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Biology

Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen

Published: May 5, 2014 doi: 10.3791/51481
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

Summary

In-vivo-Transfektion von nackter DNA durch hydrodynamische Genübertragung führt Gene in das Gewebe eines Tieres mit minimalen Entzündungsreaktion. Ausreichende Mengen an Genprodukt erzeugt werden, so dass Genfunktionen und Regelung sowie die Proteinstruktur und Funktion untersucht werden.

Abstract

Effiziente Expression von Transgenen in vivo ist von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung der Genfunktion und der Entwicklung von Behandlungen für Krankheiten. In den letzten Jahren hat hydrodynamische Gentransfer (HGD) als eine einfache, schnelle, sichere und effektive Methode für die Bereitstellung von Transgenen in Nagetiere entstanden. Diese Technik beruht auf der von der schnellen Injektion einer großen Menge einer physiologischen Lösung, um die Durchlässigkeit der Zellmembranen des perfundierten Organen erhöhen erzeugte Kraft und liefern somit DNA in Zellen. Einer der Hauptvorteile der HGD ist die Fähigkeit, Transgene in Säugerzellen unter Verwendung nackter Plasmid-DNA (pDNA) einzuführen. Einführen eines exogenen Gens unter Verwendung eines Plasmids ist minimal aufwendig, sehr leistungsfähig und im Gegensatz zu viralen Träger, bemerkenswert sicher. HGD wurde ursprünglich verwendet, um Gene in Mäuse zu liefern, wird nun verwendet, um eine Vielzahl von Stoffen, einschließlich Oligonukleotide, künstliche Chromosomen, RNA, Proteine ​​und kleine Moleküle in Mäuse, Ratten liefernund bis zu einem begrenzten Grad, andere Tiere. Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen und konzentriert sich auf drei zentrale Aspekte der Methode, die entscheidend für den erfolgreichen Durchführung des Verfahrens sind: richtige Einführen der Nadel in die Vene, das Injektionsvolumen und die Geschwindigkeit der Lieferung. Beispiele werden gegeben, um die Anwendung dieser Methode auf die transiente Expression von zwei Genen, die abgesondert wird, Primaten-spezifische Proteine ​​kodieren zeigen, Apolipoprotein LI (APOL-I) und Haptoglobin-related protein (HPR).

Introduction

Seit der ersten Beschreibung von Liu et al. Und Zhang et al., Hydrodynamische Gentransfer (HGD) hat sich ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung der Genfunktion in Nagetier-Modellsysteme 1, 2. Die Technik beinhaltet die schnelle Injektion (5-7 sec) von einem großen Volumen (8-12% des Körpergewichts) der Lösung in die Schwanzvene von Mäusen, die Aufnahme von Plasmid-DNA durch die Zellen des Zielorganen 1, 2 zu erleichtern. Diese Bedingungen führen zu robusten Genexpression in der Leber und weniger Gen-Expression in der Niere, Milz, Lunge und Herz.

Injektion von 10 ug pCMV-LacZ-Plasmid kann so viel wie 40% der Leberzellen zu transfizieren, so dass HGD die effizienteste, nicht-viralen, in vivo Genübertragung Verfahren Beginn 1. Anders als Virusträger, ist pDNA einfach zuzubereiten, ist eine Immunantwort in der Nagetier-Host 3 nicht zu entlocken ist und nicht ein Gesundheitsrisiko darstellen durch Rekombination mit Endeexogenen Viren. Zusätzlich kann, da die DNA-Moleküle durch HGD geliefert brauchen nicht Verpackung, eignet sich dieses Verfahren für die Bereitstellung von künstlichen Bakterienchromosomen (BAC) so groß wie 150 4 kb. Andere Arten von Molekülen, die durch ein hydrodynamisches Verfahren geliefert worden sind, umfassen RNA 5-10, 11 Morpholinos, Proteine ​​12, 13 und andere kleine Moleküle 12, 14. Die Vor-und Nachteile der HGD gegenüber anderen Versandmethoden sind in sehr guten Bewertungen in der Literatur 15-20 diskutiert und eine Reihe von Autoren haben eine detaillierte Beschreibung der Vorgehensweise 21 bis 23 vorgesehen.

Einführen von Transgenen in Mäusen durch HGD ist sicher und wirksam 1-3, 24 und das Verfahren wurde bei Ratten mit vergleichbarem Erfolg 25 verwendet. Mit gewissen Modifikationen, Proof-of-Concept-Experimente wurden in 26 Hühner, Kaninchen durchgeführtBits 27 und 28 Schweine, obwohl die in vivo Anwendung dieser Technik bei größeren Tieren bleibt eine Herausforderung. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist eine weitere gemeinsame Einschränkung, dass viele der verfügbaren Säugetierexpressionsvektoren nicht über die Komponenten, um eine anhaltende, hohe Genexpression zu erreichen. Mit einem pCMV-Luc-Plasmid, die Genexpression in den Zielorganen ist offensichtlich so früh wie zehn Minuten nach HGD fällt jedoch die anfängliche, hohe Expressionsniveau stark in der ersten Woche nach der Injektion ein. Langzeit-Expression des Transgens ist möglich, je nach dem Promotor und Intron in Plasmid-Design 3, 24 jedoch, Wartung von High-Level-Genexpression erfordert häufig wiederholte Injektionen verwendet. Aus diesem Grund könnte HGD weniger geeignet, um chronische Krankheiten, die eine Folge der langfristigen Exposition gegenüber schädlichen Proteine ​​oder Proteinprodukte sind zu studieren. Mit diesen Einschränkungen ist HGD ein außergewöhnlich leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der pozial Rolle des Gens und die Wirkung davon Mutanten in vivo, als auch die therapeutischen Wirkungen und Regulation von Proteinen und für die Festlegung von Tiermodellen der Erkrankung (für eine Übersicht siehe 15). Zum Beispiel kann verwendet werden, um Funktion HGD, Domains und Aminosäuren von Proteinen durch Einbringen individuell verschiedene Genkonstrukte in Mäusen, wurden die entsprechenden Gene ausgeknockt zuzuweisen. Darüber hinaus kann diese Technik in jedem Mausstamm verwendet werden.

Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen mit einem Fokus auf die technischen Aspekte notwendig, um eine erfolgreiche Transfektion zu erreichen: Die richtige Nadeleinführung in die Vene, Einspritzmenge und die Geschwindigkeit der Lieferung. Die Anwendung dieses Verfahrens ist in einem Mausmodell der afrikanischen Trypanosomiasis, einer tödlichen Erkrankung von Mensch und Vieh 29, 30 gezeigt. Während einige Arten der Trypanosomen verursachen Krankheit in Nutztiere, können die meisten nicht-Krankheit beim Menschen durch Immunkomplexe in b angeborenen verursachenlood genannt Trypanosomen lytische Faktoren (Tlfs) 29, 31, 32. Diese porenbildenden, hochdichten Lipoproteinen (HDL) enthält zwei einzigartige, Primaten-spezifischen Proteinen:. HPR, die Liganden, die die Aufnahme von Tlfs in Trypanosomen erleichtert und APOL-I, die lytische Komponente 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense der Lage ist, Menschen aufgrund der Expression eines mit Serumresistenz assoziierten Proteins (SRA), das bindet und neutralisiert menschliche APOL-I 34, 39 zu infizieren. Baboon TLF wird nicht von SRA aufgrund ihrer divergierenden APOL-I-Protein 40 neutralisiert. Wie bereits berichtet, mit einem Säugetier-Expressionsvektor (pRG977), transgenen Expression von Pavian TLF-Komponenten in Mäusen einen Schutz gegen die Menscheninfektiösen Trypanosomen 40. Die hier präsentierten Daten demonstrieren, wie repräsentativ hydrodynamischen Genübertragung angewendet werden, um die therapeutischen Wirkungen des Proteins zu untersuchen.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Hunter College, City University of New York zugelassen.

1. Vorbereitung der Endotoxin-freiem Plasmid-DNA

  1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von Bakterien, die das Gen von Interesse in einer Säugetier-Expressionsvektor von einer frisch ausgestrichenen selektive Platte.
  2. Folgen Sie den Empfehlungen im Handbuch eines handelsüblichen Endotoxin-freie Plasmid-Reinigungs-Kits für den Anbau und die Ernte Bakterien gefunden.
  3. Reinige den Endotoxin-freie Plasmid-DNA aus Bakterienzellen durch nach dem Protokoll von einem kommerziell erhältlichen Endotoxin-freiem Plasmid-Reinigungskits.
  4. Verwenden Endotoxin-freiem Kunststoff-ware und Griff-DNA mit darauf, dass Endotoxin wird nicht in der DNA-Probe nach dem Entfernen Schritt wieder eingeführt.
  5. Messung der Konzentration von Endotoxin-freiem Plasmid-DNA durch Bestimmung seiner Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines MICRo-Volumen UV-Spektrophotometer wie unten beschrieben, oder ein Standard-Küvetten-basierte Spektralphotometer.
    1. Reinigen der unteren und oberen optischen Oberflächen der Mikro Spektrophotometer Probenhaltesystem wie folgt. Je 1 ul sauber VE-Wasser auf die untere optischen Systems. Schließen Sie den Hebelarm und tippen Sie es ein paar Mal, um die obere optische System zu baden, dann den Hebel zum Öffnen und wischen Sie mit einem Gewebe.
    2. Öffnen Sie die Software von der Mikro-Spektralphotometer und wählen Sie die Nukleinsäuren-Modul.
    3. Platz 1 ul sauber VE-Wasser auf der unteren optischen System, senken Sie den Hebelarm und wählen Sie "initialisieren" aus dem Programm-Software. Sobald die Initialisierung abgeschlossen ist, reinigen Sie beide optischen Flächen mit einem Tuch ..
    4. Führen Sie Blindmessung durch Laden von 1 ul der Endotoxin-freiem TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) und wählen Sie "blank" aus dem Programm-Software. Sobald Leermessung durchgeführt wird, sauber sowohl optischen Oberflächen mit einemGewebe.
    5. Führen Probenmessung durch Laden 1 Mikroliter Endotoxin-freie DNA-Probe und wählen Sie "Maßnahme" aus der Programm-Software. Notieren Sie sich die DNA-Konzentration. Bewerten DNA Reinheit durch die Aufnahme der Absorptionsverhältnis 260/280 nm, die auf dem Bildschirm erscheint. Da die Verwendung von reiner DNA (260/280 Verhältnis von 1,8) für HGD ist sehr wünschenswert, zu vermeiden, mit einer DNA-Probe mit einem Verhältnis von 260/280 unter 1,7. Nach Messung durchgeführt wird, reinigen Sie beide optischen Flächen mit einem Tuch.

2. Wiegen der Mäuse

  1. Mark Mäuse in einer angemessenen Art und Weise für den Stamm. Hinweis: Kennzeichnung der Schwanz wird für dieses Verfahren nicht empfohlen.
    1. Mark Mausarten, die weißes Fell (z. B. Swiss Webster) auf dem Rücken mit einem schwarzen Marker zu haben. Wenden Marken im Laufe der Zeit wie nötig.
    2. Mark Mausarten, die schwarzes Fell (zB C57BL / 6) mit dem Ohr haben Stanzen mehrere Tage im Voraus.
  2. Wiegen Mäuse individually vorsichtig, indem sie in einem Tier Waagschale oder Eimer auf einem digitalen Laborwaage gelegt. Das Gewicht jeder Maus in dem Experiment verwendet, am Tag des Experiments.

