Summary
In trasfezione in vivo di DNA nudo dal gene delivery idrodinamico introduce geni nel tessuto di un animale con risposta infiammatoria minima. Quantità sufficiente di prodotto genico sono generate in modo tale che la funzione del gene e la regolazione così come la struttura e la funzione della proteina possono essere analizzati.
Abstract
Espressione efficace dei transgeni in vivo è di fondamentale importanza nello studio funzione del gene e lo sviluppo di trattamenti per le malattie. Negli ultimi anni, la consegna del gene idrodinamico (HGD) è emersa come un metodo semplice, veloce, sicuro ed efficace per la consegna di transgeni in roditori. Questa tecnica si basa sulla forza generata dalla iniezione rapida di un gran volume di soluzione fisiologica per aumentare la permeabilità delle membrane cellulari di organi perfusi e quindi consegnare DNA nelle cellule. Uno dei principali vantaggi del HGD è la possibilità di introdurre transgeni in cellule di mammifero usando nuda DNA plasmidico (pDNA). L'introduzione di un gene esogeno utilizzando un plasmide è minimamente laborioso, altamente efficiente e, contrariamente ai vettori virali, notevolmente sicuro. HGD è stato inizialmente utilizzato per trasportare i geni nei topi, è ora utilizzato per fornire una vasta gamma di sostanze, tra cui oligonucleotidi, cromosomi artificiali, RNA, proteine e piccole molecole in topi, rattie, in misura limitata, altri animali. Questo protocollo descrive HGD nei topi e si concentra su tre aspetti fondamentali del metodo che sono fondamentali per eseguire la procedura correttamente: corretto inserimento dell'ago nella vena, il volume di iniezione e la velocità di consegna. Esempi sono forniti per mostrare l'applicazione di questo metodo per l'espressione transiente dei due geni che codificano proteine secrete, specifico primate-, apolipoproteina LI (APOL-I) e proteine aptoglobina correlata (HPR).
Introduction
Fin dalla sua prima descrizione da Liu et al. Ed Zhang et al., Consegna del gene idrodinamico (HGD) è diventato uno strumento prezioso per studiare la funzione del gene in sistemi modello roditore 1, 2. La tecnica prevede l'iniezione rapida (5-7 sec) di un grande volume (8-12% del peso corporeo) di soluzione nella vena caudale di topi per facilitare l'assorbimento di DNA plasmidico da cellule di organi bersaglio 1, 2. Queste condizioni portano ad espressione genica robusta nel fegato e meno espressione genica nel rene, milza, polmone e cuore.
Iniezione di 10 mg pCMV-LacZ plasmide può trasfettare fino al 40% degli epatociti, rendendo il HGD non virale in vivo metodo più efficiente, il trasferimento genico ad oggi 1. A differenza di vettori virali, pDNA è facile da preparare, non suscitare una risposta immunitaria nell'ospite roditore 3 e non costituisce un rischio per la salute ricombinando con finevirus esogeni. Inoltre, poiché le molecole di DNA forniti da HGD non necessitano imballaggio, questo metodo è adatto per la consegna dei cromosomi batterici artificiali (BAC) grandi come 150 kb 4. Altri tipi di molecole che sono state fornite da un metodo idrodinamico includono RNA 5-10, Morpholinos 11, proteine 12, 13 e altre piccole molecole 12, 14. I vantaggi e gli svantaggi di HGD rispetto ad altri metodi di consegna sono stati discussi in eccellenti recensioni in letteratura 15-20 e un certo numero di autori hanno fornito una descrizione dettagliata della procedura 21-23.
Introdurre transgeni in topi da HGD è sicuro ed efficace 1-3, 24 e il metodo è stato utilizzato in ratti con successo paragonabile 25. Con alcune modifiche, proof of concept esperimenti sono stati condotti in polli 26, rabi bit 27 e 28 suini, anche se, l'applicazione in vivo di questa tecnica in animali più grandi rimane una sfida. Quando si utilizza questo metodo, un altro limite comune è che molti dei vettori di espressione di mammifero disponibili mancano i componenti per realizzare una persistente, elevato livello di espressione genica. Utilizzando un plasmide, espressione genica pCMV-Luc in organi bersaglio è evidente già dieci minuti dopo HGD, tuttavia, il livello di espressione iniziale elevato scende bruscamente nella prima settimana dopo l'iniezione 1. Espressione del transgene a lungo termine è possibile a seconda del promotore e introni utilizzato nella progettazione plasmide 3, 24 iniezioni tuttavia, manutenzione di espressione genica di alto livello spesso richiede ripetuti. Per questo motivo, HGD potrebbe essere meno adatto per studiare le malattie croniche che sono il risultato di esposizione a lungo termine alle proteine dannose o prodotti proteici. Con queste limitazioni, HGD è uno strumento estremamente potente per studiare il Poziale ruolo di un gene e l'effetto di essa mutanti in vivo, così come gli effetti terapeutici e regolazione delle proteine e per la creazione di modelli animali di malattia (per una rassegna, si veda 15). Ad esempio, HGD può essere utilizzato per assegnare funzioni ai domini e aminoacidi di proteine introducendo singolarmente vari costrutti genici in topi che hanno i rispettivi geni messo fuori. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata in qualsiasi ceppo di topi.
