Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gående uttrykk av proteiner ved Hydrodynamisk Gene Levering i Mus

Published: May 5, 2014 doi: 10.3791/51481
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

Summary

In vivo transfeksjon av naken DNA ved hydrodynamisk genet levering introduserer gener inn i vevet til et dyr med minimal inflammatorisk respons. Tilstrekkelige mengder av gen-produktet er generert slik at gen-funksjon og regulering, så vel som proteinstruktur og funksjon kan analyseres.

Abstract

Effektiv uttrykk av transgener i vivo er av avgjørende betydning i å studere gen-funksjon og utvikle behandlingsmetoder for sykdommer. I løpet av de siste årene, har hydrodynamisk genet levering (HGD) dukket opp som en enkel, rask, trygg og effektiv metode for å levere transgener til gnagere. Denne teknikk er avhengig av den kraft som genereres av den raske injeksjon av et stort volum av fysiologisk løsning for å øke permeabiliteten av cellemembraner av perfusert organer og derved levere DNA inn i celler. En av de viktigste fordelene med HGD er muligheten for å innføre transgener inn i pattedyrceller ved bruk av nakent plasmid DNA (pDNA). Vi presenterer en eksogen genet ved hjelp av et plasmid er minimal arbeidskrevende, svært effektiv og, i motsetning til virus-bærere, bemerkelsesverdig trygg. HGD ble opprinnelig brukt for å levere gener i mus, er det nå brukes til å levere et bredt spekter av substanser, inklusive oligonukleotider, kunstige kromosomer, RNA, proteiner og små molekyler i mus, rotterog, i begrenset grad, andre dyr. Denne protokollen beskriver HGD i mus og fokuserer på tre viktige aspekter ved den metoden som er kritiske til å utføre prosedyren vellykket: korrekt innsetting av nålen inn i venen, volumet av injeksjon og hastigheten på levering. Eksempler er gitt for å vise anvendelsen av denne fremgangsmåte for transient ekspresjon av to gener som koder for utskilte, primat-spesifikke proteiner, apolipoprotein LI (APOL-I) og haptoglobin-relatert protein (HPR).

Introduction

Siden sin første beskrivelse av Liu et al. Og Zhang et al., Har hydrodynamisk genet levering (HGD) blitt et uvurderlig verktøy for å studere gen-funksjon hos gnagere modellsystemer 1, 2. Teknikken innebærer en rask injeksjon (5-7 sekunder) fra et stort volum (8-12% av kroppsvekten) av oppløsningen inn i halevenen til mus for å lette opptaket av plasmid-DNA av cellene i målorganene 1, 2. Disse forhold fører til robust genekspresjon i leveren og mindre genekspresjon i nyren, milt, lunge og hjerte.

Injeksjon av 10 mikrogram pCMV-LacZ plasmid kan transfektere så mye som 40% av hepatocytter, gjør HGD den mest effektive, ikke-viral, in vivo genet levering metode for å date en. I motsetning til virusbærere, er enkel å tilberede pDNA, ikke framprovosere en immunrespons i gnager host tre og ikke utgjør en helserisiko ved å rekombinere med sluttenogenous virus. I tillegg, siden den DNA-molekyler som leveres av HGD ikke trenger emballasje, er denne metoden er egnet for levering av bakterielle kunstige kromosomer (BAC) så store som 150 kb 4. Andre typer av molekyler som har blitt levert av en hydrodynamisk fremgangsmåte omfatter RNA 5-10, Morpholinos 11, proteiner 12, 13 og andre små molekyler 12, 14. Fordelene og ulempene ved HGD fremfor andre leveringsmetoder har vært diskutert i gode anmeldelser i litteraturen 15-20 og en rekke forfattere har gitt en detaljert beskrivelse av prosedyren 21-23.

