Summary
Dans la transfection in vivo d'ADN nu par la délivrance de gènes hydrodynamique introduit les gènes dans le tissu d'un animal avec une réponse inflammatoire minime. Des quantités suffisantes de produit du gène sont générées de telle sorte que la fonction des gènes et de la réglementation ainsi que la structure et la fonction des protéines peuvent être analysées.
Abstract
L'expression efficace de transgènes in vivo est d'une importance critique pour l'étude de la fonction génique et le développement de traitements pour des maladies. Au cours des dernières années, la livraison de gène hydrodynamique (DHG) a émergé comme une méthode simple, rapide, sûr et efficace pour fournir des transgènes dans les rongeurs. Cette technique repose sur la force générée par l'injection rapide d'un grand volume de solution physiologique pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires des organes perfusés et ainsi délivrer de l'ADN dans les cellules. L'un des principaux avantages de HGD est la possibilité d'introduire des transgènes dans des cellules de mammifère en utilisant l'ADN plasmidique nu (ADNp). L'introduction d'un gène exogène en utilisant un plasmide est peu laborieux, très efficace et, contrairement aux transporteurs virales, remarquablement sûr. HGD a été initialement utilisé pour délivrer des gènes dans des souris, il est maintenant utilisé pour délivrer une large gamme de substances, y compris des oligonucleotides, des chromosomes artificiels, des ARN, des protéines et de petites molécules dans des souris, des ratset, à un degré limité, d'autres animaux. Ce protocole décrit HGD chez la souris et se concentre sur trois aspects clés de la méthode qui sont essentiels à l'exécution de la procédure avec succès: une bonne insertion de l'aiguille dans la veine, le volume d'injection et la rapidité de livraison. Des exemples sont donnés pour montrer l'application de cette méthode pour l'expression transitoire de deux gènes qui codent pour des protéines sécrétées, des primates-spécifique, l'apolipoprotéine LI (apoL-I) et la protéine apparentée à l'haptoglobine (HPR).
Introduction
Depuis sa première description par Liu et al. Et Zhang et al., La livraison de gène hydrodynamique (DHG) est devenu un outil précieux pour étudier la fonction des gènes dans des systèmes modèles de rongeurs 1, 2. La technique implique l'injection rapide (7.5 sec) d'un volume important (12.8% de poids corporel) de la solution dans la veine caudale de souris afin de faciliter l'absorption de l'ADN plasmidique par des cellules d'organes cibles 1, 2. Ces conditions conduisent à l'expression des gènes dans le foie robuste et moins l'expression du gène dans le rein, la rate, les poumons et le cœur.
Injection de 10 pg pCMV-LacZ plasmide peut transfecter autant que 40% des hépatocytes, ce qui HGD non-virale, la méthode la plus efficace, in vivo livraison de gène à la date 1. Contrairement transporteurs virales, pDNA est facile à préparer, ne provoque pas une réponse immunitaire chez l'hôte rongeur 3 et ne pose pas de risque pour la santé par se recombiner avec finvirus exogène. En outre, puisque les molécules d'ADN fournis par HGD n'ont pas besoin de l'emballage, cette méthode est adaptée pour la livraison de chromosomes artificiels de bactéries (BAC) aussi grandes que 150 ko 4. D'autres types de molécules qui ont été délivrés par un procédé hydrodynamique comprennent l'ARN de 5 à 10, 11 morpholinos, des protéines de 12, 13 et d'autres petites molécules 12, 14. Les avantages et les inconvénients de HGD sur les autres méthodes de livraison ont été abordés dans d'excellentes critiques dans la littérature 15-20 et un certain nombre d'auteurs ont fourni une description détaillée de la procédure 21-23.
L'introduction de transgènes dans des souris par le MH est sûr et efficace 1-3, 24 et le procédé a été utilisé avec succès chez des rats comparable 25. Avec certaines modifications, des expériences de validation de concept ont été réalisées chez les poulets, 26 rables bits 27 et 28 porcs, bien que, l'application in vivo de cette technique dans les plus grands animaux reste un défi. Lorsqu'on utilise ce procédé, une autre limitation commune est que la plupart des vecteurs d'expression mammaliens disponibles ne disposent pas des composants pour atteindre une persistante, le niveau élevé de l'expression génique. L'utilisation d'un plasmide, l'expression du gène pCMV-Luc dans les organes cibles est évident dès dix minutes après HGD, toutefois, le niveau d'expression initial, haute diminue fortement dans la première semaine après l'injection 1. L'expression du transgène à long terme est possible selon le promoteur et l'intron utilisés dans la conception de plasmide 3, 24 injections Toutefois, le maintien de l'expression du gène de haut niveau nécessite souvent répété. Pour cette raison, HGD peut-être moins approprié pour étudier les maladies chroniques qui sont le résultat de l'exposition à long terme à des protéines nuisibles ou des produits protéiques. Avec ces limitations, HGD est un outil extrêmement puissant pour étudier la potiel rôle d'un gène et l'effet de celle des mutants in vivo, ainsi que les effets thérapeutiques et la régulation des protéines et pour établir des modèles animaux de la maladie (pour revue, voir 15). Par exemple, HGD peut être utilisée pour affecter la fonction des domaines et des acides aminés des protéines en introduisant individuellement différentes constructions de gènes dans les souris qui ont les gènes respectifs assommé. En outre, cette technique peut être utilisée dans n'importe quelle souche de souris.
