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Biology

चूहे में द्रव्यगतिकी जीन डिलीवरी द्वारा प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति

Published: May 5, 2014 doi: 10.3791/51481
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

Summary

Hydrodynamic जीन डिलीवरी द्वारा नग्न डीएनए के vivo अभिकर्मक में कम से कम भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ एक पशु के ऊतकों में जीनों का परिचय. जीन उत्पाद के लिए पर्याप्त मात्रा में जीन समारोह और विनियमन के साथ ही प्रोटीन संरचना और समारोह का विश्लेषण किया जा सकता है कि इस तरह उत्पन्न कर रहे हैं.

Abstract

विवो में transgenes की कुशल अभिव्यक्ति जीन समारोह का अध्ययन और रोगों के उपचार को विकसित करने में महत्वपूर्ण महत्व का है. पिछले वर्षों में, hydrodynamic जीन डिलीवरी (HGD) कृन्तकों में transgenes देने के लिए एक सरल, तेज, सुरक्षित और प्रभावी तरीके के रूप में उभरा है. इस तकनीक perfused अंगों की कोशिका झिल्ली की पारगम्यता बढ़ाने के लिए शारीरिक समाधान की एक बड़ी मात्रा का तेजी से इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न बल पर निर्भर करता है और इस प्रकार की कोशिकाओं में डीएनए उद्धार. HGD का मुख्य लाभ में से एक नग्न प्लास्मिड डीएनए (pDNA) का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं में transgenes शुरू करने की क्षमता है. एक प्लाज्मिड का उपयोग कर एक exogenous जीन परिचय उल्लेखनीय सुरक्षित, न्यूनतम अत्यधिक कुशल, श्रमसाध्य और वायरल वाहक के विपरीत है. HGD शुरू में चूहों में जीन देने के लिए इस्तेमाल किया गया था, यह अब oligonucleotides, कृत्रिम क्रोमोसोम, शाही सेना, प्रोटीन और चूहों में छोटे अणुओं सहित पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला, चूहों देने के लिए प्रयोग किया जाता हैऔर, एक सीमित हद तक अन्य जानवरों. इस प्रोटोकॉल चूहों में HGD वर्णन करता है और सफलतापूर्वक प्रक्रिया के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं कि विधि के तीन प्रमुख पहलुओं पर केंद्रित है: नस में सुई की सही प्रविष्टि, इंजेक्शन की मात्रा और वितरण की गति. उदाहरण स्रावित, रहनुमा विशेष प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि दो जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए इस विधि के आवेदन को दिखाने के लिए दिया जाता है, अपोलीपोप्रोटीन ली (Apol मैं) और haptoglobin से संबंधित प्रोटीन (HPR).

Introduction

द्वारा अपनी पहली विवरण के बाद लियू एट अल. और झांग एट अल., Hydrodynamic जीन डिलीवरी (HGD) कृंतक मॉडल प्रणाली 1, 2 में जीन समारोह के अध्ययन के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है. तकनीक लक्ष्य अंगों 1, 2 की कोशिकाओं से डीएनए प्लाज्मिड के तेज की सुविधा के लिए चूहों की पूंछ नस में समाधान की एक बड़ी मात्रा (8-12% शरीर के वजन) के तेजी से इंजेक्शन (5-7 सेकंड) शामिल है. इन शर्तों गुर्दा, तिल्ली, फेफड़े और दिल में जिगर और कम जीन अभिव्यक्ति में मजबूत जीन की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व.

10 माइक्रोग्राम pCMV-lacZ प्लाज्मिड इंजेक्शन HGD तारीख 1 सबसे कुशल, गैर वायरल, vivo जीन वितरण पद्धति है, जिससे hepatocytes के रूप में ज्यादा के रूप में 40% transfect कर सकते हैं. वायरल वाहक के विपरीत, pDNA तैयार करने के लिए आसान है, कृंतक मेजबान 3 में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना नहीं करता है और अंत के साथ पुनर्संयोजन द्वारा एक स्वास्थ्य खतरा उत्पन्न नहीं करताogenous वायरस. HGD ने दिया डीएनए अणु पैकेजिंग की जरूरत नहीं है, क्योंकि इसके अलावा, इस विधि 150 केबी के रूप में 4 के रूप में बड़े जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) की डिलीवरी के लिए उपयुक्त है. एक hydrodynamic विधि द्वारा दिया गया है कि अणुओं के अन्य प्रकार शाही सेना 5-10, morpholinos 11, प्रोटीन 12, 13 और अन्य छोटे अणुओं 12, 14 में शामिल हैं. अन्य प्रसव के तरीके से अधिक HGD के फायदे और नुकसान साहित्य 15-20 में उत्कृष्ट समीक्षा में चर्चा की गई है और लेखकों में से एक नंबर प्रक्रिया 21-23 का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराई है.

HGD द्वारा चूहों में transgenes परिचय सुरक्षित और 1-3, 24 से प्रभावी है और विधि तुलनीय सफलता 25 के साथ चूहों में इस्तेमाल किया गया है. कुछ संशोधनों के साथ, सबूत की अवधारणा प्रयोगों मुर्गियों 26, रब में बाहर किया गया हैबड़े जानवरों में इस तकनीक के vivo आवेदन एक चुनौती बनी हुई है, हालांकि, 27 और सूअरों 28 बिट्स. इस पद्धति का उपयोग करते हैं, तो एक और सामान्य सीमा उपलब्ध स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर के कई जीन अभिव्यक्ति का एक लगातार उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए घटकों की कमी है. लक्ष्य अंगों में एक pCMV ल्यूक प्लाज्मिड, जीन अभिव्यक्ति का उपयोग हालांकि, प्रारंभिक, उच्च अभिव्यक्ति के स्तर इंजेक्शन 1 के बाद पहले सप्ताह में तेजी से चला जाता है, HGD के बाद दस मिनट के रूप में जल्दी के रूप में स्पष्ट है. लंबे समय तक transgene अभिव्यक्ति प्लाज्मिड डिजाइन 3, 24 बहरहाल, उच्च स्तर के जीन की अभिव्यक्ति के रखरखाव अक्सर दोहराया आवश्यकता इंजेक्शन में इस्तेमाल प्रमोटर और Intron के आधार पर संभव है. इस कारण से, HGD हानिकारक प्रोटीन या प्रोटीन उत्पादों के लिए लंबी अवधि के निवेश का एक परिणाम हैं कि पुराने रोगों का अध्ययन करने के लिए कम उपयुक्त हो सकता है. इन सीमाओं के साथ, HGD पीओ के अध्ययन के लिए एक असाधारण शक्तिशाली उपकरण हैएक जीन और यह के प्रभाव की क्षमता का भूमिका (समीक्षा के लिए, 15 देखें) विवो, साथ ही चिकित्सीय प्रभाव और प्रोटीन के नियमन में और रोग के पशु मॉडल की स्थापना के लिए म्यूटेंट. उदाहरण के लिए, HGD व्यक्तिगत रूप से संबंधित जीन बाहर दस्तक दी है कि चूहों में विभिन्न जीन निर्माणों को शुरू करने से डोमेन और प्रोटीन के अमीनो एसिड के लिए समारोह आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक को किसी भी माउस तनाव में इस्तेमाल किया जा सकता है.

