Summary
בtransfection vivo של DNA עירום על ידי מסירת גן הידרודינמית מציג גנים לתוך הרקמה של בעלי חיים עם תגובה דלקתית מינימאלית. כמויות מספיקות של מוצר גן נוצרות באופן שתפקוד הגן והרגולציה, כמו גם מבנה חלבון ותפקוד ניתן לנתח.
Abstract
ביטוי יעיל של transgenes in vivo הוא בעלת חשיבות מכרעת בלימוד תפקוד גן ובפיתוח טיפולים למחלות. בשנים האחרונות, משלוח הידרודינמית גן (HGD) התפתחה כשיטת פשוטה, מהירה, בטוחה ויעילה לאספקת transgenes למכרסמים. טכניקה זו נשענת על הכוח שנוצר על ידי ההזרקה המהירה של כמויות גדולות של פתרון פיסיולוגי כדי להגדיל את החדירות של קרום תא של איברי perfused ובכך להעביר דנ"א לתוך תאים. אחד היתרונות העיקריים של HGD הוא היכולת להציג transgenes לתאי יונקים באמצעות DNA עירום פלסמיד (pDNA). היכרות עם גן אקסוגני באמצעות פלסמיד היא מינימאלי מייגע, יעיל ביותר ובניגוד לנישאים נגיפיים, בטוח להפליא. HGD שימש בתחילה להעברת גנים לעכברים, הוא משמש כעת כדי לספק מגוון רחב של חומרים, כולל oligonucleotides, כרומוזומים מלאכותיים, רנ"א, חלבונים ומולקולות קטנות לעכברים, חולדותו, במידה מוגבלת, בעלי חיים אחרים. פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים ומתמקד בשלושה היבטים מרכזיים של השיטה שהן קריטיים לביצוע ההליך בהצלחה: הכנסה נכונה של המחט לווריד, נפח ההזרקה ומהירות המשלוח. ניתנות דוגמאות כדי להראות את יישומה של שיטה זו לביטוי החולף של שני גנים המקודדים חלבונים מופרשים, הפרימטים ספציפיים, אפוליפופרוטאין LI (תתנצ-I) וחלבונים הקשורים לhaptoglobin (HPR).
Introduction
מאז התיאור הראשון שלה על ידי יו et al. וג'אנג et al., משלוח הידרודינמית גן (HGD) הפך לכלי רב ערך ללימוד תפקוד גן במערכות מכרסמים מודל 1, 2. הטכניקה כרוכה בהזרקה המהירה (5-7 שניות) בהיקפים גדולים (8-12% ממשקל גוף) של פתרון לוריד הזנב של עכברים כדי להקל על הספיגה של ה-DNA פלסמיד על ידי התאים של אברי מטרת 1, 2. תנאים אלו מובילים לביטוי גנים חזק בכבד ובביטוי פחות גנים בכליות, טחול, הריאות ולב.
הזרקה של 10 מיקרוגרם פלסמיד pCMV-LacZ יכולה transfect ככל 40% מhepatocytes, מה שהופך HGD השיטה היעילה ביותר, לא ויראלי, in vivo מסירת הגן עד כה 1. בניגוד לנישאים נגיפיים, pDNA הוא קל להכנה, לא לעורר תגובה חיסונית במארח המכרסם 3 ואינו מהווה סיכון בריאותי על ידי recombining עם הסוףוירוסי ogenous. בנוסף, מאחר שמולקולות ה-DNA מועברות על ידי HGD לא צריכה אריזה, שיטה זו מתאימה למשלוח של כרומוזומים בקטריאלי מלאכותיים (BAC) גדולים כמו 150 KB 4. סוגים אחרים של מולקולות שכבר נמסרו על ידי שיטה הידרודינמית כוללים RNA 5-10, 11 morpholinos, חלבוני 12, 13 ומולקולות קטנות אחרות 12, 14. היתרונות והחסרונות של HGD על פני שיטות משלוח אחרות כבר נדונו בביקורות מצוינות בספרות 15-20 ומספר המחברים סיפק תיאור מפורט של ההליך 21-23.
היכרות transgenes לעכברים על ידי HGD היא בטוחה ויעיל 1-3, 24 והשיטה נעשתה שימוש בחולדות עם הצלחה דומה 25. עם שינויים מסוימים, ניסויי הוכחה של הקונספט בוצעו בתרנגולות 26, ראבביטים 27 וחזירים 28, אם כי, vivo היישום בטכניקה זו בבעלי חיים גדולים יותר עדיין מהווה אתגר. בעת השימוש בשיטה זו, עוד הגבלה נפוצה היא שרבים מוקטורי הביטוי היונקים הזמינים חסרים את המרכיבים כדי להשיג רמה גבוהה מתמשכת, של ביטוי גנים. באמצעות פלסמיד, ביטוי גני pCMV לוק באברי המטרה ניכר כבר בעשר דקות לאחר HGD, לעומת זאת, רמת הביטוי הראשונית, הגבוהה יורדת בצורה חדה בשבוע שלאחר הזרקת 1 הראשון. ביטוי transgene ארוך טווח אפשרי בהתאם לאמרגן ואינטרון השתמש בפלסמיד עיצוב 3, 24 זריקות עם זאת, תחזוקה של ביטוי גנים ברמה הגבוהה דורשת לעתים קרובות חוזרות ונשנות. מסיבה זו, HGD עשוי להיות פחות מתאים ללמוד מחלות כרוניות שהן תוצאה של חשיפה ארוך טווח לחלבונים מזיקים או מוצרי חלבון. עם המגבלות האלה, HGD הוא כלי רב עוצמה במיוחד ללימוד פותפקיד tential של גן ואת ההשפעה שלו מוטציות in vivo, כמו גם את ההשפעות והרגולציה של חלבונים הטיפוליים ולהקמת מודלים של בעלי חיים למחלות (לסקירה, ראה 15). לדוגמא, HGD ניתן להשתמש כדי להקצות פונקציה לתחומים וחומצות אמינו של חלבונים על ידי החדרת בנפרד מבני גנים שונים לעכברים שהגנים המתאימים בנוקאאוט. יתר על כן, בטכניקה זו ניתן להשתמש בכל זן עכבר.