Ce protocole décrit HGD chez la souris avec un accent sur les aspects techniques nécessaires à la réalisation transfection réussie: insertion correcte de l'aiguille dans la veine, le volume d'injection et la rapidité de livraison. L'application de cette méthode est démontrée dans un modèle de souris de la trypanosomiase africaine, une maladie mortelle de l'homme et de l'élevage 29, 30. Bien que plusieurs espèces de trypanosomes causent la maladie chez le bétail, la plupart ne peuvent pas provoquer la maladie chez l'homme due à des complexes immuns innés en blood appelées facteurs lytiques des trypanosomes (TLF) 29, 31, 32. Ces, lipoprotéines de haute densité formation de pores (HDL) contiennent deux protéines, les primates spécifique uniques:. HPR, le ligand de, ce qui facilite l'absorption de TLF dans les trypanosomes, et PALO-I, le composant lytique 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense est capable d'infecter les êtres humains en raison de l'expression d'une protéine associée à la résistance de sérum (SRA) qui se lie à et neutralise apoL-I humain 34, 39. Baboon TLF n'est pas neutralisé par SRA en raison de sa divergent protéine PALO-I 40. Comme indiqué précédemment, en utilisant un vecteur d'expression de mammifère (pRG977), l'expression transgénique de babouin composants TLF chez la souris confère une protection contre les trypanosomes humains-infectieux 40. Les données représentatives présentées ici montrent comment la délivrance de gènes hydrodynamique peut être appliquée pour étudier les effets thérapeutiques d'une protéine.
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Protocol
Toutes les expériences décrites ici ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de Hunter College, City University de New York.
Une. Préparation d'ADN plasmidique sans endotoxine
- Choisir une colonie unique de bactéries contenant le gène d'intérêt dans un vecteur d'expression de mammifère à partir d'une plaque sélective fraîchement striée.
- Suivez les recommandations contenues dans le manuel d'un kit de purification de plasmide disponible dans le commerce sans endotoxine des bactéries croissance et la récolte.
- Purifier le plasmide ADN libre à l'endotoxine à partir de cellules bactériennes en suivant le protocole du kit de purification de plasmide exempt d'endotoxine disponibles dans le commerce.
- Utilisez les articles en plastique sans endotoxine et manipuler l'ADN avec soin pour s'assurer que l'endotoxine n'est pas réintroduite dans l'échantillon d'ADN après l'étape d'élimination.
- Mesurer la concentration de l'ADN plasmidique exempt d'endotoxine par la détermination de son absorbance à 260 nm en utilisant un micro volume spectrophotomètre UV telle que décrite ci-dessous ou à une norme, spectrophotomètre base cuvette.
- Nettoyer les surfaces optiques inférieures et supérieures du système de retenue d'échantillon du spectrophotomètre micro comme suit. 1 ul d'eau désionisée propre sur le système optique inférieur. Fermez le bras de levier et appuyez dessus à quelques reprises pour baigner le système optique supérieure, alors levier d'ouverture et essuyer avec un tissu.
- Ouvrez le logiciel de micro spectrophotomètre et sélectionner le module d'acides nucléiques.
- Placez 1 pi d'eau déminéralisée propre sur le système optique inférieur, le bras de levier et sélectionnez "initialiser" à partir du logiciel de programme. Une fois l'initialisation surfaces complètes, propres à la fois optiques avec un tissu ..
- Effectuer mesure à blanc en chargeant 1 pl de tampon TE exempt d'endotoxine (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) et en sélectionnant "vide" à partir du logiciel de programme. Une fois la mesure vide est fait, nettoyer les surfaces optiques à la fois avec untissu.
- Effectuer une mesure de l'échantillon en chargeant 1 ul de l'échantillon et en sélectionnant l'ADN exempt d'endotoxine "mesure" à partir du logiciel de programme. On enregistre la concentration de l'ADN. Évaluer la pureté de l'ADN par l'enregistrement du rapport d'absorbance 260/280 nm qui apparaît sur l'écran. Etant donné que l'utilisation d'ADN pur (260/280 du rapport de 1,8) pour le MH est hautement souhaitable, éviter d'utiliser un échantillon d'ADN avec un rapport de 260/280 en dessous de 1,7. Une fois la mesure terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un tissu.
2. Pesée de souris
- Mark souris dans un approprié de manière à la souche. Remarque: le marquage de la queue n'est pas recommandé pour cette procédure.
- Espèces de souris Marquer ayant fourrure blanche (par exemple Swiss Webster) sur le dos avec un marqueur noir. Réappliquer marques au fil du temps si nécessaire.
- Espèces Mark souris qui ont une fourrure noire (par exemple C57BL / 6) à l'oreille poinçonnage plusieurs jours à l'avance.
- Peser souris individually en les plaçant dans un plateau de pesée des animaux ou seau doucement placé sur une balance de laboratoire numérique. Noter le poids de chaque souris utilisée dans l'expérience, le jour de l'expérience.
3. Préparation des seringues
- Préparation du mélange d'injection
- Calcul de la quantité d'ADN nécessaire en supposant 5-50 ug d'ADN plasmidique exempt d'endotoxine pour l'injection de chaque souris.
- Déterminer la quantité optimale d'ADN de plasmide expérimentalement.
- Lors de la détermination de la quantité d'ADN nécessaire, assumer injection d'une souris supplémentaire par groupe, comme le chargement correct des seringues, il faudra un certain mélange d'injection supplémentaire. Pour aider les calculs, prenons l'exemple suivant: injecter 4 souris expérimentales et 4 contrôle, chaque 25 g pesage, avec 50 ug d'ADN plasmidique par la souris. Pour déterminer la quantité d'ADN nécessaire dans ce cas, calculer avec 5 souris par groupe: 5 x 50 pg = 250 pg d'ADN nécessaires pour chaque groupe.
- Déterminer la quantité de solution saline (chlorure de sodium à 0,9%) nécessaire en supposant 10% de poids de corps pour l'injection de chaque souris.
- Selon l'exemple ci-dessus, chaque injection de 25 g de souris avec 50 ug d'ADN plasmidique dans 2,5 ml de solution saline (2,5 g de liquide).