वितरण की नस, इंजेक्शन की मात्रा और गति में सही सुई प्रविष्टि: इस प्रोटोकॉल सफल अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए आवश्यक तकनीकी पहलुओं पर ध्यान देने के साथ चूहों में HGD वर्णन करता है. इस विधि के आवेदन अफ्रीकी trypanosomiasis, मनुष्यों की एक घातक रोग और पशुधन 29, 30 के एक माउस मॉडल में प्रदर्शन किया है. Trypanosomes की कई प्रजातियों के पशुओं में रोग का कारण हैं, सबसे ख में प्रतिरक्षा परिसरों जन्मजात की वजह से मानव में बीमारी का कारण नहीं कर सकतेlood बुलाया असिकाय अपघट्य कारकों (TLFs) 29, 31, 32. ये ताकना के गठन, उच्च घनत्व लिपो प्रोटीन (एचडीएल) दो अद्वितीय, रहनुमा विशेष प्रोटीन होते हैं. Trypanosomes में TLFs के तेज जो सुविधा HPR, ligand,, और Apol-मैं, अपघट्य घटक 31, 33-38 ट्रिपैनोसोमा ब्रुसे rhodesiense के कारण बांध और मानव Apol-मैं 34, 39 neutralizes कि एक सीरम प्रतिरोध जुड़े प्रोटीन (एसआरए) की अभिव्यक्ति के लिए मनुष्यों को संक्रमित करने में सक्षम है. लंगूर TLF कारण इसकी मुक़्तलिफ़ Apol-I प्रोटीन से 40 एसआरए द्वारा निष्प्रभावी नहीं है. एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर (pRG977), चूहों में लंगूर TLF घटकों के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए, जैसा कि पहले बताया मानव संक्रामक trypanosomes 40 के खिलाफ संरक्षण प्रदान करता है. यहाँ प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा hydrodynamic जीन डिलीवरी एक प्रोटीन की चिकित्सीय प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी प्रयोगों हंटर कॉलेज के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, न्यूयॉर्क के सिटी विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.

Endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए के 1. तैयारी

  1. एक हौसले से परेशान चयनात्मक थाली से एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की जीन से युक्त बैक्टीरिया की एक कॉलोनी उठाओ.
  2. बैक्टीरिया बढ़ रही है और कटाई के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध endotoxin मुक्त प्लाज्मिड शुद्धि किट की पुस्तिका में पाया सिफारिशों का पालन करें.
  3. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध endotoxin मुक्त प्लाज्मिड शुद्धि किट के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए बैक्टीरियल कोशिकाओं से endotoxin मुक्त प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध.
  4. Endotoxin मुक्त प्लास्टिक के बर्तन का प्रयोग करें और उस endotoxin हटाने कदम के बाद डीएनए नमूने में फिर से शुरू नहीं कर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से डीएनए संभाल.
  5. एक माइकर का उपयोग कर 260 एनएम पर अपनी absorbance के निर्धारण से endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए की एकाग्रता उपायओ मात्रा यूवी रूप में नीचे वर्णित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या एक मानक, क्युवेट आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर.
    1. इस प्रकार के रूप सूक्ष्म स्पेक्ट्रोफोटोमीटर नमूना प्रतिधारण प्रणाली के निचले और ऊपरी ऑप्टिकल सतहों को साफ. कम ऑप्टिकल सिस्टम पर साफ विआयनीकृत पानी की पिपेट 1 μl. लीवर हाथ को बंद करें और ऊपरी ऑप्टिकल सिस्टम स्नान करने के लिए यह एक कई बार नल, तब खुला लीवर और एक ऊतक के साथ साफ साफ.
    2. सूक्ष्म स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के सॉफ्टवेयर खोलें और न्यूक्लिक एसिड मॉड्यूल का चयन करें.
    3. लीवर हाथ कम और कार्यक्रम सॉफ्टवेयर से "आरंभ करें" का चयन करें, कम ऑप्टिकल सिस्टम पर 1 μl साफ विआयनीकृत पानी रखें. प्रारंभन के एक ऊतक के साथ, पूर्ण स्वच्छ दोनों ऑप्टिकल सतहों है एक बार ..
    4. और कार्यक्रम सॉफ्टवेयर से "खाली" का चयन, endotoxin मुक्त ते बफर (1 मिमी EDTA 10 मिमी Tris-सीएल, 8.0 पीएच) के 1 μl लोड करके रिक्त माप प्रदर्शन. एक साथ रिक्त माप बार किया जाता है, स्वच्छ दोनों ऑप्टिकल सतहोंऊतक.
    5. कार्यक्रम सॉफ्टवेयर से endotoxin मुक्त डीएनए नमूने और चयन "उपाय" का 1 μl लोड करके नमूना माप प्रदर्शन. डीएनए एकाग्रता रिकार्ड. स्क्रीन पर दिखाई देता है कि absorbance के अनुपात 260/280 एनएम रिकॉर्डिंग से डीएनए पवित्रता का आकलन करें. HGD के लिए शुद्ध डीएनए (1.8 से 260/280 अनुपात) का उपयोग उच्च वांछनीय है के बाद से, 1.7 से नीचे एक 260/280 अनुपात के साथ एक डीएनए नमूने का उपयोग कर से बचने. माप बार किया जाता है, एक ऊतक के साथ दोनों ऑप्टिकल सतहों को साफ.

2. चूहों का वजन

  1. तनाव के लिए एक तरह से उचित में मार्क चूहों. नोट: पूंछ का अंकन इस प्रक्रिया के लिए अनुशंसित नहीं है.
    1. एक काला मार्कर के साथ उनकी पीठ पर सफेद फर (जैसे स्विस वेबस्टर) है कि मार्क माउस प्रजातियों. आवश्यक के रूप में समय के साथ निशान पुन: लागू करना.
    2. कान से काले फर (जैसे C57BL / 6) है कि मार्क माउस प्रजातियों अग्रिम में कई दिनों छिद्रण.
  2. चूहों individua वजनlly धीरे एक पशु वजन पैन या बाल्टी में उन्हें रखने के द्वारा एक डिजिटल प्रयोगशाला संतुलन पर रखा. प्रयोग के दिन, प्रयोग में इस्तेमाल प्रत्येक माउस के वजन रिकॉर्ड.

