Summary
流体力学的遺伝子送達による裸のDNAのin vivoトランスフェクションは、最小限の炎症反応と動物の組織に遺伝子を導入しています。遺伝子産物の十分な量は、遺伝子の機能および調節、ならびにタンパク質の構造および機能を分析することができるように生成される。
Abstract
インビボでの導入遺伝子の効率的な発現は、遺伝子機能を研究および疾患のための治療法を開発する上で極めて重要である。過去数年にわたり、流体力学的遺伝子送達（HGD）はげっ歯類に導入遺伝子を提供するための、簡単、迅速、安全かつ効果的な方法として浮上している。この技術は、灌流臓器の細胞膜の透過性を増加させ、従って、細胞内にDNAを送達するために生理的溶液の大量の急速注入が発生する力に依拠している。 HGDの主な利点の一つは、裸のプラスミドDNA（pDNAの）を用いて哺乳動物細胞に導入遺伝子を導入する能力である。プラスミドを用いて外来遺伝子を導入することは最小限に、高効率、面倒で、ウイルスのキャリアに反して、格段に安全である。 HGDが最初にマウスに遺伝子を送達するために使用された、現在では、マウスへのオリゴヌクレオチド、人工染色体、RNA、タンパク質および小分子を含む広範囲の物質を送達するために使用され、ラットそして、限られた程度に、他の動物。このプロトコルは、マウスではHGDについて説明し、成功した手順を実行するに不可欠な方法の3つの重要な側面に焦点を当てています。正しい静脈への針の挿入、注入量および配信の速度。例は、分泌、霊長類特異的タンパク質をコードする2つの遺伝子の一過性発現にこの方法を適用することを示すために与えられて、アポリポタンパク質のLI（APOL-I）およびハプトグロビン関連タンパク質（HPR）。
Introduction
によるその最初の記述以来、Liu らとZhang ら 、流体力学的遺伝子送達（HGD）は、齧歯類モデル系1、2における遺伝子機能を研究するための貴重なツールとなっています。技術は、標的器官1,2,3の細胞によるプラスミドDNAの取り込みを容易にするために、マウスの尾静脈に大量の溶液（8〜12％の体重）の急速注入（5-7秒）を含む。これらの条件は、肝臓におけるロバストな遺伝子発現および腎臓、脾臓、肺および心臓におけるより少ない遺伝子発現をもたらす。
10のpCMV-LacZのプラスミドの注射はHGD日1に、最も効率的、非ウイルス、in vivoでの遺伝子送達方法作り、肝細胞の40％をトランスフェクトすることができます。ウイルス担体とは異なり、pDNAの準備が容易であり、齧歯類宿主3において免疫応答を誘発しないと終了と再結合することにより健康リスクをもたらすものではないogenousウイルス。 HGDにより送達DNA分子は、パッケージングを必要としないので、また、この方法は、150キロバイト4と大きい細菌人工染色体（BAC）の送達に適している。流体力学的方法によって送達されている他のタイプの分子は、RNA 384-768、モルホリノ11、タンパク質12、13および他の小分子12、14を含む。その他の配送方法を超えるHGDの長所と短所は、文献15から20に優れたレビューで議論されてきたと著者数が21〜23の手順の詳細な説明を提供してきました。
HGDでマウスに導入遺伝子を導入することは、安全で1-3、24有効であり、この方法は、同等の成功を25としたラットで使用されています。ある種の改変で、概念実証実験は、ニワトリ26にRABが行われているビット27と豚28は 、あるが、より大きな動物ではこの技術のin vivoでの適用は課題である。この方法を使用する場合、別の一般的な制限は、利用可能な哺乳動物発現ベクターの多くは、遺伝子発現の持続性の、高レベルを達成するための構成要素を欠いていることである。のpCMV-Lucのプラスミドを用いて、標的臓器における遺伝子発現がHGD後10分早ければ明らかであるが、当初、高発現レベルは、注射の1の後の最初の週に急激に低下する。長期の導入遺伝子発現は、しかしながら、高レベルの遺伝子発現の維持は、多くの場合、反復注射を必要とするプラスミドのデザイン3,24で用いられるプロモーターおよびイントロンに応じて可能である。このため、HGDは、タンパク質またはタンパク質産物を損傷への長期暴露の結果である慢性疾患を研究するのにはあまり適しかもしれない。これらの制限で、HGDはPOを研究するための例外的に強力なツールです。インビボでの遺伝子およびその変異体の効果、並びに治療効果およびタンパク質および疾患の動物モデルを確立するための調節の役割tential（総説については、15を参照）。例えば、HGD、個別にそれぞれの遺伝子をノックアウトしたマウスに種々の遺伝子構築物を導入することにより、ドメインおよびタンパク質のアミノ酸に機能を割り当てるために使用されてもよい。さらに、この技術は、任意のマウス株において使用され得る。
