na hydrodynamische DNA levering. Een eerste periode van hijgen en immobiliteit is normaal te wijten aan de tijdelijke aritmie veroorzaakt door HGD maar zorg ervoor dat de muis toont tekenen van herstel in ongeveer 5 minuten. Als de ademhaling van de muis wordt zeer ondiep, zachtjes masseren van de buik van de muis om de ademhaling te vergemakkelijken. Merk op dat percentage herstel kan enigszins worden beïnvloed door de muis stam.
- Return muistot huisvesting kooi en ervoor zorgen dat de muis heeft een overvloedig aanbod van voedsel en water.
- Groot-volume staartaderinjectie behulp van een alternatieve positie van de hand
- Plaats de muis in de restrainer en voor te bereiden voor injectie door de stappen 4.3.1 tot 4.3.5, zoals eerder beschreven.
- Rest de niet-injecterende hand op een vlakke ondergrond met vier vingers gebogen in een hoek van negentig graden. De vingers (alle behalve duim) dient tegen elkaar, waardoor een platform. Houd de staart van de muis tussen de duim en de wijzende vinger (Figuur 1B).
- Gebruik Anderzijds veeg het gebied opnieuw te worden geïnjecteerd met een alcohol. Laat gebied droog is.
- Pak spuit met het injecteren met de hand en houd hem bij de flens en het einde van de plunjer, klaar voor injectie.
- Voltooi de procedure door het volgen van dit protocol uit stap 4.3.9 tot en met stap 4.3.17, zoals eerder beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Correcte plaatsing van de naald in de staartader van de muis (zoals getoond in figuur 1) is een voorwaarde voor het succesvol leveren van een transgen door hydrodynamica gebaseerde transfectie. Vaak is de meest uitdagende gedeelte van de techniek is echter de retentie van de naald in de staartader zonder beweging, zodat het gehele volume van de injectie binnen 6-8 s kan worden geleverd. Kleine fouten tijdens het injectieproces kan resulteren in sterk verminderde efficiëntie transfectie en eiwitexpressie. Daarom is het noodzakelijk om het succes van de dysplasie van elk experiment te controleren. Als het transgeen eiwit van interesse is moeilijk te detecteren zijn door western blot door het ontbreken van gevoelige antilichamen, bij baviaan APOL-I injectie efficiëntie kan gevolgd worden door co-injectie van een plasmide dat een gen voor een eiwit dat gemakkelijk detecteerbaar. In de in figuur 2 experiment werden muizen geïnjecteerd met 50ug van een plasmide dat een van de drie differentieel 6xHIS tag baviaan APOL-I genen en 50 ug van een ander plasmide (dezelfde uitdrukking vector design) die droeg baviaan HPR (bHPR, untagged). Het voornaamste doel van dit experiment was om te beoordelen of de toevoeging van een 6xHIS op de gekozen volgorde plaatsen interfereert met de juiste verwerking en de uitscheiding van de baviaan APOL-I eiwit. Indien echter de toevoeging van de label verstoort de correcte vouwing en dus uitscheiding van het eiwit, wordt het moeilijk te bepalen of het verlies van eiwitexpressie voordoet vanwege verminderde verwerking of mislukte dysplasie. Bovendien, vanwege het gebrek aan voldoende gevoeligheid antilichamen, directe detectie van de baviaan APOL-I getransfecteerde muizenplasma moeilijk zelfs bij een succesvolle gen delivery (zoals bepaald door de bescherming van muizen tegen menselijk-infectieuze trypanosoom challenge). In dit experiment werden deze kwestiesdoor de toevoeging van een equivalente hoeveelheid baviaan HPR plasmide naar het APOL-ik HGD mengsel om te dienen als een surrogaat injectie controle. Zoals in de figuur is baviaan HPR hoog tot expressie in het plasma van bijna alle getransfecteerde muizen aangeeft dat de dysplasie geslaagd. Kleine druppels in expressieniveaus, zoals te zien in een van de twee muizen in bAPOL-I 6xHIS groep 1 in figuur 2A, die in het