सीरिंज की 3. तैयारी

  1. इंजेक्शन मिश्रण की तैयारी
    1. प्रत्येक माउस के इंजेक्शन के लिए 50 ग्राम endotoxin मुक्त प्लास्मिड डीएनए - 5 संभालने के द्वारा की जरूरत डीएनए की मात्रा की गणना.
      1. प्रयोगात्मक प्लास्मिड डीएनए की अधिकतम राशि निर्धारित करते हैं.
      2. आवश्यक डीएनए की राशि का निर्धारण करते हैं, सीरिंज का उचित लोड हो रहा है कुछ अतिरिक्त इंजेक्शन मिश्रण की आवश्यकता होगी, के रूप में समूह के प्रति एक अतिरिक्त माउस का इंजेक्शन मान. गणना में मदद करने के लिए निम्न उदाहरण पर विचार करें: माउस प्रति 50 ग्राम प्लास्मिड डीएनए के साथ, 4 प्रयोगात्मक और 4 नियंत्रण चूहों, प्रत्येक का वजन 25 ग्राम इंजेक्षन. प्रत्येक समूह के लिए आवश्यक 5 एक्स 50 माइक्रोग्राम = 250 ग्राम डीएनए: इस मामले में जरूरत डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए, समूह प्रति 5 चूहों के साथ गणना.
    2. प्रत्येक माउस के इंजेक्शन के लिए शरीर के वजन के 10% मानते जरूरत खारा की राशि (0.9% सोडियम क्लोराइड) का निर्धारण करें.
      1. ऊपर के उदाहरण के अनुसार, 2.5 मिलीलीटर खारा (2.5 ग्राम) तरल में प्लास्मिड डीएनए के 50 ग्राम के साथ प्रत्येक 25 ग्राम माउस इंजेक्षन.
      2. चूहों के एक पूरे समूह के लिए आवश्यक खारा की राशि का निर्धारण करते हैं, सीरिंज का उचित लोड करने के लिए अनुमति देने के लिए समूह प्रति एक अतिरिक्त माउस का इंजेक्शन मान. दिए गए प्रयोग को देखते हुए, प्रत्येक समूह में 5 चूहों के लिए आवश्यक खारा की राशि की गणना: 5 एक्स 2.5 एमएल = प्रत्येक समूह के लिए 12.5 मिलीलीटर खारा (या 25 मिलीलीटर कुल). नोट: एक ही समूह के भीतर चूहों एक ही वजन (शरीर के वजन में 10% से अधिक का अंतर) नहीं हैं, इंजेक्शन अलग घोला जा सकता है तैयार.
    3. 10 मिलीलीटर, एकाधिक उपयोग शीशियों में, मानव उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया है कि परिरक्षक और endotoxin मुक्त, बाँझ खारा प्रयोग करें.
    4. एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का एक luer ताला टिप से जुड़ी एक 20 गेज सुई (x 25 मिमी 0.9 मिमी) का उपयोग करना,खारा शीशियों से तरल को वापस लेने और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सीरिंज खाली है. डीएनए खारा इंजेक्शन घोला जा सकता है की तैयारी के दौरान खारा की सटीक pipetting मदद करने के लिए, प्रयोग में सभी चूहों के इंजेक्शन के लिए जरूरी से अधिक खारा इकट्ठा. प्रयोग के लिए आवश्यक खारा की राशि की गणना केवल 25 मिलीग्राम है, भले ही ऊपर प्रयोग के लिए, 3 से 10 मिलीलीटर की शीशियों (लगभग 30 मिलीलीटर की कुल) खारा वापस ले लें.
    5. एक अलग 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में डीएनए की गणना की राशि पिपेट. Endotoxin की शुरूआत से बचने के लिए पिपेट शरीर के साथ ट्यूब की ओर छू नहीं ख्याल रखना. उदाहरण के अनुसार, अलग शंक्वाकार ट्यूबों में प्रयोगात्मक प्लास्मिड डीएनए के 250 नियंत्रण के ग्राम और 250 ग्राम पिपेट.
    6. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग डीएनए को खारा के लिए आवश्यक राशि जोड़ें. को ध्यान में रखते नमूना प्रयोग, मास्टर घोला जा सकता है (प्रयोगात्मक और नियंत्रण) में से प्रत्येक के लिए पिपेट 12.5 मिलीलीटर खारा.
    7. सभी समाधान तक पहुँचने की अनुमतिइंजेक्शन के लिए पहले कमरे के तापमान.
  2. सीरिंज की तैयारी
    1. प्रत्येक माउस के लिए, एक बाँझ, 20 गेज सुई (0.9 मिमी x 25 मिमी) का उपयोग करते हुए डीएनए खारा मिश्रण के साथ एक बाँझ, 3 मिलीग्राम, luer ताला सिरिंज भरें. हवाई बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखना. इंजेक्शन के प्रवाह की दर बहुत अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, और यह एक हाथ में बड़ा सीरिंज में हेरफेर करने के लिए मुश्किल है के रूप में अधिक मात्रा में सीरिंज का प्रयोग से बचें. इस फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में वापस शंक्वाकार ट्यूब में किसी भी अतिरिक्त डीएनए खारा मिश्रण निकालें.
    2. एक बाँझ, 27 गेज सुई सुई स्विच. पूरी तरह से हवाई बुलबुले शुरू करने के बिना तरल के साथ सुई भरें. माउस के वजन के आधार पर गणना के रूप में डीएनए खारा मिश्रण की मात्रा समायोजित करें.
    3. Uncapped सुई किसी भी गैर बाँझ सतह को छूने की अनुमति न दें. दूसरे हाथ से टोपी पर पकड़ के बिना सुई डालने और छाया हुआ सुई प्रेस, एक फ्लैट सतह पर टोपी जगह: यदि आवश्यक हो, सुई एक हाथ तकनीक का उपयोग कर फिर से छाया हुआ जा सकता हैसुई पर टोपी सुरक्षित करने के लिए एक फर्म वस्तु के खिलाफ. सीरिंज अब पूंछ नस इंजेक्शन के लिए तैयार हैं.

4. द्रव्यगतिकी डीएनए वितरण

  1. Anesthetizing चूहों व्यवहार्यता को कम कर सकते हैं ध्यान दें. यह भी व्यवहार्यता कम हो जाएगा, के रूप में भी ठंडा है कि एक कमरे में HGD प्रदर्शन से बचें. कक्ष 20 डिग्री सेल्सियस के एक परिवेश तापमान है या संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं, तो किसी भी जानवरों के नुकसान से बचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस बाद की प्रक्रिया में सेट एक हीटिंग पैड पर चूहों जगह है. संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं, तो माउस के मुंह और थूथन गर्मी पैड पर अबाधित जबकि कर रहे हैं और यह पूरी तरह से ठीक हो जाए जब तक माउस का पालन सुनिश्चित करें कि. पूर्व HGD को चूहों से भोजन या पानी रोक नहीं है.
  2. रक्त वाहिकाओं को चौड़ा करने के लिए चूहों गर्म.
    1. बिस्तर का तापमान लगभग 38-39 डिग्री सेल्सियस है कि इतनी 5 मिनट के लिए एक गर्मी पैड पर माउस पिंजरे (बिस्तर शामिल साथ) रखें तापमान एक के लिए गर्मी पैड पर चूहों रखने के लिए काफी कम होना चाहिएअवधि बढ़ा दी.
    2. वैकल्पिक रूप से, कम से कम संयम के साथ एक पृष्ठीय पहुँच restrainer में माउस जगह. धीरे गर्म पानी में गीला धुंध का एक टुकड़ा के साथ पकड़े द्वारा 1 मिनट के लिए माउस की पूंछ गर्म. यदि आवश्यक हो तो, फिर से स्थिति के लिए माउस की अनुमति दें. सुखाने के लिए एक ऊतक के साथ पूंछ साफ कर लें.
    3. वैकल्पिक रूप से, अधिक नहीं 2 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे पिंजरे रखकर गर्म माउस. एक गर्मी दीपक का उपयोग करते हैं, तो माउस के overheating से बचने के लिए सावधानी बरतें.
  3. बड़ी मात्रा पूंछ नस इंजेक्शन
    1. प्रयोगशाला टेप से एक फ्लैट सतह पर एक पृष्ठीय पहुँच restrainer स्थिर.
    2. पूंछ से होल्डिंग, धीरे restrainer में माउस जगह और प्लग डालें. Immobilized पूंछ रखने के लिए आवश्यक के रूप में के रूप में थोड़ा संयम का प्रयोग करें. माउस स्वतंत्र रूप से साँस ले रहा है सुनिश्चित करें.
    3. माउस प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर गंभीर संकट में है, तो तुरंत restrainer से माउस को हटाने और यह आराम करने के लिए अनुमति देते हैं.
    4. माउस की स्थिति तोपार्श्व दुम नसों में से एक दिखाई देता है. पूंछ के दोनों तरफ नीली लाइनों पार्श्व दुम नसों हैं जबकि पूंछ के बीच में चल रहे लाल रेखा, एक धमनी है: माउस के पीछे सीधे नीचे देख कर पार्श्व दुम नसों का पता लगाएँ.
    5. अच्छी तरह से एक शराब झाड़ू के साथ माउस की पूंछ साफ कर लें.
    6. पूंछ मध्य और तीसरे उंगलियों पर और छोटी उंगली के नीचे, तर्जनी के नीचे से गुजरता है, ताकि गैर इंजेक्शन लगाने के हाथ का प्रयोग, सूचकांक और मध्यम उंगलियों के बीच कसकर पूंछ पकड़. अंगूठे को स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र रहने की अनुमति. (चित्रा 1 ए)
    7. दूसरी ओर प्रयोग, एक शराब झाड़ू के साथ फिर से इंजेक्शन जा क्षेत्र पोंछे. क्षेत्र सूखे की अनुमति दें.
    8. इंजेक्शन हाथ के साथ भरी हुई सिरिंज उठाओ और अंगूठे और अन्य चार अंकों के बीच प्रति बैरल से यह पकड़ो. सवार पर पकड़ नहीं है.
    9. माउस के शरीर की ओर सुई इशारा पूंछ के लिए सिरिंज समानांतर स्थिति औरऊपर का सामना करना पड़ सुई का उठाव (झुका हुआ धार).
    10. पूंछ नस में सुई डालें. कोई प्रतिरोध के साथ में रपट सुई से स्पष्ट है जो नस सही ढंग से स्थित होने पर ही इंजेक्शन, के साथ आगे बढ़ें. सुई चुभाने की गहराई हालांकि, पूर्ण प्रविष्टि की वजह से नस के बाल काटना का एक बढ़ा जोखिम के लिए अनुशंसित नहीं है व्यक्तिगत पसंद की बात है कि ध्यान दें. सुई घूम रहा से बचें.
    11. पूंछ पकड़े हाथ के अंगूठे का प्रयोग, स्थिति में सुई पकड़ पूंछ के खिलाफ सुई और प्रेस हब के केंद्र पर नीचे बंद हुआ. अत्यधिक दबाव लागू नहीं है और इन नस में तरल के प्रवाह में बाधा के रूप में होगा, सुई शाफ्ट पर पकड़ नहीं है. इंजेक्शन (चित्रा 1 ए) में बाधा के रूप में नहीं तो शिथिल इस बिंदु पर तर्जनी के साथ पूंछ पकड़.
    12. तर्जनी और मध्यम उंगली निकला हुआ किनारा पर पकड़ रहे हैं और अंगूठे सवार के अंत (Figur पर इतना है कि सिरिंज होल्डिंग हाथ फिर से स्थितिई 1 ए).
    13. एक, निरंतर गति में सवार पर नीचे प्रेस और 6-8 सेकंड में तरल की पूरी मात्रा इंजेक्षन.
    14. नस से सुई निकालें और एक ऊतक के साथ पूंछ के लिए कोमल दबाव लागू करने से खून बह रहा बंद करो.
    15. एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखा एक वसूली पिंजरे में restrainer और जगह माउस से माउस निकालें (बिस्तर 37-38 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए). इंजेक्शन कक्ष ठंड है, तो इस कदम माउस अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है. खून बह रहा है पूरी तरह से बंद हो जाता है जब तक माउस की पूंछ पर पकड़ो.
    16. Hydrodynamic डीएनए प्रसव के बाद 1 घंटे के लिए माउस को ध्यान से देखें. पुताई और गतिहीनता की एक प्रारंभिक अवधि के कारण HGD की वजह से अस्थायी अतालता के लिए सामान्य है, लेकिन माउस लगभग 5 मिनट में सुधार के संकेत से पता चलता है कि यह सुनिश्चित कर लें. माउस की सांस लेने की बेहद उथला हो जाता है, तो धीरे साँस लेने की सुविधा के लिए माउस के पेट की मालिश. वसूली की दर थोड़ा इस्तेमाल माउस तनाव से प्रभावित हो सकता है.
    17. वापसी माउसआवास पिंजरे और माउस भोजन और पानी की एक प्रचुर आपूर्ति सुनिश्चित करना है कि.
  4. एक विकल्प के हाथ की स्थिति का उपयोग कर बड़ी मात्रा पूंछ नस इंजेक्शन
    1. Restrainer में माउस रखें और पहले से वर्णित के रूप में, 4.3.5 के माध्यम से कदम 4.3.1 निम्न द्वारा इंजेक्शन के लिए तैयार करते हैं.
    2. एक नब्बे डिग्री के कोण पर तुला चार उंगलियों के साथ एक फ्लैट सतह पर गैर इंजेक्शन लगाने के हाथ को आराम दें. उंगलियों (अंगूठे के अलावा सभी) एक मंच बनाने, एक दूसरे के शीर्ष पर आराम करना चाहिए. अंगूठे और इशारा करते हुए उंगली (चित्रा 1 बी) के बीच माउस की पूंछ पकड़.
    3. दूसरी ओर प्रयोग, एक शराब झाड़ू के साथ फिर से इंजेक्शन जा क्षेत्र पोंछे. क्षेत्र सूखे की अनुमति दें.
    4. इंजेक्शन हाथ के साथ सिरिंज ले लो और निकला हुआ किनारा और इंजेक्शन के लिए तैयार सवार, के अंत तक इसे पकड़.
    5. पहले से वर्णित है, कदम 4.3.17 के माध्यम से कदम 4.3.9 से इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए प्रक्रिया को पूरा करें.