פרוטוקול זה מתאר HGD בעכברים עם דגש על ההיבטים הטכניים הדרושים כדי להשיג transfection המוצלח: החדרת מחט נכונה לוריד, הזרקת הנפח ומהירות המשלוח. יישומה של שיטה זו בא לידי הביטוי במודל של עכברים של trypanosomiasis אפריקה, מחלה של בני אדם ובעלי חיים קטלנית 29, 30. בעוד כמה מינים של trypanosomes לגרום למחלות בבעלי חיים, רוב לא יכול לגרום למחלה בבני אדם בשל מולדת מתחמים חיסוניים בבגורמי עונג עילאי טבע דם הנקראים trypanosome ממס (TLFs) 29, 31 ב, 32. , ליפופרוטאינים אלה יוצרים הנקבוביות בצפיפות גבוהה (HDL) מכילים שני חלבונים ייחודיים, הפרימטים ספציפיים:. HPR, ליגנד, המאפשר את הספיגה של TLFs לtrypanosomes, ותתנצ-I, את רכיב ממס ביום 31 ב, 33-38 Trypanosoma rhodesiense brucei הוא מסוגל להדביק בני אדם בשל ביטוי של חלבון בסרום הקשורים התנגדות (SRA) שנקשר ומנטרל תתנצ-אני אדם 34, 39. בון TLF לא נוטרל על ידי SRA בשל תתנצ-חלבון מסתעף 40. כפי שדווח בעבר, באמצעות וקטור יונקים ביטוי (pRG977), ביטוי מהונדס של רכיבי TLF בון בעכברים מקנה הגנה מפני trypanosomes אדם זיהומיות 40. הנתונים שהוצגו כאן הנציג להדגים כיצד מסירת גן הידרודינמית ניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בהאנטר קולג', האוניברסיטה של העיר ניו יורק.
1. הכנה של ה-DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי
- פיק מושבה אחת של חיידקים המכילים את הגן של עניין בוקטור ביטוי יונקים מצלחת סלקטיבית טרי מפוספסת.
- בצע את ההמלצות שנמצאו בספר ההדרכה של ערכת טיהור פלסמיד זמינה מסחרי ללא רעלן פנימי לגידול וקציר חיידקים.
- לטהר DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי מתאי חיידקים על ידי ביצוע הפרוטוקול של ערכת טיהור פלסמיד ללא רעלן פנימי זמינה באופן מסחרי.
- השתמש בכלי פלסטיק ללא רעלן פנימי ולהתמודד עם ה-DNA בזהירות כדי להבטיח רעלן פנימי שאינו מחדש הציג לדגימת DNA לאחר שלב ההסרה.
- למדוד את הריכוז של ה-DNA פלסמיד ללא רעלן פנימי על ידי קביעת הספיגה שלה ב260 ננומטר באמצעות MICRספקטרופוטומטר o נפח UV כמתואר להלן או סטנדרטי, ספקטרופוטומטר מבוסס קובט.
- נקה את המשטחים אופטיים התחתונים ועליונים של מערכת השמירה מדגם ספקטרופוטומטר מיקרו כדלקמן. μl פיפטה 1 של מים deionized נקיים על המערכת האופטית נמוכה יותר. סגור את זרוע המנוף והקש עליו כמה פעמים כדי לרחוץ את המערכת העליונה אופטית, ואז מנוף פתוח ולנגב לנקות עם רקמה.
- פתח את התוכנה של ספקטרופוטומטר מיקרו ובחר את מודול חומצות הגרעין.
- הנח מים deionized נקיים 1 μl על המערכת האופטית נמוכה יותר, להפחית את זרוע המנוף ובחר "לאתחל" מהתוכנה. ברגע אתחול הוא משטחים שלמים, נקיים שני אופטיים עם רקמה ..
- לבצע מדידה ריקה על ידי טעינת 1 μl של חיץ TE ללא רעלן פנימי (10 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA) ובחירה באפשרות "ריק" מהתוכנה. משטחים ברגע מדידה ריקה נעשה, נקיים שני אופטיים עםרקמות.
- לבצע מדידת מדגם על ידי טעינת 1 μl של דגימת DNA ללא רעלן פנימי ובחירה באפשרות "למדוד" מהתוכנה. רשום את ריכוז ה-DNA. להעריך טוהר-DNA על ידי הקלטת יחס הספיגה 260/280 ננומטר שמופיע על המסך. מכיוון שהשימוש בדנ"א הטהור (260/280 יחס 1.8) לHGD רצוי מאוד, להימנע משימוש בדגימת DNA עם יחס 260/280 מתחת 1.7. ברגע שהמדידה נעשה, לנקות גם משטחים אופטיים עם רקמה.
2. משקל של עכברים
- מארק עכברים באופן מתאים למתח. שים לב: סימון של הזנב אינו מומלץ להליך זה.
- מיני עכבר מארק שיש פרווה לבנה (למשל השוויצרי וובסטר) על גבם עם טוש שחור. מרח את קרם הסימנים לאורך זמן בהתאם לצורך.
- מיני מארק עכבר שיש לי פרווה שחורה (למשל C57BL / 6) על ידי אוזן ניקוב כמה ימים מראש.
- שוקל individua עכבריםlly בעדינות על ידי הצבת אותם במחבת במשקל של בעלי חיים או דלי שהונח על איזון מעבדה דיגיטלי. רשום את המשקל של כל עכבר המשמש בניסוי, ביום של הניסוי.
3. הכנת מזרקים
- הכנת תערובת ההזרקה
- לחשב את כמות ה-DNA הנדרשת על ידי הנחת 5-50 פלסמיד דנ"א ללא רעלן פנימי מיקרוגרם לזריקה של כל עכבר.
- לקבוע את הכמות האופטימלית של ה-DNA פלסמיד בניסוי.
- בעת קביעת כמות ה-DNA הנדרש, מניח הזרקה של עכבר אחד נוסף לכל קבוצה, כמו טעינה תקינה של המזרקים תדרוש קצת תמהיל הזרקה נוסף. כדי לעזור לחישובים, לשקול את הדוגמא הבאה: להזריק 4 עכברי ניסוי ו4 שליטה, כל גרם במשקל 25, עם 50 פלסמיד דנ"א מיקרוגרם לכל עכבר. כדי לקבוע את כמות ה-DNA הנדרשת במקרה זה, לחשב עם 5 עכברים בכל קבוצה: 5 x 50 מיקרוגרם = 250 DNA מיקרוגרם דרוש לכל קבוצה.
- לקבוע את הכמות של תמיסת מלח (0.9% נתרן כלורי) הנדרשת על ידי הנחת 10% ממשקל גוף להזרקה של כל עכבר.
- לפי הדוגמא לעיל, להזריק כל עכבר 25 גרם עם 50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד ב2.5 מיליליטר תמיסת מלח (נוזל גרם 2.5).