Questo protocollo descrive HGD in topi con un focus sugli aspetti tecnici necessari per raggiungere trasfezione di successo: corretto inserimento ago nella vena, volume di iniezione e la velocità di consegna. L'applicazione di questo metodo è dimostrato in un modello murino di tripanosomiasi africana, una malattia fatale di esseri umani e animali 29, 30. Mentre diverse specie di trypanosomes causano malattie nel bestiame, la maggior parte non può causare malattie negli esseri umani a causa di complessi immuni innate in blood chiamate fattori litici tripanosoma (TLFs) 29, 31, 32. Questi, lipoproteine ad alta densità formanti pori (HDL) contengono due uniche, specifiche primate-proteine:. HPR, il ligando, che facilita l'assorbimento di TLFs in trypanosomes e APOL-I, la componente litica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense è in grado di infettare gli esseri umani a causa di espressione di una resistenza associata proteine del siero (SRA) che si lega e neutralizza umano APOL-I 34, 39. Baboon TLF non è neutralizzato da SRA grazie alla sua divergente APOL-I proteica 40. Come riportato in precedenza, utilizzando un vettore di espressione di mammifero (pRG977), espressione transgenica di babbuino componenti TLF nei topi conferisce protezione contro trypanosomes umane-infettivi 40. I dati rappresentativi presentati dimostrano come gene delivery idrodinamico può essere applicato per studiare gli effetti terapeutici di una proteina.
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Protocol
Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal Comitato di Hunter College Institutional Animal Care ed uso, City University of New York.
1. Preparazione privo di endotossine plasmide DNA
- Scegliere una singola colonia di batteri contenenti il gene di interesse in un vettore di espressione di mammifero da una piastra selettiva appena striato.
- Seguire le indicazioni fornite nel manuale di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio per la coltivazione e la raccolta dei batteri.
- Purificare il privo di endotossine DNA plasmidico da cellule batteriche seguendo il protocollo di un kit di purificazione plasmide privo di endotossine disponibile in commercio.
- Utilizzare privo di endotossine plastico e maneggiare DNA con cura per assicurare che endotossine non è re-introdotto nel campione di DNA dopo la fase di rimozione.
- Misurare la concentrazione di endotossina senza plasmide DNA determinando la sua assorbanza a 260 nm utilizzando un micrspettrofotometro o volumi UV come descritto di seguito o uno standard, spettrofotometro basato cuvetta.
- Pulire le superfici ottiche inferiori e superiori del sistema di ritenzione del campione spettrofotometro micro come segue. Dispensare 1 ml di acqua deionizzata pulita sul sistema ottico inferiore. Chiudere il braccio di leva e toccare un paio di volte a fare il bagno al sistema ottico superiore, quindi leva di apertura e pulire con un panno.
- Aprire il software del micro spettrofotometro e selezionare il modulo acidi nucleici.
- Mettere 1 ml di acqua pulita deionizzata sul sistema ottico inferiore, abbassare il braccio di leva e selezionare "inizializzare" dal programma software. Una volta che l'inizializzazione è superfici completi, puliti sia ottici con un tessuto ..
- Eseguire la misurazione in bianco caricando 1 ml di privo di endotossine tampone TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) e selezionando "vuoto" dal programma software. Una volta che la misurazione in bianco è fatto, superfici pulite sia ottiche contessuto.
- Eseguire la misurazione del campione caricando 1 ml di privo di endotossine campione di DNA e selezionando "misura" dal programma software. Registrare la concentrazione di DNA. Valutare la purezza del DNA registrando il rapporto di assorbanza 260/280 nm che appare sullo schermo. Poiché l'uso di DNA puro (260/280 rapporto di 1,8) per HGD è altamente auspicabile, evitare di utilizzare un campione di DNA con un rapporto 260/280 sotto 1.7. Una volta misurazione viene effettuata, pulire entrambe le superfici ottiche con un fazzoletto.
2. Pesatura dei topi
- Mark topi in modo appropriato per il ceppo. Nota: la marcatura della coda non è raccomandato per questa procedura.
- Specie di topo Mark che hanno pelliccia bianca (es. Swiss Webster) sulla schiena con un pennarello nero. Riapplicare marchi nel tempo necessario.
- Mark specie di topo che hanno pelliccia nera (ad es C57BL / 6) a orecchio punzonatura diversi giorni di anticipo.
- Pesare topi individually mettendoli delicatamente in un piatto animale o secchio posto su una bilancia da laboratorio digitale. Registrare il peso di ciascun topo utilizzato nell'esperimento, il giorno dell'esperimento.
3. Preparazione di siringhe
- Preparazione della miscela di iniezione
- Calcolare la quantità di DNA necessaria assumendo 5-50 ug privo di endotossine DNA plasmidico per l'iniezione di ciascun topo.
- Determinare la quantità ottimale di DNA plasmidico sperimentalmente.
- Nel determinare la quantità di DNA necessaria, assumere l'iniezione di un mouse aggiuntivo per ogni gruppo, come il caricamento corretto delle siringhe richiederà un po 'di mix di iniezione supplementare. Per aiutare i calcoli, si consideri il seguente esempio: iniettare 4 topi sperimentali e 4 di controllo, ciascuno del peso di 25 g, con 50 microgrammi di plasmide DNA per mouse. Per determinare la quantità di DNA necessaria in questo caso, calcolare con 5 topi per gruppo: 5 x 50 mcg = 250 ug di DNA necessarie per ciascun gruppo.
- Determinare la quantità di soluzione fisiologica (0,9% cloruro di sodio) necessari assumendo il 10% del peso corporeo per l'iniezione di ciascun topo.
- Secondo l'esempio di cui sopra, iniettare ogni 25 g mouse con 50 pg di DNA plasmidico in 2,5 ml di soluzione fisiologica (2,5 g di liquido).
- Nel determinare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per un intero gruppo di topi, assumere l'iniezione di un mouse aggiuntivo per gruppo per consentire il caricamento corretto delle siringhe. Considerando l'esperimento data, calcolare la quantità di soluzione fisiologica necessaria per 5 topi in ciascun gruppo: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml di soluzione fisiologica per ogni gruppo (o 25 ml totale). Nota: Se topi dello stesso gruppo non sono lo stesso peso (differenza superiore al 10% del peso corporeo), preparare iniezione mescola separatamente.