algemeen toegeschreven aan een zeer geringe vermindering (1-2 s) in injectiesnelheid. In figuur 2B, de eerste plasma monster baan 1 (in bAPOL-I 6xHIS groep 3) toont een volledig gebrek aan proteïne-expressie aangeeft een mislukte HGD. In de meeste gevallen is dit door onvolledige injectie van het volledige volume van het transportmiddel. Aangezien dit experiment bevestigt het succes van dysplasie in alle gevallen slechts een, het effect van 6xHIS tagging op bAPOL-I secretie kan nu worden geëvalueerd door een anti-6xHIS immunoblot (figuur 2C en D). Zoalsfiguur 2D, de enige groep muizen die detecteerbare niveaus van 6XHis-gelabeld eiwit in hun plasma had was aan 3. Het eiwit patroonuitdrukking binnen deze groep bevestigd dat injectie van een van de muizen in deze groep was niet succesvol. Het volledig ontbreken van detecteerbare 6XHis eiwitten in de groepen 1 en 2 (figuur 2C) onderstreept het belang van het opnemen van een tracer eiwit in de injectie mix tot het succes van de HGD te monitoren. Zonder de plasmaspiegels van bHPR (figuur 2A en B), kunnen de gegevens uit figuur 2C en D gemakkelijk worden geïnterpreteerd als een falen van dysplasie in groepen 1 en 2.
Succesvolle HGD van de baviaan TLF1 componenten bAPOL-I en bHPR, geeft muizen weerstand tegen de mens-infectieuze Trypanosoma brucei brucei-SRA parasieten (Tbb-SRA, een laboratorium gelijkwaardig T. b. Rhodesiense) 40. Deze weerstand wordt veroorzaakt door de transgene expressie van bAPOL-I </ Em>, zoals injectie van bHPR alleen biedt geen bescherming tegen menselijke-infectieuze parasieten. Om te beoordelen of 6xHIS-gemerkte varianten van bAPOL-ik zijn nog steeds in staat om als lytische eiwitten functioneren, werden muizen die zowel bAPOL-I en bHPR ontvangen door HGD uitgedaagd met 5000 Tbb-SRA parasieten twee dagen na genlevering. Zoals gezien in figuur 3, muizen in groep 2 6xHIS bezweken voor infectie vroeg, terwijl de meeste muizen in groepen 1 en 3 overleefden zolang de ongemerkte bAPOL-I positieve controle. (Baviaan APOL-I verleent gedeeltelijke bescherming in dit muizenstam.) Aangezien transgene expressie in groep 2 was algemeen hoog is, kan het gebrek aan bescherming in deze muizen correct worden geïnterpreteerd als het verlies van bAPOL-I lytische functie te wijten aan de 6xHIS op dat positie. Let er echter dat de premature (dag 7) overlijden van een muis in groep 3 niet wordt geïnterpreteerd, aangezien deze muis werd niet succesvol geïnjecteerd met de transgenen (zie Figure 2B, baan 1). In het licht van gecombineerde gegevens van figuren 2 en 3, concluderen we dat bAPOL-I worden gelabeld op positie 3 (in 6xHis groep 3) zonder nadelige effecten bij het tikken van dit eiwit op positie 2 (in 6xHis groep 2) verstoort de lytische functie. In 6xHis groep 1, terwijl de gegevens suggereren bescherming het aantal muizen onvoldoende om significante gegevens te verkrijgen. Vermogen analyses moeten worden uitgevoerd om het aantal muizen die voor elk experiment bepaald. Terwijl het schijnbare gebrek aan detecteerbare eiwitten in muizen plasma van Groep 1 lijken tegen de bescherming patroon gezien in figuur 3, mee dat een negatieve anti 6xHis western blot in deze groep het resultaat van een gebrek aan detectie plaats kan het gevolg proteïneverwerking dan een gebrek aan genexpressie. In groep 1 werd de 6xHIS dicht toegevoegd na de splitsing plaats van de voorspelde signaal peptide. De baviaan APOL-I aminozuur sequentie bevat een extra predicted proteolytische splitsingsplaats ongeveer 20 aminozuren van de splitsingsplaats van het signaalpeptide 40. Daarom is het duidelijk dat bAPOL-I in deze muizen wordt afgescheiden en functionele maar verloor de 6xHIS nodig voor de detectie. Zo illustreert het belang van zijn tag plaatsing.