- Pour déterminer la quantité de solution saline nécessaire pour tout un groupe de souris, supposons injection d'une souris supplémentaire par groupe pour permettre le chargement correct des seringues. Compte tenu de l'expérience donnée, calculer la quantité de solution saline nécessaire pour 5 souris dans chaque groupe: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml de solution saline pour chaque groupe (ou 25 ml au total). Remarque: si des souris d'un même groupe ne sont pas le même poids (différence de plus de 10% du poids corporel), à préparer l'injection se mélange séparément.
- Utiliser, une solution saline stérile sans conservateur et sans endotoxine qui a été approuvé pour l'usage humain, en 10 ml, des flacons à usage multiple.
- En utilisant une aiguille de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm) fixé à un embout de type luer-lock d'une seringue de 20 ml,retirer le liquide à partir de flacons de sérum physiologique et de vider la seringue dans un tube conique de 50 ml. Pour aider pipetage précise de solution saline au cours de la préparation des mélanges d'injection ADN-solution saline, une solution saline recueillir plus que nécessaire pour l'injection de toutes les souris dans l'expérience. Pour l'expérience ci-dessus, retirer saline de 3, flacons de 10 ml (soit un total d'environ 30 ml), même si le montant calculé de solution saline nécessaire pour l'expérience est à seulement 25 ml.
- Introduire à la pipette la quantité calculée d'ADN dans un tube conique de 50 ml différente. Prenez soin de ne pas toucher le côté du tube avec le corps de la pipette pour éviter l'introduction de l'endotoxine. Selon l'exemple, pipeter 250 ug de contrôle et 250 pg d'ADN de plasmide expérimentale dans des tubes coniques distinctes.
- Ajouter la quantité nécessaire de solution saline à l'ADN en utilisant une pipette sérologique. Compte tenu de l'expérience de l'échantillon, la pipette 12,5 ml de sérum physiologique à chacun des mélanges maîtres (expérimental et de contrôle).
- Autoriser toutes les solutions pour atteindrela température ambiante avant l'injection.
- Calcul de la quantité d'ADN nécessaire en supposant 5-50 ug d'ADN plasmidique exempt d'endotoxine pour l'injection de chaque souris.
- Préparation des seringues
- Pour chaque souris, remplir un, 3 ml, de Luer-Lok seringue stérile avec la composition de l'ADN en utilisant une solution saline, une aiguille stérile de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm). Prenez soin d'éviter les bulles d'air. Évitez d'utiliser des seringues de volume plus élevé que le taux d'injection de flux ne peut pas être contrôlée très bien, et il est difficile de manipuler les grandes seringues dans une main. Éjecter tout ADN-saline mélange en excès dans le tube conique, comme cela peut être réutilisé.
- Mettez l'aiguille, une aiguille stérile de calibre 27. Remplissez l'aiguille avec le liquide complètement sans introduire de bulles d'air. Ajuster le volume du mélange d'ADN-une solution saline telle que calculée sur la base du poids de la souris.
- Ne pas laisser l'aiguille non plafonné de toucher n'importe quelle surface non stérile. Si nécessaire, les aiguilles peuvent être re-plafonnés en utilisant la technique d'une seule main: placer le bouchon sur une surface plane, insérer l'aiguille sans avoir à tenir le cap avec l'autre main et appuyez sur l'aiguille plafonnéecontre un objet dur pour fixer le capuchon sur l'aiguille. Les seringues sont maintenant prêts pour les injections de queue veineuse.
4. Livraison d'ADN hydrodynamique
- A noter que les souris anesthésiants peuvent réduire la viabilité. Évitez d'effectuer des DHG dans une salle qui est trop froid, car cela permettra également de réduire la viabilité. Si la pièce a une température ambiante de 20 ° C ou si vous utilisez l'anesthésie, placez la souris sur un coussin chauffant à 37 ° C procédure de poste pour éviter la perte de tous les animaux. Si vous utilisez l'anesthésie, veiller à ce que la bouche et le nez de la souris sont alors dégagée sur la garniture de la chaleur et d'observer la souris jusqu'à ce qu'il récupère entièrement. Ne pas retenir la nourriture ou de l'eau de la souris avant HGD.
- Réchauffer les souris à dilater les vaisseaux sanguins.
- Placer la cage de la souris (avec literie incluse) sur un tapis de chaleur pendant 5 minutes pour que la température de la litière est d'environ 38 à 39 ° C. La température doit être suffisamment bas pour maintenir les souris sur le tapis de la chaleur pour unpériode prolongée.
- Sinon, placez la souris dans un dispositif de retenue d'accès dorsal avec retenue minimale. Réchauffez la queue de la souris pendant 1 min en maintenant doucement avec un morceau de gaze humidifiée à l'eau tiède. Laisser la souris pour repositionner, si nécessaire. Essuyez la queue avec un mouchoir pour sécher.
- En variante, souris chaude en plaçant la cage sous une lampe chauffante pendant pas plus de 2 min. Si vous utilisez une lampe de chaleur, faire preuve de prudence pour éviter la surchauffe de la souris.
- Injection veine de la queue de grand volume
- Immobiliser un accès de contention dorsale sur une surface plane par un ruban de laboratoire.
- Tenant par la queue, placez la souris doucement dans le dispositif de retenue et insérer la fiche. Utilisez le moins de retenue que nécessaire pour que la queue immobilisée. Assurez-vous que la souris respire librement.
- Si la souris est en détresse à tout moment de la procédure, retirez la souris du dispositif de retenue immédiatement et laisser reposer.
- Placez la souris pourl'une des veines caudales latérale est visible. Repérez les veines caudales latérales par la recherche vers le bas à l'arrière de la souris: la ligne rouge qui dans le milieu de la queue est une artère, tandis que les lignes bleues de chaque côté de la queue sont les veines caudales latérales.