- Utilizzare conservanti e privo di endotossine, soluzione salina sterile che è stato approvato per uso umano, in 10 ml, più flaconi di utilizzo.
- Utilizzando un ago calibro 20 (0,9 mm x 25 mm) attaccato ad una punta luer-lock di una siringa da 20 ml,prelevare il liquido da fiale saline e svuotare le siringhe in una provetta conica da 50 ml. Per aiutare pipettaggio accurata salina durante la preparazione delle miscele di iniezione di DNA-salina, soluzione salina raccogliere più del necessario per l'iniezione di tutti i topi nell'esperimento. Per l'esperimento di cui sopra, ritirarsi salina da 3, 10 ml fiale (per un totale di circa 30 ml), anche se l'importo calcolato di soluzione fisiologica necessari per l'esperimento è solo 25 ml.
- Pipettare la quantità calcolata di DNA in un tubo da 50 ml differente. Fate attenzione a non toccare il lato del tubo con il corpo pipetta per evitare l'introduzione di endotossine. Secondo l'esempio, pipettare 250 pg di controllo e 250 pg di DNA plasmidico sperimentale in provette coniche separati.
- Aggiungere la quantità richiesta di soluzione salina al DNA usando una pipetta sierologica. Considerando l'esperimento campione, pipettare 12,5 ml di soluzione salina a ciascuno dei Master Mix (sperimentale e di controllo).
- Consentire tutte le soluzioni per raggiungeretemperatura ambiente prima dell'iniezione.
- Calcolare la quantità di DNA necessaria assumendo 5-50 ug privo di endotossine DNA plasmidico per l'iniezione di ciascun topo.
- Preparazione di siringhe
- Per ciascun topo, riempire una sterile, 3 ml, siringa luer-lock con la miscela di DNA-salina sterile utilizzando una, ago 20 gauge (0,9 mm x 25 mm). Fare attenzione ad evitare bolle d'aria. Evitare di utilizzare siringhe volumi elevati, la portata di iniezione non può essere controllato molto bene, ed è difficile da manipolare siringhe più grandi in una mano. Espellere qualsiasi mix di DNA-salina in eccesso nel tubo conico in quanto questo può essere riutilizzato.
- Passare l'ago di una sterile, ago 27-gauge. Riempire l'ago con il liquido completamente senza introdurre bolle d'aria. Regolare il volume della miscela di DNA-salina calcolato sulla base del peso del mouse.
- Non permettere che l'ago senza cappuccio di toccare qualsiasi superficie non sterile. Se necessario, gli aghi possono essere nuovamente presenze con la tecnica con una sola mano: mettere il tappo su una superficie piana, inserire l'ago, senza trattenendo il tappo con l'altra mano e premere l'ago copertocontro un oggetto fermo per fissare il tappo sul dell'ago. Le siringhe sono ora pronti per iniezioni vena della coda.
4. Consegna del DNA idrodinamica
- Si noti che i topi anestetizzante può ridurre la vitalità. Evitare di eseguire HGD in una stanza che è troppo freddo, in quanto questo sarà anche ridurre la vitalità. Se la stanza ha una temperatura ambiente di 20 ° C o se si utilizza l'anestesia, posizionare il mouse su una piastra elettrica a 37 ° C procedura di post per evitare la perdita di qualsiasi animale. Se si utilizza l'anestesia, assicurarsi che la bocca e il muso del mouse mentre si libera sulla rampa di calore e osservare il mouse fino a che non si riprenda pienamente. Non trattenere cibo né acqua dai topi prima di HGD.
- Riscaldare i topi di dilatare i vasi sanguigni.
- Posizionare la gabbia del mouse (con letti preparati) su un tappetino di calore per 5 minuti in modo che la temperatura della lettiera è di circa 38-39 ° C. La temperatura deve essere sufficientemente bassa per mantenere i topi sul tappetino calore per unperiodo prolungato.
- In alternativa, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione accesso dorsale con moderazione minima. Riscaldare la coda del topo per 1 min tenendolo delicatamente con una garza bagnata in acqua calda. Lasciare mouse per riposizionare, se necessario. Pulire la coda con un tessuto ad asciugare.
- In alternativa, caldo mouse posizionando la gabbia sotto una lampada di calore per non più di 2 min. Se si utilizza una lampada di calore, cautela per evitare il surriscaldamento del mouse.
- Iniezione coda vena di grandi volumi
- Immobilizzare un accesso restrainer dorsale su una superficie piana nastro laboratorio.
- Tenendo per la coda, posizionare il mouse delicatamente nel dispositivo di immobilizzazione e inserire la spina. Uso come poco fermo come necessario per mantenere la coda immobilizzato. Assicurarsi che il mouse respira liberamente.
- Se il mouse è in grave crisi in qualsiasi momento durante la procedura, rimuovere il mouse dalla immobilizzazione immediatamente e lasciarlo riposare.
- Posizionare il mouse in modouna delle vene caudale laterale è visibile. Individuare le vene caudali laterali da visto direttamente sul retro del mouse: la linea rossa scorre al centro della coda è un'arteria, mentre le linee blu su entrambi i lati della coda sono le vene caudali laterali.
- Pulire la coda del topo accuratamente con alcool.
- Usando la mano non iniezione, tenere la coda stretta tra l'indice e il medio in modo che la coda passa sotto l'indice, il medio e l'anulare e sotto il mignolo. Lasciare che il pollice di rimanere libero di muoversi. (Figura 1A)
- Con l'altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona.