Vi presenterer transgener i mus ved HGD er trygg og effektiv 1-3, 24 og metoden har vært brukt i rotter med sammenlign suksess 25. Med visse modifikasjoner, har proof-of-concept eksperimenter utført i kyllinger 26, Rabbits 27 og griser 28, selv om den in vivo-anvendelsen av denne teknikk i større dyr er fortsatt en utfordring. Når du bruker denne metoden, er en annen vanlig begrensning at mange av de tilgjengelige pattedyr ekspresjonsvektorene mangler komponenter for å oppnå en vedvarende, høy grad av genuttrykk. Ved hjelp av en pCMV-Luc plasmid, genuttrykk i målet organer er tydelig så tidlig som ti minutter etter HGD, derimot, faller den første, høyt uttrykk nivået kraftig i første uke etter injeksjonen en. Long-term transgen ekspresjon er mulig, avhengig av promoter-og intron anvendes i plasmid utforming 3, 24 er imidlertid opprettholdelsen av høynivå genekspresjon ofte krever gjentatte injeksjoner. Av denne grunn, kan HGD være mindre egnet til å studere kroniske sykdommer som er et resultat av langvarig eksponering for skadelige proteiner eller proteinprodukter. Med disse begrensningene, er HGD en usedvanlig kraftig verktøy for å studere den potensiale rolle av et gen og effekten av det mutanter in vivo, så vel som de terapeutiske effekter og regulering av proteiner og for å etablere dyremodeller av sykdom (for gjennomgang, se 15). For eksempel kan HGD benyttes for å knytte funksjonen til domener og aminosyrer i proteiner ved individuelt å innføre forskjellige gen-konstruksjoner i mus som har de respektive gener slått ut. Videre kan denne teknikken bli brukt i en hvilken som helst muse belastning.

Denne protokollen beskriver HGD i mus med fokus på de tekniske aspektene er nødvendig for å oppnå vellykket transfeksjon: riktig nål innsetting i venen, injeksjonsvolumet og hastigheten på levering. Anvendelsen av denne fremgangsmåte er vist i en musemodell av afrikansk trypanosomiasis, en dødelig sykdom hos mennesker og husdyr 29, 30. Mens flere arter av trypanosomer forårsake sykdom hos husdyr, kan de ikke forårsaker sykdom hos mennesker på grunn av medfødte immunkomplekser i blood kalt trypanosom lytiske faktorer (TLFs) 29, 31, 32. Disse poredannende, high-density lipoproteiner (HDL) inneholder to unike, primat-spesifikke proteiner:. HPR, liganden, som letter opptaket av TLFs inn trypanosomer, og APOL-I, lytisk komponenten 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense er i stand til å infisere mennesker på grunn av ekspresjon av et serum resistens-assosiert protein (SRA) som binder seg til og nøytraliserer human APOL-I 34, 39. Baboon TLF er ikke nøytralisert av SRA grunn av sin avvik APOL-Jeg protein 40. Som rapportert tidligere, ved hjelp av en pattedyr uttrykk vektor (pRG977), transgene uttrykk for bavian TLF komponenter i mus ensidige beskyttelse mot menneske-infeksiøs trypanosomer 40. De representative data presentert her viser hvordan hydrodynamisk genet levering kan anvendes for å studere de terapeutiske virkninger av et protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter er beskrevet her ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Hunter College, City University of New York.