- בעת קביעת הסכום של תמיסת מלח הנדרש לקבוצה שלמה של עכברים, מניח הזרקה של עכבר נוסף לכל קבוצה, כדי לאפשר טעינה תקינה של המזרקים. בהתחשב בניסוי נתון, לחשב את כמות הדרושה למלוח 5 עכברים בכל קבוצה: 5 x 2.5 מיליליטר = 12.5 מיליליטר תמיסת מלח לכל קבוצה (או 25 מיליליטר בסך הכל). הערה: אם עכברים בתוך אותה הקבוצה אינם זהה במשקל (הבדל יותר מ -10% במשקל גוף), להכין הזרקה מתערבבת בנפרד.
- השתמש במלח חומר משמר וללא רעלן פנימי, סטרילי שאושר לשימוש בבני אדם, ב10 מיליליטר, בקבוקוני שימוש מרובים.
- באמצעות מחט 20 מד (0.9 מ"מ x 25 מ"מ) מחוברת לקצה luer נעילה של מזרק 20 מיליליטר,למשוך את הנוזל מבקבוקונים מלוחים ורוקן את המזרקים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. כדי לעזור pipetting מדויק של מלח בזמן הכנת תערובות הזרקת ה-DNA מלח, לאסוף מלח יותר מהדרוש להזרקה של כל העכברים בניסוי. לצורך הניסוי לעיל, לסגת מלוח מ3, 10 מיליליטר בקבוקונים (כולל של כ 30 מיליליטר) גם אם הכמות המחושבת של מי מלח הנחוץ לניסוי היא רק 25 מיליליטר.
- פיפטה את הכמות המחושבת של דנ"א לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר שונה. יש להיזהר שלא לגעת בצד של הצינור עם גוף פיפטה כדי למנוע כניסתה של רעלן פנימי. על פי הדוגמא, פיפטה 250 מיקרוגרם של שליטה ו250 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד הניסיוני לתוך צינורות חרוטי בנפרד.
- הוסף את הכמות הנדרשת של מי מלח לדנ"א באמצעות פיפטה סרולוגיות. בהתחשב בניסוי המדגם, פיפטה 12.5 מיליליטר תמיסת מלח לכל אחת מהתערובות הראשיים (ניסוי וביקורת).
- אפשר את כל הפתרונות להגיעטמפרטורת חדר לפני ההזרקה.
- לחשב את כמות ה-DNA הנדרשת על ידי הנחת 5-50 פלסמיד דנ"א ללא רעלן פנימי מיקרוגרם לזריקה של כל עכבר.
- הכנת מזרקים
- לכל עכבר, למלא 3 מיליליטר, מזרק עם תערובת ה-DNA מלוחה באמצעות מחט סטרילית, 20 מד (0.9 מ"מ x 25 מ"מ) סטרילי, luer נעילה. תשמור על עצמך, כדי למנוע בועות אוויר. הימנע משימוש במזרקים בנפח גבוה יותר כמו קצב הזרימה של הזרקה לא ניתן לשלוט טוב מאוד, וקשה לתמרן מזרקים גדולים יותר ביד אחת. הוצא כל תערובת ה-DNA מלוחה עודפת בחזרה לתוך צינור חרוטי כמו זה עשוי להיות שימוש חוזר.
- לעבור את המחט למחט סטרילית, 27-מד. מלא את המחט עם נוזל לחלוטין ללא החדרת בועות אוויר. כוון את עוצמת הקול של תערובת ה-DNA מלוחה כפי שחושב על בסיס המשקל של העכבר.
- אל תאפשר את המחט הסירה את המכסה לגעת כל משטח שאינו סטרילי. במידת צורך, מחטים עשויות להיות מחדש כתרים שימוש בטכניקה ביד אחת: להציב את הכובע על משטח שטוח, להכניס את המחט בלי להחזיק את הכובע ביד השנייה ולחץ את המחט כתריםנגד אובייקט מוצק כדי להבטיח את הכובע על המחט. המזרקים מוכנים לזריקות וריד זנב עכשיו.
4. משלוח DNA הידרודינמית
- שימו לב שעכברי הרדמה עשויים להפחית את הכדאיות. הימנע מביצוע HGD בחדר כי הוא קר מדי, כפי שזה יהיה גם להפחית את הכדאיות. אם בחדר יש טמפרטורת סביבה של C ° 20 או אם בהרדמה, הנח את העכברים על כרית חימום שנקבעה על 37 הודעה C ° הליך כדי למנוע אובדן של כל בעלי חיים. אם בהרדמה, להבטיח כי את הפה והחוטם של העכבר הם בלא הפרעה ואילו על כרית החום ולבחון את העכבר עד שהוא מתאושש באופן מלא. לא למנוע ממנו מזון או מים מהעכברים לפני HGD.
- לחמם את העכברים להרחבת כלי דם.
- מניחים את כלוב העכבר (עם מצעים כלולים) על משטח חום במשך 5 דקות, כך שהטמפרטורה של המצע היא כ 38-39 ° C. הטמפרטורה צריכה להיות נמוכה מספיק כדי לשמור על העכברים על כרית החוםהוארך התקופה.
- לחלופין, למקם את העכבר לעוצר גישה הגבי באיפוק מינימאלי. לחמם את הזנב של עכבר דקות 1 בעדינות על ידי מחזיק אותו עם פיסת הגזה הרטובות במים חמים. לאפשר עכבר מחדש עמדה, במידת צורך. נגב את הזנב עם רקמה לייבוש.
- לחלופין, עכבר חם על ידי הצבת הכלוב תחת מנורת חום לא יותר מ -2 דקות. אם אתם משתמשים במנורת חום, לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע התחממות יתר של העכבר.
- הזרקה לוריד זנב בהיקפים גדולים
- לשתק עוצרים גישת גב על משטח שטוח ידי קלטת מעבדה.
- מחזיק בזנבו, במקום את העכבר בעדינות לתוך העוצר ולהכניס את התקע. השתמש באיפוק כמו שדרוש כדי לשמור על הזנב משותק. ודא שהעכבר הוא נושם בחופשיות.
- אם העכבר הוא במצוקה קשה בכל נקודה במהלך ההליך, הסר את העכבר מהעוצר באופן מיידי ולאפשר לו לנוח.
- מקם את העכבר כל כךאחד מורידי הזנב לרוחב גלוי. אתר את ורידי הזנב לרוחב על ידי מסתכל ישר למטה בחלק האחורי של העכבר: הקו האדום פועל באמצע הזנב הוא עורק, בעוד הקווים הכחולים בכל צד של הזנב הם ורידי הזנב לרוחב.
- נגב את הזנב של העכבר ביסודיות עם ספוגית אלכוהול.