- Raccogliete la siringa caricata con il iniezione-mano e tenere per la canna tra il pollice e le altre quattro cifre. Non tenere su lo stantuffo.
- Posizionare la siringa parallela alla coda con la punta dell'ago verso il corpo del mouse ela smussatura (bordo inclinato) dell'ago rivolta verso l'alto.
- Inserire l'ago nella vena della coda. Procedere con l'iniezione solo se la vena è posizionata correttamente, che è evidente dall'ago scorrevole in senza resistenza. Si noti che la profondità di inserimento dell'ago è una questione di preferenze personali però, pieno di inserimento non è raccomandato a causa di un aumentato rischio di taglio della vena. Evitare di spostare l'ago.
- Usando il pollice della mano-coda tenendo, chiudere sul mozzo dell'ago e premere mozzo contro la coda di tenere l'ago in posizione. Non applicare una pressione estrema e non tenere sull'albero ago, in quanto questi saranno ostacolare il flusso di liquido nella vena. Tenere la coda con il dito indice liberamente a questo punto in modo da non ostacolare l'iniezione (Figura 1A).
- Riposizionare la mano-siringa che tiene in modo che il dito indice e medio stanno trattenendo la flangia e il pollice si trova all'estremità dello stantuffo (Figure 1A).
- Premere verso il basso sul pistone in un movimento continuo ed iniettare l'intero volume del liquido in 6-8 sec.
- Rimuovere l'ago dalla vena e fermare l'emorragia applicando una leggera pressione alla coda con un fazzoletto.
- Rimuovere il mouse dal dispositivo di immobilizzazione e il luogo topo in una gabbia di recupero posta sulla cima di una piastra elettrica (biancheria da letto dovrebbe essere 37-38 ° C). Se la camera di iniezione è fredda, questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza del mouse. Tenere su la coda del topo fino sanguinamento si arresta completamente.
- Osservare il mouse per 1 ora dopo la consegna del DNA idrodinamica. Un periodo iniziale di ansimare e di immobilità è normale a causa dell'aritmia temporanea causata da HGD ma fare in modo che il mouse mostra segni di ripresa in circa 5 min. Se il respiro del mouse diventa estremamente superficiale, massaggiare delicatamente l'addome del mouse per facilitare la respirazione. Si noti che il tasso di recupero può essere leggermente influenzata dal ceppo di topi utilizzato.
- Topo di ritornoa gabbia alloggi e garantire che il mouse ha un abbondante approvvigionamento di cibo e acqua.
- Large-volume di iniezione coda vena con una posizione alternativa a mano
- Posizionare il mouse nel dispositivo di immobilizzazione e prepararsi per l'iniezione seguendo i punti 4.3.1 tramite 4.3.5, come descritto in precedenza.
- Appoggiare la mano non iniezione su una superficie piana con quattro dita piegate con un angolo di novanta gradi. Le dita (tutti tranne pollice) devono appoggiare su di loro, creando una piattaforma. Tenere la coda del topo tra il pollice e il dito di puntamento (Figura 1B).
- Con l'altra mano, pulire la zona da iniettare nuovamente con alcool. Lasciare asciugare zona.
- Afferrare siringa con l'iniezione mano tenendolo per la flangia e l'estremità dello stantuffo, pronto per l'iniezione.
- Completare la procedura seguendo questo protocollo dal punto 4.3.9 fino al passo 4.3.17, come descritto in precedenza.
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Representative Results
Il corretto posizionamento dell'ago nella vena della coda del topo (come illustrato nella Figura 1) è un prerequisito per ottenere con successo un transgene mediante trasfezione basato idrodinamica. Spesso la parte più impegnativa della tecnica, tuttavia, è il mantenimento dell'ago all'interno della vena caudale senza movimento in modo che l'intero volume di iniezione può essere formulato entro 6-8 s. Piccoli errori durante il processo di iniezione possono causare notevolmente ridotta efficienza di trasfezione e proteica. Pertanto, è indispensabile per monitorare il successo del HGD per ciascun esperimento. Se la proteina transgenica di interesse è difficile da rilevare mediante western blot per la mancanza di anticorpi sensibili, come nel caso di babbuino APOL-I, efficienza iniezione può essere monitorato da co-iniezione di un plasmide che contiene un gene per una proteina che è facilmente rilevabile. Nell'esperimento mostrato in Figura 2, i topi sono stati iniettati con 50pg di un plasmide che trasporta uno dei tre differenziale 6xHis etichettato babbuino geni APOL-I e 50 microgrammi di un altro plasmide (stesso disegno vettore di espressione), che stava trasportando babbuino HPR (bHPR, etichettato). L'obiettivo principale di questo esperimento era di valutare se l'aggiunta di un tag 6xHis nelle posizioni sequenza scelta interferisce con la corretta elaborazione e la secrezione del babbuino APOL I-proteina. Se, tuttavia, l'aggiunta del tag interrompe il ripiegamento corretto e, di conseguenza, la secrezione della proteina, diventa difficile determinare se la perdita di espressione della proteina è verificato a causa dell'elaborazione alterata o fallita HGD. Inoltre, a causa della mancanza di anticorpi sufficientemente sensibili, rilevazione diretta del babbuino APOL-I nel plasma topo trasfettate è difficile anche in caso di rilascio genico successo (come determinato dalla protezione di topi contro una sfida tripanosoma umano infettiva). In questo esperimento, sono state affrontate queste questionimediante aggiunta di una quantità equivalente di babbuino HPR plasmide alla miscela APOL-I HGD per servire come controllo iniezione surrogato. Come mostrato nella figura, babbuino HPR è altamente espresso nel plasma di quasi tutti i topi trasfettate indicando che il HGD è riuscita. Gocce minori nei livelli di espressione, come si vede in una delle due topi nel gruppo bAPOL-I 6xHis 1 Nella Figura 2A, sono generalmente attribuibili ad una riduzione molto piccola (1-2 s) della velocità di iniezione. In Figura 2B, il primo campione corsia plasma 1 (in gruppo bAPOL-I 6xHis 3) mostra una completa mancanza di espressione della proteina indica un HGD fallito. In molti casi, questo è dovuto all'iniezione incompleta del volume massimo del veicolo di consegna. Da questo esperimento conferma la riuscita HGD in tutti i casi tranne uno, l'effetto di 6xHis marcatura su bAPOL-I secrezione può ora essere valutati con un immunoblot anti-6xHis (Figura 2C e D). Come si è vistoin figura 2D, il solo gruppo di topi che avevano livelli rilevabili di proteina 6xHis-tag nel plasma era gruppo 3. Il modello di espressione della proteina all'interno di questo gruppo ha confermato che l'iniezione di uno dei topi in questo gruppo non ha avuto successo. La completa assenza di proteine 6xHis rilevabili nei gruppi 1 e 2 (Figura 2C) sottolinea l'importanza di includere una proteina tracciante nella miscela di iniezione per monitorare il successo del HGD. Senza considerare i livelli plasmatici di bHPR (Figura 2A e B), i dati di Figura 2C e D potrebbero facilmente essere erroneamente interpretate come un fallimento di HGD nei gruppi 1 e 2.