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Representative Results

माउस की पूंछ नस में सुई की सही स्थिति (चित्रा 1 में सचित्र) सफलतापूर्वक हाइड्रोइनेमिकस आधारित अभिकर्मक से एक transgene पहुंचाने के लिए एक शर्त है. इंजेक्शन की पूरी मात्रा एक 6-8 की अवधि के भीतर दिया जा सकता है कि ऐसा अक्सर तकनीक की सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है, लेकिन आंदोलन के बिना पूंछ नस के भीतर सुई की अवधारण है. इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान मामूली त्रुटियों बेहद कम अभिकर्मक दक्षता और प्रोटीन अभिव्यक्ति में हो सकता है. इसलिए, यह एक प्रयोग के लिए HGD की सफलता पर नजर रखने के लिए आवश्यक है. ब्याज की ट्रांसजेनिक प्रोटीन के कारण संवेदनशील एंटीबॉडी की कमी के कारण पश्चिमी धब्बा द्वारा पता लगाने के लिए मुश्किल है, लंगूर Apol-I के मामले में, इंजेक्शन दक्षता एक प्रोटीन के लिए एक जीन ले एक प्लाज्मिड के सह इंजेक्शन द्वारा नजर रखी जा सकती है कि आसानी से पता लगाने योग्य है. चित्रा 2 में दिखाया गया है प्रयोग में चूहों 50 इंजेक्शन के साथ थेतीन विभिन्न 6XHIS में से एक ले जाने के एक प्लाज्मिड के ग्राम लंगूर Apol-मैं जीन और लंगूर HPR (bHPR, untagged) ले जा रहा था कि एक और प्लाज्मिड (समान अभिव्यक्ति वेक्टर डिजाइन) की 50 ग्राम टैग किया. इस प्रयोग की प्रमुख लक्ष्य चुना अनुक्रम स्थानों पर एक 6XHIS टैग के अलावा सही प्रसंस्करण और लंगूर Apol-I प्रोटीन का स्राव के साथ हस्तक्षेप का आकलन है कि था. हालांकि, टैग के अलावा सही तह और इसके परिणामस्वरूप, प्रोटीन का स्राव बाधित हैं, तो यह प्रोटीन अभिव्यक्ति के नुकसान की वजह से बिगड़ा प्रसंस्करण या असफल HGD की हुई है कि क्या तय कर पाना मुश्किल हो जाता है. (एक मानव संक्रामक असिकाय चुनौती के खिलाफ चूहों के संरक्षण द्वारा निर्धारित) इसके अलावा, के कारण पर्याप्त संवेदनशील एंटीबॉडी की कमी के कारण, ट्रांसफ़ेक्ट माउस प्लाज्मा में लंगूर Apol-I के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए भी एक सफल जीन डिलीवरी के मामले में मुश्किल है. इस प्रयोग में, इन मुद्दों को संबोधित कर रहे थेApol मैं HGD मिश्रण करने के लिए लंगूर HPR प्लाज्मिड के एक बराबर राशि के अलावा द्वारा एक सरोगेट इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए. चित्रा में प्रदर्शन के रूप में, लंगूर HPR अत्यधिक लगभग सभी ट्रांसफ़ेक्ट चूहों की HGD सफल रहा था कि यह दर्शाता है की प्लाज्मा में व्यक्त की गई थी. अभिव्यक्ति के स्तर में मामूली बूंदें, चित्रा 2A में bAPOL मैं 6XHIS समूह 1 में दो चूहों में से एक के रूप में देखा, आम तौर पर इंजेक्शन की गति में एक बहुत ही छोटी सी कमी (1-2 ओं) के कारण होते हैं. चित्रा 2B, (bAPOL मैं 6XHIS समूह 3) में पहली प्लाज्मा नमूना लेन 1 में विफल HGD का संकेत प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक पूर्ण अभाव को दर्शाता है. ज्यादातर मामलों में, यह प्रसव वाहन की पूरी मात्रा का अधूरा इंजेक्शन की वजह से है. इस प्रयोग सभी मामलों में HGD की सफलता लेकिन एक, bAPOL मैं स्राव पर 6XHIS टैगिंग का असर अब एक विरोधी 6XHIS immunoblot (चित्रा -2 और डी) द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है की पुष्टि के बाद. देखा जैसाचित्रा 2 डी में, उनके प्लाज्मा में 6xHIS टैग प्रोटीन के detectable स्तर था कि चूहों के केवल समूह समूह 3 था. इस समूह के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न इस समूह में चूहों का एक इंजेक्शन असफल रहा था कि पुष्टि की. समूह 1 और 2 में detectable 6xHIS प्रोटीन का पूर्ण अभाव (चित्रा -2) HGD की सफलता पर नजर रखने के लिए इंजेक्शन मिश्रण में एक अनुरेखक प्रोटीन सहित के महत्व को रेखांकित करता है. BHPR (चित्रा 2A और बी) के प्लाज्मा स्तर पर विचार किए बिना, चित्रा -2 और डी से डेटा को आसानी से समूह 1 और 2 में HGD की एक विफलता के रूप में misinterpreted किया जा सकता है.