3. Vorbereitung von Spritzen

  1. Herstellung der Injektionsmischung
    1. Berechnen der Menge an DNA unter der Annahme, 5 erforderlich - 50 ug Endotoxin-freie Plasmid-DNA für die Injektion von jeder Maus.
      1. Bestimmung der optimalen Menge an Plasmid-DNA experimentell.
      2. Bei der Bestimmung der Menge an DNA benötigt wird, übernehmen Injektion einer zusätzlichen Maus pro Gruppe, wie eine ordnungsgemäße Ladung der Spritzen einige zusätzliche Injektion Mix erforderlich. Um Berechnungen zu helfen, sollten Sie das folgende Beispiel: injizieren 4 Versuchs und 4 Kontroll-Mäusen, einem Gewicht von jeweils 25 g, mit 50 ug Plasmid-DNA pro Maus. Um die Menge an DNA in diesem Fall notwendig zu bestimmen, berechnet mit 5 Mäusen pro Gruppe: 5 x 50 = 250 &mgr; g pro &mgr; g DNA Gruppe benötigt.
    2. Bestimmung der Menge an Salzlösung (0,9% Natriumchlorid) unter der Annahme von 10% des Körpergewichts für die Injektion von jeder Maus erforderlich.
      1. Gemäß dem obigen Beispiel injizieren je 25 g Maus mit 50 ug Plasmid-DNA in 2,5 ml Kochsalzlösung (2,5 g Flüssigkeit).
      2. Bei der Bestimmung der Menge an Kochsalzlösung für eine ganze Gruppe von Mäusen erforderlich, übernehmen Injektion einer zusätzlichen Maus pro Gruppe, um eine ordnungsgemäße Beladung der Spritzen zu ermöglichen. Berücksichtigung des Experiments gegeben, die Berechnung der Menge an Kochsalzlösung für 5 Mäuse in jeder Gruppe benötigt: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml Kochsalzlösung für jede Gruppe (oder 25 ml insgesamt). Hinweis: Wenn Mäusen innerhalb der gleichen Gruppe sind nicht das gleiche Gewicht (mehr als 10% Unterschied im Körpergewicht), bereiten Injektion vermischt sich getrennt.
    3. Verwenden Konservierungsmittel-und Endotoxin-frei, steriler Kochsalzlösung, die für den menschlichen Gebrauch zugelassen wurde, in 10 ml, Mehrfachnutzung Fläschchen.
    4. Verwendung einer 20-Gauge-Nadel (0,9 mm x 25 mm) mit einem Luer-Lock-Spitze einer 20 ml-Spritze angebracht ist,ziehen Sie die Flüssigkeit aus Salzfläschchen und leeren die Spritzen in einen 50 ml konischen Röhrchen. Um genaue Pipettieren von Salz während der Herstellung der DNA-Kochsalzinjektion Mischungen helfen, sammeln mehr als Salzlösung für die Injektion von allen Mäusen in dem Experiment benötigt. Für das Experiment oben zurückzuziehen Kochsalzlösung aus 3, 10 ml Vials (insgesamt etwa 30 ml), selbst wenn die berechnete Menge von Kochsalzlösung für das Experiment erforderlich ist, ist nur 25 ml.
    5. Pipettieren die berechnete Menge an DNA in einen anderen 50 ml konischen Röhrchen. Achten Sie darauf, nicht auf die Seite der Röhre mit der Pipette Körper zu berühren, um die Einführung von Endotoxin zu vermeiden. Gemäß dem Beispiel, pipettieren 250 ug und 250 ug Steuer experimenteller Plasmid-DNA in separaten konischen Röhrchen.
    6. Die erforderliche Menge an Salzlösung mit der DNA unter Verwendung einer serologischen Pipette. In Anbetracht der Proben Experiment Pipette 12,5 ml Kochsalzlösung zu jeder der Master-Mixe (Versuchs-und Kontroll).
    7. Lassen Sie alle Lösungen zu erreichen,Raumtemperatur vor der Injektion.
  2. Vorbereitung von Spritzen
    1. Für jede Maus Füllen eines sterilen 3 ml, Luer-Lock-Spritze mit der DNA-Kochsalzmischung mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel (0,9 mm x 25 mm). Achten Sie darauf, um Luftblasen zu vermeiden. Vermeiden, mit höheren Volumen Spritzen als die Strömungsgeschwindigkeit der Injektion kann nicht sehr gut gesteuert werden und es schwierig ist, größere Spritzen in einer Hand manipulieren. Werfen Sie überschüssiges DNA-Salzmischung zurück in den konischen Rohr dies auch sein mag wieder verwendet werden.
    2. Wechseln Sie die Nadel in einem sterilen, 27-Gauge-Nadel. Füllen Sie die Nadel mit der Flüssigkeit vollständig, ohne dabei Luftblasen. Stellen Sie die Lautstärke der DNA-Kochsalzmischung als bezogen auf das Gewicht der Maus berechnet.
    3. Lassen Sie das nicht begrenzten Nadel nicht mit einer nicht-sterilen Oberfläche berühren. Falls erforderlich, können Nadeln wieder verschlossen mit der Ein-Hand-Technik werden: Legen Sie den Deckel auf eine ebene Fläche, die Nadel legen, ohne das Festhalten an der Kappe mit der anderen Hand und drücken Sie die bedeckten Nadelgegen einen festen Gegenstand, den Deckel auf die Nadel zu sichern. Die Spritzen sind nun bereit für Schwanzvene Injektionen.