Il successo HGD del babbuino componenti TLF1 bAPOL-I e bHPR, dà topi resistenza ai parassiti umani infettiva Trypanosoma brucei brucei-SRA (Tbb-SRA, un equivalente laboratorio di T. b. Rhodesiense) 40. Questa resistenza è dovuta alla espressione transgenica di bAPOL-I </ Em>, come l'iniezione di bHPR da solo non fornisce alcuna protezione contro i parassiti umani infettive. Per valutare se le varianti 6xHis-targhetta di bAPOL-I sono ancora in grado di funzionare proteine come litici, i topi che hanno ricevuto entrambi bAPOL-I e bHPR da HGD si sono sfidati con 5000 Tbb-SRA parassiti due giorni dopo la consegna del gene. Come si vede nella figura 3, i topi del gruppo 6xHis 2 ceduto alle infezioni molto precoce, mentre la maggior parte dei topi in gruppi 1 e 3 sono sopravvissuti fino a quando il controllo positivo non etichettato bAPOL-I. (Baboon APOL-I conferisce una protezione parziale in questo ceppo di topi.) Poiché l'espressione del transgene nel gruppo 2 era universalmente alto, la mancanza di protezione in questi topi può essere interpretata correttamente come la perdita di bAPOL-I funzione litico grazie al tag 6xHis in quel posizione. Bisogna fare attenzione, tuttavia, che la prematura (giorno 7) morte di un mouse all'interno del gruppo 3 non è interpretato, come questo mouse non è stato iniettato con successo con i transgeni (vedi Fig.ure 2B, corsia 1). Alla luce dei dati combinati provenienti da figure 2 e 3, si può concludere che bAPOL-I, possono essere marcate in posizione 3 (in gruppo 6xHis 3), senza effetti collaterali, mentre la codifica di questa proteina in posizione 2 (in gruppo 6xHis 2) interrompe la sua litico funzione. Nel gruppo 6xHis 1, mentre i dati suggeriscono tutela il numero di topi era insufficiente per ottenere dati significativi. Analisi di potenza devono essere eseguite per determinare il numero di topi richiesti per ogni esperimento. Mentre l'apparente mancanza di proteina rilevabile nel topo plasma dal gruppo 1 può sembrare contraddittorio al modello di protezione visto in Figura 3, si noti che un anti-6xHis western blot negativo in questo gruppo può essere il risultato di una mancanza di rilevamento dovute alla lavorazione proteina piuttosto che una mancanza di espressione genica. Nel gruppo 1, il tag 6xHis è stato aggiunto vicino dopo che il sito scissione del peptide segnale previsto. Il babbuino APOL-I Amino sequenza di acido contiene un predicte supplementared sito di clivaggio proteolitico circa 20 aminoacidi dal sito di clivaggio del peptide segnale 40. Pertanto, è chiaro che bAPOL-io in questi topi è secreto e funzionale ancora perso il tag 6xHis necessario per la sua individuazione. Così illustrando l'importanza della sua collocazione tag.
APOL-I uccide trypanosomes africani formazione di pori nella membrana parassita lisosoma 36, 37. Varianti naturali di umana APOL-I, che si trova in persone con recente origine africana, sono stati fortemente associati con la malattia renale negli afro-americani, anche se, il meccanismo di danno renale è ancora chiaro 41, 42. Dal HGD traduce nell'espressione genica più alta nel fegato, abbiamo voluto indagare se umano APOL-I o la sua variante sequenza sintetica provoca danni a questo organo. A tal fine, i topi sono stati iniettati con 50 pg di WT umana APOL-I o un singolo amminoacido mutante sintetica designatos K4.To valutare danni al fegato, abbiamo misurato aspartato transaminasi (AST) i livelli nel topo di plasma raccolti il giorno 2 post-iniezione. Coerentemente con la sua funzione litico, WT umana APOL-I provoca un aumento dei livelli sierici di AST (Figura 4A) rispetto ai topi soluzione salina iniettata. Al contrario, l'iniezione di mutante K4, che differisce in un solo amminoacido, causato molto poco liberatoria AST. Le differenze a danno epatico è improbabile che siano attribuibili a livelli di espressione della proteina, come i livelli di proteina K4 sono equivalenti o superiori a quelli del WT umana APOL-I (Figura 4B). L'esame dei fegati di topi HGD raccolto cinque giorni dopo l'iniezione mostra che umano WT APOL-I provoca la necrosi dei tessuti limitata con moderata infiltrazione di macrofagi (Figura 5B) rispetto ai topi soluzione salina iniettata che mostrano normale istologia epatica (Figura 5A, zone viola) . Confermando i dati ottenuti misurando AST plasma, K4 iniettato nella stessa backg plasmiderotondo come la WT mostra normale istologia epatica (Figura 5C).