- Essuyez la queue de la souris à fond avec un tampon imbibé d'alcool.
- Avec la main non injectables, tenir la queue bien entre l'index et le majeur ainsi que la queue passe sous l'index, sur le milieu et troisième doigts et sous le petit doigt. Laisser le pouce reste libre de se déplacer. (Figure 1A)
- De l'autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d'alcool. Laisser la surface de sécher.
- Prenez la seringue chargé de l'injection à la main et en le tenant par le canon entre le pouce et les quatre autres chiffres. Ne tenez pas sur le piston.
- Placer la seringue parallèlement à la queue avec le pointage de l'aiguille en direction du corps de la souris etle biseau (arête oblique) de l'aiguille vers le haut.
- Insérez l'aiguille dans la veine de la queue. Procéder à l'injection que si la veine est correctement placé, ce qui est évident à partir de l'aiguille coulissant dans aucune résistance. Notez que la profondeur d'insertion de l'aiguille est une question de préférence personnelle cependant, l'insertion complète n'est pas recommandée en raison du risque accru de cisaillement de la veine. Évitez de déplacer l'aiguille.
- Avec le pouce de la main de la queue-tenant, fermer sur le moyeu de l'aiguille et appuyez sur moyeu contre la queue pour maintenir l'aiguille en position. Ne pas appliquer de pression extrême et ne tient pas sur l'arbre de l'aiguille, car ceux-ci entraver l'écoulement du liquide dans la veine. Tenez la queue avec l'index de façon lâche à ce point afin de ne pas entraver l'injection (figure 1A).
- Re-positionner la main une seringue de telle façon que l'index et le majeur tiennent sur la bride et le pouce est à l'extrémité du piston (Figure 1A).
- Appuyez sur le piston en un, un mouvement continu et injecter la totalité du volume de liquide dans 6-8 sec.
- Retirez l'aiguille de la veine et arrêter le saignement en appliquant une légère pression sur la queue avec un mouchoir.
- Retirez la souris de la contention et le lieu souris dans une cage de récupération placé sur le dessus d'un coussin chauffant (literie devrait être 37-38 ° C). Si la chambre d'injection est froid, cette étape est essentielle pour la survie de la souris. Tenez la queue de la souris jusqu'à ce que le saignement s'arrête complètement.
- Observez la souris pendant 1 heure après la livraison de l'ADN hydrodynamique. Une période initiale de halètement et l'immobilité est normal en raison de l'arythmie temporaire causée par HGD mais assurez-vous que la souris montre des signes de reprise dans environ 5 min. Si la respiration de la souris devient extrêmement faible, masser doucement l'abdomen de la souris pour faciliter la respiration. A noter que le taux de recouvrement peut être légèrement influencée par la souche de souris utilisée.
- la souris de retourau logement cage et veiller à ce que la souris a une offre abondante de nourriture et d'eau.
- Injection veine de la queue de grand volume en utilisant une position de la main de remplacement
- Placer la souris dans le dispositif de retenue et se préparer pour injection en suivant les étapes 4.3.1 4.3.5 à travers, comme décrit précédemment.
- Reste la main non-injection sur une surface plane avec quatre doigts pliés à un angle de quatre-vingt-degré. Les doigts (tous sauf le pouce) devraient reposer sur le dessus de l'autre, la création d'une plate-forme. Tenez la queue de la souris entre le pouce et le doigt de pointage (figure 1B).
- De l'autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d'alcool. Laisser la surface de sécher.
- Prenez la seringue avec l'injection à la main et la tenir par la bride et l'extrémité du piston, prête pour l'injection.
- Terminez la procédure en suivant ce protocole de l'étape 4.3.9 à l'étape 4.3.17, comme décrit précédemment.
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Representative Results
Le positionnement correct de l'aiguille dans la veine de la queue de la souris (comme illustré à la figure 1) est une condition préalable pour avoir réussi un transgène par transfection à base d'hydrodynamique. Souvent, la partie la plus difficile de la technique, cependant, est le maintien de l'aiguille dans la veine de la queue sans mouvement de sorte que la totalité du volume de l'injection peut être rendu dans un délai de 6-8 s. Les erreurs mineures au cours du processus d'injection peut entraîner une efficacité de transfection nettement réduite et l'expression de la protéine. Par conséquent, il est impératif de contrôler le succès de l'HGD pour chaque expérience. Si la protéine transgénique d'intérêt est difficile à détecter par western blot en raison de l'absence d'anticorps sensibles, comme dans le cas de babouin apoL-I, l'efficacité de l'injection peut être surveillée par co-injection d'un plasmide portant un gène codant pour une protéine qui est facilement détectable. Dans l'expérience représentée sur la figure 2, les souris ont été injectées avec 50pg d'un plasmide portant l'une des trois différentielle 6XHIS marqué babouin gènes PALO-I et 50 ug d'un autre plasmide (même conception de vecteur d'expression) qui transportait babouin HPR (bHPR, non balisé). Le principal objectif de cette expérience était d'évaluer si l'ajout d'une étiquette 6XHIS aux emplacements de séquences choisies interfère avec le traitement et la sécrétion de la protéine babouin PALO-je correct. Si toutefois, l'ajout de l'étiquette perturbe le repliement correct et, par conséquent, la sécrétion de la protéine, il devient difficile de déterminer si la perte de l'expression de la protéine a eu lieu en raison d'une déficience ou d'un traitement infructueux HGD. En outre, en raison de l'absence d'anticorps suffisamment sensibles, la détection directe du babouin apoL-I dans le plasma de la souris transfectée est difficile, même dans le cas d'une délivrance de gène réussie (telle que déterminée par la protection des souris contre une épreuve de trypanosome humaine infectieux). Dans cette expérience, ces questions ont été abordéespar l'addition d'une quantité équivalente de babouin HPR plasmide au mélange apoL-I HGD pour servir de commande d'injection de substitution. Comme démontré dans la figure, le babouin HPR a été fortement