4. Hydrodynamische DNA-Abgabe

  1. Beachten Sie, dass Anästhesie Mäuse können Lebensfähigkeit zu reduzieren. Vermeiden Sie es, HGD in einem Raum, der zu kalt ist, da dies auch zu einer Verminderung Lebensfähigkeit. Wenn der Raum hat eine Umgebungstemperatur von 20 ° C oder bei Verwendung von Anästhesie, legen die Mäuse auf einem Heizkissen bei 37 ° C nach dem Eingriff festgelegt, um den Verlust von Tieren zu vermeiden. Bei der Verwendung von Anästhesie, sicherzustellen, dass der Mund und Zunge des Maus frei sind, während auf dem Heizkissen und beobachten Sie die Maus, bis es vollständig erholt. Keine Lebensmittel oder Wasser zurückzuhalten, nicht von den Mäusen vor der HGD.
  2. Wärmen Sie die Maus, um die Blutgefäße erweitern.
    1. Platzieren Sie die Maus Käfig (mit Einstreu) auf einem Heizkissen für 5 Minuten, so dass die Temperatur der Betten beträgt ca. 38-39 ° C. Die Temperatur sollte niedrig genug, um die Mäuse auf dem Heizkissen für eine haltenZeitraum verlängert.
    2. Alternativ legen Sie mit der Maus in einen dorsalen Zugang Rainer mit minimaler Zurückhaltung. Wärmen Sie den Schwanz der Maus für 1 min durch leichtes Halten Sie es mit einem Stück Gaze in warmem Wasser benetzt. Ermöglichen Maus neu zu positionieren, wenn nötig. Wischen Sie den Schwanz mit einem Tuch zu trocknen.
    3. Alternativ warme Maus, indem der Käfig unter einer Wärmelampe für nicht mehr als 2 min. Bei Verwendung einer Wärmelampe, Vorsicht walten lassen, um eine Überhitzung der Maus zu vermeiden.
  3. Large-Volume-Injektion in die Schwanzvene
    1. Immobilisieren einen dorsalen Zugang Rainer auf einer ebenen Fläche durch Labor Band.
    2. Halten am Schwanz, die Maus sanft in den Restrainer und den Stecker. Verwenden Sie so wenig Zurückhaltung wie nötig, um den Schwanz zu halten immobilisiert. Stellen Sie sicher, dass die Maus frei zu atmen.
    3. Wenn die Maus ist in schwere Bedrängnis zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens, entfernen Sie die Maus aus dem Restrainer sofort und lassen Sie es ruhen.
    4. Bewegen Sie die Maus soeiner der lateralen Schwanzvenen sichtbar ist. Suchen Sie die seitlichen Schwanzvenen suchen Sie gerade nach unten an der Rückseite der Maus: Die rote Linie in der Mitte des Schwanzes läuft eine Arterie, während die blauen Linien auf beiden Seiten der Schwanz sind die seitlichen Schwanzvenen.
    5. Wischen Sie den Schwanz der Maus gründlich mit einem Alkoholtupfer.
    6. Verwendung der Nicht-Einspritz Hand den Schwanz fest zwischen Zeigefinger und Mittelfinger, so dass der Schwanz tritt unter dem Zeigefinger über den mittleren und dritten Finger und unter dem kleinen Finger. Lassen Sie den Daumen frei beweglich zu bleiben. (1A)
    7. Mit der anderen Hand, wischen Sie die Fläche wieder mit einem Alkoholtupfer eingespritzt werden. Ermöglichen Bereich zu trocknen.
    8. Nehmen Sie den geladenen Spritze mit der Injektions Hand und halten Sie sie durch den Lauf zwischen Daumen und den anderen vier Ziffern. Nicht auf die Kolben nicht festhalten.
    9. Positionieren der Spritze parallel zum Heck mit der Nadel in Richtung des Körpers der Maus unddie Schräge (schräge Kante) der Nadel nach oben zeigt.
    10. Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene. Weiter mit der Injektion, wenn die Vene vollständig entfernt, was sich von der Nadel Einschieben ohne Widerstand. Beachten Sie, dass die Tiefe der Nadelung ist eine Frage des persönlichen Geschmacks jedoch das vollständige Einführen aufgrund eines erhöhten Risikos für das Scheren der Vene empfohlen. Vermeiden Bewegen der Nadel.
    11. Mit dem Daumen der Schwanz an der Hand, und schließen Sie auf der Nabe der Nadel und drücken Nabe gegen den Schwanz, um die Nadel in Position zu halten. Extremen Druck nicht und sind nicht auf Nadelschaft zu halten, da diese die Strömung der Flüssigkeit in die Vene behindern. Halten Sie den Schwanz mit dem Zeigefinger locker an dieser Stelle, um nicht zu behindern Injektion (Abbildung 1A).
    12. Re-Positionierung des Spritzenhalte Hand, so dass der Zeigefinger und Mittelfinger sind auf den Flansch Halten und der Daumen auf das Ende des Kolbens (FigurE 1A).
    13. Drücken Sie auf Kolben in einem, kontinuierliche Bewegung und injizieren das volle Volumen der Flüssigkeit in 6-8 sek.
    14. Entfernen Sie die Nadel aus der Vene und die Blutung zu stoppen durch leichten Druck auf den Schwanz mit einem Gewebe.
    15. Entfernen Sie mit der Maus aus dem Restrainer und Ort der Maus in eine Erholungskäfig auf einem Heizkissen platziert (Bettwäsche sollte 37-38 ° C sein). Wenn der Injektionsraum kalt ist, ist dieser Schritt nicht entscheidend für das Überleben der Mäuse. Halten Sie auf den Schwanz der Maus, bis Blutung stoppt vollständig.
    16. Beachten Sie die Maus für 1 h folgende hydrodynamischen DNA Lieferung. Eine erste Frist von Keuchen und Unbeweglichkeit ist normal aufgrund der temporären Herzrhythmusstörungen verursacht durch HGD aber stellen Sie sicher, dass die Maus zeigt Anzeichen der Erholung in ca. 5 min. Wenn das Atmen der Maus wird überaus flach, sanft massieren den Bauch der Maus, um die Atmung zu erleichtern. Beachten Sie, dass Verwertungsquote kann etwas von der Mausstamm verwendet, beeinflusst werden.
    17. Zurück Mausbis Gehäusekäfig und sicherzustellen, dass Maus hat ein reichhaltiges Angebot an Essen und Wasser.
  4. Großvolumige Schwanzveneninjektion mit einer alternativen Handposition
    1. Zeigen Maus in den Restrainer und die Vorbereitungen für Einspritzung durch folgende Schritte 4.3.1 bis 4.3.5, wie zuvor beschrieben.
    2. Legen Sie das nicht injizierenden Hand auf einer ebenen Fläche mit vier Fingern an einer Neunzig-Grad-Winkel gebogen. Die Finger (alle außer Daumen) sollte auf der jeweils anderen ruhen, die Schaffung einer Plattform. Halten Sie den Schwanz der Maus zwischen Daumen und Zeigefinger (Abbildung 1B).
    3. Mit der anderen Hand, wischen Sie die Fläche wieder mit einem Alkoholtupfer eingespritzt werden. Ermöglichen Bereich zu trocknen.
    4. Schnappen Spritze mit der Injektions-Hand und halten Sie es an dem Flansch und dem Ende des Kolbens, bereit zur Injektion.
    5. Füllen Sie das folgende Verfahren durch dieses Protokoll von Schritt 4.3.9 bis 4.3.17 Schritt, wie zuvor beschrieben.

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Representative Results

Korrekte Positionierung der Nadel in die Schwanzvene der Maus (wie in Fig. 1 dargestellt) ist eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Abgabe eines Transgens durch die Hydrodynamik basierende Transfektion. Oft der schwierigste Teil der Technik ist jedoch die Beibehaltung der Nadel in die Schwanzvene ohne Bewegung, so daß das gesamte Volumen der Injektion innerhalb 6-8 s geliefert werden. Kleinere Fehler beim Einspritzvorgang kann in beträchtlichem Ausmaß verringert Transfektionseffizienz und Protein-Expression führen. Daher ist es zwingend notwendig, um den Erfolg der HGD für jedes Experiment zu überwachen. Wenn das transgene Protein von Interesse ist schwierig, durch Western-Blot durch das Fehlen von empfindlichen Nachweis von Antikörpern, wie im Fall von Pavian APOL-I, Injektionseffizienz kann durch Co-Injektion eines Plasmids, das ein Gen für ein Protein kontrolliert werden, dass ist leicht nachweisbar. In der in Fig. 2 gezeigte Experiment wurden die Mäuse mit 50 injiziertug eines Plasmid, das eine von drei unterschiedlich 6XHIS getaggt Pavian APOL-I-Gene und 50 ug von einem anderen Plasmid (gleiche Expressionsvektor-Design), die trug Pavian HPR (bHPR, ohne Kennung). Das Hauptziel dieses Experiments war es zu beurteilen, ob die Zugabe eines 6XHIS Tag bei den gewählten Reihenfolge Standorten stört korrekte Verarbeitung und Sekretion des Pavian APOL-I-Protein. Wenn jedoch stört die Zugabe des Tags die korrekte Faltung und somit die Sekretion des Proteins wird es schwierig zu bestimmen, ob der Verlust der Proteinexpression aufgetreten, da der Verarbeitung beeinträchtigt oder erfolglos HGD. Außerdem ist es aufgrund des Fehlens von ausreichend empfindlich Antikörper ist der direkte Nachweis des Pavian APOL-I in transfizierten Mausplasma selbst im Fall einer erfolgreichen Gen-Abgabe schwierig (wie durch den Schutz von Mäusen gegen eine menschliche infektiöse Herausforderung Trypanosomen bestimmt). In diesem Experiment wurden diese Probleme gerichtetdurch die Zugabe einer äquivalenten Menge von Pavian-HPR Plasmid zum APOL-I HGD Mischung als Ersatz Pritzsteuerung dienen. Wie in der Figur gezeigt, wurde Pavian HPR hoch im Plasma fast alle der transfizierten Mäusen anzeigt, dass der HGD erfolgreich exprimiert. Kleinere Tropfen in Expressionsniveaus, wie in einem der zwei Mäuse in bAPOL-I 6XHIS Gruppe 1 In Fig. 2A zu sehen, sind im Allgemeinen auf eine sehr geringe Reduktion (1-2 s) in der Einspritzgeschwindigkeit. In 2B der ersten Plasmaprobe Spur 1 (in bAPOL-I 6XHIS Gruppe 3) zeigt einen völligen Mangel an Protein-Expression, die einen gescheiterten HGD. In den meisten Fällen ist dies aufgrund unvollständiger Einspritzung der vollen Volumen des Lieferfahrzeugs. Da dieses Experiment bestätigt den Erfolg HGD in allen Fällen, aber eine, die Wirkung der Markierung auf 6XHIS bAPOL-I-Sekretion kann nun durch einen anti-6xHis-Immunoblot (Fig. 2C und D) ausgewertet werden. Wie zu sehenin Fig. 2D, die einzige Gruppe von Mäusen, die nachweisbare Mengen an 6xHis-markiertem Protein in ihrem Plasma hatte, war 3-Gruppe. Die Proteinexpressionsmuster innerhalb dieser Gruppe bestätigt, dass die Injektion von einer der Mäuse in dieser Gruppe war nicht erfolgreich. Das völlige Fehlen von nachweisbaren 6XHIS Proteine ​​in den Gruppen 1 und 2 (Abbildung 2C) unterstreicht die Bedeutung der Einbeziehung eines Tracers Protein in der Einspritz Mix, um den Erfolg des HGD überwachen. Ohne Berücksichtigung der Plasmaspiegel von bHPR (2A und B), können Daten von Fig. 2C und D leicht als ein Versagen der HGD in den Gruppen 1 und 2 interpretiert werden.