लंगूर TLF1 घटकों bAPOL-मैं और bHPR के सफल HGD, मानव संक्रामक ट्रिपैनोसोमा ब्रुसे ब्रुसे-एसआरए परजीवी (TBB-एसआरए, टी. बी की एक प्रयोगशाला बराबर. Rhodesiense) से 40 चूहों प्रतिरोध देता है. यह प्रतिरोध bAPOL मैं <के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति की वजह से है/ Em>, अकेले bHPR इंजेक्शन मानव संक्रामक परजीवी के खिलाफ कोई सुरक्षा प्रदान करता है. के 6XHIS टैग वेरिएंट bAPOL मैं अभी भी रूप में lytic प्रोटीन कार्य करने में सक्षम हैं या नहीं का मूल्यांकन करने के लिए, HGD द्वारा bAPOL-मैं और bHPR दोनों प्राप्त चूहों कि 5000 के साथ TBB-एसआरए दो दिनों जीन डिलीवरी के बाद परजीवी चुनौती दी थी. चित्रा 3 में देखा समूहों 1 और 3 में सबसे चूहों के रूप में लंबे untagged bAPOL मैं सकारात्मक नियंत्रण के रूप में बच गया, जबकि 6XHIS समूह 2 में चूहों, बहुत जल्दी संक्रमण का शिकार. (लंगूर Apol-मैं इस माउस तनाव में आंशिक संरक्षण प्रदान करता है.) 2 समूह के भीतर transgene अभिव्यक्ति सार्वभौमिक उच्च था, इन चूहों में सुरक्षा की कमी को सही ढंग से होने के कारण उस पर 6XHIS टैग करने bAPOL मैं अपघट्य समारोह के नुकसान के रूप में व्याख्या की जा सकती है स्थिति. केयर छवि देखते हैं (इस माउस सफलतापूर्वक transgenes इंजेक्शन के साथ नहीं किया गया था के रूप में समूह 3 के भीतर एक माउस के समय से पहले (सुबह 7) मौत, गलत व्याख्या नहीं है, तथापि, कि लिया जाना चाहिएure 2 बी, लेन 1). आंकड़े 2 और 3 से संयुक्त डेटा के प्रकाश में, हम (6xHIS समूह 2 में) स्थिति 2 में इस प्रोटीन की टैगिंग, जबकि bAPOL मैं अपने अपघट्य बाधित, प्रतिकूल प्रभाव के बिना (6xHIS समूह 3 में) 3 स्थिति में चिह्नित किया जा सकता है निष्कर्ष है कि समारोह. 6xHIS समूह 1 में, डेटा संरक्षण के सूचक हैं, जबकि चूहों की संख्या महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त था. पावर विश्लेषण प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक चूहों की संख्या निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए. समूह 1 से माउस प्लाज्मा में detectable प्रोटीन की कमी स्पष्ट चित्रा 3 में देखा संरक्षण पैटर्न के लिए विरोधाभासी लग सकता है, इस समूह में एक नकारात्मक विरोधी 6xHIS पश्चिमी धब्बा बल्कि कारण प्रोटीन प्रसंस्करण के लिए पता लगाने की कमी का नतीजा हो सकता है कि ध्यान दें जीन अभिव्यक्ति की कमी से. समूह 1 में, 6xHIS टैग भविष्यवाणी संकेत पेप्टाइड की दरार साइट के बाद करीब जोड़ा गया है. Apol मैं एसिड अनुक्रम अमीनो लंगूर एक अतिरिक्त predicte शामिलडी proteolytic दरार साइट संकेत पेप्टाइड 40 की दरार साइट से लगभग 20 अमीनो एसिड होता है. इसलिए, यह इन चूहों में bAPOL मैं स्रावित और कार्यात्मक अभी तक अपनी पहचान के लिए आवश्यक 6xHIS टैग खो गया है कि स्पष्ट है. इस प्रकार उनके टैग नियुक्ति के महत्व को दर्शाता हुआ.

Apol मैं परजीवी लाइसोसोम झिल्ली 36, 37 में ताकना गठन के द्वारा अफ्रीकी trypanosomes मारता है. गुर्दे की क्षति का तंत्र अभी तक 41, 42 स्पष्ट नहीं है, हालांकि हाल ही में अफ्रीकी पूर्वजों के साथ लोगों में पाया मानव Apol-I की प्राकृतिक वेरिएंट, दृढ़ता, अफ्रीकी अमेरिकियों में गुर्दे की बीमारी के साथ संबद्ध किया गया है. HGD जिगर में उच्चतम जीन अभिव्यक्ति में परिणाम के बाद से, हम मानव Apol-मैं या इसके सिंथेटिक अनुक्रम संस्करण इस अंग में क्षति का कारण बनता है अगर जांच करना चाहता था. यह अंत करने के लिए, चूहों एक नामित 50 गुम्मट मानव Apol-I के ग्राम या एक एमिनो एसिड सिंथेटिक उत्परिवर्ती इंजेक्शन के साथ थेएस K4.To जिगर की क्षति का आकलन, हम एस्पार्टेट ट्रांसअमाइनेज (एएसटी) दिन 2 के बाद इंजेक्शन पर एकत्र माउस प्लाज्मा में स्तर मापा. इसके अपघट्य समारोह के अनुरूप, गुम्मट मानव Apol मैं खारा इंजेक्शन चूहों की तुलना में सीरम AST स्तर की ऊंचाई (चित्रा -4 ए) का कारण बनता है. इसके विपरीत, केवल एक एमिनो एसिड में अलग है जो उत्परिवर्ती K4,, इंजेक्शन बहुत कम AST रिहाई का कारण बना. K4 प्रोटीन का स्तर बराबर या WT मानव Apol-मैं (चित्रा 4 बी) की तुलना में अधिक है के रूप में जिगर नुकसान में मतभेद, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के कारण होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं. HGD चूहों से यकृत की परीक्षा 5 दिनों के बाद इंजेक्शन मानव गुम्मट Apol मैं सामान्य जिगर ऊतक विज्ञान बताते हैं कि खारा इंजेक्शन चूहों की तुलना में मध्यम बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ (चित्रा 5 ब) के साथ सीमित ऊतक परिगलन का कारण बनता है पता चलता है कि एकत्र (चित्रा 5 ए, बैंगनी क्षेत्रों) . प्लाज्मा AST स्तर को मापने के द्वारा प्राप्त आंकड़ों की पुष्टि करते हुए K4 एक ही प्लाज्मिड backg में इंजेक्टगुम्मट के रूप दौर सामान्य जिगर ऊतक विज्ञान (चित्रा 5C) से पता चलता है.