exprimé dans le plasma de la quasi-totalité de la souris transfectée indiquant que le HGD a réussi. Gouttes mineures dans les niveaux d'expression, comme on le voit dans l'une des deux souris du groupe I-BAPol 6XHIS 1 Sur la figure 2A, sont généralement attribuable à une très faible réduction (1-2 s) de la vitesse d'injection. Sur la figure 2B, le premier échantillon de plasma piste 1 (dans le groupe BAPol-I 6XHIS 3) montre un manque total d'expression de la protéine indiquant un échec HGD. Dans la plupart des cas, cela est dû à l'injection incomplète de la totalité du volume du véhicule de livraison. Depuis cette expérience confirme le succès de la DHG dans tous les cas sauf un, l'effet de 6XHIS marquage sur BAPol-je sécrétion peut maintenant être évaluée par un immunoblot anti-6XHIS (figure 2C et D). Comme on le voitla figure 2D, le seul groupe de souris qui avaient des niveaux détectables de protéine-6xHIS marqués dans leur plasma était le groupe 3. Le modèle d'expression de la protéine à l'intérieur de ce groupe a confirmé que l'injection de l'un de la souris dans ce groupe a été infructueuse. L'absence totale de protéines 6xHIS détectables dans les groupes 1 et 2 (figure 2C) souligne l'importance d'inclure une protéine marqueur dans le mélange d'injection pour évaluer le succès de la DHG. Sans tenir compte des niveaux de plasma de bHPR (figure 2A et B), les données de la figure 2C et D pourraient facilement être mal interprétés comme un échec de la DHG dans les groupes 1 et 2.
HGD succès du babouin composants TLF1 BAPol-I et bHPR, donne souris résistance aux parasites infectieux pour les humains Trypanosoma brucei brucei SRA (TBB-SRA, un laboratoire équivalent de T. b. Rhodesiense) 40. Cette résistance est due à l'expression transgénique de BAPol-I </ Em>, comme l'injection de bHPR seul ne fournit aucune protection contre les parasites infectieux pour les humains. Pour évaluer si les variantes 6XHIS balisés de BAPol-je encore capable de fonctionner en tant que protéines lytiques, les souris qui ont reçu à la fois BAPol-I et bHPR par HGD ont été exposés à 5000 Tbb-SRA parasites, deux jours après la livraison de gènes. Comme le montre la figure 3, les souris du groupe 2 6XHIS succombé à une infection très tôt, alors que la plupart des souris dans les groupes 1 et 3 ont survécu aussi longtemps que le contrôle positif non balisé BAPol-je. (Baboon PALO-je confère une protection partielle dans cette souche de souris.) Depuis l'expression du transgène dans le groupe 2 était universellement élevé, l'absence de protection dans ces souris peut être correctement interprété comme une perte de BAPol-je fonction lytique en raison de la balise 6XHIS à ce la position. Il faut veiller, cependant, que le prématuré (jour 7) la mort d'une souris dans le groupe 3 n'est pas mal interprété, comme cette souris n'a pas été injecté avec succès les transgènes (voir figureure 2B, voie 1). À la lumière des données combinées des figures 2 et 3, nous concluons que BAPol-I peut être étiqueté en position 3 (dans le groupe 6xHIS 3) sans effets indésirables, tandis que le marquage de cette protéine en position 2 (dans le groupe 6xHIS 2) perturbe son lytique fonction. Dans le groupe 6xHIS 1, tandis que les données sont évocateurs de la protection du nombre de souris était insuffisante pour obtenir des données significatives. analyses d'alimentation doivent être effectuées pour déterminer le nombre de souris nécessaires pour chaque expérience. Alors que le manque apparent de la protéine détectable dans le plasma de la souris du groupe 1 peut sembler contradictoire au motif de la protection montre la figure 3, noter que les anti 6xHIS blot négatif occidentale dans ce groupe peut être le résultat d'une absence de détection en raison de la transformation des protéines, plutôt que l'absence d'expression du gène. Dans le groupe 1, le mot-clé a été ajouté 6xHIS fermer après le site de clivage du peptide signal prédit. Le babouin PALO-je séquence d'acides aminés contient un predicte supplémentairesd site de clivage protéolytique d'environ 20 acides aminés à partir du site de clivage du peptide signal 40. Par conséquent, il est clair que BAPol-je dans ces souris est sécrétée et fonctionnelle encore perdu l'étiquette 6xHIS nécessaire à sa détection. Illustrant ainsi l'importance de HIS placement.
ApoL-I tue les trypanosomes africains par la formation de pores dans la membrane du lysosome parasite 36, 37. Variants naturels de PALO-je humaine, trouvés chez les personnes d'ascendance africaine récente, ont été fortement associée à la maladie rénale chez les Afro-Américains, bien que le mécanisme de dommages aux reins est encore difficile de 41, 42. Depuis HGD conduit à la plus haute expression de gène dans le foie, nous avons voulu vérifier si PALO-je homme ou sa variante de séquence synthétique provoque des dommages dans cet organe. A cette fin, des souris ont été injectées avec 50 ug de WT apoL-I humaine ou un mutant de synthèse d'acides aminés unique désigné uns K4.To évaluation des dommages du foie, nous avons mesuré aspartate aminotransférase (AST) de niveaux dans le plasma de la souris recueillies sur 2 jours après l'injection. Conformément à sa fonction lytique, WT PALO-je humaine provoque une élévation des taux d'ASAT sériques (figure 4A) par rapport aux souris de solution saline injectée. En revanche, l'injection de mutant K4, qui en diffère par un seul acide aminé, provoqué très peu de libération de l'AST. Les différences dans les lésions hépatiques sont peu susceptibles d'être attribués à des niveaux d'expression des protéines, comme les taux de protéine K4 sont équivalentes ou supérieures à celles du WT apoL-I humaine (Figure 4B). Examen de foies de souris MH recueilli 5 jours après l'injection montre que WT PALO-je humaine provoque une nécrose tissulaire limitée avec infiltration macrophagique modérée (figure 5B) par rapport aux souris de solution saline injectée qui montrent l'histologie hépatique normale (figure 5A, les zones violet) . Confirmant les données obtenues par la mesure des taux d'AST plasma, K4 injecté dans le même plasmide backgrond comme le WT montre l'histologie hépatique normale (figure 5C).