En. Utarbeidelse av endotoksin-fri plasmid DNA

  1. Plukk en enkelt koloni av bakterier inneholdende genet av interesse i en pattedyr ekspresjonsvektor fra en nylig stripete selektiv plate.
  2. Følge anbefalingene som finnes i håndboken av et kommersielt tilgjengelig endotoxin-fritt plasmid rensing kit for dyrking og høsting bakterier.
  3. Rens endotoxin-fri plasmid-DNA fra bakterielle celler ved å følge den protokoll av et kommersielt tilgjengelig endotoxin-fritt plasmid rensing kit.
  4. Bruk endotoksin-fri plast ware og håndtere DNA med forsiktighet for å sikre at endotoksin ikke er re-introdusert i DNA-prøven etter fjerning trinn.
  5. Måle konsentrasjonen av endotoksin-fritt plasmid DNA ved å bestemme dets absorbans ved 260 nm ved hjelp av en MICRo-volum UV-spektrofotometer slik som beskrevet nedenfor, eller en standard, kyvette basert spektrofotometer.
    1. Rens øvre og nedre optiske overflatene til mikro spektrofotometer prøven festesystem som følger. Pipetter 1 pl av rent avionisert vann på den nedre optiske system. Lukk hevarmen og trykk på det et par ganger for å bade øvre optisk system, da åpningsspaken og tørk med en klut.
    2. Åpne programvaren for mikro spektrofotometer og velger nuklein-syrer modulen.
    3. Plasser en mL rent ionisert vann på nedre optisk system, senke hevarmen og velg "initial" fra programmet programvare. Når initialiseringen er fullført, rene både optiske flater med en vev ..
    4. Utfør blank måling ved å laste en mL av endotoksin-fri TE-buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) og velge "blank" fra programmet programvare. Når blank målingen er gjort, rent både optiske flater med envev.
    5. Utfør prøvemåling ved å laste en ul av endotoksin-free DNA-prøve og velge "måle" fra programmet programvare. Noter DNA konsentrasjon. Vurdere DNA renhet ved å registrere absorbans ratio 260/280 nm som vises på skjermen. Siden bruk av rent DNA (260/280 forholdet mellom 1,8) for HGD er svært ønskelig å unngå å bruke en DNA-prøve med en 260/280 forholdet under 1,7. Når målingen er gjort, rengjøre begge optiske flater med en vev.

2. Veiing av mus

  1. Mark mus på en måte som passer for belastningen. Merk: merking av halen er ikke anbefalt for denne prosedyren.
    1. Marker musearter som har hvit pels (f.eks sveitsiske Webster) på ryggen med en sort tusj. Påfør merker over tid som er nødvendig.
    2. Mark muse arter som har svart pels (f.eks C57BL / 6) av øret punching flere dager i forveien.
  2. Vei mus individually ved forsiktig å plassere dem i et dyr som veier panne eller bøtte som er lagt inn på en digital laboratorie balanse. Noter vekten av hver mus ble anvendt i forsøket, på dagen for eksperimentet.