Erfolgreiche HGD der Pavian TLF1 Komponenten bAPOL-I und bHPR, Mäuse gibt Widerstand gegen Mensch-Trypanosoma brucei brucei Infektions SRA-Parasiten (TBB-SRA, ein Laborwert von T. b. Rhodesiense) 40. Aufgrund der transgenen Expression von bAPOL-I <Dieser Widerstand ist/ Em>, wie Injektion von bHPR allein bietet keinen Schutz gegen die Menschen-infektiöse Parasiten. Zu beurteilen, ob 6XHIS-markierte Varianten bAPOL-I noch in der Lage, als lytische Proteine ​​funktionieren, wurden Mäuse, die sowohl bAPOL-I und bHPR erhalten durch HGD herausgefordert mit TBB-5000 SRA Parasiten zwei Tage nach der Genübertragung. Wie in Fig. 3 zu sehen, Mäuse in Gruppe 2 6XHIS erlegen Infektion sehr früh, während die meisten Mäuse in den Gruppen 1 und 3 überlebten, solange die unmarkierte bAPOL-I-positiven Kontrolle. (Baboon APOL-I-Teilschutz verleiht in diesem Mausstamm.) Da Transgen-Expression in der Gruppe 2 war allgemein hoch, der fehlende Schutz in diesen Mäusen kann korrekt als Verlust von bAPOL-I lytische Funktion aufgrund der 6XHIS-Tag am interpretiert werden, dass Position. Es muss darauf geachtet werden, jedoch, dass die vorzeitige (Tag 7) Tod der Maus in Gruppe 3 nicht falsch interpretiert, als diese Maus nicht erfolgreich mit der Transgene injiziert (sieheAbbildung 2B, Spur 1). Angesichts der kombinierten Daten aus den Fig. 2 und 3 schließen wir, dass bAPOL-I in 3-Stellung, ohne schädliche Wirkungen versehen werden (in 6 × His-Gruppe 3), und Markieren des Proteins in Position 2 (in 6 × His-Gruppe 2) stört ihre lytische -Funktion. In 6XHIS Gruppe 1, während die Daten deuten auf Schutz die Zahl der Mäuse war nicht ausreichend, um aussagekräftige Daten zu erhalten. Leistungsanalysen durchgeführt, um zu bestimmen, sollte Anzahl der Mäuse pro Experiment erforderlich. Während das offensichtliche Fehlen von nachweisbarem Protein in Mäuseplasma aus der Gruppe 1 widersprüchlich zum Schutz Muster in Fig. 3 zu sehen scheint zu beachten, dass ein negativer Anti 6xHis Western Blot in dieser Gruppe kann die Folge einer fehlenden Erfassung aufgrund Proteinverarbeitung eher als ein Mangel der Genexpression. In der Gruppe 1 wurde die 6 × His-Tag in der Nähe nach der Spaltstelle des vorhergesagten Signalpeptid aufgenommen. Der Pavian APOL-I-Aminosäuresequenz enthält eine zusätzliche predicted proteolytische Spaltungsstelle etwa 20 Aminosäuren, die von der Spaltstelle des Signalpeptids 40. Daher ist es klar, dass bAPOL-I in diesen Mäusen abgesondert und Funktions noch die 6 × His-Tag für die Erfassung erforderlich verloren. So veranschaulicht die Bedeutung der HIS-Tag-Platzierung.

APOL-I tötet afrikanischen Trypanosomen durch Porenbildung in der Parasit Lysosomenmembran 36, 37. Natürliche Varianten der menschlichen APOL-I, bei Menschen mit afrikanischer Abstammung letzten gefunden, sind stark mit Nierenerkrankungen in Afro-Amerikaner verbunden, obwohl der Mechanismus der Nierenschädigung ist noch unklar, 41, 42. Seit HGD ergibt höchste Genexpression in der Leber, wollten wir untersuchen, ob die menschliche APOL-I oder seiner synthetischen Sequenzvariante verursacht Schäden in diesem Organ. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit 50 ug des menschlichen APOL WT-I oder einer einzigen Aminosäure synthetische Mutante injiziert bezeichnet eins K4.To beurteilen Leberschäden, messen wir Aspartat-Transaminase (AST)-Spiegel im Plasma Maus am Tag 2 nach der Injektion gesammelt. Einklang mit ihrer lytischen Funktion WT menschlichen APOL-I führt zu einer Erhöhung der Serum-AST-Spiegel (Fig. 4A) im Vergleich zu mit Kochsalzlösung injizierten Mäusen. Im Gegensatz dazu Injektion Mutante K4, die nur in einer Aminosäure unterscheidet, verursacht wenig AST Release. Unterschiede bei Leberschäden unwahrscheinlich zuzuschreiben Proteinexpressionsniveaus zu sein, wie K4 Proteinspiegel äquivalent oder höher als die des menschlichen APOL WT-I (4B) sind. Die Untersuchung der Leber von Mäusen HGD sammelte 5 Tage nach der Injektion zeigt, dass menschliche APOL WT-I verursacht begrenzte Nekrosen mit moderaten Makrophageninfiltration (5B) im Vergleich zur Kochsalzlösung injiziert Mäusen, die normale Leber-Histologie zeigen (Abbildung 5A, lila Bereich) . Bestätigung der durch die Messung Plasma AST-Werte erhaltenen Daten injiziert K4 in der gleichen Plasmid backgrund wie der WT zeigt normale Leber Histologie (5C).