Figure 1. Illustration de positions de la main pour le MH. A.) Position 1. Recommandé position de la main pour atteindre la vitesse d'injection maximale et à éviter les mouvements de l'aiguille après l'injection a été lancé. La flèche indique le mouvement du pouce suggéré après l'insertion de l'aiguille dans la veine. Pouce doit immobiliser l'aiguille en tenant doucement le moyeu contre la queue de la souris. La main qui tient la seringue doit être repositionné pour être en mesure d'appuyer sur le piston avant l'injection. B.) Position 2. Cette position est recommandée si l'injection dans la veine caudale doit être effectué plus près de la base de la queue due à des injections répétées. Une fois que l'aiguille est insérée dans la veine, cette position de la main n'a pas besoin de fourrureajustements utres.
Figure 2 analyse Western blot de plasma recueilli de cinq semaines d'âge, les souris injectées avec un mélange de deux plasmides séparés des femmes, Swiss Webster (SW):. 50 ug babouin HPR et 50 pg de façon différentielle 6XHIS marqué gènes de babouin PALO-I. Les souris ont été injectées avec un véhicule de solution saline comme contrôle négatif. Pour confirmer le succès de HGD, cette expérience montre les taux plasmatiques circulants de la protéine babouin HPR, comme le babouin PALO-I est difficile à détecter. Des échantillons de plasma de souris ont été prélevés des niveaux d'expression 2 jours après MH et de protéines ont été analysés par western blot (plasma dilué 1:20) sur 10% de gels de Polyacrylamide Tris-glycine dans des conditions dénaturantes, les conditions non réductrices. HPR a été détectée en utilisant un anticorps polyclonal de lapin contre l'haptoglobine humaine (HP), qui a également recognizes babouin HPR. Tagged BAPol-je été détectée en utilisant un anticorps polyclonal de lapin contre un tag 6xHIS. Les poids moléculaires des protéines 6xHis le contrôle sont inclus 40 et 50 kDa. A.) Panel montre un exemple d'une analyse western blot de la protéine sécrétée (HPR) lorsque toutes les souris dans un groupe ont été injectées avec succès. Notez l'expression de la protéine uniformément élevé dans le deuxième groupe HIS-étiqueté (BAPol groupe I-6XHIS 2), où l'injection a été très réussie. Dans le premier groupe (groupe I-BAPol 6XHIS 1), l'expression des protéines à partir de l'un de la souris est en avant, mais quelque peu réduite, probablement en raison de la vitesse réduite de l'injection. B.) panneau montre un exemple des niveaux d'expression de protéines lorsque l'un des injections (en BAPol groupe I-6XHIS 3) a été infructueuse. C) Groupe démontre l'importance d'inclure une protéine marqueur (bHPR) pour évaluer le succès de HGD lorsque la détection de la protéine d'intérêt (BAPol-I) est incertain. Malgré le succès confirmé de la DHG dans BAPol-je
Figure 3. Survie des souris exprimant babouin variantes PALO-je 6xHIS et babouin HPR. Cinq semaines d'âge, des femmes, des souris Swiss Webster a reçu 50 pg de chacun des deux plasmides séparés par HGD dans le même mélange d'injection. Les souris utilisées dans cette expérience répondent à l'analyse du plasma sur la figure 2. Au jour 2 post-injections, les souris ont été infectées avec des parasites Tbb 5000-SRA-infectieux humains et la parasitémie a été suivie. Lorsque la parasitémie atteint 10 9 parasites / ml, les souris ont été euthanasiées. La survie était significativement différent du contrôle saline indication (* - P <0,05, log-test de rang). La survie des souris lors de l'épreuve de parasite est un exemple de comment le succès de HGD influence des données obtenues à partir des expériences ultérieures. Lorsque babouin apoL-I est injecté avec succès, le produit du gène est sécrété dans le sang de la souris où il est repris par des trypanosomes humains et tue-infectieux. La courbe de survie montre que les souris injectées avec la version de tags 6xHIS 3 de babouin PALO-I ont été considérablement protégé contre Tbb-SRA. Le seul décès prématuré dans ce groupe correspond à la souris qui n'a pas été injecté avec succès avec le plasmide portant le transgène (voir figure 2). Cette souris devrait être exclu de l'analyse de survie que sa survie lors de l'épreuve de parasite n'est pas attribuable à des différences du transgène reçues, mais à l'échec de la livraison de gènes.
Figure 5. Une substitution d'un seul acide aminé dans les résultats apoL-I séquence à différents niveaux de la pathologie du tissu. La figure montre les foies de souris SW qui ont reçu des injections hydrodynamiques du véhicule salin (A), 50 ug humaine WT PALO-I (B), ou 50 pg d'un variant mutant synthétique de PALO-je, K4 (C). Foies ont été enlevés le jour 5 post-injection et traitées à l'hématoxyline et à l'éosine. Des exemples représentatifs sont présentés de la même souris testées pour les niveaux d'AST dans la figure 4. Panneaux (DF) montrent d'autres exemples de zones endommagées chez les souris WT. foyers de nécrose dans les panneaux (B), (DF) sont repérés par des rectangles noirs et sont agrandies. Les flèches blanches dans ces panneaux indiquent les zones d'infiltration des macrophages. A titre de comparaison, Un tissu normal à partir d'une zone représentative du foie d'une souris de véhicule à injection saline est marqué par un rectangle bleu clair et est également agrandie. Panneaux (B) et (D) sont des images représentatives de la même souris WT, tandis que les panneaux (E) et (F) sont de deux souris WT différents.