Tre. Utarbeidelse av sprøyter

  1. Forberedelse av injeksjons mix
    1. Beregn mengden av DNA som trengs ved å anta 5-50 ug endotoksin-fri plasmid DNA for injeksjon av hver mus.
      1. Bestem den optimale mengden av plasmid DNA eksperimentelt.
      2. Ved bestemmelse av mengden av DNA som kreves, antar injeksjon av en ytterligere mus per gruppe, som passende lasting av sprøytene vil kreve noe ekstra sprøyteblanding. For å hjelpe beregninger, bør du vurdere følgende eksempel: injisere fire eksperimentelle og 4 kontroll mus, som hver veier 25 g, med 50 mikrogram plasmid DNA per mus. For å bestemme mengden av DNA er nødvendig i dette tilfelle, beregner med 5 mus per gruppe: 5 x 50 ug = 250 ug DNA som trengs for hver gruppe.
    2. Bestemme mengden av saltløsning (0,9% natriumklorid) som er nødvendig ved å anta at 10% av kroppsvekten etter injeksjon av hver mus.
      1. I henhold til ovenstående eksempel injisere hver 25 g mus med 50 ug av plasmid-DNA i 2,5 ml saltoppløsning (2,5 g væske).
      2. Ved bestemmelse av mengden av salt som kreves for en hel gruppe av mus, antar injeksjon av en ytterligere mus per gruppe for å tillate riktig belastning av sprøytene. Tatt i betraktning det eksperiment gitt, beregne mengden av saltoppløsning som er nødvendig for 5 mus i hver gruppe: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml saltløsning for hver gruppe (eller 25 ml totalt). Merk: Hvis musene innen samme gruppe er ikke den samme vekt (mer enn 10% forskjell i kroppsvekt), klar injeksjon blandes separat.
    3. Bruk konserveringsmiddel-og endotoksiner fritt, sterilt saltvann som er godkjent for bruk på mennesker, i 10 ml, flerbruks ampuller.
    4. Ved hjelp av en 20-gauge nål (0,9 mm x 25 mm) som er festet til en luer-lock tuppen av en 20 ml sprøyte,trekke væsken fra saltvann ampuller og tømme sprøyter inn i en 50 ml konisk tube. For å bidra til nøyaktig pipettering av saltvann i løpet av fremstillingen av DNA-saltinjeksjonsmikser, samle saltere enn nødvendig for injeksjon av alle mus i forsøket. For eksperimentet ovenfor, trekke saltvann fra 3, 10 ml hetteglass (totalt ca 30 ml), selv om den beregnede mengde saltvann trengs for eksperimentet er bare 25 ml.
    5. Pipetter den beregnede mengden av DNA inn i en annen 50 ml konisk rør. Pass på å ikke berøre siden av røret med pipetten kroppen for å unngå innføring av endotoksiner. I henhold til eksemplet, pipettere 250 ug av kontroll og 250 mikrogram av forsøks plasmid-DNA inn i separate koniske rør.
    6. Til den nødvendige mengden av saltvann til DNA ved hjelp av en serologisk pipette. Med tanke på prøven eksperiment, pipetteres 12,5 ml saltvann til hver av Master Mix (forsøks-og kontroll).
    7. La alle løsninger for å nåromtemperatur før injeksjon.
  2. Utarbeidelse av sprøyter
    1. For hver mus, fylle en steril, 3 ml, luer-lock sprøyte med DNA-saltholdig blanding ved hjelp av en steril, 20-gauge nål (0,9 mm x 25 mm). Vær forsiktig for å unngå luftbobler. Unngå å bruke høyere volum sprøyter som strømningshastigheten for injeksjon ikke kan kontrolleres meget godt, og det er vanskelig å manipulere større sprøyter med en hånd. Løs ut overflødig DNA-saltvann mix tilbake i konisk tube, da dette kan være gjenbrukt.
    2. Slå av nålen til en steril 27-gauge nål. Fyll nålen med væske helt uten å innføre luftbobler. Juster volumet av DNA-saltholdig blanding som beregnet på grunnlag av vekten av musen.
    3. Ikke la Uncapped nål å berøre noen ikke-steril overflate. Om nødvendig, nåler kan bli re-avkortet ved hjelp av enhåndsteknikk: legg lokket på et flatt underlag, stikk kanylen uten å holde på hetten med den andre hånden og trykker på avkortet nålmot en fast gjenstand for å feste lokket på nålen. Sprøytene er nå klar for hale-vene injeksjoner.