- שימוש הלא הזרקה השני, להחזיק את הזנב בחוזקה בין האצבע ואמה כך שהזנב עובר מתחת לאצבע המורה, מעל באמצע והאצבעות שלישיים ומתחת לאצבע הקטנה. לאפשר לאגודל להישאר חופשי לנוע. (איור 1 א)
- שימוש מצד השני, לנגב את האזור להיות מוזרקים שוב עם ספוגית אלכוהול. אפשר לאזור לייבוש.
- תרים את המזרק הטעון עם הזרקת היד והחזיק אותו בחבית בין האגודל ואת ארבע הספרות אחרת. אל תחזיק על הבוכנה.
- מקם את מקביל המזרק לזנב עם ההצבעה המחט לכיוון גופו של העכבר וההטיה (קצה אלכסוני) של המחט פונה כלפי מעלה.
- הכנס את המחט לתוך וריד הזנב. להמשיך עם ההזרקה רק אם הווריד ממוקם בצורה נכונה, וזה ניכר מהמחט הזזה בללא התנגדות. שים לב שעומק החדרת מחט הוא עניין של העדפה אישית לעומת זאת, הכנסה מלאה אינה מומלצת בשל סיכון מוגבר של גז מהווריד. הימנע הזזת המחט.
- שימוש באגודל של החזקת הזנב השני, לסגור על הרכזת של המחט ורכזת העיתונות נגד הזנב להחזיק מחט בעמדה. אל תפעיל לחץ קיצוני ולא להיאחז פיר מחט, כמו אלה לעכב את הזרימה של נוזלים לווריד. החזק את הזנב עם האצבע באופן רופף בשלב זה כדי לא לעכב (איור 1 א) הזרקה.
- למקם מחדש מחזיק מזרק ביד, כך שאצבע המורה והאמה מחזיקים על מקורבות והאצבע היא בסופו של הבוכנה (figurדואר 1A).
- לחץ כלפי מטה על בוכנה באחד תנועה, רציפה ומזריק את מלוא העצמה של נוזל ב6-8 שניות.
- הסר את המחט מהווריד ולעצור את הדימום על ידי הפעלת לחץ עדין על הזנב עם רקמה.
- הסר את העכבר מהעכבר עוצר ומקום לכלוב התאוששות מונח על גבי כרית חימום (מצעים צריכים להיות 37-38 מעלות צלזיוס). אם חדר ההזרקה הוא קר, שלב זה הוא קריטי להישרדות עכבר. להחזיק את הזנב של העכבר עד שהדימום מפסיק לחלוטין.
- שים לב לעכבר לשעה 1 לאחר לידת DNA הידרודינמית. התקופה ראשונית של מתנשף וחוסר תנועה היא נורמלית עקב הפרעות קצב הזמניים שנגרמו על ידי HGD אבל לוודא שהעכבר מראה סימנים של התאוששות בכ 5 דקות. אם הנשימה של העכבר הופכת להיות מאוד רדודה, לעסות בעדינות את הבטן של העכבר כדי להקל על נשימה. שים לב שהשיעור של התאוששות עשוי להיות מושפע מעט על ידי זן העכבר בשימוש.
- עכבר תשואהלכלוב דיור ולהבטיח כי העכבר של שפע של מזון ומים.
- הזרקה לוריד זנב בהיקפים גדולים באמצעות יד עמדה חלופית
- העבר את העכבר לעוצר ולהתכונן לזריקה על ידי ביצוע שלבי 4.3.1 דרך 4.3.5, כפי שתואר לעיל.
- הנח את הלא הזרקת היד על משטח שטוח עם ארבע אצבעות כפופות בזווית של תשעים מעלות. האצבעות (כולם מלבד אגודל) צריכים לנוח על גב אחד את השני, יצירת פלטפורמה. להחזיק את הזנב של העכבר בין האגודל ואצבע המורה (איור 1).
- שימוש מצד השני, לנגב את האזור להיות מוזרקים שוב עם ספוגית אלכוהול. אפשר לאזור לייבוש.
- תפוס את המזרק עם הזרקת היד ולהחזיק אותו על ידי מקורבות וסופו של הבוכנה, מוכנה להזרקה.
- להשלים את ההליך על ידי ביצוע פרוטוקול זה מהצעד 4.3.9 עד שלב 4.3.17, כפי שתואר לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקום נכון של המחט לוריד הזנב של העכבר (כפי שמודגם באיור 1) הוא תנאי הכרחי לאספקת transgene בהצלחה על ידי transfection מבוסס הידרודינמיקה. לעתים קרובות החלק המאתגר ביותר של הטכניקה, לעומת זאת, הוא השמירה של המחט בתוך וריד הזנב ללא תנועה כך שכל הנפח של הזריקה יכול להיות מועבר בתוך תקופה של 6-8. טעויות קטנות במהלך תהליך ההזרקה עלולות לגרום ליעילות transfection מופחת בהרבה וביטוי חלבון. לכן, זה הכרחי כדי לפקח על ההצלחה של HGD עבור כל ניסוי. אם החלבון המהונדס של עניין הוא קשה לזהות על ידי כתם מערבי בשל חוסר נוגדנים רגישים, כמו במקרה של בבון תתנצ-I, יעילות הזרקה עשויה להיות במעקב על ידי הזרקה המשותפת של פלסמיד שנשא גן לחלבון זה הוא לזיהוי בקלות. בניסוי שמוצג באיור 2, עכברים הוזרקו 50 עםמיקרוגרם של פלסמיד שנשא אחד משלוש 6XHIS דיפרנציאלי מתויג בון גנים תתנצ-I ו 50 מיקרוגרם של פלסמיד אחר (אותו עיצוב וקטור ביטוי) שנשא בבון HPR (bHPR, לא מתויג). המטרה העיקרית של הניסוי הייתה להעריך האם התוספת של תג 6XHIS במיקומים הרצף נבחרו מפריעה לעיבוד והפרשה של בון תתנצ-החלבון נכונים. אם לעומת זאת, התוספת של התג משבשת את הקיפול הנכון וכתוצאה מכך, הפרשת החלבון, הוא הופך להיות קשה לקבוע אם אובדן של ביטוי חלבון התרחש כתוצאה מעיבוד לקוי או HGD לא מוצלח. יתר על כן, בשל היעדרם של נוגדנים רגישים מספיק, זיהוי ישיר של בון תתנצ-I בפלזמת עכבר transfected קשה גם במקרה מסירת גן מוצלחת של (כפי שנקבע על ידי ההגנה של עכברים נגד אתגר trypanosome אדם זיהומיות). בניסוי זה, בנושאים אלה טופלועל ידי התוספת של כמות שווה של פלסמיד HPR בון לתערובת תתנצ-אני HGD לשמש שליטת הזרקה פונדקאית. כפי שמודגם באיור, בבון HPR בא לידי הביטוי מאוד בפלזמה של כמעט כל עכברי transfected המציין כי HGD היה מוצלח. טיפות קטנות ברמות ביטוי, כפי שניתן לראות באחד משני עכברים בקבוצת bAPOL-אני 6XHIS 1 באיור 2 א ', הן בדרך כלל מיוחסות לירידה קטנה מאוד (1-2 ים) במהירות זריקה. בתרשים 2B, הנתיב הראשון הפלזמה מדגם 1 (בקבוצת bAPOL-אני 6XHIS 3) מראה חוסר מוחלט של ביטוי חלבון שמעיד על HGD נכשל. ברוב המקרים, זה נובע מהזרקה שלמה של הנפח המלא של מסירת הרכב. מאז ניסוי זה מאשר את ההצלחה של HGD בכל המקרים, אבל אחד, את ההשפעה של תיוג 6XHIS על bAPOL-הפרשה יכול כעת להיות מוערכת על ידי immunoblot אנטי 6XHIS (איור 2C ו-D). כפי שניתן לראותבאיור 2 ד, הקבוצה של עכברים שרק היו רמות לגילוי חלבון מתויג-6xHIS של בפלזמה שלהם הייתה קבוצה 3. דפוס ביטוי החלבונים בתוך קבוצה זו אישר כי הזרקה של אחד מהעכברים בקבוצה זו הייתה לא מוצלחת. חוסר המוחלט של חלבוני 6xHIS להבחין בקבוצות 1 ו -2 (איור 2C) מדגיש את החשיבות של כולל חלבון נותב בתמהיל ההזרקה כדי לפקח על ההצלחה של HGD. מבלי לקחת בחשבון את רמות הפלזמה של bHPR (איור 2 א 'וב'), נתונים מהאיור 2C ו-D יכולים בקלות להתפרש ככישלון של HGD בקבוצות 1 ו -2.