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Discussion
Quand elle est réalisée correctement, HGD est un moyen remarquablement efficace et sans danger de la livraison du transgène. Les étapes essentielles à la réussite de HGD sont: 1) fournir la bonne quantité d'ADN dans un grand volume d'eau salée véhicule 2) dans la veine de la queue de la souris 3) en moins de 8 secondes.
Bien que le processus d'injection elle-même exige indéniablement une certaine dextérité manuelle, le succès de cette deuxième procédure de six réside souvent dans une préparation minutieuse de l'expérience. La quantité d'ADNp nécessaire pour obtenir une expression maximale du gène peut varier fortement en fonction du plasmide utilisé et le gène à exprimer par conséquent, la quantité optimale d'ADN à injecter doit être déterminée expérimentalement pour chaque application. Pour les souris, l'intervalle recommandé d'ADN est en général de 5 à 50 pg, au-delà de laquelle l'expression du gène peut atteindre un plateau. Dans nos mains, l'injection de 50 pg pRG977 portant soit le PALO-je ou gène HPR conduit à des niveaux élevés de circulating taux de protéines dans les deux premiers jours après HGD. niveaux de deux protéines du sang diminuent de façon significative au cours des prochains jours jusqu'à ce que les niveaux de protéines tomber en dessous des niveaux détectables autour de 10 jours (38 et données non publiées). La quantité optimale de l'ADN doit être délivré dans une solution physiologique équivalente à 8-12% du poids corporel de la souris 1, 2. Alors que la plupart des chercheurs, y compris nous, utilisent une solution saline comme le véhicule d'injection, la solution de Ringer a été utilisé pour HGD avec succès comparable 2. Notez que, bien qu'il n'est pas nécessaire d'effectuer HGD dans un environnement stérile, il est impératif d'éviter toute contamination par des endotoxines de la solution d'injection pendant toute la procédure. A cette fin, la solution saline utilisée pour les injections doivent être de qualité supérieure et de l'ADN à injecter doit être préparé en utilisant un kit disponible dans le commerce qui élimine l'endotoxine. Une autre étape préparatoire importante est le peser avec soin les souris. Etant donné que lele volume d'injection est l'un des aspects essentiels de la réussite HGD, il est important de s'assurer que la souris n'est pas sous-dosé, ni sur-dosé avec une solution saline. Les résultats antérieurs d'erreur dans la transfection optimale, tandis que le dernier dans la mort possible de l'animal. Pour assurer davantage la sécurité des animaux, nous recommandons de charger les seringues avec aiguille de petit calibre pour éviter d'introduire des bulles d'air petits qui sont difficiles à se débarrasser. HGD doit être effectuée avec un 27 - aiguille de calibre tel que décrit dans le protocole.
Injection correcte est grandement facilitée si les veines caudales sont clairement visibles. Dilatant les vaisseaux sanguins par un léger chauffage de la souris peut faciliter la visualisation des veines si un dispositif de retenue avec une queue-illuminateur n'est pas disponible. Placer la cage de la souris sur un tapis de chaleur pendant quelques minutes ou tenant la queue avec un travail de tissu chaud et humide bien dans nos mains. Si vous utilisez une lampe de chaleur, il faut être extrêmement prudent de ne pas surchauffer les souris. Nous constatons que nousment une lampe de chaleur provoque le stress inutile de souris et de l'inconfort et doit donc être évitée. L'essuyage de la queue avec 70% d'éthanol permet en outre la visualisation en augmentant le contraste entre la veine de la queue et la peau. Cette étape est également essentielle pour éviter la contamination bactérienne lors de l'injection. Une fois que la souris est préparée pour l'injection, la veine de la queue peut être injecté en utilisant une ou l'autre des positions de la main décrites dans ce protocole. Notez que, bien que la position 2 semble plus facile et plus simple, il peut être plus difficile d'injecter la totalité du volume de liquide, sans déplacer la seringue. En revanche, l'établissement d'une bonne position de l'aiguille à l'aide de la première méthode est cependant plus lourde, une fois que le moyeu de l'aiguille est fermement maintenu contre la queue, injection manque rarement. La première méthode est également recommandé pour une vitesse maximale, bien que la transfection réussie est possible en utilisant soit la position de la main.