4. Hydrodynamisk DNA levering

  1. Merk at bedøvelse mus kan redusere levedyktighet. Unngå å utføre HGD i et rom som er for kaldt, da dette vil også redusere levedyktighet. Hvis rommet har en omgivelsestemperatur på 20 ° C eller hvis du bruker anestesi, plasser mus på en varmepute innstilt på 37 ° C etter prosedyre for å unngå tap av dyr. Hvis du bruker anestesi, sørge for at munn og snute av musen er uhindret mens på varmeputen og observere musa før det seg helt. Ikke holde tilbake mat eller vann fra mus før HGD.
  2. Varm musene å utvide blodårene.
    1. Sett muse buret (med sengetøy inkludert) på en varmepute i 5 min slik at temperaturen på bedding er omtrent 38 til 39 ° C. Temperaturen bør være lav nok til å holde musene på varmepute for enforlenget periode.
    2. Alternativt, plasserer musen til en dorsal tilgang rainer med minimal holdenhet. Varm halen av musen i 1 min ved forsiktig å holde den med et stykke gas fuktet i varmt vann. Tillat mus for å re-stillingen, om nødvendig. Tørk halen med en vev for å tørke.
    3. Alternativt kan varme mus ved å plassere buret under en varmelampe for ikke mer enn 2 min. Hvis du bruker en varmelampe, utvise forsiktighet for å unngå overoppheting av musen.
  3. Stor-volum hale vene injeksjon
    1. Immobilisere en dorsal tilgang rainer på en flat overflate ved laboratoriet tape.
    2. Holder i halen, plasserer du muse forsiktig inn i rainer og sette støpselet. Bruk så lite tilbakeholdenhet som er nødvendig for å holde halen immobilisert. Kontroller at musen er puste fritt.
    3. Hvis musen er i alvorlig nød på noe tidspunkt under prosedyren, fjerne musen fra rainer umiddelbart og la den hvile.
    4. Plasser musen sliken av den laterale hale årer er synlig. Finn den laterale hale vener ved å se rett ned på baksiden av mus: den røde linje som går i midten av halen er en arterie, mens de blå linjer på hver side av hale er den laterale hale årer.
    5. Tørk halen av musa grundig med en spritserviett.
    6. Ved hjelp av den ikke-injisering hånden til å holde halen stramt mellom peke-og langfingeren, slik at halen passerer under pekefingeren, over midten og tredje fingrene og under lillefinger. Tillater tommelen å forbli fri til å bevege seg. (Fig. 1A)
    7. Ved hjelp av den andre hånden, tørk området som skal injiseres igjen med en spritserviett. Tillat området tørke.
    8. Plukk opp den lastet sprøyte med sprøyte hånd og hold den tønna mellom tommel og de andre fire sifre. Ikke holde på stempelet.
    9. Plasser sprøyten parallelt med halen med nålen pekende mot kroppen av mus ogskråkant (skråkant) av nålen vendt opp.
    10. Stikk nålen inn i halevenen. Fortsett med injeksjonen bare når venen ligger riktig, noe som fremgår av nålen glir på uten motstand. Merk at dybden av nålestikk er et spørsmål om personlig preferanse derimot, er full innsetting anbefales ikke på grunn av økt risiko for klipping av venen. Unngå å bevege nålen.
    11. Ved hjelp av tommelen på halen-holding hånd, legge ned på navet av nålen og trykk knutepunkt mot halen til å holde nålen på plass. Ikke anvende ekstreme trykk og ikke holde på nåleskaftet, da dette vil vanskeliggjøre strømmen av væske inn i venen. Hold i halen med pekefingeren løst på dette punktet slik at den ikke hindrer injeksjon (figur 1A).
    12. Re-plasser sprøyte-holder hånden slik at pekefingeren og langfingeren holder på flensen og tommelen er på enden av stempelet (Figure 1A).
    13. Trykk nedover på stempelet i en kontinuerlig bevegelse og injisere hele væskevolumet i 6-8 sek.
    14. Fjern nålen fra venen og stoppe blødningen ved å trykke lett på halen med en vev.
    15. Fjern mus fra rainer og plassere musen i en utvinnings bur plassert på toppen av en varmepute (bedding bør være 37-38 ° C). Dersom sprøyterommet er kaldt, er dette trinnet kritisk for mus overlevelse. Hold på halen av musen til blødningen stopper helt.
    16. Observer musen for en time etter hydrodynamisk DNA levering. En innledende periode med pesing og immobilitet er normalt på grunn av den midlertidige arytmi forårsaket av HGD men sørg for at musen viser tegn til bedring i ca 5 min. Hvis pust av musen blir svært grunt, forsiktig massere magen på musen for å lette pusten. Legg merke til at utvinningsgraden kan være svakt påvirket av mus belastning anvendes.
    17. Tilbake mustil bolig bur og sikre at musen har en rikelig tilførsel av mat og vann.
  4. Store volum halevene-injeksjon med en alternativ håndstilling
    1. Plasser musen inn i rainer og forberede for injeksjon ved å følge trinn 4.3.1 gjennom 4.3.5, som beskrevet tidligere.
    2. Hvil ikke-injisering hånd på en flat overflate med fire fingre bøyd i en nitti graders vinkel. Fingrene (alle unntatt tommelen) skal hvile på toppen av hverandre, noe som skaper en plattform. Hold i halen av musen mellom tommelen og pekefingeren (fig. 1B).
    3. Ved hjelp av den andre hånden, tørk området som skal injiseres igjen med en spritserviett. Tillat området tørke.
    4. Grab sprøyte med injeksjons hånd og holde i flens og enden av stempelet, klar for injeksjon.
    5. Fullføre prosedyren ved å følge denne protokollen fra trinn 4.3.9 gjennom trinn 4.3.17, som beskrevet tidligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Riktig plassering av nålen inn i halevenen på mus (figur 1) er en forutsetning for en vellykket levering av et transgen av hydrodynamikk-basert transfeksjon. Ofte er den mest krevende delen av teknikken, er imidlertid at bibehold av nålen inne i halevenen uten bevegelse, slik at hele volumet av injeksjon kan leveres i løpet av en 6-8 s periode. Mindre feil under injeksjonsprosessen kan føre til vesentlig redusert transfeksjon effektivitet og proteinekspresjon. Derfor er det viktig å overvåke suksessen til HGD for hvert forsøk. Hvis det transgene protein av interesse er vanskelig å oppdage ved western blot grunn av mangel av følsomme antistoffer, som i tilfelle av bavian APOL-I, injeksjon effektivitet kan overvåkes ved ko-injeksjon av et plasmid som bærer et gen for et protein som er lett synlig. I forsøket vist i figur 2, ble mus injisert med 50mikrogram av en plasmidbærende en av tre forskjellig 6XHIS tagget bavian APOL-I gener og 50 mikrogram av et annet plasmid (samme uttrykk vektor design) som fraktet bavian HPR (bHPR, ukodet). Hovedmålet med dette eksperimentet var å vurdere om tillegg av en 6XHIS tag på de valgte sekvens steder forstyrrer riktig behandling og sekresjon av bavian APOL-Jeg protein. Hvis imidlertid tilsetningen av merkelappen forstyrrer den korrekte folding og dermed utskillelse av proteinet, blir det vanskelig å fastslå om tap av protein ekspresjon oppstått på grunn av nedsatt behandling eller mislykket HGD. Videre, på grunn av mangel på tilstrekkelig følsomme antistoffer, er direkte påvisning av bavian APOL-I i transfekterte muse plasma vanskelig selv i tilfelle av en vellykket levering genet (som bestemt ved beskyttelse av mus mot human-infeksiøst trypanosome utfordring). I dette eksperimentet, ble disse problemene adressertved tilsetning av en ekvivalent mengde av bavian HPR plasmid til APOL-I HGD blandingen for å tjene som et surrogat injeksjonskontroll. Som vist i figuren, ble bavian HPR høyt uttrykt i plasma hos nesten alle av de transfekterte mus indikerer at HGD var vellykket. Små dråper i ekspresjonsnivåer, som sett i en av de to mus i bAPOL-I 6XHIS gruppe 1 figur 2A, er generelt tilskrives en meget liten reduksjon (1-2 r) i injeksjonshastighet. I figur 2B, den første plasmaprøve kjørefelt 1 (i bAPOL-I 6XHIS gruppe 3) viser en fullstendig mangel på protein uttrykk som indikerer en mislykket HGD. I de fleste tilfeller er dette på grunn av ufullstendig injeksjon av hele volumet av leveringsmiddelet. Siden dette forsøk bekrefter suksess for HGD i alle tilfeller, men man, kan effekten av 6XHIS merking på bAPOL-I sekresjon kan nå vurderes av en anti-6XHIS immunoblotanalyse (Fig. 2C og D). Som settpå figur 2D, er den eneste gruppe av mus som hadde påvisbare nivåer av 6xHIS-merket protein i plasma var gruppe 3. Proteinet uttrykksmønster innenfor denne gruppe bekreftet at injeksjon av en av musene i denne gruppen var mislykket. Den komplette mangel på påvisbare 6xHIS proteiner i grupper 1 og 2 (Figur 2C) understreker viktigheten av å inkludere en tracer protein i injeksjons mix å overvåke suksessen til HGD. Uten tanke på plasmanivået av bHPR (Figur 2A og B), kan data fra figur 2C og D lett feiltolkes som en svikt i HGD i gruppene 1 og 2.