APOL-I doodt Afrikaanse trypanosomen door porievorming in de parasiet lysosoom membraan 36, 37. Natuurlijke varianten van humaan APOL-I in mensen met recente Afrikaanse afkomst zijn sterk geassocieerd met nierziekte bij Afrikaanse Amerikanen, hoewel het mechanisme van nierschade nog onduidelijk 41, 42. Aangezien HGD resulteert in de hoogste genexpressie in de lever, we wilden onderzoeken of humane APOL-I of de synthetische sequentievariant veroorzaakt schade in dit orgaan. Hiervoor werden muizen geïnjecteerd met 50 ug van WT menselijke APOL-I of een aminozuur synthetisch gemuteerde aangewezens K4.To beoordelen leverschade, we gemeten aspartaattransaminase (AST) niveaus in muisplasma verzameld op dag 2 na de injectie. In overeenstemming met zijn lytische functie WT menselijke APOL-I veroorzaakt een verhoging van serum AST niveaus (Figuur 4A) in vergelijking met zoutoplossing geïnjecteerde muizen. Daarentegen injectie van mutant K4, die verschilt in slechts een aminozuur, veroorzaakt weinig AST release. Verschillen in leverschade waarschijnlijk toegeschreven aan niveaus van eiwitexpressie zijn, zoals K4 eiwitniveaus gelijkwaardig of hoger dan die van de WT menselijke APOL-I (Figuur 4B). Onderzoek van levers dysplasie muizen verzameld 5 dagen na injectie blijkt dat menselijke WT APOL-I veroorzaakt beperkte weefselnecrose met matige macrofaag infiltratie (Figuur 5B) vergeleken met zoutoplossing geïnjecteerde muizen die normale lever histologie vertonen (Figuur 5A, paars gebieden) . De verkregen door het meten van plasma AST niveaus waaruit blijkt, K4 geïnjecteerd in dezelfde plasmide achteronde als de WT toont normale lever histologie (Figuur 5C).
Figuur 1. Illustratie van de handposities voor HGD. A.) Positie 1. Aanbevolen positie van de hand om maximale injectie snelheid te bereiken en om de naald beweging na de injectie te vermijden is gestart. De pijl geeft de gesuggereerde beweging van de duim na het inbrengen van de naald in de ader. Duim moet de naald te immobiliseren door voorzichtig met de naaf tegen de staart van de muis. De hand die de spuit moet worden verplaatst om te kunnen beneden te drukken op de zuiger voor de injectie. B.) Positie 2. Deze positie wordt aanbevolen als de staartader injectie voldoende dicht bij de basis van de staart door herhaalde injecties worden uitgevoerd. Zodra de naald in de ader wordt ingebracht, deze hand positie behoeft geen bontther aanpassingen.