La vitesse recommandée de l'injection chez la souris HGD est de 6-8 sec, biende nombreux auteurs suggèrent que les injections rapides donnent des résultats encore meilleurs 1, 12. Résultats d'injection lente de l'expression génique nettement réduite. Cependant, la raison la plus courante pour une absence totale de l'expression des gènes est l'impossibilité de livrer la totalité du volume d'injection. Cela se produit lorsque l'aiguille est déplacée, après l'injection a été initié. Correctement positionné, l'aiguille pénètre dans la veine sans résistance. Pour vérifier que l'aiguille est insérée dans la veine correctement, on peut injecter une très petite quantité (100 pi) de liquide dans la veine avant l'injection complète. Si vous appuyez sur le piston rencontre une résistance extrême, l'aiguille est dans une mauvaise position et le liquide pénètre dans le tissu de la queue. Si l'aiguille quitte la mi-injection veine, la correction de la DHG pas réussi, peut être tenté après on a laissé la souris pour se reposer pendant quelques heures. Re-injection après un repos insuffisant provoque une détresse à la souris et peut entraîner une perte de pressur hydrodynamiquee par l'ouverture de la première plaie sur la queue de la souris. Si des injections répétées sont nécessaires, la souris peut être injecté avec le plein volume de solution saline (et quantité d'ADN), soit près de la base de la queue dans la même veine ou dans la veine controlatérale. Après HGD, la souris doit être observée dans une cage placée sur un tapis de chaleur pour au moins une heure. HGD provoque une forte augmentation de la pression intra-vasculaire qui entraîne une irrégularité aiguë de la fonction cardiaque, l'expansion du foie, et une perturbation des pores de la membrane des cellules du foie, et des sinusoïdes fenestrae 12, 14, 43. Malgré le doublement de leur volume de sang dans quelques secondes, les souris tolèrent HGD remarquablement bien. Les rendements de la fréquence cardiaque à la normale en 2 min et la pression intravasculaire, ce qui diminue rapidement dès après l'injection, les approches des niveaux de base en 3 min 12, 43. Les hépatocytes perturbé reboucher en moins de 2 min et le foie rendements de taille élargisà la taille normale en 30 min suivie par la récupération de la fonction sinusoïde dans environ 24 heures 43. Alors que de nombreux chercheurs utilisent l'anesthésie avec succès, dans nos mains, l'anesthésie isofluorane aggrave la détresse respiratoire de souris en raison de HGD. Nous constatons que les souris anesthésiées prennent plus de temps pour récupérer et parfois nécessiter une réanimation pour la survie. Si l'injection d'un grand groupe de souris à l'aide de l'anesthésie, il peut être nécessaire d'avoir une personne supplémentaire dans la salle dédiée à surveiller le bien-être des animaux se rétablissent. Sans anesthésie, même après injections répétées, la survie de la souris est de 100% et le temps de récupération est inférieure à 5 minutes.
Le protocole décrit ici peut être utilisé pour délivrer une large gamme de molécules dans le foie de la souris. Utilisation de la protéine sécrétée apoL-I, par exemple, nous avons montré comment HGD pourrait être utilisé pour établir un modèle de souris et d'étudier la fonction d'une protéine protectrice. Lorsque l'on compare la fonction de divers produits de gènes, l'success du HGD doit être évaluée chaque fois que possible. Pour les protéines sécrétées, il est facile de surveiller les niveaux d'expression par l'analyse du plasma de souris en utilisant western blot (figures 2 et 4B.) Il est particulièrement important pour assurer le succès de la DHG lors du dosage de variants naturels ou synthétiques d'une protéine thérapeutique, que l'efficacité de la transfection peut fortement influencer l'issue des maladies (figures 2 et 3). Des exemples sont donnés pour montrer comment ce procédé peut être étendu à l'analyse des dommages au foie causés par APOLI, qui est une protéine formant des pores (figures 4 et 5). Des variants de séquence d'apoL-I dans le même résultat de fond de plasmide dans des profils nettement différents de dégâts. Ceci suggère que les lésions des tissus est associée à la fonction des protéines et pas le vecteur d'expression ou le traumatisme de l'injection elle-même. Il convient de noter que, dans nos mains, d'AST sont universellement haute au jour 1 post-injection (données non présentées). Le jour 2, cependant, les niveaux AST de souris dansprojetée avec une solution saline retour à la normale et les différences entre les variantes génétiques sont facilement reconnaissables (Figure 4). Au jour 3 post-injection, AST mesurée dans tous les traitements revenir à leur niveau de base (données non présentées). Étant donné que le tissu nécrotique et de l'inflammation dans le foie sont évidentes plus d'une augmentation transitoire de l'AST, lésion hépatique due à l'expression du gène prolongée peut être évaluée de façon plus fiable, mais qualitativement, par la coloration des foies prélevés au jour 5 post-injection. Les exemples donnés montrent que les variantes de PALO-je qui provoquent une augmentation de la libération de l'AST 2 jours après l'injection entraînent également des dommages au foie plus soutenue évaluée par coloration à l'hématoxyline et de l'éosine.
La délivrance de gènes hydrodynamique permet l'analyse rapide de l'expression des gènes in vivo. Elle nécessite la construction simple du gène à l'étude dans un vecteur d'expression eucaryote et la capacité d'effectuer l'injection tel que décrit ci-dessus. Génération de transgesouris nic utilisant d'autres formes de prestation de gène, tels que les vecteurs lentiviraux recombinants dérivés du VIH-1 ou recombinants vecteurs viraux adéno-associés, nécessitent beaucoup plus de connaissances spécialisées. Cependant, leur avantage est soutenue expression des gènes, bien que l'expression des gènes viraux provoque souvent une réponse inflammatoire due à l'hôte de détection d'une infection virale et la réponse 15 à 19. En outre, les vecteurs viraux ont une capacité limitée d'emballage et donc, sont limités dans la taille du gène, alors que taux d'alcoolémie de 150kb ont été utilisés avec succès dans HGD 4. Après la maîtrise de cette technique, l'utilisateur peut transfecter un acide nucléique (ADNc ou ADNg ou d'ARN) in vivo et le suivi de la production de protéine et les conséquences biologiques. La protéine peut être intracellulaire, liée à la membrane ou extracellulaire; il peut être marqué ou modifié à l'acide nucléique et le niveau d'acide aminé ainsi. Plus important encore, il s'agit d'une technique très simple et rapide.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) pour d'abord nous enseigner la technique HGD et le Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) pour son orientation permanente dans divers aspects de la technologie. Ce travail a été financé par Hunter College, CUNY fonds de démarrage et d'attribution NSF pain IOS-1249166. Nous remercions la subvention d'appui NYULMC histopathologie base NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 pour l'histologie sur des foies de souris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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