Figur 1
Abbildung 1. Illustration von Handpositionen für HGD. A.) Position ein. Empfohlene Handposition, um eine maximale Einspritzgeschwindigkeit zu erreichen und die Nadelbewegung nach der Injektion zu vermeiden, wurde eingeleitet. Der Pfeil zeigt die vorgeschlagene Bewegung des Daumens nach dem Einsetzen der Nadel in die Vene. Thumb sollte die Nadel durch leichtes Halten der Nabe gegen den Schwanz der Maus zu immobilisieren. Die Hand mit der Spritze müssen neu positioniert werden, um auf den Kolben vor der Injektion nach unten drücken können. B.) Position 2. Diese Position wird empfohlen, wenn die Schwanzveneninjektion muss näher an der Basis des Schwanzes durch wiederholte Injektionen durchgeführt werden. Sobald die Nadel in die Vene eingeführt wird, muss diese Handstellung kein Fellther Anpassungen.

Figur 2
Abbildung 2 Western-Blot-Analyse von Plasma von 5 Wochen alt, weiblich, Swiss Webster (SW) Mäusen, die mit einer Mischung aus zwei getrennten Plasmiden injiziert gesammelt:. Pavian HPR 50 ug und 50 ug differentiell 6XHIS getaggt Pavian APOL-I-Genen. Mäuse wurden mit Kochsalzträger als negative Kontrolle injiziert. Um den Erfolg der HGD bestätigen, zeigt dieses Experiment die zirkulierenden Plasmaspiegel des Pavian HPR-Protein, wie Pavian APOL-I ist schwer zu erkennen. Maus Plasmaproben wurden gesammelt 2 Tage Post HGD und Protein-Expressionsniveaus wurden durch Western-Blot-(Plasma 1:20 verdünnt) auf 10% Tris-Glycin-Polyacrylamidgel unter denaturierenden, nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. HPR wurde unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen Human-Haptoglobin (HP), die auch erfasst recognizes Pavian HPR. Stichwort bAPOL-I wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen ein 6 × His-Tag festgestellt. Molekulargewichte des Steuer 6XHIS Proteine ​​enthalten sind 40 und 50 kDa. A.) Steuerung zeigt ein Beispiel eines Western-Blot-Analyse von einem sekretierten Protein (HPR), wenn alle Mäuse in einer Gruppe, wurden erfolgreich injiziert. Beachten Sie die gleichbleibend hohe Proteinexpression in der zweiten HIS-tagged-Gruppe (bAPOL-I 6XHIS Gruppe 2), in der Injektion war sehr erfolgreich. In der ersten Gruppe (I-bAPOL 6XHIS Gruppe 1), ist die Proteinexpression von einer der Mäuse offensichtlich, aber etwas reduziert, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Geschwindigkeit der Injektion. B.)-Panel zeigt ein Beispiel der Proteinexpressionsniveaus, wenn eine der Injektionen (in bAPOL-I 6XHIS Gruppe 3) war nicht erfolgreich. C) Das Bedienfeld zeigt die Wichtigkeit, einen Tracer-Protein (bHPR), um den Erfolg der HGD überwachen, wenn der Nachweis des Proteins von Interesse (bAPOL-I), ist ungewiss. Trotz der bestätigten Erfolg der HGD in bAPOL-I

Fig. 3
Abbildung 3. Überleben von Mäusen, die Pavian-I APOL 6XHIS Varianten und Pavian HPR. Fünf Wochen alt, weiblich, Swiss Webster-Mäuse erhielten 50 ug von jeweils zwei getrennten Plasmiden von HGD in der gleichen Injektions Mix. Mäuse in diesem Experiment verwendet werden, entsprechen dem Plasma in 2 analysiert. Am 2. Tag post-Injektionen wurden die Mäuse mit 5000 Menschen infektiöse TBB-SRA Parasiten und Parasitämie wurde überwacht infiziert. Wenn Parasitämie erreicht 10 9 Parasiten / ml wurden die Mäuse getötet. Das Überleben war signifikant von Kochsalzlösung Steuer wo angegeben (* - p <0,05, Log-Rank-Test). Überleben der Mäuse nach Parasiten Herausforderung ist ein Beispiel, wie der Erfolg der HGD beeinflusst Daten von nachfolgenden Experimenten erhalten. Wenn Pavian APOL-I erfolgreich eingespritzt wird, das Genprodukt in Mäuseblut, wo es durch genommen und tötet menschliche infektiösen Trypanosomen abgesondert. Die Überlebenskurve zeigt, dass Mäuse injiziert mit dem 6 × His-Tag-Version 3 von Pavian APOL-I signifikant gegen TBB-SRA geschützt. Die einzige vorzeitigen Tod in dieser Gruppe entspricht der Maus, die nicht erfolgreich mit dem Plasmid, das das Transgen injiziert wurde (siehe Abbildung 2). Diese Maus sollte von der Überlebensanalyse ausgeschlossen werden, da ihr Überleben auf Parasiten Herausforderung ist nicht auf die Unterschiede des Transgens erhalten, aber den Ausfall von Gentransfer.

Fig. 4
APOL-I. Das Plasmid Träger (pRG977) war für alle Gen-Varianten identisch. Maus Plasmaproben wurden zwei Tage nach HGD gesammelt. AST-Spiegel wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen kolorimetrischen Kits gemessen. Beachten Sie, dass Erhöhungen der AST-Werte werden mit Sequenzvariationen in der APOL-I-Gen und nicht das Trauma der HGD selbst verbunden. Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment dreifach unter Verwendung der folgenden Reihe von Plasmaproben untersucht: Salzlösung (n = 6), K4 (n = 4) und WT (n = 3). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. B) Western-Blot-Analyse von Plasma am Tag 2 nach der HGD von Mäusen, die für die AST-Werte in Panel A. Proteinexpressionsniveaus wurden durch Immunoblot (Plasma 1:40 verdünnt) mit 10% Tris-Glycin-Polyacrylamidgelen unter denaturierenden analysiert beurteilt wurden gesammelt , nicht-reduzierenden Bedingungen. APOL-Ich war mit ein erkannterpolyklonale Kaninchen-Antikörper gegen den N-Terminus des menschlichen APOL-I.

Figur 5
5. Eine einzelne Aminosäuresubstitution in den APOL-I-Sequenz führt zu verschiedenen Ebenen der Gewebepathologie. Die Figur zeigt Lebern von Mäusen, SW hydrodynamischen Injektionen von Kochsalzträger (A), 50 ug menschlicher APOL WT-I (B) oder 50 ug eines synthetischen mutierten Variante APOL-I, K4 (C) erhalten. Lebern wurden am Tag 5 nach der Injektion entnommen und mit Hämatoxylin und Eosin-Färbung verarbeitet. Repräsentative Beispiele sind die gleichen Mäuse AST-Spiegel in 4. Panels (DF) getestet angezeigt zusätzliche Beispiele von beschädigten Stellen in WT-Mäusen. Nekrose-Herde in Platten (B) werden (DF) mit schwarzen Rechtecken markiert und vergrößert werden. Weiße Pfeile in dieser Platten weisen auf Bereiche der Makrophageninfiltration. Zum Vergleich, Normales Gewebe von einem repräsentativen Bereich der Leber von einer Salz Fahrzeug-Maus injiziert wird von einer Licht blaue Rechteck markiert und auch vergrößert. Platten (B) und (D) sind repräsentative Bilder von der gleichen WT-Maus, während Platten (E) und (F) sind aus zwei verschiedenen WT-Mäusen.