HGD המוצלח של בון רכיבי TLF1 bAPOL-I ו bHPR, נותן עכברים התנגדות לטפילים אנושיים זיהומיות Trypanosoma brucei brucei-SRA (TBB-SRA, שווה ערך מעבדה של ט 'ב. Rhodesiense) 40. התנגדות זו נובעת מהביטוי המהונדס של bAPOL-</ Em>, כמו הזרקה של bHPR לבד לא מספקת הגנה מפני טפילי אדם מדבקים. כדי להעריך אם גרסאות 6XHIS מתויגות של bAPOL-אני עדיין מסוגלת לתפקד חלבוני ממס כ, עכברים שקיבלו שני bAPOL-I ו bHPR ידי HGD היו תיגר עם 5000 TBB-SRA טפילי יומיים לאחר מסירת הגן. כפי שניתן לראות באיור 3, עכברים בקבוצת 6XHIS 2 נכנעו לזיהום בשלב מוקדם מאוד, ואילו רוב העכברים בקבוצות 1 ו -3 שרדו כל עוד ביקורת החיובית bAPOL-אני לא מתויגת. (הבבון תתנצ-אני מקנה הגנה חלקית בזן העכבר הזה.) מאז ביטוי transgene בקבוצה 2 היה גבוה באופן אוניברסלי, חוסר ההגנה בעכברים אלו עשויים להתפרש בצורה נכונה כאובדן תפקוד ממס bAPOL-בשל תג 6XHIS באותו תפקיד. יש להקפיד, עם זאת, כי (יום 7) מותו בטרם עת של עכבר בתוך קבוצה 3 הוא לא שלא כהלכה, כפי שהעכבר הזה לא היה מוזרק בהצלחה עם transgenes (ראה איור2B יור, מסלול 1). לאור הנתונים משולבים מאיורים 2 ו -3, אנו מגיעים למסקנה שbAPOL-I עשוי להיות מתויגים בעמדה 3 (בקבוצת 6xHIS 3) ללא תופעות לוואי, בעוד שתיוג של חלבון זה בעמדה 2 (בקבוצת 6xHIS 2) משבש הממס פונקציה. בקבוצת 6xHIS 1, בעוד שהנתונים מרמזים על ההגנה מספר העכברים לא היה מספיק כדי לקבל נתונים משמעותיים. יש לבצע ניתוחי כוח לקבוע מספר העכברים הנדרשים לכל ניסוי. בעוד העדר לכאורה של חלבון לזיהוי בפלזמת עכבר מקבוצת 1 אולי נראה סותר לדפוס ההגנה ניתן לראות באיור 3, שימו לב שכתם מערבי 6xHIS אנטי שלילי בקבוצה זו עשויה להיות התוצאה של חוסר זיהוי בשל עיבוד חלבון ולא מאשר חוסר של ביטוי גנים. בקבוצת 1, תג 6xHIS נוספו קרוב לאחר שאתר המחשוף של הפפטיד האות החזויה. בון תתנצ-I רצף חומצות אמינו מכיל predicte נוסףאתר מחשוף פרוטאוליטי ד כ 20 חומצות אמינו מאתר המחשוף של הפפטיד האות 40. לכן, ברור כי bAPOL-בעכברים אלו מופרש ופונקציונליים אך איבד את תג 6xHIS ההכרחי לגילויה. וכך ממחיש את החשיבות של מיקום התג שלו.
תתנצ-אני הורג trypanosomes האפריקאי על ידי היווצרות נקבובית בקרום הליזוזום טפיל 36, 37. וריאנטים טבעיים של תתנצ-אני אדם, שנמצאו בבני אדם ממוצא אפריקאי האחרון, היו קשורים מאוד עם מחלת כליות ב אפריקאי אמריקאים, אם כי, המנגנון של נזק לכליות הוא עדיין לא ברור 41, 42. מאז HGD תוצאות בביטוי הגנים הגבוה ביותר בכבד, שרצינו לחקור אם אדם תתנצ-I או גרסת הרצף הסינתטי שלה גורמת לניזק באיבר זה. לשם כך, עכברים הוזרקו 50 מיקרוגרם של תתנצ-אני אדם WT או מוטציה סינתטית חומצת אמינו אחת מיועדשל K4.To להעריך נזק כבד, מדדנו טרנסאמינזות aspartate (AST) רמות בפלזמה של עכבר שנאספו ביום 2 לאחר הזרקה. עולה בקנה אחד עם תפקודה ממס, WT-תתנצ אני אדם גורם להעלאת רמות AST בסרום (איור 4 א), בהשוואה לעכברים שהוזרק תמיסת מלח. לעומת זאת, הזרקה של K4 מוטציה, שונה רק באחד חומצת אמינו, הנגרמת על שחרור AST מעט מאוד. הבדלים בנזק כבד צפויים להיות מיוחס לרמות של ביטוי חלבון, כמו רמות חלבון K4 שווים או גבוהות מאלה של תתנצ-WT אני אדם (איור 4). בדיקה של כבדים מעכברי HGD נאספה 5 ימים לאחר ההזרקה מראה כי WT-תתנצ אני אדם גורם לנימק של רקמות מוגבלות עם חדירת מקרופאג מתונה (איור 5), בהשוואה לעכברים שהוזרק תמיסת מלח שמראים היסטולוגיה התקינה של הכבד (איור 5A, אזורים סגולים) . המאשר את הנתונים שהתקבלו על ידי מדידת רמות AST הפלזמה, K4 הזריק באותו backg פלסמידעגול כמו WT תערוכות היסטולוגיה כבד הנורמלי (איור 5 ג).