Vellykket HGD av bavian TLF1 komponenter bAPOL-I og bHPR, gir mus motstand mot menneske-smittsomme Trypanosoma brucei brucei-SRA parasitter (TBB-SRA, et laboratorium tilsvarer T. b.. Rhodesiense) 40. Denne motstand skyldes den transgene ekspresjon av bAPOL-I </ Em>, som injeksjon av bHPR alene gir ingen beskyttelse mot menneske-smittsomme parasitter. For å vurdere om 6XHIS-merkede varianter av bAPOL-Jeg er fortsatt i stand til å fungere som lytiske proteiner, ble musene som fikk både bAPOL-I og bHPR av HGD utfordret med 5000 TBB-SRA parasitter to dager etter at genet levering. Som vist i figur 3, mus i 6XHIS gruppe 2 bukket under for infeksjon meget tidlig, mens de fleste mus i gruppene 1 og 3 overlevde så lenge den ukodede bAPOL-I positiv kontroll. (Baboon APOL-Jeg tildeler delvis beskyttelse i denne musen belastning.) Siden transgene uttrykk innenfor gruppe 2 var universelt høy, kan mangelen på beskyttelse i disse musene være riktig tolket som tap av bAPOL-Jeg lytisk funksjon på grunn av 6XHIS tag på det stilling. Hensyn må tas, men at det for tidlig (dag 7) død av en mus i gruppe 3 ikke blir feiltolket, som denne musen ikke ble injisert med transgener (se figure 2B, kolonne 1). I lys av kombinerte data fra figurene 2 og 3, konkluderer vi med at bAPOL-I kan bli merket i posisjon 3 (i 6xHIS gruppe 3), uten uønskede bivirkninger, mens merking av dette proteinet i posisjon 2 (i 6xHIS gruppe 2) forstyrrer dens lytisk funksjon. I 6xHIS gruppe 1, mens data antyder beskyttelse antall mus som var utilstrekkelig til å oppnå signifikante data. Strøm analyser bør utføres for å bestemme antall mus som kreves for hvert forsøk. Mens den tilsynelatende mangel på påviselig protein i museplasma fra gruppe 1 kan synes motstridende til beskyttelsesmønster sett i figur 3, være oppmerksom på at en negativ anti 6xHIS western blot i denne gruppen kan være et resultat av en mangel på deteksjon på grunn av protein prosessering heller enn en mangel på genekspresjon. I gruppe 1 ble 6xHIS tag lagt tett etter spaltningssetet av den anslåtte signal peptid. Den bavian APOL-I aminosyresekvensen inneholder en ekstra predicted proteolytisk spaltningssete omtrent 20 aminosyrer fra spaltningssetet av signal-peptidet 40. Derfor er det klart at bAPOL-I i disse musene utskilles og funksjonell mistet 6xHIS signal som er nødvendig for dens deteksjon. Således illustrerer viktigheten av HIS tag plassering.