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Discussion

Wenn richtig ausgeführt, ist HGD ein bemerkenswert sicheres und wirksames Mittel der Trans Lieferung. Die kritischen Schritte zur erfolgreichen HGD sind: 1) Bereitstellung der richtigen Menge von DNA in einem großen Volumen an Kochsalzträger 2) in die Schwanzvene der Maus, 3) in weniger als 8 Sekunden.

Obwohl der Prozess der Injektion selbst erfordert zweifellos etwas Fingerfertigkeit, der Erfolg dieser sechs zweite Verfahren liegt oft in der sorgfältigen Vorbereitung des Experiments. Die Menge an pDNA notwendig, um eine maximale Genexpression zu erreichen, kann stark in Abhängigkeit von der verwendeten Plasmid und dem Gen, das exprimiert werden soll, variieren daher sollte die optimale Menge des zu injizierenden DNA experimentell für jede Anwendung bestimmt werden. Bei Mäusen ist die empfohlene DNA-Bereich in der Regel 5-50 ug, hinter der Genexpression könnte ein Plateau zu erreichen. In unseren Händen Injektion von 50 ug pRG977, die entweder die APOL-I oder HPR-Gens führt zu hohen circulating Protein-Spiegel in den ersten zwei Tagen nach der HGD. Der Blutspiegel von beiden Proteinen deutlich sinken über die nächsten paar Tage, bis Proteinwerte fallen unter nachweisbaren Mengen um Tag 10 (38 und unveröffentlichte Daten). Die optimale Menge von DNA sollte in einer physiologischen Lösung äquivalent zu 8-12% des Körpergewichts der Maus 1, 2 geliefert werden. Während die meisten Forscher, einschließlich uns, verwenden Sie Kochsalzlösung als Injektion Fahrzeug hat Ringer-Lösung für HGD mit vergleichbaren Erfolg 2 verwendet. Beachten Sie, dass, während es nicht notwendig ist, HGD in einer sterilen Umgebung durchzuführen, ist es unbedingt erforderlich, Endotoxin-Kontamination der Injektionslösung während des Verfahrens zu vermeiden. Zu diesem Zweck sollte die für Injektionen von Kochsalzlösung überlegen Reinheit und der zu injizierenden DNA sollte unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits, die Endotoxin entfernt, hergestellt werden. Ein weiterer wichtiger Vorbereitungsschritt ist die sorgfältige Abwägung von Mäusen. Da dieInjektionsvolumen ist einer der wichtigsten Aspekte der erfolgreichen HGD, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Maus ist weder unter-noch über dosiert dosiert mit Kochsalzlösung. Die bisherigen Fehler führt zu einer suboptimalen Transfektion, während letztere in der möglicherweise zum Tod des Tieres. Zur Gewährleistung der Sicherheit der Tiere, empfehlen wir das Laden der Spritzen mit kleinen Nadel zu vermeiden, die Einführung kleine Luftblasen, die nur schwer wieder loszuwerden sind. Gauge-Nadel, wie in dem Protokoll beschrieben - HGD sollte mit einer 27 durchgeführt werden.

Korrekte Injektion stark erleichtert, wenn die Schwanzvenen sind deutlich sichtbar. Erweiterung von Blutgefäßen durch leichtes Erwärmen der Maus kann die Visualisierung der Venen zu helfen, wenn ein Restrainer mit einem Schwanz-Illuminator ist nicht verfügbar. Wenn Sie den Mauszeiger Käfig auf einem Heizkissen für ein paar Minuten oder halten den Schwanz mit einem warmen, feuchten Tuch Arbeit gut in der Hand. Bei Verwendung einer Wärmelampe, muss man äußerste Vorsicht walten lassen, um die Mäuse nicht überhitzen. Wir finden, dass unsing eines wärme Lampe bewirkt, dass die Mäuse unnötigen Stress und Schmerzen und sollte daher vermieden werden. Abwischen der Schwanz mit 70% igem Ethanol weiter hilft Visualisierung, um den Kontrast zwischen der Schwanzvene und die Haut. Dieser Schritt ist auch kritisch, um bakterielle Verunreinigung während der Injektion zu vermeiden. Sobald die Maus für die Injektion hergestellt wird, kann die Schwanzvene unter Verwendung entweder eines der in diesem Protokoll beschriebenen Handpositionen eingespritzt werden. Beachten Sie, daß, während Position 2 erscheint einfacher und einfach ist, kann es schwierig sein, das volle Volumen der Flüssigkeit ohne Bewegung der Spritze zu injizieren. Im Gegensatz Aufbau guter Nadelposition mit der ersten Methode ist umständlich jedoch, sobald die Nadel Nabe ist sicher gegen den Schwanz gehalten, nicht selten Injektion. Die erste Methode ist auch für die maximale Geschwindigkeit zu empfehlen, obwohl erfolgreiche Transfektion möglich entweder mit Handposition.