איור 1. איור של תנוחות ידיים לHGD. א) מיקום יד מיקום 1. מומלץ כדי להשיג מהירות זריקה מקסימלי ולהימנע מתנועת מחט לאחר ההזרקה כבר יזם. החץ מציין את התנועה הציעה האגודל לאחר החדרת המחט לווריד. אגודל צריך לשתק את המחט בעדינות על ידי מחזיק את הרכזת נגד הזנב של העכבר. היד מחזיקה את המזרק חייבת להיות מיקומו כדי להיות מסוגל ללחוץ על הבוכנה לפני הזריקה. ב) קבוצה 2. עמדה זו מומלצת אם ההזרקה לוריד הזנב חייבת להתבצע יותר קרובה לבסיס הזנב עקב זריקות חוזרות ונשנות. ברגע שהמחט מוחדרת לווריד, יד עמדה זו אינה זקוקה לפרווההתאמות יס.
איור 2 ניתוח כתם המערבי של פלזמה שנאסף מחמש בני שבוע, נקבה, השוויצרי וובסטר (SW) עכברים שהוזרקו עם שילוב של שני פלסמידים נפרדים:. 50 מיקרוגרם HPR בון ו50 מיקרוגרם של 6XHIS דיפרנציאלי מתויג בון גנים תתנצ-I. עכברים הוזרקו בקרה שלילית כרכב מלוח. כדי לאשר את ההצלחה של HGD, ניסוי זה מראה את רמות הפלזמה במחזור של חלבון HPR בון, כמו בבון תתנצ-קשה לזהות. דגימות פלזמה עכבר נאספו רמות ביטוי ההודעה HGD וחלבון 2 ימים נותחו על ידי כתם מערבי (פלזמה מדוללת 1:20) על ג'לים polyacrylamide טריס-גליצין 10% מתחת denaturing, תנאים שאינם תנאי צמצום. HPR זוהה באמצעות נוגדן הארנב polyclonal נגד haptoglobin האנושי (HP), שגם recognizes בון HPR. שתייגת bAPOL-אני זוהה באמצעות נוגדן הארנב polyclonal נגד תג 6xHIS. משקלים מולקולריים של השליטה 6XHIS חלבונים נכללים 40 ו50 kDa. א) לוח מראה דוגמא של ניתוח כתם המערבי של חלבון מופרש (HPR), כאשר כל העכברים בקבוצה הוזרקו בהצלחה. שים לב לביטוי חלבון הגבוה והאחיד בקבוצה השנייה שלו בתיוג (6XHIS קבוצת bAPOL-2), שבו הזריקה הייתה מוצלחת ביותר. בקבוצה הראשונה (bAPOL-אני 6XHIS הקבוצה 1), ביטוי חלבון מאחד מהעכברים הוא בולט אך הפחית במידה מה, ככל הנראה בשל מהירות מופחתת של ההזרקה. לוח ב ') מראה דוגמא של רמות ביטוי חלבון כאשר אחד מהזריקות (בbAPOL-I קבוצת 6XHIS 3) לא עלה יפה. לוח ג) מדגים את החשיבות של כולל חלבון נותב (bHPR) כדי לפקח על ההצלחה של HGD כאשר זיהוי של החלבון של עניין (bAPOL-I) אינו ודאית. למרות ההצלחה המוכחת של HGD בbAPOL-
איור 3. הישרדות של עכברים להביע בון גרסאות תתנצ-אני 6XHIS ובון HPR. חמישה שבועות בן, נקבה, עכברים השוויצריים וובסטר קיבלו 50 מיקרוגרם של כל אחד משני פלסמידים נפרדים על ידי HGD באותו תמהיל ההזרקה. עכברים המשמשים בניסוי זה מתאימות לפלזמה ניתחה באיור 2. ביום שלאחר 2 זריקות, עכברים נגועים בטפילי 5000 TBB-SRA אדם זיהומיות וparasitemia היה פיקוח. כאשר parasitemia הגיע 10 9 מיליליטר / טפילים, עכברים מורדמים. ההישרדות הייתה שונה באופן משמעותי משליטה מלוחה בהם מצויינים (* - P <0.05, יומןמבחן דרגה). הישרדות עכבר על אתגר הטפיל היא דוגמא לאופן שבו ההצלחה של HGD משפיעה הנתונים המתקבלים מהניסויים הבאים. כאשר בון תתנצ-אני מוזרק בהצלחה, מוצר הגן מופרש לדם בעכבר שבו הוא נלקח על ידי והורג trypanosomes אדם זיהומיות. עקומת ההישרדות מראה כי עכברים שהוזרקו עם גרסת 6xHIS תג 3 של בון תתנצ-אני היה מוגנת באופן משמעותי מול TBB-SRA. מותו בטרם עת רק בקבוצה זו מתאים לעכבר שלא הוזרק בהצלחה עם פלסמיד שנשא את transgene (ראה איור 2). עכבר זה צריך להיות נכלל בניתוח ההישרדות כהישרדות שלה על אתגר טפיל אינה מיוחסת להבדלים של transgene קיבלו, אבל לכישלון של מסירת הגן.