配達の静脈、注入量と速度に正しい針の挿入：このプロトコルは、成功したトランスフェクションを達成するために必要な技術的な側面に焦点を当てたマウスではHGDについて説明します。この方法の適用は、アフリカトリパノソーマ症のマウスモデル、ヒトおよび家畜29の致命的な病気、30に示されている。トリパノソーマのいくつかの種は、家畜の病気の原因となるが、ほとんどは、Bで免疫複合体を生得によるヒトに疾患を引き起こすことはできません100dは呼ばトリパノソーマ溶解性因子（TLFS）29、31、32。 。HPR、トリパノソーマにTLFSの取り込みを促進するリガンド、およびAPOL-I、溶解成分の31、33-38 トリパノソーマ ：これらの孔形成、高密度リポタンパク質（HDL）が2ユニークな、霊長類特異的なタンパク質が含まれているローデシアはに結合し、人間APOL-I 34、39を中和する血清耐性関連タンパク質（SRA）の発現のためにヒトに感染することができます。ヒヒTLFは、その発散APOL-Iタンパク質40に、SRAによって中和されていません。哺乳動物発現ベクター（pRG977）を使用して、以前に報告されたように、マウスにおけるヒヒTLF成分のトランスジェニック発現は、ヒト感染性トリパノソーマ40に対する防御を付与する。ここに提示代表的なデータは、遺伝子送達は、タンパク質の治療効果を研究するために適用することができる流体力学的方法を示している。
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Protocol
ここで説明する全ての実験は、ハンターカレッジの施設内動物管理使用委員会、ニューヨーク市立大学によって承認された。
エンドトキシンフリーのプラスミドDNAの1。準備
- 新しく作製した選択プレートから哺乳動物発現ベクター中の目的の遺伝子を含む細菌のシングルコロニーを選択します。
- バクテリアの成長や収穫のための市販のエンドトキシンフリープラスミド精製キットのハンドブック推奨事項に従ってください。
- 市販のエンドトキシンフリープラスミド精製キットのプロトコールに従って細菌細胞からエンドトキシンフリーのプラスミドDNAを精製する。
- エンドトキシンフリーのプラスチック製品を使用し、その毒素を除去工程後のDNAサンプルに再導入されていないように注意して、DNAを扱う。
- MICRを用いて260nmの吸光度を測定することによりエンドトキシンフリーのプラスミドDNAの濃度を測定O容量の紫外線の下に説明するように、分光光度計または標準キュベットベースの分光光度計。
- 次のようにマイクロ分光光度計のサンプル保持システムの下限と上限の光学面をクリーニングします。低い光学系へのきれいな脱イオン水をピペット1μL。レバーアームを閉じて、上部の光学系を入浴するためにそれを数回タップしてから、オープンレバーやティッシュで拭いてください。
- マイクロ分光光度計のソフトウェアを開き、核酸モジュールを選択します。
- レバーアームを下げ、プログラムソフトから「初期化」を選択し、下側の光学システムに1μlのきれいな脱イオン水を置きます。初期化が完了すると、組織との両方の光学面をクリーニング..
- そして、プログラムソフトウェアから「ブランク」を選択することと、エンドトキシンフリーTEバッファー（1mMのEDTA、10mMのトリス-Cl、pH8.0）を1μLをロードすることによってブランク測定を行います。とブランク測定が完了すると、きれいな両方の光学面組織。
- エンドトキシンフリーのDNA試料を1μLをロードし、プログラムソフトウェアから「測定」を選択して、サンプル測定を実行します。 DNA濃度を記録します。画面に表示される吸光度比280分の260 nmで記録することにより、DNAの純度を評価。 HGDのための純粋なDNA（1.8の吸光度比260/280）を使用することが非常に望ましいことから、1.7以下の吸光度比260/280とのDNAサンプルを使用しないでください。測定が完了すると、組織との両方の光学面をクリーニングします。
2。マウスの計量
- 株について適切な方法でマークしたマウス。注：尾のマーキングは、この手順にはお勧めできません。
- 黒のマーカーで仰向けに白い毛皮（ 例えばスイスウェブスター）がマークにマウス種。必要に応じて時間をかけてマークを再適用します。
- 耳で黒の毛皮（ 例えば 、C57BL / 6）を持つマークにマウス種は、事前に数日間パンチ。
- マウスindividuaを量るLLY優しく動物計量皿やバケツに入れて、デジタル研究所スケール上に配置した。実験の日に、実験に用いた各マウスの体重を記録します。
注射器の3。準備
- 注射ミックスの調製
- 各マウスの注入のための50μgのエンドトキシンフリープラスミドDNA - 5を想定して必要とされるDNAの量を計算します。
- 実験的にプラスミドDNAの最適量を決定します。
- 必要なDNAの量を決定する際には、注射器の適切なローディングは、いくつかの余分な注入ミックスが必要になりますように、グループごとに1つの追加のマウスの注入を想定しています。計算を支援するために、次の例を考えてみましょう。マウスあたり50μgのプラスミドDNAを用いて、4つの実験および4対照マウス、各重量25グラムを注入する。各グループのために必要な5×50μgの= 250μgのDNAをこの場合に必要とされるDNAの量を決定するために、グループあたり5匹で計算します。
- 各マウスの注射のために体重の10％を仮定して必要とされる生理食塩水の量（0.9％塩化ナトリウム）を決定する。
- 上記の例によれば、2.5ミリリットルの生理食塩水（2.5グラム液）中のプラスミドDNA50μgの各25gのマウスを注入する。