Figuur 2 Western blot analyse van plasma verzameld van vijf weken oude, vrouwelijke, Zwitserse Webster (SW) muizen geïnjecteerd met een mix van twee afzonderlijke plasmiden:. 50 ug baviaan HPR en 50 ug van differentieel 6xHIS gelabeld baviaan APOL-I genen. Muizen werden geïnjecteerd met zoutoplossing voertuig negatieve controle. Om het succes van dysplasie bevestigen Dit experiment toont de circulerende plasmaspiegels van de baviaan HPR eiwit, zoals baviaan APOL-I is moeilijk te detecteren. Muis plasmamonsters werden verzameld 2 dagen na dysplasie en eiwit expressieniveaus werden geanalyseerd met western blot (plasma 1:20 verdund) op 10% Tris-Glycine polyacrylamide gels onder denaturerende en niet-reducerende omstandigheden. HPR werd gedetecteerd met een konijn polyklonaal antilichaam tegen humaan haptoglobine (PK), wat ook recognizes baviaan HPR. Tagged bAPOL-I werd gedetecteerd met behulp van een konijn polyklonaal antilichaam tegen een 6xHIS. Molecuulgewichten van de controle 6xHIS eiwitten opgenomen zijn 40 en 50 kDa. A.) paneel toont een voorbeeld van Western blot analyse van een uitgescheiden eiwit (HPR) bij alle muizen in een groep succesvol geïnjecteerd. Let op de uniforme hoge eiwit expressie in de tweede HIS-gelabelde groep (bAPOL-I 6xHIS groep 2), waar de injectie was zeer succesvol. In de eerste groep (bAPOL-I 6xHIS groep 1), eiwitexpressie van een van de muizen prominente maar iets minder waarschijnlijk door verminderde snelheid van de injectie. B.) paneel toont een voorbeeld van eiwitexpressie niveaus wanneer een van de injecties (in bAPOL-I 6xHIS groep 3) was niet succesvol. C.) Panel toont het belang van het opnemen van een tracer eiwit (bHPR) aan het succes van HGD controleren wanneer de detectie van het eiwit van belang (bAPOL-I) is onzeker. Ondanks de bevestigde succes van HGD in bAPOL-I
Figuur 3. Overleving van muizen die baviaan APOL-I 6xHIS varianten en baviaan HPR. Vijf weken oude, vrouwelijke Swiss Webster muizen ontvingen 50 pg van elk van twee afzonderlijke plasmiden van dysplasie in dezelfde injectie mix. Muizen in dit experiment overeen met het plasma in figuur 2 geanalyseerd. Op dag 2 na de injecties werden de muizen geïnfecteerd met 5000 menselijke infecties Tbb-SRA parasieten en parasitemie werd gevolgd. Wanneer parasitemie bereikt 10 9 parasieten / ml, werden muizen gedood. De overleving was significant verschillend van zoutoplossingcontrole waar aangegeven (* - P <0,05, log-rank test). Muis overleving na parasiet uitdaging is een voorbeeld van hoe het succes van HGD invloed op gegevens die zijn verkregen uit latere experimenten. Wanneer baviaan APOL-I met succes wordt geïnjecteerd, wordt het gen product uitgescheiden in muis bloed waar het wordt opgenomen door en doodt de mens-infectieuze trypanosomen. De survival curve toont aan dat muizen geïnjecteerd met de 6xHIS versie 3 van baviaan APOL-I waren significant beschermd tegen Tbb-SRA. De enige voortijdige sterfte in deze groep komt overeen met de muis die niet succesvol was geïnjecteerd met het plasmide dat het transgen draagt (zie figuur 2). Deze muis moet uit de survival analyse worden uitgesloten, aangezien haar voortbestaan op parasiet uitdaging is niet toe te schrijven aan verschillen in de transgene ontvangen, maar om het falen van genlevering.