איור 5. החלפת חומצת אמינו בודדת בתוצאות תתנצ-רצף ברמות של פתולוגיה ברקמות שונות. איור מציג את כבדים של עכברי SW שקיבלו זריקות הידרודינמית של רכב תמיסת מלח (), 50 מיקרוגרם WT תתנצ-I (ב ') אדם, או 50 מיקרוגרם של גרסת מוטציה סינתטית של תתנצ-I, K4 (C). כבדים הוסרו ביום 5 לאחר הזרקה ומעובד לhematoxylin ומכתים eosin. דוגמאות מייצגות מוצגות מאותו העכברים assayed עבור רמות AST באיור 4. פנלים (DF) מראות דוגמאות נוספות של אזורים שנפגעו בעכברי WT. מוקדי נמק בפנלים (ב '), (DF) מסומנים במלבנים שחורים והם מוגדלים. חצים לבנים בלוחות אלה מצביעים על תחומים של חדירת מקרופאג. לשם השוואה, רקמות מאזור נציג של הכבד של עכבר הזריק רכב מלוח מסומנת במלבן בצבע תכלת וגם מוגדל. פנלים (ב) ו (ד ') הם תמונות מייצגות מאותו עכבר WT, ואילו לוחות (E) ו( F) נמצאים משני עכברי WT שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר מבוצע כהלכה, HGD הוא אמצעי בטוח ויעיל להפליא של משלוח transgene. השלבים הקריטיים לHGD המוצלח הם: 1) מספק את הכמות הנכונה של ה-DNA בנפח גדול של מי מלח רכב 2) לוריד הזנב של עכבר 3) בפחות מ -8 שניות.
למרות התהליך של הזרקה עצמה ללא ספק דורש קצת מיומנות ידנית, ההצלחה של הליך שש שני זה לעתים קרובות נמצאת בהכנה קפדנית של הניסוי. כמות pDNA הדרושה כדי להשיג ביטוי גנים מקסימאלי עשויה להשתנות במידה רבה בהתאם לפלסמיד המשמש ואת הגן לבוא לידי ביטוי ולכן, הכמות האופטימלית של ה-DNA להיות מוזרקים צריכה להיקבע באופן ניסיוני עבור כל יישום. לעכברים, טווח ה-DNA המומלץ באופן כללי הוא 5-50 מיקרוגרם, שמעבר לו ביטוי גנים עשוי להגיע לרמה. בידיים שלנו, הזרקה של 50 מיקרוגרם pRG977 ביצוע או תתנצ-I או גן HPR מובילה לרמות גבוהות של circulatinרמות גרם חלבון ביומיים הראשונים לפרסם HGD. רמות בדם של שני החלבונים להקטין באופן משמעותי במשך כמה ימים הבאים עד רמות חלבון ייפלו מתחת לרמות לזיהוי סביב יום 10 (38 ונתונים שלא פורסמו). הכמות האופטימלית של ה-DNA צריכה להיות מועברת במקבילת פתרון פיזיולוגית ל8-12% ממשקל הגוף של העכבר 1, 2. בעוד שרוב החוקרים, כוללים אותנו, השתמשו במלח כרכב הזרקה, הפתרון של רינגר שמש במשך HGD עם הצלחה דומה 2. שים לב, שבזמן שאין צורך לבצע HGD בסביבת סטרילית, זה הכרחי כדי למנוע זיהום רעלן פנימי של פתרון ההזרקה לאורך כל ההליך. לשם כך, תמיסת מלח המשמשת לזריקות צריכה להיות של טוהר מעולה ואת ה-DNA להיות מוזרקים צריכה להיות מוכנה באמצעות ערכה זמינה מסחרי שמסירה רעלן פנימי. עוד צעד הכנה חשוב הוא שקילה זהירה של עכברים. מאזנפח ההזרקה הוא אחד ההיבטים הקריטיים של HGD המוצלח, חשוב לוודא כי העכבר הוא לא במינון ולא בעם מי מלח במינון מעל. התוצאות לשעבר השגיאה בtransfection לא טובים, בזמן האחרון במותו האפשרי של בעלי החיים. כדי להבטיח את שלומם של בעלי החיים נוספים, אנו ממליצים לטעון את המזרקים עם מחט קטנה בקוטר כדי למנוע החדרת בועות אוויר קטנות שקשה להיפטר ממנו. HGD צריך להתבצע עם 27 - מחט מד כפי שתואר בפרוטוקול.
הזרקה נכונה היא הקל מאוד אם ורידי הזנב נראה בבירור. הרחבת כלי דם על ידי חימום עדין של העכבר עשויה לסייע להדמיה של העורקים אם עוצר עם זנב הפנס אינו זמין. הצבת כלוב העכבר על משטח חום במשך כמה דקות או מחזיק את הזנב עם עבודת בד חמה, רטובה גם בידיים שלנו. אם אתם משתמשים בחום מנורה, יש לנהוג בזהירות רבה שלא לחמם יותר מדי את העכברים. אנו מוצאים כיing חום מנורה גורם ללחץ מיותר העכברים ואי נוחות, ולכן, יש להימנע. מנגב את הזנב עם אתנול 70% נוספים מסייע להדמיה על ידי הגדלת הניגוד בין וריד הזנב והעור. שלב זה הוא קריטי גם כדי למנוע זיהום חיידקים במהלך הזרקה. ברגע שהעכבר מוכן להזרקה, וריד הזנב ניתן להזריק או באמצעות אחת מתנוחות הידיים שתוארו בפרוטוקול זה. שים לב, שבעוד שעמדה 2 מופיעה יותר קלה ופשוט יותר, זה עשוי להיות קשה יותר כדי להזריק נפח מלא בנוזל מבלי להזיז את המזרק. לעומת זאת, הקמת עמדת מחט טובה בשיטה הראשונה היא מסורבלת יותר לעומת זאת, ברגע שרכזת המחט מוחזקת באופן מאובטח כנגד הזנב, הזרקה לעתים רחוקות נכשלה. השיטה הראשונה מומלצת גם למהירות המרבית, אם כי transfection המוצלח הוא אפשרי באמצעות שתי ידיים את העמדה.