Figura 1. Illustrazione di posizioni delle mani per HGD. A.) è stato avviato montaggio 1. Positiva posizione della mano per raggiungere la velocità massima di iniezione e per evitare movimenti ago dopo l'iniezione. La freccia indica il movimento suggerito del pollice dopo l'inserimento dell'ago nella vena. Thumb dovrebbe immobilizzare l'ago tenendo delicatamente il mozzo contro la coda del topo. La mano che tiene la siringa deve essere riposizionato per essere in grado di premere sullo stantuffo prima dell'iniezione. B.) Posizione 2. Questa posizione è consigliata se l'iniezione coda vena deve essere effettuata più vicino alla base della coda a causa di iniezioni ripetute. Una volta che l'ago è inserito nella vena, questa posizione della mano non ha bisogno pellicciarettifiche ther.
Figura 2 Western blot di plasma raccolto da cinque settimane di età, di sesso femminile, Swiss Webster (SW) topi iniettati con un mix di due plasmidi distinti:. Babbuino HPR 50 mg e 50 mg di differenziale 6xHis tagged babbuino geni APOL-I. I topi sono stati iniettati con veicolo salina come controllo negativo. Per confermare il successo di HGD, questo esperimento mostra i livelli plasmatici circolanti di proteina babbuino HPR, come babbuino APOL-I è difficile da rilevare. Campioni di plasma di topo sono stati raccolti i livelli di espressione 2 giorni dopo HGD e proteine sono stati analizzati mediante western blot (plasma diluito 1,20) il 10% Tris-glicina gel di poliacrilammide denaturante, sotto condizioni non riducenti. HPR è stato rilevato usando un anticorpo policlonale di coniglio contro aptoglobina umana (HP), che reco anchegnizes babbuino HPR. Tagged bAPOL-I è stato rilevato utilizzando un anticorpo policlonale di coniglio contro un tag 6xHis. Pesi molecolari del controllo 6xHis proteine sono incluse 40 e 50 kDa. A.) Pannello mostra un esempio di analisi western blot di una proteina secreta (HPR) quando tutti i topi in un gruppo sono stati iniettati con successo. Notare l'espressione uniformemente alto contenuto di proteine nel secondo gruppo HIS-tag (bAPOL-I 6xHis Gruppo 2), dove iniezione era di grande successo. Nel primo gruppo (bAPOL-I 6xHis Gruppo 1), l'espressione della proteina da uno dei topi è prominente ma piuttosto ridotta, probabilmente a causa della ridotta velocità di iniezione. B.) pannello mostra un esempio dei livelli di espressione della proteina quando una delle iniezioni (in bAPOL-I 6xHis Gruppo 3) non ha avuto successo. C.) Pannello dimostra l'importanza di includere una proteina tracciante (bHPR) per monitorare il successo dei HGD quando la rilevazione della proteina di interesse (bAPOL-I) è incerto. Nonostante il successo confermata di HGD in bAPOL-I
Figura 3. Sopravvivenza dei topi che esprimono babbuino varianti APOL-I 6xHis e babbuino HPR. Cinque settimane di età, di sesso femminile, Swiss Webster topi hanno ricevuto 50 mg di ciascuno dei due plasmidi separati da HGD nello stesso mix di iniezione. I topi utilizzati in questo esperimento corrisponde al plasma analizzato in Figura 2. Il giorno 2 post-iniezioni, i topi sono stati infettati con 5000 umani-infettivi parassiti Tbb-SRA e parassitemia è stata monitorata. Quando parassitemia raggiunto 10 9 parassiti / ml, i topi sono stati sacrificati. La sopravvivenza era significativamente diversa dal controllo salino dove indicato (* - P <0,05, log-rank test). Sopravvivenza mouse su sfida parassita è un esempio di come il successo di HGD influenza dati ottenuti da esperimenti successivi. Quando babbuino APOL-I viene iniettato con successo, il prodotto del gene viene secreto nel sangue del mouse dove viene ripreso da e uccide trypanosomes umane-infettivi. La curva di sopravvivenza mostra che i topi iniettati con il tag versione 6xHis 3 del babbuino APOL-I erano significativamente protetto contro Tbb-SRA. L'unica morte prematura in questo gruppo corrisponde al mouse che non è stato iniettato con successo con il plasmide recante il transgene (vedere Figura 2). Questo mouse dovrebbe essere escluso dall'analisi di sopravvivenza come la sua sopravvivenza sulla sfida parassita non è attribuibile a differenze del transgene ricevute, ma al fallimento della consegna del gene.