Die Richtgeschwindigkeit von HGD Injektion in Mäusen 6-8 sec, obwohlviele Autoren vermuten, dass Injektionen schneller noch bessere Ergebnisse liefern 1, 12. Langsame Injektion führt zu deutlich reduzierten Genexpression. , Der häufigste Grund für eine völlige Fehlen von Gen-Expression ist jedoch Ausfall die volle Injektionsvolumen zu liefern. Dies geschieht, wenn die Nadel bewegt wird, nachdem die Injektion begonnen wurde. Richtig positioniert, die Nadel in die Vene ohne Widerstand. Um zu überprüfen, dass die Nadel richtig in die Vene eingeführt, kann man eine sehr kleine Menge (100 ul) Flüssigkeit in die Vene vor der vollständigen Injektion injizieren. Wenn das Drücken auf den Kolben trifft extreme Widerstandsfähigkeit, ist die Nadel in der falschen Position und die Flüssigkeit wird in die Schwanzgewebe. Wenn die Nadel aus der Vene Mitte Injektion Korrektur der HGD erfolglos versucht werden, nachdem die Maus wurde für ein paar Stunden ruhen. Re-Injektion nach unzureichender Ruhe verursacht Not an die Maus und kann zum Verlust der hydrodynamischen pressur führene durch die Öffnung der ersten Wunde am Schwanz der Maus. Wenn wiederholte Injektionen erforderlich sind, kann die Maus mit dem vollen Volumen Kochsalzlösung (und DNA-Menge), aber näher an der Basis des Schwanzes in die gleiche Richtung oder in der kontralateralen Vene injiziert werden. Nach HGD, sollte die Maus in einen Käfig für ein Heizkissen für mindestens eine Stunde lang beobachtet werden. HGD bewirkt einen starken Anstieg der intravaskulären Drucks, was zu einer akuten Unregelmäßigkeit der Herzfunktion, Leber Expansion und einer Störung der Membranporen von Leberzellen, Sinuswellen und fenestrae 12, 14, 43. Trotz der Verdoppelung ihrer Blutvolumen in wenigen Sekunden, Mäuse vertragen HGD bemerkenswert gut. Die Herzfrequenz wieder normal in 2 min und der intravaskulären Druck, der bald nach der Injektion rasch abnimmt, nähert basalen Level in 3 min 12, 43. Die aufgebrochenen Hepatozyten verschließen in weniger als 2 min und die erweiterten Lebergröße zurückauf die normale Größe in 30 min, gefolgt von der Erholung der Sinusfunktion in etwa 24 Stunden 43. Während viele Forscher erfolgreich Anästhesie, in unseren Händen, verschärft Isofluoran Anästhesie die Atemnot von Mäusen durch HGD. Wir finden, dass narkotisierten Mäusen länger dauern, sich zu erholen und gelegentlich eine Wiederbelebung für das Überleben. Wenn Injektion einer großen Gruppe von Mäusen mit Anästhesie, kann es notwendig sein, eine zusätzliche Person im Raum gewidmet haben, um zu überwachen, das Wohlbefinden der Tiere erholt. Ohne Narkose, selbst nach wiederholten Injektionen, ist das Überleben der Mäuse 100% und Recovery-Zeit ist weniger als 5 Minuten.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet werden, um eine Vielzahl von Molekülen an der Mausleber zu liefern. Verwendung des sekretierten Proteins APOL-I als ein Beispiel haben wir gezeigt, wie HGD könnte verwendet werden, um ein Maus-Modell zu etablieren und Untersuchung der Funktion einer Schutzprotein. Beim Vergleich der Funktion verschiedener Genprodukte, die success der HGD sollte beurteilt werden, wann immer möglich. Für sekretierte Proteine, ist es leicht, die Expressionsniveaus durch Analysieren Mausplasma mit Western-Blot überwacht (Fig. 2 und 4B.) Es ist besonders wichtig, um den Erfolg sicherzustellen, wenn HGD Testen natürliche oder synthetische Varianten eines therapeutischen Proteins, wie Transfektionseffizienz kann stark beeinflussen Krankheitsverlauf (Fig. 2 und 3). Beispiele werden angegeben, um zu zeigen, wie diese Verfahren kann erweitert werden, um Leberschäden durch Apoli, die ein porenbildendes Protein (Figures 4 und 5) verursacht analysieren. Sequenzvarianten APOL-I in der gleichen Plasmid Hintergrund ergeben deutlich unterschiedliche Schadensbilder. Dies legt nahe, dass die Gewebeschäden mit Protein-Funktion und nicht der Expressionsvektor oder das Trauma der Injektion selbst verbunden. Es sei darauf hingewiesen, dass in den Händen, allgemein Hoch am Tag 1 nach der Injektion (Daten nicht gezeigt) sind AST werden. An Tag 2, jedoch AST-Werte von Mäusenprojizierten mit Kochsalzlösung, den normalen und Unterschiede zwischen Gen-Varianten sind leicht erkennbar (Abbildung 4). Am Tag 3 nach der Injektion, AST bei allen Behandlungen gemessen Rückkehr in ihre Grundniveau (Daten nicht gezeigt). Seit Nekrosen und Entzündungen in der Leber mehr als ein vorübergehender Anstieg der AST liegen auf der Hand, kann Leberschäden durch anhalt Genexpression mehr zuverlässig, wenn auch qualitativ bewertet werden, durch Färbung der am 5. Tag nach der Injektion gesammelt Lebern. Die Beispiele zeigen, dass angesichts der APOL-I, die eine erhöhte Freisetzung von AST verursachen Varianten 2 Tage nach der Injektion auch in länger anhaltenden Leberschäden führen, wie durch Färbung mit Hämatoxylin und Eosin bewertet.

Hydrodynamische Genübertragung ermöglicht die schnelle Analyse der Genexpression in vivo. Es erfordert die einfache Konstruktion des Gens untersucht in einem eukaryotischen Expressionsvektor und die Fähigkeit, den Einspritz wie oben beschrieben durchzuführen. Generierung von transgenic Mäusen unter Verwendung anderer Formen von Gentransfer, wie rekombinante lentivirale Vektoren von HIV-1 oder rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren abgeleitet sind, erfordern viel Fachwissen. Allerdings ist ihr Vorteil nachhaltige Genexpression, obwohl virale Genexpression führt häufig zu einer Entzündungsreaktion aufgrund der Host Erfassen einer Virusinfektion reagiert und 15-19. Weiterhin haben die viralen Vektoren eine begrenzte Verpackungsfähigkeit und sind daher in der Gen-Größe begrenzt, während der 150kb BACs wurden erfolgreich in HGD 4 verwendet. Nach Beherrschung dieser Technik kann der Anwender jede Nukleinsäure (cDNA oder gDNA oder RNA) in vivo Transfektion und folgen der Produktion von Protein und die biologischen Folgen. Das Protein kann intrazellulären sein, oder extrazelluläre Membran gebunden; es kann markiert werden oder geändert auf Nukleinsäure und damit Aminosäureebene. Am wichtigsten ist, ist dies eine sehr schnelle und unkomplizierte Technik.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir danken Xia Liu (Neron Pharmaceuticals) für zunächst lehrt uns die HGD Technik und Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) für seine kontinuierliche Führung in verschiedenen Aspekten der Technologie. Diese Arbeit wurde vom Hunter College finanziert CUNY Startkapital und NSF Brot Auszeichnung IOS-1249166. Wir danken der NYULMC Histopathologie Kern NYUCI Center Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 für die Histologie auf Mäuselebern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol Prep Wipe Webcol 6818
AST kit, Amplite Colorimetric AAT Bioquest 13801
Conical Tube, 50 ml BD Falcon 352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
KimWipes KIMTECH 34120
Mouse Tail Illuminator Braintree Scientific MTI RST Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) BD 305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) BD 305109
pRG977 (mammalian expression vector) Regeneron Pharmaceuticals Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira  Fisher NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip BD 309657 Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD

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Genetik hydrodynamische Gentransfer Hydrodynamik basierende Transfektion Maus Gentherapie Plasmid-DNA transiente Genexpression Schwanzveneninjektion
Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen
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Kovacsics, D., Raper, J. Transient… More

Kovacsics, D., Raper, J. Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice. J. Vis. Exp. (87), e51481, doi:10.3791/51481 (2014).

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