- マウスのグループ全体のために必要な生理食塩水の量を決定する際には、注射器の適切なローディングを可能にするために、グループごとの追加マウスの注入を想定しています。指定された実験を考慮すると、各グループの5匹のマウスに必要な生理食塩水の量を計算する：5×2.5ミリリットル=各グループの12.5ミリリットルの生理食塩水（または25ミリリットルの合計）。注：同じグループ内のマウスは、同じ量（体重の10％以上の差）でない場合、注入は別々に混合し調製する。
- 10ミリリットル、複数回使用バイアル中に、ヒトへの使用が承認されている防腐剤やエンドトキシンフリー、滅菌生理食塩水を使用してください。
- 20ミリリットルの注射器のルアーロック先端に取り付け20ゲージの針（X 25ミリメートル0.9ミリメートル）を使用して、生理食塩水のバイアルから液体を引き出すと50mlのコニカルチューブに注射器を空にする。 DNA-生理食塩水注入ミックスの製造中に生理食塩水の正確なピペット操作を支援するために、実験ではすべてのマウスの注射のために必要以上の生理食塩水を集める。上記の実験では、実験に必要な生理食塩水の計算された量だけ25ミリリットルであっても、3、10ミリリットルバイアル（約30ミリリットルの合計）から生理食塩水を撤回。
- 別の50ミリリットルコニカルチューブにDNAの計算された量をピペット。エンドトキシンの導入を回避するために、ピペット本体とチューブの側面に触れないように注意してください。実施例によれば、別個のコニカルチューブに実験的なプラスミドDNAの250μgの制御および250μgのにピペッティング。
- 血清学的ピペットを使用してDNAへの生理食塩水の必要量を加える。マスターミックス（実験及びコントロール）のそれぞれにサンプル実験、ピペット12.5ミリリットルの生理食塩水を考える。
- すべてのソリューションに到達することができます注射前に室温。
- 各マウスの注入のための50μgのエンドトキシンフリープラスミドDNA - 5を想定して必要とされるDNAの量を計算します。
- 注射器の作製
- 各マウスには、滅菌された20ゲージの針（0.9ミリメートル×25 mm）を用いたDNA-生理食塩水の混合、滅菌、3ミリリットル、ルアーロック注射器を埋める。気泡がないように注意してください。注入の流量がより高い体積のシリンジの使用を避け、非常によく制御することができず、それは片手で大きな注射器を操作することは困難である。これは、再使用できるように戻って円錐管に余分なDNA-生理食塩水のミックスを取り出します。
- 無菌の27ゲージの針に針を切り替えます。気泡を導入することなく、完全に液体と針を埋める。マウスの重量を基準にして計算されるように、DNA-生理食塩水ミックスの音量を調整します。
- キャップを外し、針が任意の非無菌面には触れないようにしてください。もう一方の手でキャップの上に保持せずに針を挿入し、蓋をし、針を押し、平らな面にキャップを配置します。必要に応じて、針が片手で技術を使用して再封止されていてもよい針にキャップを固定するためのしっかりしたオブジェクトに対して。注射器は現在、尾静脈注射の準備ができている。
4。流体力学的DNA送達
- 麻酔マウスは生存能力を低下させる可能性があることに注意してください。これも生存性を低下するため、寒すぎる部屋でHGDを実行しないようにします。部屋は20℃の周囲温度がまたは麻酔を使用している場合は、任意の動物の損失を避けるために、37℃のポスト手順で設定した加熱パッドの上にマウスを置くと。麻酔を使用する場合は、マウスの口や鼻、熱パッドの上に障害物がない間であり、それが完全に回復するまで、マウスを観察していることを確認します。前HGD匹のマウスから食べ物や水を保留しないでください。
- 血管を拡張するために、マウスを温める。
- （寝具は含まれていて）、寝具の温度が約38〜39℃になるように、5分間のヒートパッド上でマウスのケージを置きます温度は、ANのための加熱パッド上でマウスを維持するのに十分低くなければならない期間を延長した。
- 代わりに、最小限の拘束で背アクセス制止にマウスを置きます。優しく暖かい水で湿らせたガーゼとそれを保持することによって、1分間のマウスの尾を温める。必要であれば、マウスは再配置することができます。乾燥させるための組織と尾を拭きます。
- 代わりに、これ以上の2以上分間加熱ランプの下にケージを配置することによって暖かいマウス。加熱ランプを使用している場合は、マウスの過熱を避けるために、十分に注意してください。
- 大容量尾静脈注射
- 実験室でのテープで平らな面に背アクセス制止を固定。
- 尾を持ち、静かに制止にマウスを置き、プラグを挿入します。固定化された尾を保つために、必要に応じて、わずか拘束を使用してください。マウスが自由に呼吸していることを確認してください。
- マウスが手術中の任意の時点で厳しい苦痛にある場合は、すぐに制止からマウスを取り外して、休息することができます。
- マウスを置きそう側方尾静脈のいずれかが表示される。尾の両側の青い線が横尾静脈であるが、尾の途中で実行されている赤い線は、動脈である：マウスの背中にまっすぐ下に見ることで横方向の尾静脈の位置を確認します。
- アルコール綿で十分にマウスの尾を拭いてください。