Figura 5. Sostituzione di un singolo amminoacido nella sequenza APOL-I risultati in diversi livelli di patologia dei tessuti. La figura mostra fegato dei topi SW che hanno ricevuto iniezioni idrodinamiche di veicoli salino (A), 50 mg umano WT APOL-I (B), o 50 mg di una variante mutante sintetico di APOL-I, K4 (C). I fegati sono stati rimossi il giorno 5 dopo l'iniezione e trattati per ematossilina ed eosina. Esempi rappresentativi sono mostrati degli stessi topi saggiato per AST in Figura 4. Pannelli (DF) mostrano ulteriori esempi di aree danneggiate in topi WT. Focolai di necrosi in pannelli (B), (DF) sono contrassegnati con rettangoli neri e sono ingrandite. Frecce bianche in questi pannelli indicano le aree di infiltrazione dei macrofagi. Per confronto, Tessuto normale da una zona rappresentativa del fegato di un veicolo salino-iniettato mouse è contrassegnato da un rettangolo azzurro chiaro ed è anche allargata. Pannelli (B) e (D) sono immagini rappresentative dello stesso topo WT, mentre i pannelli (E) e (F) provengono da due diversi topi WT.
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Discussion
Quando eseguito correttamente, HGD è un mezzo straordinariamente efficace e sicuro di consegna transgene. I passaggi critici di successo HGD sono: 1) fornire la giusta quantità di DNA in un grande volume di soluzione salina veicolo 2) nella vena della coda del topo 3) in meno di 8 sec.
Sebbene il processo di iniezione stesso richiede innegabilmente una certa destrezza manuale, il successo di questa procedura sei secondi si trova spesso in preparazione accurata dell'esperimento. La quantità di pDNA necessario per raggiungere la massima espressione genica può variare notevolmente a seconda del plasmide usato e il gene da esprimere, pertanto, la quantità ottimale di DNA da iniettare deve essere determinato sperimentalmente per ogni applicazione. Per i topi, la gamma DNA consigliata in generale è 5-50 mg, oltre il quale l'espressione genica può raggiungere un plateau. Nelle nostre mani, l'iniezione di 50 mg pRG977 trasportano sia il APOL-I o gene HPR porta ad elevati livelli di circulating livelli di proteine nei primi due giorni dopo HGD. I livelli ematici di entrambe le proteine diminuiscono significativamente nel corso dei prossimi due giorni fino a quando i livelli di proteina scendere al di sotto dei livelli rilevabili in tutto 10 giorni (38 e dati non pubblicati). La quantità ottimale di DNA deve essere spedito in una soluzione fisiologica pari al 8-12% del peso corporeo del topo 1, 2. Mentre la maggior parte dei ricercatori, noi compresi, usa salina come veicolo iniezione, soluzione di Ringer è stato usato per HGD con successo paragonabile 2. Si noti che, mentre non è necessario effettuare HGD in un ambiente sterile, è indispensabile per evitare la contaminazione endotossina della soluzione iniettabile di tutta la procedura. A tal fine, la soluzione salina utilizzata per iniezioni deve essere di purezza superiore e il DNA da iniettare deve essere preparato utilizzando un kit disponibile in commercio che rimuove endotossina. Un altro importante passo preparatorio è l'attenta valutazione dei topi. Poiché l'volume di iniezione di uno degli aspetti critici di successo HGD, è importante accertarsi che il mouse è né sotto-dosato né troppo dosato con soluzione salina. I primi risultati di errore in trasfezione non ottimale, mentre il secondo nella possibile morte dell'animale. Per garantire ulteriormente la sicurezza degli animali, si consiglia di caricare le siringhe con la piccola-gauge per evitare l'introduzione di piccole bolle d'aria che sono difficili da eliminare. HGD deve essere effettuata con un 27 - ago calibro come descritto nel protocollo.
Iniezione corretta è notevolmente facilitata se le vene caudali sono chiaramente visibili. Dilatando i vasi sanguigni da riscaldamento delicato del mouse può aiutare la visualizzazione delle vene se un dispositivo di immobilizzazione con una coda-illuminatore non è disponibile. Posizionando la gabbia del mouse su un pad termico per pochi minuti o tenendo la coda con un caldo, il lavoro panno bagnato bene nelle nostre mani. Se si utilizza un calore lampada, si deve prestare la massima attenzione a non surriscaldare i topi. Troviamo che cizione un calore provoca la lampada topi stress e disagi non necessari e pertanto deve essere evitato. Pulendo la coda con il 70% di etanolo aiuta ulteriormente visualizzazione aumentando il contrasto tra la vena della coda e la pelle. Questa fase è critica per evitare la contaminazione batterica durante l'iniezione. Una volta che il mouse viene preparata per l'iniezione, la vena della coda può essere iniettato utilizzando una delle posizioni delle mani descritte in questo protocollo. Si noti che mentre la posizione 2 appare più facile e più semplice, può essere più difficile iniettare l'intero volume di liquido senza spostare la siringa. Al contrario, stabilire una buona posizione dell'ago utilizzando il primo metodo è più ingombrante però, una volta che il mozzo dell'ago è tenuto saldamente contro la coda, iniezione fallisce raramente. Il primo metodo è consigliato anche per la massima velocità, anche se la transfezione di successo è possibile utilizzando la posizione della mano.