Figuur 5. Een enkele aminozuursubstitutie in de APOL-I sequentie leidt tot verschillende niveaus weefsel pathologie. De figuur toont levers van muizen die SW hydrodynamische injecties van zoutoplossing voertuig (A), 50 ug humaan WT APOL-I (B) of 50 pg van een synthetisch mutant variant van APOL-I, K4 (C) ontvingen. Levers werden verwijderd op dag 5 na de injectie en verwerkt voor hematoxyline en eosine kleuring. Representatieve voorbeelden getoond van dezelfde muizen getest AST niveaus in figuur 4. Panels (DF) tonen meer voorbeelden van beschadigde gebieden in WT-muizen. Necrose foci in panelen (B), (DF) zijn gemarkeerd met zwarte rechthoeken en zijn vergroot. Witte pijlen in deze panelen wijzen op gebieden van macrofaag infiltratie. Ter vergelijking, Normaal weefsel van een representatief deel van de lever van een zoutoplossing-voertuig geïnjecteerde muis wordt gekenmerkt door een licht blauwe rechthoek wordt ook vergroot. Panels (B) en (D) representatief beelden van dezelfde WT muis, terwijl panelen (E) en (F) zijn uit twee verschillende WT-muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wanneer correct uitgevoerd, HGD is een opmerkelijk veilige en effectieve manier van transgene levering. De kritische stappen succesvolle dysplasie zijn: 1) het leveren van de juiste hoeveelheid DNA in een groot volume zoutoplossing voertuig 2) in de staartader van de muis 3) in minder dan 8 seconden.
Hoewel het proces van de injectie zelf onmiskenbaar vereist enige handigheid, het succes van deze zes-tweede procedure ligt vaak in een zorgvuldige voorbereiding van het experiment. De hoeveelheid pDNA moeten maximale genexpressie kan sterk variëren afhankelijk van de gebruikte plasmide en de gen derhalve worden uitgedrukt, moet de optimale hoeveelheid DNA te injecteren experimenteel worden bepaald voor elke toepassing. Voor muizen, de aanbevolen DNA bereik in het algemeen is 5-50 ug, waarboven genexpressie een plateau kunnen bereiken. In onze handen, injectie van 50 ug pRG977 dragen ofwel de APOL-I of HPR gen leidt tot hoge circulating eiwit niveaus in de eerste twee dagen na dysplasie. Bloedspiegels van beide eiwitten een significante daling in de komende paar dagen tot eiwit niveaus beneden detecteerbare niveaus rond dag 10 (38 en ongepubliceerde gegevens). De optimale hoeveelheid DNA worden geleverd in een fysiologische oplossing overeenkomt met 8-12% van het lichaamsgewicht van de muizen 1, 2. Terwijl de meeste onderzoekers, waaronder ons, gebruiken zoutoplossing als de injectie voertuig, heeft Ringer-oplossing gebruikt voor HGD met vergelijkbare succes 2. Merk op, dat hoewel het niet noodzakelijk HGD voeren in een steriele omgeving, is het noodzakelijk om endotoxine verontreiniging van de injectie-oplossing gedurende de procedure te voorkomen. Daartoe moet de zoutoplossing voor injectie van superieure zuiverheid en het DNA te injecteren worden bereid met een commercieel verkrijgbare kit die endotoxine verwijdert. Een andere belangrijke voorbereidende stap is de zorgvuldige afweging van muizen. Aangezien devolume van injectie is een van de belangrijke aspecten van succesvolle dysplasie, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de muis niet onder gedoseerd noch te gedoseerd met zoutoplossing. De voormalige fout resulteert in suboptimale transfectie, terwijl de laatste in de mogelijke dood van het dier. Om verder te zorgen voor de veiligheid van de dieren, raden wij het laden van de spuiten met kleine-gauge naald te voorkomen dat er kleine luchtbelletjes die moeilijk om zich te ontdoen van zijn. HGD moet worden uitgevoerd met een 27 - gauge naald zoals beschreven in het protocol.