APOL-Jeg dreper afrikanske trypanosomer etter poredannelse i parasitten lysosome membran 36, 37. Naturlige varianter av humant APOL-I, som finnes i mennesker med nyere afrikansk herkomst, har blitt sterkt assosiert med nyresykdom i afrikanske amerikanere, selv om mekanismen for nyreskade er ennå uklart 41, 42. Siden HGD resulterer i høyeste genuttrykk i leveren, ønsket vi å undersøke om menneskelig APOL-I eller dens syntetisk sekvens variant forårsaker skade i dette organet. For dette formål ble musene injisert med 50 pg av humant WT APOL-I, eller en enkelt aminosyre syntetisk mutant betegnet ens K4.To vurdere leverskade, målte vi aspartattransaminase (AST) nivåer i muse plasma samlet på dag 2 etter injeksjonen. I samsvar med sin lytisk funksjon, forårsaker WT human APOL-I en heving av serum ASAT (figur 4A), sammenlignet med saltvann-injiserte mus. I motsetning til dette injeksjon av mutant K4, som skiller seg i bare en aminosyre, forårsaket svært lite AST frigjøring. Forskjeller i leverskader er usannsynlig å være knyttet til nivåer av protein uttrykk, som K4 proteinnivået er tilsvarende eller høyere enn de av WT human APOL-I (Figur 4B). Undersøkelse av lever fra HGD mus samlet fem dager etter injeksjon viser at menneskelig WT APOL-Jeg fører begrenset vevsnekrose med moderat makrofag infiltrasjon (figur 5B) sammenlignet med saltvann-injisert mus som viser normal leverhistologi (Figur 5A, lilla områder) . Bekrefte data innhentet ved å måle plasma ASAT, K4 injisert i samme plasmid backgrunde som WT viser normal leverhistologi (figur 5C).