המהירות המומלצת של הזרקת HGD בעכברים היא 6-8 שניות, אם כיסופרים רבים מצביעים על כך שזריקות מהר יותר להניב תוצאות אפילו טובות יותר 1, 12. תוצאות הזרקה איטית בביטוי גנים מופחת במידה ניכרת. עם זאת, הסיבה השכיחה ביותר לחוסר של ביטוי גנים שלם היא אי מסירת מלוא העצמה של הזרקה. מצב זה מתרחש כאשר המחט עברה, לאחר ההזרקה הייתה יזם. בצורה נכונה את מיקומו, את המחט נכנסת לווריד ללא התנגדות. כדי לוודא שהמחט מוחדרת לווריד בצורה נכונה, ניתן להזריק כמות קטנה מאוד (100 μl) נוזל לתוך הווריד לפני הזרקה מלאה. אם לוחצים על הבוכנה נתקל בהתנגדות קיצונית, המחט היא במקום הלא נכון ובנוזל נכנסים רקמת הזנב. אם המחט משאירה את אמצע הזרקה, תיקון הווריד של HGD לא מוצלח עשויים להיות ניסיון אחרי העכבר הורשה לנוח לכמה שעות. Re-זריקה אחרי מנוחה מספקת גורמת מצוקה לעכבר ולעלול לגרום לאובדן של pressur הידרודינמיתדואר על ידי פתיחת הפצע הראשון על הזנב של העכבר. אם זריקות חוזרות ונשנות הן הכרחיות, העכבר ניתן להזריק עם הנפח המלא של תמיסת מלח (וכמות ה-DNA) או קרוב יותר לבסיס הזנב באותו הווריד או בעורק הנגדי. בעקבות HGD, העכבר צריך להיות שנצפה בכלוב שהונח על כרית חום למשך שעה אחת לפחות. HGD גורם לעלייה חדה בלחץ intravascular וכתוצאה מכך אי סדירות חריפה של תפקוד לב, התרחבות כבד, ושיבוש של הנקבוביות הקרום של תאים כבד, sinusoids ו12 fenestrae, 14, 43. למרות ההכפלה של נפח הדם שלהם בכמה שניות, עכברים לסבול HGD להפליא. מחזיר את קצב לב לקדמותו תוך 2 דקות ולחץ intravascular, אשר יורד במהירות זמן קצר לאחר הזרקה, גישות רמות בסיס ב3 דקות 12, 43. Hepatocytes שיבש לחתום מחדש בפחות מ -2 דקות ומחזיר הגודל הכבד המורחבלגודל רגיל ב30 דקות ואחריו ההתאוששות של תפקוד סינוסואידה בכ 24 שעות 43. בעוד חוקרים רבים משתמשים בהרדמה בהצלחה, בידיים שלנו, ההרדמה isofluorane מחריפה את המצוקה נשימתית של עכברים בשל HGD. אנו מוצאים כי עכברים מורדמים להימשך זמן רב יותר כדי להתאושש ולעתים דורשים החייאה להישרדות. אם הזרקת קבוצה גדולה של עכברים באמצעות הרדמה, ייתכן שיהיה צורך יש אדם נוסף בחדר המוקדש ליפקח על שלומו של בעלי החיים מתאוששים. ללא הרדמה, גם זריקות חוזרות ונשנות אחרי, הישרדות עכבר היא 100% וזמן התאוששות הוא פחות מ -5 דקות.
הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש כדי לספק מגוון רחב של מולקולות בכבד העכבר. שימוש בחלבון המופרש תתנצ-כדוגמא, שהראינו כיצד ניתן להשתמש HGD לבסס מודל עכבר וללמוד את הפונקציה של חלבון מגן. כאשר משווה את הפונקציה של מוצרי גן שונים, success של HGD יש לבחון בכל הזדמנות אפשרית. לחלבונים מופרשים, קל לעקוב אחר רמות ביטוי על ידי ניתוח פלזמה עכבר באמצעות כתם המערבי (איורים 2 ו 4 ב.) זה חשוב במיוחד על מנת להבטיח את הצלחתו של HGD כשמנסה לאמוד וריאנטים טבעיים או סינטטיים של חלבון טיפולי, כיעילות transfection יכול קשה להשפיע על תוצאות מחלה (איורים 2 ו -3). ניתנות דוגמאות כדי להראות כיצד ניתן להרחיב בשיטה זו כדי לנתח את הנזק כבד שנגרם על ידי APOLI, שהוא חלבון יוצרים נקבובית (איורים 4 ו -5). רצף הגרסאות של תתנצ-אני באותה תוצאת רקע פלסמיד בפרופילי נזק שונים במידה ניכרת. הדבר מצביע על כך נזק לרקמות קשור בתפקוד חלבון ולא וקטור הביטוי או הטראומה של ההזרקה עצמה. יש לציין כי, בידיים שלנו, רמות AST גבוהות באופן אוניברסלי ביום 1 שלאחר הזרקה (מידע לא מוצג). ביום 2, לעומת זאת, רמות AST של עכברים בjected עם תשואה מלוחה לקדמותו והבדלים בין גרסאות הגנים הם ללא קושי ניכר (איור 4). ביום 3 לאחר הזרקה, AST נמדד בכל הטיפולים לחזור לרמתם הבסיסית (מידע לא מוצג). מאז רקמת נימק ודלקת בכבד ניכרות זמן רב יותר מעלייה זמנית בAST, נזק כבד כתוצאה מביטוי גנים מתמשך ניתן להעריך בצורה מהימנה יותר, אם כי באופן איכותי, על ידי צביעה של הכבדים שנאספו ביום 5 לאחר הזרקה. דוגמאות שניתנו מראה כי וריאנטים של תתנצ-שגורם לשחרור מוגבר של AST 2 ימים לאחר ההזרקה גם לגרום לניזק בכבד ממושך יותר כפי שהוערכה על ידי צביעה עם hematoxylin ו eosin.
מסירת גן הידרודינמית מאפשרת ניתוח המהיר של ביטוי גנים בגוף חי. זה דורש בנייה הפשוטה של הגן תחת מחקר לתוך וקטור ביטוי אוקריוטים והיכולת לבצע ההזרקה כפי שתואר לעיל. דור של transgeעכברי NIC באמצעות צורות אחרות של משלוח הגן, כגון וקטורי lentiviral רקומביננטי הנגזרים מHIV-1 או רקומביננטי וקטורים ויראליים adeno הקשורים, דורשים הרבה יותר מיוחד מומחיות. עם זאת, היתרון שלהם הוא שנגרם ביטוי גנים, אם כי ביטוי גנים נגיפי לעתים קרובות גורם לתגובה דלקתית עקב מארח חישת זיהום ויראלי ולהגיב 15-19. יתר על כן, יש וקטורים ויראליים יכולת אריזה מוגבלת ולכן, מוגבלים בגודל גן, ואילו BACS של 150kb שימש בהצלחה ב4 HGD. כאשר אשלוט בטכניקה זו, המשתמש יכול transfect כל חומצות גרעין (cDNA או gDNA או RNA) in vivo ובצע את הייצור של חלבון והשלכות הביולוגיות. החלבון יכול להיות תאיים, קרום מאוגד או תאי; יכול להיות מתויג זה או שונה בחומצות הגרעין ורמת חומצת אמינו ובכך. והכי חשוב, זו היא טכניקה מאוד מהירה וישירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לשיה יו (Regeneron Pharmaceuticals) להתחלה מלמד אותנו את הטכניקה וHGD ד"ר ראסל תומסון (אלברט איינשטיין לרפואה) להדרכה המתמדת שלו בהיבטים שונים של הטכנולוגיה. עבודה זו מומנה על ידי Hunter College, CUNY להתחיל את הקרנות ופרס NSF לחם IOS-1,249,166. אנו מודים NYULMC histopathology Core מרכז NYUCI תמיכת גרנט, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 להיסטולוגיה בכבד עכבר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al.
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D.
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D.
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