- 尾は中間および第三の指の上に小指の下に、人差し指の下を通過するように、非噴射の手を使用して、人差し指と中指の間でしっかりと尾を持つ。親指が自由に動くことがままにできるようにします。 （ 図1A）
- もう一方の手を使用して、アルコール綿で再び注入されるエリアを拭いてください。エリアを乾燥させる。
- 注入手にロードされた注射器を手に取り、親指と他の4桁の数字の間のバレルを持ってください。プランジャー上に持たないでください。
- 針はマウスの本体側に向けて尾に注射器を平行に配置し、上を向いて、針のベベル（斜めエッジ）。
- 尾静脈に針を挿入します。抵抗なく摺動針から明らかな静脈が正しく配置されている場合にのみ、注射、に進みます。針の挿入の深さはしかし、完全に挿入が原因で静脈のせん断のリスクの増加にはお勧めしません個人的な好みの問題であることに注意してください。 針を動かさないようにします。
- テール持った手の親指を使って、位置に針を保持するために、テールに対して針を押しハブのハブに閉鎖。極端な圧力を加えないでください、これらは静脈内への液体の流れを妨げるように、針の軸上に保持していません。インジェクション（ 図1A）を妨げないように、この時点で緩く人差し指で尻尾を持ちます。
- 再位置シリンジ保持手の人差し指と中指は、フランジ上に保持され、親指がプランジャの端になるように（FigurE 1A）。
- 1、連続動作にプランジャーを押し下げと6-8秒内の液体のフルボリュームを注入する。
- 静脈から針を外し、ティッシュで最後尾に穏やかな圧力を適用することにより、出血を止める。
- 加熱パッドの上に置かれ、回復ケージに拘束し、場所をマウスからマウスを取り外します（寝具37〜38℃にする必要があります）。注入部屋が冷えている場合は、このステップは、マウスの生存のために重要である。出血が完全に停止するまで、マウスの尾を握る。
- 流体力学的なDNA送達後1時間、マウスを観察します。喘ぐと不動の初期期間は、HGDによる一時的な不整脈に正常であるが、マウスは約5分で回復の兆しを示していることを確認してください。マウスの呼吸が非常に浅くなった場合は、ゆっくりと呼吸を容易にするために、マウスの腹部をマッサージ。回収率はわずかに使用したマウス株によって影響され得ることに留意されたい。
- リターンマウス住宅ケージ、マウスが食料や水の豊富な供給があることを確認してください。
- 代替的な手の位置を使用して、大容量尾静脈注射
- 制止にマウスを置き、次の手順により、注射の準備を前述したように、4.3.5経由4.3.1。
- 90度の角度で曲げ4本の指で平らな面に非噴射の手を休める。指（親指を除く全て）は、プラットフォームを作成する、互いの上に載るべきである。親指と人差し指（ 図1B）との間にマウスの尾を保持します。
- もう一方の手を使用して、アルコール綿で再び注入されるエリアを拭いてください。エリアを乾燥させる。
- 注入 - 手で注射器をつかみ、フランジと、注射の準備ができて、プランジャー、年末を持ってください。
- 前述したように、ステップ4.3.17を経てステップ4.3.9から、このプロトコルに従って、手順を完了します。
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Representative Results
マウスの尾静脈への針の正確な位置決めは、（ 図1に示されるように）正常に流体力学ベースのトランスフェクションによって導入遺伝子を送達するための前提条件である。注射の全体積は6-8秒の期間内に送達することができるように、しばしば、技術の最も困難な部分は、しかし、移動せずに尾静脈内の針の保持である。射出プロセス中に小さなエラーが大幅に減少し、トランスフェクション効率およびタンパク質発現をもたらし得る。したがって、各実験のHGDの成功を監視することが不可欠である。目的のトランスジェニックタンパク質による感受性の抗体がないためにウェスタンブロットによって検出することが困難である場合には、ヒヒAPOL-Iの場合と同様に、注入効率はタンパク質の遺伝子を担持するプラスミドの同時注入することによりモニターすることができること容易に検出可能である。 図2に示す実験において、マウスを、50を注射した3差別的6XHISの1を保有するプラスミドμgのはヒヒAPOL-I遺伝子およびヒヒHPR（bHPR、タグなし）を運んでいた別のプラスミド（同じ発現ベクターの設計）の50μgのタグ付き。この実験の主要な目的は、選択された配列位置における6XHISタグの添加が正しい処理及びヒヒAPOL-Iタンパク質の分泌を妨害するかどうかを評価することであった。しかし、もし、タグの付加は、正確なフォールディングを破壊し、その結果、タンパク質の分泌は、タンパク質発現の消失が原因で損なわ処理または失敗HGDから発生したかどうかを判断することが困難になる。 （ヒトトリパノソーマ感染性チャレンジに対するマウスの防御によって決定される）さらに、十分な感度による抗体の欠如のために、トランスフェクトされたマウス血漿中のヒヒAPOL-Iの直接検出にも成功した遺伝子送達の場合に困難である。この実験では、これらの問題が対処されたAPOL-I HGD混合物にヒヒHPRプラスミドの等量を添加することによって代用噴射制御として機能する。同図に示されるように、ヒヒHPRは非常にトランスフェクトされたほとんど全てのマウスのHGDが成功したことを示すの血漿中で発現させた。