La velocità di somministrazione raccomandato HGD nei topi è 6-8 sec, sebbenemolti autori suggeriscono che le iniezioni più veloci producono risultati ancora migliori 1, 12. Risultati iniezione lenta in genica marcatamente ridotta. Tuttavia, il motivo più comune per una completa mancanza di espressione genica è mancata consegna l'intero volume di iniezione. Ciò si verifica quando l'ago viene spostato, dopo l'avvio dell'iniezione. Correttamente posizionato, l'ago entra nella vena senza resistenza. Per verificare che l'ago sia inserito correttamente nella vena, si può iniettare una piccola quantità (100 ml) di liquido nella vena prima dell'iniezione completo. Se premendo lo stantuffo incontra con estrema resistenza, l'ago è in posizione sbagliata e il liquido entra nel tessuto coda. Se l'ago lascia la vena mid-iniezione, correzione del soccombente HGD può essere tentata dopo che il topo è stato permesso di riposare per un paio d'ore. Re-iniezione dopo un riposo insufficiente fonte di sofferenza per il mouse e può provocare la perdita di PRESSIONE idrodinamicoe aprendo la prima ferita sulla coda del topo. Se sono necessarie iniezioni ripetute, il mouse può essere iniettato con l'intero volume di soluzione salina (e la quantità di DNA) sia più vicino alla base della coda nella stessa vena o nella vena controlaterale. Seguendo HGD, il mouse deve essere osservata in una gabbia posta su un pad termico per almeno un'ora. HGD provoca un brusco aumento della pressione intravascolare con conseguente irregolarità acuta della funzione cardiaca, espansione fegato, e una rottura dei pori della membrana delle cellule del fegato, sinusoidi e Fenestrae 12, 14, 43. Nonostante il raddoppio del loro volume di sangue in pochi secondi, i topi tollerano HGD molto bene. La frequenza cardiaca ritorna normale in 2 min e la pressione intravascolare, che diminuisce rapidamente subito dopo l'iniezione, si avvicina a livelli basali in 3 min 12, 43. Gli epatociti perturbato richiudersi in meno di 2 minuti ed i rendimenti dimensioni del fegato espansealle dimensioni normali in 30 min seguita dal recupero della funzione sinusoide in circa 24 ore 43. Mentre molti ricercatori usano l'anestesia con successo, nelle nostre mani, l'anestesia isofluorane aggrava il distress respiratorio dei topi a causa di HGD. Troviamo che i topi anestetizzati richiedono più tempo per recuperare e, occasionalmente richiedere la rianimazione per la sopravvivenza. Se l'iniezione di un folto gruppo di topi utilizzando anestesia, può essere necessario avere una persona in più nella stanza dedicata per sorvegliare il benessere degli animali recupero. Senza anestesia, anche dopo ripetute iniezioni, la sopravvivenza del mouse è al 100% e il tempo di recupero è a meno di 5 minuti.
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per fornire una vasta gamma di molecole al fegato mouse. Utilizzando la proteina secreta APOL-I come esempio, abbiamo mostrato come HGD potrebbe essere utilizzato per stabilire un modello di topo e studiare la funzione di una proteina protettiva. Confrontando la funzione di vari prodotti genici, il success del HGD deve essere valutata quando possibile. Per le proteine secrete, è facile monitorare i livelli di espressione analizzando topo plasma usando western blot (Figure 2 e 4B.) È particolarmente importante garantire il successo di HGD quando saggiare varianti naturali o sintetiche di una proteina terapeutica, come efficienza di trasfezione può influenzare gravemente esito malattia (figure 2 e 3). Esempi sono forniti per mostrare come questo metodo può essere esteso per analizzare danni al fegato causati da Apoli, che è una proteina che formano pori (figure 4 e 5). Varianti di sequenza di APOL-I nello stesso plasmide risultato background in marcatamente differenti profili di danno. Questo suggerisce che il danno tissutale è associato con la funzione della proteina e non il vettore di espressione o il trauma della stessa iniezione. Va notato che, nelle nostre mani, AST sono universalmente alta al giorno 1 post-iniezione (dati non mostrati). Il giorno 2, tuttavia, i livelli di AST di topi inproiettata con il ritorno alla normalità fisiologica e le differenze tra le varianti geniche sono facilmente riconoscibili (Figura 4). Di giorno 3 post-iniezione, AST misurata in tutti i trattamenti di ritorno al livello basale (dati non mostrati). Dal momento che il tessuto necrotico e infiammazione nel fegato sono evidenti più di un aumento transitorio AST, danni al fegato a causa di espressione genica sostenuta può essere valutata in modo più affidabile, anche se qualitativamente, attraverso la colorazione dei fegati prelevati il giorno 5 dopo l'iniezione. Gli esempi riportati mostrano che le varianti di APOL-I che causano un aumento del rilascio di AST due giorni dopo l'iniezione risultato anche in danno epatico più sostenuta come valutato mediante colorazione con ematossilina eosina.
Gene delivery idrodinamico permette la rapida analisi di espressione genica in vivo. Richiede la semplice costruzione del gene in esame in un vettore di espressione eucariotico e la capacità di effettuare l'iniezione, come descritto sopra. Generazione di transgetopi nic con altre forme di trasferimento genico, come vettori lentivirali ricombinanti derivati da HIV-1 o ricombinanti vettori virali adeno-associati, richiedono molto più specializzato competenza. Tuttavia, il loro vantaggio è sostenuta espressione genica, sebbene l'espressione genica virale spesso provoca una risposta infiammatoria da all'host rilevamento di un'infezione virale e rispondendo 15-19. Inoltre, i vettori virali hanno una capacità limitata di imballaggio e, quindi, sono limitate nelle dimensioni gene, che BAC di 150kb sono stati utilizzati con successo in HGD 4. Dopo aver imparato questa tecnica, l'utente può trasfettare qualsiasi acido nucleico (cDNA o gDNA o RNA) in vivo e seguire la produzione di proteine e le conseguenze biologiche. La proteina può essere intracellulare, legato alla membrana o extracellulare; può essere etichettato o modificato al acido nucleico e livello dell'acido ammino così. Ancora più importante, questa è una tecnica molto rapida e semplice.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) per averci insegnato inizialmente la tecnica HGD e il dottor Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) per la sua continua guida in vari aspetti della tecnologia. Questo lavoro è stato finanziato da Hunter College, CUNY start up fondi e premio NSF Pane IOS-1249166. Ringraziamo il NYULMC Istopatologia Nucleo NYUCI Support Center Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 per l'esame istologico sui fegati di topo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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