Correcte injectie wordt aanzienlijk vergemakkelijkt als de caudale aders duidelijk zichtbaar. Verwijden van de bloedvaten door voorzichtig verwarmen van de muis kan visualisatie van de aderen te helpen als een restrainer met een staart-hulplicht is niet beschikbaar. Het plaatsen van de muis kooi op een warmte-pad voor een paar minuten of het bedrijf de staart met een warme, natte doek werk goed in onze handen. Bij gebruik van een warmte-lamp, moet men uiterst voorzichtig de muizen niet oververhit raken. Wij vinden dat onsing een warmtelamp veroorzaakt de muizen onnodige stress en ongemak en bijgevolg kunnen worden vermeden. Vegen de staart met 70% ethanol verder helpt visualisatie door het verhogen van het contrast tussen de staart ader en de huid. Deze stap is ook van cruciaal belang om bacteriële besmetting tijdens injectie te vermijden. Zodra de muis wordt voorbereid voor injectie kunnen de staartader geïnjecteerd worden via een van de handposities beschreven in dit protocol. Merk op, dat hoewel positie 2 wordt gemakkelijker en eenvoudiger kan het moeilijker zijn om de volledige hoeveelheid vloeistof injecteren zonder dat de spuit. In tegenstelling, het vaststellen van goede naald positie met behulp van de eerste methode is omslachtiger maar zodra de naald hub stevig is gehouden tegen de staart, injectie zelden mislukt. De eerste methode wordt ook aanbevolen voor maximale snelheid, hoewel succesvolle transfectie is mogelijk met behulp van de hand positie.
De aanbevolen snelheid van HGD injectie bij muizen is 6-8 sec, hoewelvele auteurs suggereren dat sneller injecties geven nog betere resultaten 1, 12. Langzame injectie resulteert in sterk verminderde genexpressie. Echter, de meest voorkomende reden voor een compleet gebrek aan genexpressie is niet het volledige volume van de injectie te leveren. Dit gebeurt wanneer de naald wordt bewogen, na de injectie werd ingeleid. Goed geplaatst, de naald in de ader zonder weerstand. Om te controleren of de naald goed in de ader wordt geplaatst, kan men een zeer kleine hoeveelheid (100 pl) vloeistof te injecteren in de ader voor volledige injectie. Als drukken op de zuiger komt met extreme weerstand, de naald in de verkeerde positie en de vloeistof is het invoeren van de staart weefsel. Als de naald verlaat de ader midden-injectie, correctie van de mislukte HGD kan worden geprobeerd nadat de muis mocht rusten voor een paar uur. Re-injectie na onvoldoende rust veroorzaakt leed bij de muis en kan leiden tot verlies van hydrodynamische druk gezete door de openstelling van de eerste wond aan de staart van de muis. Indien herhaalde injecties nodig zijn, kan de muis worden geïnjecteerd met het volledige volume zoutoplossing (en hoeveelheid DNA) hetzij dichter bij de basis van de staart in dezelfde geest of de contralaterale ader. Na HGD moet de muis worden waargenomen in een kooi geplaatst op een warmte pad minstens een uur. HGD veroorzaakt een sterke toename van de intravasculaire druk resulteert in een acute onregelmatigheid van de hartfunctie, uitbreiding lever, en een verstoring van het membraan poriën van levercellen, sinusoïden en fenestrae 12, 14, 43. Ondanks de verdubbeling van hun bloedvolume in een paar seconden, muizen tolereren HGD opmerkelijk goed. De hartslag weer normaal in 2 min en de intravasculaire druk, die snel afneemt vlak na injectie, benadert basale niveaus in 3 min 12, 43. De verstoorde hepatocyten sluit in minder dan 2 minuten en de uitgebreide lever grootte rendementnaar de normale grootte in 30 min, gevolgd door het herstel van de sinusoïde functie in ongeveer 24 uur 43. Hoewel veel onderzoekers gebruik van anesthesie met succes, in onze handen, isofluorane anesthesie verergert de ademnood van muizen als gevolg van HGD. We vinden dat verdoofde muizen langer duren om te herstellen en af en toe nodig reanimatie te overleven. Als een injectie een grote groep muizen met anesthesie, kan het noodzakelijk zijn een extra persoon in de kamer gewijd aan toezicht het welzijn van de herstellende dieren. Zonder verdoving, zelfs na herhaalde injecties, muis overleving 100% en hersteltijd is minder dan 5 minuten.