発現レベルのわずかな降下が、 図2AにおいてbAPOL-I 6XHISグループ1 の 2匹のマウスのいずれかに見られるように、一般に注入速度が非常に小さな減少（1-2秒）に起因している。 図2Bに、（bAPOL-I 6XHISグループ 3）で第1のプラズマのサンプルレーン1に失敗しましたHGDを示すタンパク質発現の完全な欠如を示している。ほとんどの場合、これは送達媒体の全体積の不完全な注射によるものである。この実験は、全ての場合においてHGDの成功が、一、bAPOL-I分泌に対する6XHISタギングの効果は、現在、抗6XHISイムノブロット（ 図2C及びD）によって評価することができることを確認するからである。見られるように図2Dに、その血漿中に6xHisタグタンパク質の検出可能なレベルを持っていたマウスの唯一のグループには、グループ3であった。このグループ内のタンパク質発現パターンは、この群のマウスの1の注入が成功しなかったことを確認した。グループ1及び2において検出可能なの6xHisタンパク質の完全な欠如（ 図2C）は、HGDの成功を監視するために注入混合物中のトレーサータンパク質を含むことの重要性を強調する。 bHPR（ 図2AおよびB）の血漿レベルを考慮することなく、 図2CおよびDからのデータを容易にグループ1および2のHGDの故障と誤解することができる。
ヒヒTLF1コンポーネントbAPOL-IとbHPRの成功HGDは、人間が感染トリパノソーマトリパノソーマ -SRA寄生虫（TBB-SRA、T. Bの実験室と同等。ローデシア ）40匹のマウスの耐性を提供します。この抵抗はbAPOL-Iのトランスジェニック発現に起因している</ em>が、一人でbHPRの注入は、人間が感染寄生虫に対する保護を提供しないように。 5000 TBB-SRAは2日間遺伝子送達後に寄生虫の6xHisタグ変種bAPOLが、私はまだのような溶解性タンパク質を機能することができるかどうかを評価するために、HGDでbAPOL-IとbHPRの両方を受けたマウスは、チャレンジした。 図3に示すようにグループ1と3で最もマウスがいる限り、タグなしbAPOL-I陽性対照として生き残ったのに対し、6XHISグループ2のマウスは、非常に初期の感染に屈し。 （ヒヒAPOLさん。このマウス系統で部分的な保護を与える。）、グループ2内の導入遺伝子の発現は、普遍的に高いため、これらのマウスでの保護の欠如を正確に起因するもので6XHISタグにbAPOL-I溶解機能の喪失と解釈することができる位置。ケアは図を参照してください（このマウスが正常に導入遺伝子を注入されていなかったとして、グループ3内でマウスの早期（7日目）死は、誤って解釈されないことが、注意する必要がありますUREの2B、レーン1）。 図2および図3から合成データに照らして、我々は（6×グループ2内の）位置2でのこのタンパク質のタグ付けながらbAPOL-Iは、その溶解性を破壊する、悪影響を及ぼすことなく（6xHisタググループ3）3位にタグ付けすることができると結論機能。 6×1基では、データは保護を示唆している間のマウスの数が有意なデータを得るには不十分であった。電力分析は、各実験について必要とさマウスの数を決定するために実行されるべきである。グループ1からのマウス血漿中の検出可能なタンパク質の見かけの欠如は、 図3に示す保護パターンに反するかもしれませんが、このグループの負の抗6×ウェスタンブロットではなく、原因タンパク質プロセシングに検出の欠如の結果である可能性があることに注意遺伝子発現の欠如よりも。グループ1では、6×タグが予測されるシグナルペプチドの切断部位の後に近くに追加されました。 APOL-Iはアミノ酸配列をヒヒには、追加predicteが含まれていますdはタンパク質分解切断部位、シグナルペプチド40の切断部位から約20個のアミノ酸。したがって、これらのマウスにおけるbAPOL-I分泌および機能まだその検出に必要なの6xHisタグを失っていることが明らかである。こうして彼のタグの配置の重要性を説明する。
APOL-私は寄生虫のリソソーム膜36、37に孔形成によるアフリカトリパノソーマを殺す。腎臓障害のメカニズムは未だ不明で41、42である、が、近年のアフリカの祖先を持つ人々に見られる人間APOL-Iの天然の変異体は、強く、アフリカ系アメリカ人に腎臓病と関連している。 HGDは肝臓で最も高い遺伝子発現をもたらすので、私たちは人間APOL-Iまたはその合成配列変異体は、この器官に損傷を引き起こすかどうかを調査したいと考えました。この目的のために、マウスを、指定された50のヒトAPOL WT-Iμgの又は単一のアミノ酸の合成変異体を注射したS K4.Toは肝障害を評価し、我々は2日目、注入後に収集されたマウス血漿中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）レベルを測定した。その溶解機能と一致して、WTヒトAPOL-Iは生理食塩水を注射したマウスと比較して、血清ASTレベルの上昇（ 図4A）を引き起こす。対照的に、1つのアミノ酸だけが異なる変異体K4の注入は、非常に少ないAST放出を引き起こした。 K4タンパク質レベルが同等またはWTヒトAPOL-I（ 図4B）のそれよりも高いように、肝臓損傷の違いは、タンパク質発現のレベルに起因する可能性は低い。 HGDマウスの肝臓の検査は5日間、注射後は、人間のWT APOL-Iは正常肝組織像を示して生理食塩水を注射したマウスと比較して緩やかなマクロファージの浸潤（ 図5B）に限定された組織の壊死を引き起こすことを示して収集された（ 図5A、紫の領域 ） 。血漿中ASTレベルを測定することによって得られたデータを確認し、K4は、同じバックグラウンド·プラスミドに注入WTとしてのラウンドは、正常な肝組織像（ 図5C）を示している。