चित्रा 1
HGD के लिए हाथ पदों का आंकड़ा 1. चित्रण. ए) अधिकतम इंजेक्शन वेग प्राप्त करने के लिए और इंजेक्शन के बाद सुई आंदोलन से बचने के लिए स्थिति 1. सिफारिश हाथ की स्थिति शुरू किया गया है. तीर नस में सुई की प्रविष्टि के बाद अंगूठे का सुझाव दिया आंदोलन को इंगित करता है. अंगूठे धीरे माउस की पूंछ के खिलाफ हब धारण करके सुई स्थिर करना चाहिए. सिरिंज पकड़े हाथ इंजेक्शन के लिए पहले सवार पर नीचे प्रेस करने के लिए सक्षम होने के लिए repositioned किया जाना चाहिए. पूंछ नस इंजेक्शन करीब पूंछ के आधार की वजह से दोहराया इंजेक्शन के लिए किया जाना चाहिए अगर बी) श्रेणी 2. इस स्थिति की सिफारिश की है. सुई नस में डाला जाता है एक बार, इस स्थिति हाथ कोई फर जरूरतवहाँ समायोजन.

चित्रा 2
चित्रा 2 पाँच सप्ताह पुरानी, ​​महिला, स्विस वेबस्टर (पश्चिम) दो अलग plasmids के मिश्रण के साथ इंजेक्शन चूहों से एकत्र प्लाज्मा के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण:. 50 माइक्रोग्राम लंगूर HPR और विभिन्न 6XHIS की 50 ग्राम लंगूर Apol-मैं जीन में चिह्नित. चूहे खारा वाहन के रूप में नकारात्मक नियंत्रण इंजेक्शन के साथ थे. HGD की सफलता की पुष्टि करने के लिए, इस प्रयोग लंगूर Apol मैं पता लगाने के लिए मुश्किल है, के रूप में लंगूर HPR प्रोटीन संचलन प्लाज्मा स्तर को दर्शाता है. माउस प्लाज्मा नमूनों 2 दिनों के बाद HGD और प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर denaturing, गैर कम करने परिस्थितियों में 10% Tris-Glycine polyacrylamide जैल पर वेस्टर्न ब्लॉट (प्लाज्मा 01:20 पतला) द्वारा विश्लेषण किया गया एकत्र किए गए थे. HPR भी reco जो मानव haptoglobin (हिमाचल प्रदेश), के खिलाफ एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया गया थालंगूर HPR gnizes. टैग की गईं bAPOL-मैं एक 6xHIS टैग के खिलाफ एक खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग पाया गया. 6XHIS प्रोटीन शामिल नियंत्रण की आणविक भार 40 और 50 केडीए हैं. ए) पैनल एक secreted प्रोटीन एक समूह में सभी चूहों को सफलतापूर्वक इंजेक्शन थे जब (HPR) के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का एक उदाहरण दिखाता है. इंजेक्शन बेहद सफल रहा था, जहां दूसरा उसके टैग समूह (bAPOL मैं 6XHIS समूह 2), में समान रूप से उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति पर ध्यान दें. पहले समूह (bAPOL मैं 6XHIS समूह 1) में, चूहों में से एक से प्रोटीन अभिव्यक्ति की वजह से इंजेक्शन की कम गति की संभावना, प्रमुख, लेकिन कुछ हद तक कम कर दिया है. बी) पैनल bAPOL मैं 6XHIS 3 समूह में इंजेक्शन () में से एक असफल रहा था जब प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की एक उदाहरण दिखाता है. सी.) पैनल ब्याज की प्रोटीन (bAPOL मैं) का पता लगाने के अनिश्चित है जब HGD की सफलता की निगरानी के लिए एक अनुरेखक प्रोटीन (bHPR) सहित के महत्व को दर्शाता है. BAPOL-I में HGD की पुष्टि की सफलता के बावजूद

चित्रा 3
लंगूर Apol मैं 6XHIS वेरिएंट और लंगूर HPR व्यक्त चूहों की चित्रा 3. जीवन रक्षा. स्विस वेबस्टर चूहों ही इंजेक्शन मिश्रण में HGD द्वारा दो अलग plasmids के प्रत्येक की 50 ग्राम प्राप्त पांच हफ्ते पुरानी, ​​महिला,. इस प्रयोग में इस्तेमाल चूहों चित्रा 2 में विश्लेषण प्लाज्मा के अनुरूप हैं. दिन 2 के बाद इंजेक्शन पर, चूहों 5000 मानव संक्रामक TBB-एसआरए परजीवी और पेरासाइटिमिया नजर रखी थी से संक्रमित थे. पेरासाइटिमिया 10 9 परजीवी / एमएल पहुंचे तो चूहों euthanized थे. लॉग, पी 0.05 <- * (जहा पर जीवन रक्षा खारा नियंत्रण से काफी अलग थाकल का परीक्षण). परजीवी चुनौती पर माउस अस्तित्व HGD की सफलता के बाद के प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों को कैसे प्रभावित करता है की एक उदाहरण है. लंगूर Apol मैं सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया जाता है, जब जीन उत्पाद यह द्वारा लिया जाता है और मानव संक्रामक trypanosomes मारता है जहां माउस रक्त में स्रावित होता है. अस्तित्व की अवस्था चूहों Apol मैं काफी TBB-एसआरए के खिलाफ रक्षा की थी लंगूर की 6xHIS टैग संस्करण 3 इंजेक्शन के साथ दिखाता है. इस समूह में केवल अकाल मृत्यु सफलतापूर्वक (देखें चित्र 2) transgene ले जाने प्लाज्मिड इंजेक्शन के साथ नहीं किया गया था कि माउस से मेल खाती है. परजीवी चुनौती पर अपने अस्तित्व को प्राप्त transgene की मतभेदों को लेकिन जीन डिलीवरी की विफलता के कारण नहीं है क्योंकि यह माउस अस्तित्व विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए.

चित्रा 4
Apol-I के transgenes नामित. प्लाज्मिड वाहक (pRG977) सभी जीन वेरिएंट के लिए समान था. माउस प्लाज्मा नमूनों दो दिनों HGD के बाद एकत्र किए गए थे. AST स्तर एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वर्णमिति किट का उपयोग कर मापा गया. AST स्तर में उन्नयन Apol-मैं जीन और नहीं HGD खुद के सदमे में अनुक्रम बदलाव के साथ जुड़े रहे हैं ध्यान दें. डाटा प्लाज्मा नमूनों की निम्न संख्या का उपयोग कर तीन प्रतियों में assayed एक प्रतिनिधि प्रयोग से कर रहे हैं: खारा (एन = 6), K4 (n = 4) और WT (n = 3). त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. बी) अभिव्यक्ति के स्तर immunoblot (प्लाज्मा 1:40 पतला) denaturing के तहत 10% Tris-Glycine polyacrylamide जैल का उपयोग करके विश्लेषण किया गया पैनल ए प्रोटीन में AST स्तर के लिए मूल्यांकन किया गया कि चूहों से दिन 2 पोस्ट HGD पर एकत्र प्लाज्मा के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण , स्थितियां गैर को कम करने. Apol-मैं एक का उपयोग कर पाया गया थामानव Apol-I के एन टर्मिनस के खिलाफ खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी.

चित्रा 5
चित्रा 5. ऊतक विकृति विज्ञान के विभिन्न स्तरों में Apol-मैं अनुक्रम के परिणाम में एक एकल एमिनो एसिड प्रतिस्थापन. चित्रा खारा वाहन (ए) के hydrodynamic इंजेक्शन, 50 ग्राम मानव गुम्मट Apol-मैं (बी), या Apol-मैं, K4 (सी) की एक कृत्रिम उत्परिवर्ती संस्करण के 50 ग्राम प्राप्त है कि पश्चिम चूहों के यकृत से पता चलता है. यकृत दिन 5 के बाद इंजेक्शन पर हटा दिया है और hematoxylin और eosin धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया. प्रतिनिधि उदाहरण WT चूहों में क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के अतिरिक्त उदाहरण दिखा चित्रा 4 में AST स्तर. पैनलों (डीएफ) के लिए assayed एक ही चूहों के दिखाए जाते हैं. पैनल (बी) में नेक्रोसिस foci, (डीएफ) काले आयतों के साथ चिह्नित और बढ़े हुए हैं. इन पैनलों में सफेद तीर बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ के क्षेत्रों को इंगित करें. तुलना के लिएएक खारा वाहन इंजेक्शन माउस के जिगर का एक प्रतिनिधि क्षेत्र से सामान्य ऊतक एक हल्के नीले रंग की आयत द्वारा चिह्नित किया गया है और भी बढ़ा है. पैनल (ई) और (च) दो अलग WT चूहों से कर रहे हैं, जबकि पैनलों (बी) और (डी), एक ही WT माउस से छवियों प्रतिनिधि हैं.