De hier beschreven protocol kan worden gebruikt om een breed scala van moleculen aan de muizenlever leveren. De uitgescheiden proteïne APOL-I als voorbeeld toonden we hoe dysplasie kan worden gebruikt om een muizenmodel en het onderzoeken van de functie van een beschermend eiwit. Bij vergelijking van de werking van diverse genproducten, de success van de HGD moet worden beoordeeld waar mogelijk. Voor uitgescheiden eiwitten, is het gemakkelijk om expressieniveaus te controleren door analyse muizenplasma met Western blot (Figuren 2 en 4B.) Is bijzonder belangrijk voor het succes van dysplasie te waarborgen bij het testen van natuurlijke of synthetische varianten van een therapeutisch eiwit, zoals transfectie efficiëntie ernstig beïnvloeden ziekteresultaat (figuren 2 en 3). Voorbeelden worden gegeven om te tonen hoe deze werkwijze kan worden uitgebreid tot leverschade veroorzaakt door Apoli, een porie vormende eiwitten (figuren 4 en 5) te analyseren. Sequentievarianten van APOL-I in hetzelfde plasmide achtergrond resulteren in sterk verschillende schade-profielen. Dit suggereert dat weefsel schade geassocieerd met eiwitfunctie en niet de expressievector of het trauma van de injectie zelf. Opgemerkt moet worden dat, in onze handen, AST niveaus algemeen hoog op dag 1 na injectie (gegevens niet getoond). Op dag 2, maar AST niveaus van muizengeprojecteerde met zoutoplossing genormaliseerd en verschillen tussen genvarianten gemakkelijk waarneembaar (figuur 4). Bij dag 3 na de injectie, AST gemeten in alle behandelingen terugkeren naar hun basisniveau (gegevens niet getoond). Sinds necrotisch weefsel en ontsteking in de lever zijn duidelijk langer dan een tijdelijke toename van AST, kan schade aan de lever als gevolg van aanhoudende genexpressie betrouwbaarder worden beoordeeld, zij het kwalitatief, door kleuring van de verzamelde op dag 5 na de injectie levers. De voorbeelden laten zien dat varianten van APOL-I, dat een verhoogde afgifte van AST veroorzaken 2 dagen na de injectie ook leiden tot meer duurzame leverschade zoals beoordeeld door kleuring met hematoxyline en eosine.
Hydrodynamische gentherapie kan de snelle analyse van genexpressie in vivo. Het vereist de eenvoudige constructie van het gen onder studie in een eukaryote expressievector en de mogelijkheid om de injectie zoals hierboven beschreven uitgevoerd. Generatie transgenic muizen om andere vormen van gentherapie, zoals recombinante lentivirale vectoren afgeleid van HIV-1 of recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren, vereisen veel meer gespecialiseerde kennis. Echter, hun voordeel gehandhaafd genexpressie, hoewel virale genexpressie veroorzaakt vaak een ontstekingsreactie door de gastheer detecteren van een virale infectie en reageren 15-19. Bovendien is de virale vectoren hebben een beperkte capaciteit en verpakking daarom beperkt in omvang gen, terwijl BACs van 150kb succes gebruikt in dysplasie 4. Na het beheersen van deze techniek, kan de gebruiker elk nucleïnezuur (cDNA of gDNA of RNA) transfecteren in vivo en volgt de productie van eiwitten en de biologische gevolgen. Het eiwit kan intracellulair zijn, membraangebonden of extracellulaire; kan worden gelabeld of gewijzigd op nucleïnezuur en dus aminozuurniveau. Belangrijker is dit een zeer snelle en eenvoudige techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) voor initieel onderwijs ons de HGD techniek en Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) zijn continue begeleiding in de verschillende aspecten van de technologie. Dit werk werd gefinancierd door Hunter College, CUNY opstarten fondsen en NSF Brood award IOS-1249166. Wij danken de NYULMC Histopathology Core NYUCI Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 voor histologie op de muis levers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al.
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D.
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D.
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