HGDのための手の位置の図1。イラスト。 A.）最大射出速度を達成し、注射後の針の動きを回避するために位置1。推奨手の位置は、開始された。矢印は、静脈に針を挿入した後、親指の推奨動きを示している。親指を静かにマウスの尾に対してハブを保持することによって、針を固定する必要があります。注射器を持つ手は、注射前にプランジャーを押し下げすることができるように再配置される必要があります。尾静脈注射による反復注射に尾の付け根に近い実行されなければならない場合には、B）の位置2。この位置はお勧めします。針が静脈に挿入されると、この手の位置は毛皮を必要としないTHER調整。
図2 5週齢、メス、スイス·ウェブスター（SW）2の別々のプラスミドの組み合わせを注射したマウスから採取した血漿のウェスタンブロット分析：50μgのヒヒHPRや差別的6XHIS50μgのヒヒAPOL-I遺伝子をタグ付けされた。マウスを、陰性対照として生理食塩水ビヒクルを注射した。ヒヒAPOL-Iの検出が困難であるHGDの成功を確認するために、この実験は、ヒヒHPRタンパク質の循環血漿レベルを示す。マウス血漿試料を2日後にHGDおよびタンパク質発現レベルは、変性、非還元条件下で10％トリス - グリシンポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット（プラズマ1:20に希釈）により分析した収集した。 HPRはまたRECOヒトハプトグロビン（HP）に対するウサギポリクローナル抗体を用いて検出したヒヒHPRはgnizes。タグ付きbAPOL-Iは、6×タグに対するウサギポリクローナル抗体を用いて検出した。含まれる制御6XHISタンパク質の分子量は40と50 kDaのです。 A.）パネルは、分泌タンパク質、グループ内のすべてのマウスが正常に注射した（HPR）のウェスタンブロット分析の例を示している。注射は非常に成功した第二HISタググループ（bAPOL-I 6XHISグループ2）、均一に高タンパク質の発現に注意してください。最初のグループ（bAPOL-I 6XHISグループ1）において、マウスの一方からのタンパク質発現は、注入速度を低減する可能性が高い、目立つ幾分減少する。 bAPOL-I 6XHISグループ3の注射の一つ（）が失敗したときB.）パネルは、タンパク質発現レベルの一例を示す。 ℃）パネルは、目的のタンパク質（bAPOL-I）の検出が不確実であるときHGDの成功を監視するためにトレーサータンパク質（bHPR）を含むことの重要性を示しています。 bAPOL-IにおけるHGDの確認された成功にもかかわらず
図3。ヒヒAPOL-I 6XHIS変異体およびヒヒHPRを発現するマウスの生存。五週齢、メス、スイスウェブスターマウスは、同じ注射ミックスにHGDで2別々のプラスミドのそれぞれの50μgのを受けた。この実験で使用したマウスは、図2で分析血漿に相当する。後2日目の注射では、マウス5000ヒト感染TBB-SRA寄生虫および寄生虫血を感染させたモニターした。寄生虫血症は、10 9寄生虫/ mlに達した時点で、マウスを安楽死させた。対数、P <0.05 - *（ここで示された生存は、生理食塩水対照とは有意に異なっていたランク検定）。寄生虫のチャレンジの際に、マウスの生存率はHGDの成功はその後の実験から得られたデータをどのように影響するかの一例です。ヒヒAPOL-Iが正常に注入されると、遺伝子産物は、それが取り込まれ、ヒト感染トリパノソーマを死滅さマウスの血液中に分泌される。生存曲線は、マウスがAPOL-Iが大幅TBB-SRAから保護されたヒヒの6XHISタグバージョン3を注入していることを示しています。このグループの唯一の早死に成功し、導入遺伝子を有するプラスミド（図2参照）を注射しなかったマウスに対応しています。寄生虫のチャレンジの際にその生存を受信し、導入遺伝子の違いにあるが遺伝子送達の失敗に起因しないように、このマウスは、生存分析から除外されるべきである。
図5の組織病 理学のさまざまなレベルにおけるAPOL-I配列結果の単一アミノ酸置換。図は、生理食塩水ビヒクル（A）の流体力学的注射、50μgのヒトWT APOL-I（B）、又はAPOL-I、K4（C）の合成突然変異体の50μgのSWを受信したマウスの肝臓を示している。肝臓は、注入5日後に取り出し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために処理した。代表的な例は、図4におけるASTレベルについてアッセイした同じマウスで示されている。パネル（DF）は、WTマウスにおける損傷領域のさらなる例を示す。パネル内の壊死巣（B）、（DF）黒い長方形でマークし、拡大している。これらのパネルの白い矢印は、マクロファージ浸潤のエリアを指す。比較のために、生理食塩水ビヒクルを注射したマウスの肝臓の代表エリアから正常組織は明るい青色の四角形でマークされているにも拡大される。パネル（E）及び（F）は、2つの異なるWTマウスからであり、一方のパネル（B）および（D）は、同一のWTマウスからの代表的な画像である。