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Discussion

सही ढंग से प्रदर्शन करते हैं, तो HGD transgene प्रसव के एक उल्लेखनीय सुरक्षित और कारगर साधन है. सफल HGD के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) कम से कम 8 सेकंड में माउस 3) की पूंछ नस में) खारा वाहन 2 की एक बड़ी मात्रा में डीएनए की सही मात्रा में दे रहे थे.

इंजेक्शन की प्रक्रिया इसमें शक नहीं कुछ मैनुअल कौशल की आवश्यकता है, इस छह दूसरे की प्रक्रिया की सफलता अक्सर प्रयोग की सावधान तैयारी में है. अधिक से अधिक जीन की अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए आवश्यक pDNA की राशि का इस्तेमाल प्लाज्मिड और इसलिए व्यक्त करने के लिए जीन के आधार पर बहुत भिन्न हो सकते हैं, इंजेक्शन जा डीएनए की अधिकतम राशि प्रत्येक आवेदन के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. चूहों के लिए, सामान्य रूप में सिफारिश की डीएनए श्रृंखला जीन अभिव्यक्ति एक पठार तक पहुँच सकता है, जिसके आगे 5-50 ग्राम, है. हमारे हाथ में, Apol-मैं या HPR जीन या तो ले जाने के 50 ग्राम pRG977 इंजेक्शन circulatin के उच्च स्तर की ओर जाता हैपहले दो दिनों में ग्राम प्रोटीन का स्तर HGD पोस्ट. दोनों प्रोटीन के खून का स्तर दिन 10 (38 और अप्रकाशित डेटा) के आसपास detectable स्तर से नीचे गिर प्रोटीन का स्तर जब तक अगले कुछ दिनों में काफी कमी. डीएनए की अधिकतम राशि माउस 1, 2 के शरीर के वजन के 8-12% के लिए एक शारीरिक समाधान बराबर में वितरित किया जाना चाहिए. हमें सहित ज्यादातर शोधकर्ताओं, इंजेक्शन वाहन के रूप में खारा का उपयोग करते समय, घंटी समाधान तुलनीय सफलता 2 के साथ HGD के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह एक बाँझ वातावरण में HGD प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं है, जबकि यह प्रक्रिया के दौरान इंजेक्शन समाधान के endotoxin संक्रमण से बचने के लिए आवश्यक है कि, ध्यान दें. यह अंत करने, इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया खारा समाधान बेहतर पवित्रता का होना चाहिए और इंजेक्शन जा डीएनए endotoxin हटाता है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए. एक अन्य महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम चूहों का वजन सावधान है. के बाद सेइंजेक्शन की मात्रा सफल HGD के महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक का है, यह माउस dosed अंडर न ही खत्म-dosed नमक के साथ न तो यह है कि यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है. जानवर के संभव मौत में है, जबकि बाद के suboptimal अभिकर्मक में पूर्व त्रुटि परिणाम,. आगे जानवरों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, हम में से छुटकारा पाने के लिए मेहनत कर रहे हैं कि छोटे हवाई बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए छोटे गेज सुई के साथ सीरिंज लोड करने की सलाह देते हैं. प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में गेज सुई - HGD एक 27 के साथ किया जाना चाहिए.

दुम नसों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं अगर सही इंजेक्शन काफी मदद की है. एक पूंछ प्रकाशक के साथ एक restrainer उपलब्ध नहीं है, तो माउस की कोमल हीटिंग द्वारा रक्त वाहिकाओं विस्फारित नसों के दृश्य सहायता कर सकते हैं. कुछ मिनट के लिए एक गर्मी पैड पर माउस पिंजरे रखने या हमारे हाथों में अच्छी तरह से एक गर्म, गीला कपड़ा काम के साथ पूंछ पकड़. एक गर्मी दीपक का उपयोग करते हैं, तो एक चूहों ज़रूरत से ज़्यादा गरम नहीं अत्यधिक सावधानी व्यायाम करना चाहिए. हम पाते हैं कि हमेंएक गर्मी दीपक आईएनजी चूहों अनावश्यक तनाव और बेचैनी का कारण बनता है और इसलिए, बचा जाना चाहिए. 70% इथेनॉल के साथ पूंछ पोंछते आगे पूंछ नस और त्वचा के बीच इसके विपरीत में वृद्धि से दृश्य में मदद करता है. यह कदम इंजेक्शन के दौरान बैक्टीरियल संक्रमण से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है. माउस इंजेक्शन के लिए तैयार है, एक बार पूंछ नस इस प्रोटोकॉल में वर्णित हाथ पदों में से एक का उपयोग इंजेक्शन जा सकता है. स्थिति 2 आसान और अधिक स्पष्ट दिखाई देता है, जबकि यह सिरिंज चलते बिना तरल की पूरी मात्रा इंजेक्षन करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है, ध्यान दें. इसके विपरीत, पहली विधि का उपयोग अच्छा सुई की स्थिति की स्थापना सुई हब सुरक्षित पूंछ के खिलाफ आयोजित किया जाता है, एक बार इंजेक्शन शायद ही कभी विफल रहता है, लेकिन अधिक बोझिल है. सफल अभिकर्मक हाथ की स्थिति का उपयोग संभव है, हालांकि पहली विधि भी, अधिकतम गति के लिए सिफारिश की है.