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Discussion
正しく実行すると、HGD、導入遺伝子の送達が著しく安全で有効な手段である。成功HGDへの重要なステップは、以下のとおりです。1）未満8秒でマウス3）の尾静脈に）生理食塩水車両2の大容量で、DNAの適切な量を提供する。
注射自体のプロセスは紛れもなく、いくつかの手先の器用さが必要ですが、この6秒の手続きの成功は、多くの場合、実験の入念な準備にある。最大の遺伝子発現を達成するのに必要なpDNAの量は、使用されるプラスミド、したがって、注入されるDNAの最適量は、アプリケーションごとに実験的に決定されるべきで発現される遺伝子に依存して大きく変化し得る。マウスの場合は、一般的に推奨されるのDNA範囲は、遺伝子発現がプラトーに達することがあり、それを超える5〜50μgのです。私たちの手で、APOL-IまたはHPR遺伝子のいずれかを運ぶ50μgのpRG977の注入はcirculatin高レベルのにつながる最初の2日間gタンパク質レベルは、HGDを書き込む。タンパク質レベルは10日目（38および未発表データ）を中心に検出可能なレベルを下回るまで、両タンパク質の血中濃度は、数日の次のカップルで大幅に減少する。 DNAの最適量はマウス1、2の体重の8〜12％に生理溶液と同等で送達されるべきである。ボランティアを含むほとんどの研究者は、注射用ビヒクルとして生理食塩水を使用しながら、リンゲル液は、同等の成功2 HGDために使用されている。それは無菌環境でHGDを行う必要はないが、それは処置を通して注射液のエンドトキシン汚染を避けるために不可欠であることに留意されたい。この目的のために、注射のために使用される生理食塩水は、優れた純度のものであるべきであり、注入されるDNAは、エンドトキシンを除去し、市販のキットを用いて調製されるべきである。もう一つの重要な準備段階では、マウスの体重は注意です。から注入量が成功HGDの重要な側面の一つであり、それはマウスが投与されたアンダーもオーバー投与し、生理食塩水でもないことを確認することが重要である。動物の可能性のある死を、後者次善のトランスフェクションにおいて、元のエラーの結果、。さらに、動物の安全性を確保するために、我々は取り除くことが困難である小さな気泡を導入することを避けるために、小さなゲージの針と注射器をロードをお勧めします。プロトコールに記載のようにゲージ針 - HGD 27で行われるべきである。
尾静脈がはっきりと表示されている場合は、正しい注入が大幅に促進される。テール照明器との制止が使用できない場合は、マウスの穏やかな加熱により、血管を拡張することは静脈の可視化を助けることができる。数分間ヒートパッド上でマウスケージを配置したり、私たちの手でよく暖かく、濡れた布作業尾を保持する。熱ランプを使用した場合、1マウスを過熱しないよう十分注意する必要があります。私達は私達がわかり熱ランプをINGは、マウス不必要なストレスや不快感の原因となるため、避けるべきである。さらに70％エタノールで尾部を拭くと、尾静脈と皮膚の間のコントラストを増加させることによって可視化を助ける。このステップは、注入中の細菌汚染を避けるためにも重要である。マウスは注射用に調製された後、尾静脈は、このプロトコルに記載された手の位置のどれかを使用して注入してもよい。ポジション2は、より簡単で直接的な見えるが、それは注射器を移動させずに液体の完全な容積を注入するのがより困難であり得ることに留意されたい。対照的に、第一の方法を用いて、良好な針位置を確立する針ハブがしっかりと尾に対して保持されると、注射はほとんど失敗しない、しかしながら、より面倒である。トランスフェクションの成功は、手の位置のいずれかを使用して可能であるが第1の方法はまた、最大速度を推奨します。
マウスでのHGD注入の推奨速度はあるが、6〜8秒である多くの著者が速く注射はさらに良い結果が1、12が得られることを示唆している。著しく減少した遺伝子発現の遅い注入をもたらす。しかし、遺伝子発現の完全な欠如のための最も一般的な理由は、注入のフルボリュームを提供する障害です。針が移動したときに注入を開始した後にこれが起こる。正しい位置に、針が抵抗なく静脈に入る。針が正しく静脈に挿入されていることを確認するためには、完全な注入前に静脈内に、非常に少量（100μL）に液体を注入することができる。プランジャーを下に押すと、極端な抵抗を満たしている場合は、針が誤った位置にあり、液体が尾組織に入っている。針が静脈半ば注入を離れた場合、マウスを数時間休ませた後に、失敗したHGDの修正を試みることができる。不十分な残りは、マウスに苦痛を引き起こし、流体力学的圧力の損失をもたらすことができる再注入後Eマウスの尾の最初の傷を開放すること。反復注射が必要な場合、マウスは、同じ静脈内または静脈内の反対側の尾の基部に近いいずれかの完全な生理食塩水の体積（及びDNAの量）を注射してもよい。 HGD後、マウスを少なくとも1時間の加熱パッド上に置いケージに観察されるべきである。 HGDは、心臓機能、肝拡大、肝細胞、正弦波とfenestraの複数形12、14、43の膜細孔の崩壊の急性ムラを生じる血管内圧の急激な増加を引き起こす。数秒での血液量の倍増にもかかわらず、マウスは、非常によくHGDに耐える。 2分で正常に心拍数が戻るとすぐに注射した後に急速に低下、血管内の圧力は、3分12、43に基礎レベルに近づく。破壊された肝細胞は、2分未満、拡張肝臓サイズのリターンに再シール約24時間43における正弦波機能の回復が続く30分で通常のサイズに。多くの研究者が正常に麻酔を使用していますが、私たちの手の中に、イソフルラン麻酔はHGDによるマウスの呼吸困難を悪化させる。私たちは、麻酔したマウスは回復し、時折生存のための蘇生を必要とするように時間がかかることがわかります。麻酔を用いて、マウスの大規模なグループを注入する場合には、回復した動物のウェルの健康を監視するために専用の部屋に追加の人物を有することが必要であり得る。麻酔なしでも反復注射後、マウスの生存率は100％であり、回復時間が5分未満である。
ここで説明するプロトコルは、マウス肝臓に広範囲の分子を送達するために使用されてもよい。一例として、分泌タンパク質APOL-Iを使用して、我々はHGDマウスモデルを確立し、保護タンパク質の機能を研究するために使用することができるかを示した。種々の遺伝子産物の機能、succeを比較する場合HGDのSSは、可能な限り評価すべきである。分泌されたタンパク質のために、ウェスタンブロットを用いてマウス血漿を分析することによって発現レベルをモニターすることは容易である（ 図2及び図4B）。これは、治療用タンパク質の天然または合成変異体をアッセイする際に、トランスフェクション効率と、HGDの成功を確実にするために特に重要であることができ深刻な疾患の転帰に影響する（ 図2および3）。実施例は、この方法は孔形成タンパク質（ 図4および図5）であるAPOLIによって引き起こされる肝障害を分析するために拡張することができる方法を示すために与えられる。シーケンスは著しく異なる損傷プロファイルの同じプラスミドの背景結果でAPOL-Iの変異体である。これは、組織の損傷がタンパク質機能ではなく、発現ベクターまたは注射自体の外傷に関連することを示唆している。これは、我々の手では、ASTレベルは1日後に注射した（データは図示せず）上に普遍的に高いことに留意すべきである。マウスの2日目に、しかし、ASTレベル（ 図4）、通常の生理食塩水リターンでjectedや遺伝子変異の違いは容易に識別可能である。 3日後に注射することにより、すべての処理で測定されたASTは、その基礎レベル（データは示していない）に戻ります。肝臓における壊死組織および炎症が長くASTの一過性の増加よりも顕著であるので、持続的なによる遺伝子発現の肝臓損傷は、注入5日後に採取した肝臓の染色により、定性的ではあるが、より確実に評価することができる。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色することによって評価されるように、ASTの放出増加を引き起こすAPOL-Iの変異体のショーを与えられた例が2日後に、注射も、より持続的な肝臓障害を引き起こす。
流体力学的遺伝子送達は、 インビボでの遺伝子発現の迅速な分析を可能にする。それは、真核生物発現ベクターに、研究中の遺伝子の簡単な構成及び上記で概説したように注入を実行する能力を必要とする。 transgeの生成例えば、HIV-1または組換えアデノ随伴ウイルスベクター由来の組換えレンチウイルスベクターなどの遺伝子送達の他の形態を用いて、NICのマウスは、多くの専門知識を必要とする。ウイルス遺伝子発現は、しばしば、宿主がウイルス感染を検知し、15-19応答する炎症反応を引き起こすものの、それらの利点は、持続的な遺伝子発現である。さらに、ウイルスベクターは、限定されたパッケージング能力を有するとの150キロバイトのBACが正しくHGD 4で使用されてきた一方で、従って、遺伝子のサイズが制限される。この技術を習得した後、ユーザは、生体内で任意の核酸（cDNAまたはgDNAのまたはRNA）をトランスフェクトし、タンパク質の産生および生物学的結果に従うことができる。タンパク質は、細胞内、膜結合または細胞外することができます。それがタグ付きまたは修飾された核酸で、従って、アミノ酸レベルことができる。最も重要なことに、これは非常に迅速で簡単な技術である。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは当初、私たちの技術の様々な面での彼の継続的な指導のためHGD技術及び博士ラッセルトムソン（アルバート·アインシュタイン医科大学）教えるための夏の劉（リジェネロン）に感謝。この作品は、ニューヨーク市立資金を起動し、NSFのパン賞IOS-1249166、ハンターカレッジによって資金を供給された。我々は、マウスの肝臓での組織学のためにNYULMC組織病理コアNYUCIセンターサポートグラント、NIH / NCI 5 P30CA16087-31に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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