चूहों में HGD इंजेक्शन की सिफारिश की गति हालांकि, 6-8 सेकंड हैकई लेखकों तेजी से इंजेक्शन भी बेहतर परिणाम 1, 12 उपज का सुझाव है कि. स्पष्ट रूप से कम जीन अभिव्यक्ति में धीरे इंजेक्शन का परिणाम है. हालांकि, जीन अभिव्यक्ति का एक पूर्ण अभाव के लिए सबसे आम कारण इंजेक्शन की पूरी मात्रा देने के लिए विफलता है. इंजेक्शन शुरू किया गया था के बाद सुई, ले जाया जाता है जब यह होता है. सही स्थिति, सुई कोई प्रतिरोध के साथ नस में प्रवेश करती है. सुई सही ढंग से नस में डाला जाता है कि जांच करने के लिए एक पूर्ण इंजेक्शन से पहले नस में एक बहुत छोटी राशि (100 μl) तरल इंजेक्षन सकता है. सवार पर नीचे दबाने चरम प्रतिरोध के साथ मिलता है, तो सुई गलत स्थिति में है और तरल पूंछ ऊतक प्रवेश कर रहा है. सुई असफल HGD की नस मध्य इंजेक्शन, सुधार पत्ते माउस कुछ घंटों के लिए आराम करने की अनुमति दी गई थी के बाद का प्रयास किया जा सकता है. अपर्याप्त बाकी माउस को संकट का कारण बनता है और hydrodynamic pressur की हानि हो सकती है पुनः इंजेक्शन के बादई माउस की पूंछ पर पहली घाव खोलने से. दोहराया इंजेक्शन आवश्यक हैं, माउस पूरा खारा की मात्रा (और डीएनए की मात्रा) में एक ही नस में या contralateral नस में पूंछ के आधार पर या तो करीब इंजेक्शन के साथ किया जा सकता है. HGD के बाद, माउस में कम से कम एक घंटे के लिए एक गर्मी पैड पर रखा एक पिंजरे में मनाया जाना चाहिए. HGD दिल समारोह, जिगर विस्तार, और जिगर की कोशिकाओं, sinusoids और fenestrae 12, 14, 43 की झिल्ली pores के एक विघटन की भारी अनियमितता में जिसके परिणामस्वरूप intravascular दबाव में तेजी से वृद्धि का कारण बनता है. कुछ ही सेकंड में अपने रक्त की मात्रा के बावजूद, चूहों उल्लेखनीय HGD सहन. 2 मिनट और जल्द ही इंजेक्शन के बाद तेजी से कम हो जाती है जो intravascular दबाव में सामान्य करने के लिए हृदय की दर रिटर्न, 3 मिनट 12, 43 में बेसल स्तर दृष्टिकोण. बाधित hepatocytes कम से कम 2 मिनट और विस्तार जिगर आकार रिटर्न में resealलगभग 24 बजे 43 में sinusoid समारोह की वसूली द्वारा पीछा किया 30 मिनट में सामान्य आकार में. कई शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं, हमारे हाथ में, isofluorane संज्ञाहरण के कारण HGD को चूहों के श्वसन संकट exacerbates. हम anesthetized चूहों की वसूली और कभी कभी अस्तित्व के लिए पुनर्जीवन की आवश्यकता लंबे समय तक लेने पर दिखेगा. संज्ञाहरण का उपयोग चूहों के एक बड़े समूह को इंजेक्शन लगाने हैं, तो यह अच्छी तरह से ठीक हो रहे जानवरों की जा रही है की देखरेख के लिए समर्पित कमरे में एक अतिरिक्त व्यक्ति के लिए आवश्यक हो सकता है. संज्ञाहरण के बिना, के बाद भी दोहराया इंजेक्शन, माउस अस्तित्व 100% है और वसूली समय कम से कम 5 मिनट है.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल माउस जिगर के अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में स्रावित प्रोटीन Apol मैं का उपयोग करना, हम HGD एक माउस मॉडल की स्थापना और एक सुरक्षात्मक प्रोटीन के समारोह में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे पता चला. विभिन्न जीन उत्पादों का समारोह, succe की तुलना करते समयजब भी संभव हो HGD एस.एस. मूल्यांकन किया जाना चाहिए. स्रावित प्रोटीन के लिए, यह पश्चिमी धब्बा का उपयोग माउस प्लाज्मा विश्लेषण करके अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी करने के लिए आसान है (आंकड़े 2 और 4 बी.) यह एक चिकित्सकीय प्रोटीन की प्राकृतिक या कृत्रिम वेरिएंट परख करने की क्रिया जब अभिकर्मक दक्षता के रूप में, HGD की सफलता सुनिश्चित करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है सकते हैं गंभीर रूप से रोग परिणाम को प्रभावित (आंकड़े 2 और 3). उदाहरण के लिए इस विधि का एक ताकना गठन प्रोटीन (आंकड़े 4 और 5) है जो APOLI, की वजह से जिगर की क्षति का विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है दिखाने के लिए दिया जाता है. अनुक्रम स्पष्ट रूप से अलग क्षति प्रोफाइल में वही प्लाज्मिड पृष्ठभूमि परिणाम में Apol-I के वेरिएंट. यह ऊतकों को नुकसान प्रोटीन समारोह और अभिव्यक्ति वेक्टर या इंजेक्शन के ही आघात नहीं के साथ जुड़ा हुआ है. यह हमारे हाथ में, AST स्तर दिन 1 के बाद इंजेक्शन (नहीं दिखाया डेटा) पर सार्वभौमिक उच्च रहे हैं, उस पर ध्यान दिया जाना चाहिए. में चूहों के दिन 2 पर, तथापि, AST स्तरखारा सामान्य करने के लिए वापसी और जीन वेरिएंट के बीच मतभेदों के साथ jected (चित्रा 4) आसानी से प्रत्यक्ष कर रहे हैं. 3 दिन बाद इंजेक्शन से, सभी के उपचार में मापा AST उनके बेसल स्तर (नहीं दिखाया डेटा) के लिए वापसी. जिगर में परिगलित ऊतक और सूजन रह AST में एक क्षणिक वृद्धि से स्पष्ट कर रहे हैं, कारण निरंतर जीन की अभिव्यक्ति के लिए जिगर की क्षति दिन 5 के बाद इंजेक्शन पर एकत्र यकृत की धुंधला करके, गुणात्मक हालांकि, अधिक मज़बूती से मूल्यांकन किया जा सकता है. उदाहरण AST का एक बढ़ा रिहाई का कारण है कि Apol-I के वेरिएंट कि शो दिया hematoxylin और eosin साथ धुंधला हो जाना द्वारा मूल्यांकन के बाद इंजेक्शन भी अधिक निरंतर जिगर की क्षति में परिणाम 2 दिन.

Hydrodynamic जीन वितरण vivo में जीन की अभिव्यक्ति का तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है. यह एक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति वेक्टर में अध्ययन के तहत जीन की सरल निर्माण और ऊपर उल्लिखित के रूप में इंजेक्शन प्रदर्शन करने की क्षमता की आवश्यकता है. Transge की पीढ़ीऐसे एचआईवी -1 या पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर से व्युत्पन्न पुनः संयोजक lentiviral वैक्टर के रूप में जीन डिलीवरी के अन्य रूपों का उपयोग कर एनआईसी चूहों, और अधिक विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है. वायरल जीन अभिव्यक्ति कारण अक्सर मेजबान एक वायरल संक्रमण संवेदन और 15-19 जबाव देने के लिए एक भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बनता है हालांकि, हालांकि उनके लाभ, जीन अभिव्यक्ति निरंतर है. 150kb की BACS सफलतापूर्वक HGD 4 में इस्तेमाल किया गया है, जबकि इसके अलावा, वायरल वैक्टर, एक सीमित पैकेजिंग क्षमता है और इसलिए, जीन आकार में सीमित कर रहे है. इस तकनीक के माहिर के बाद, उपयोगकर्ता विवो में किसी भी न्यूक्लिक एसिड (सीडीएनए या gDNA या आरएनए) transfect और प्रोटीन का उत्पादन और जैविक परिणाम का पालन कर सकते हैं. प्रोटीन intracellular किया जा सकता है, झिल्ली बाध्य या बाह्य; यह टैग या संशोधित न्यूक्लिक एसिड में और इस तरह अमीनो एसिड का स्तर हो सकता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, यह एक बहुत तेजी से और सरल तकनीक है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम शुरू में हमें प्रौद्योगिकी के विभिन्न पहलुओं के बारे में अपने निरंतर मार्गदर्शन के लिए HGD तकनीक और डॉ. रसेल थॉमसन (मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज) को पढ़ाने के लिए ज़िया लियू (रीजनरोन फार्मास्यूटिकल्स) धन्यवाद. इस काम के हंटर कॉलेज द्वारा वित्त पोषित किया गया, CUNY धनराशि शुरू और NSF रोटी पुरस्कार IOS-1249166. हम माउस यकृत पर ऊतक विज्ञान के लिए NYULMC हिस्तोपैथोलोजी कोर NYUCI केंद्र सहायता अनुदान, एनआईएच / NCI 5 P30CA16087-31 धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol Prep Wipe Webcol 6818
AST kit, Amplite Colorimetric AAT Bioquest 13801
Conical Tube, 50 ml BD Falcon 352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
KimWipes KIMTECH 34120
Mouse Tail Illuminator Braintree Scientific MTI RST Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) BD 305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) BD 305109
pRG977 (mammalian expression vector) Regeneron Pharmaceuticals Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira  Fisher NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip BD 309657 Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD

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जेनेटिक्स अंक 87 hydrodynamic जीन डिलीवरी hydrodynamics आधारित अभिकर्मक माउस जीन थेरेपी प्लास्मिड डीएनए क्षणिक जीन अभिव्यक्ति पूंछ नस इंजेक्शन
चूहे में द्रव्यगतिकी जीन डिलीवरी द्वारा प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति
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Kovacsics, D., Raper, J. Transient… More

Kovacsics, D., Raper, J. Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice. J. Vis. Exp. (87), e51481, doi:10.3791/51481 (2014).

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