Figur 1
Figur 1. Illustrasjon av håndposisjoner for HGD. A.) Posisjon 1 Anbefalt. Håndstilling for å oppnå maksimal injeksjonshastighet og for å unngå nål bevegelse etter injeksjonen er igangsatt. Pilen angir den foreslåtte bevegelse av tommelen etter innsetting av nålen i venen. Tommelen skal immobilisere nålen ved å holde forsiktig navet mot halen av musa. Den hånd som holder sprøyten må flyttes for å kunne trykke ned stempelet før injeksjon. B.) Posisjon 2. Denne stilling anbefales hvis halevene-injeksjon skal utføres nærmere roten av halen på grunn av gjentatte injeksjoner. Når nålen er satt inn i venen, må denne håndstilling uten pelsther justeringer.

Fig. 2
Figur 2 Western blot analyse av plasma samlet inn fra fem uker gammel, kvinnelig, sveitsiske Webster (SW) mus injisert med en blanding av to separate plasmider:. 50 mikrogram bavian HPR og 50 mikrogram av ulikt 6XHIS tagget bavian APOL-I genene. Mus ble injisert med saltvannsbærer som negativ kontroll. For å bekrefte suksessen HGD, viser dette eksperimentet sirkulerende plasmanivået av bavian HPR protein, som bavian APOL-Jeg er vanskelig å oppdage. Museplasmaprøver ble samlet 2 dager post HGD og protein ekspresjonsnivåer ble analysert ved western blot (plasma fortynnet 1:20) på 10% Tris-Glycine denaturerende polyakrylamid-geler i henhold til ikke-reduserende betingelser. HPR ble oppdaget ved hjelp av en kanin polyklonale antistoff mot humant haptoglobin (HP), som også Recognizes bavian HPR. Merket bAPOL-Jeg ble oppdaget ved hjelp av en kanin polyklonale antistoff mot en 6xHIS tag. Molekylvekter på styre 6XHIS proteiner inkludert er 40 og 50 kDa. A.) Panel viser et eksempel på vestlige blot analyse av et utskilt protein (HPR) når alle mus i en gruppe ble injisert med hell. Legg merke til den jevnt høy protein uttrykk i den andre HIS-merkede gruppen (bAPOL-I 6XHIS Gruppe 2), hvor injeksjon var svært vellykket. I den første gruppen (bAPOL-I 6XHIS gruppe 1), er protein ekspresjon fra en av musene fremtredende, men noe mindre, sannsynligvis på grunn av redusert hastighet av injeksjonen. B.) Panel viser et eksempel på protein uttrykk nivåer når en av injeksjoner (i bAPOL-I 6XHIS Gruppe 3) var mislykket. C.) Panel demonstrerer viktigheten av å inkludere en tracer protein (bHPR) for å måle effekten av HGD ved påvisning av proteinet av interesse (bAPOL-I), er usikkert. Til tross for den bekreftet suksessen HGD i bAPOL-I

Figur 3
Figur 3. Survival of mus uttrykker bavian APOL-I 6XHIS varianter og bavian HPR. Fem uker gamle, hunn, Swiss Webster-mus mottok 50 pg av hver av to separate plasmider ved HGD i samme injeksjonsblandingen. Mus som brukes i dette eksperimentet tilsvarer plasmaet analyseres i figur 2.. På dag 2 post-injeksjon, ble musene infisert med 5000 humane infeksjons TBB-SRA parasitter og parasitemia ble overvåket. Når parasitemia nådd 10 9 parasitter / ml, ble musene avlives. Overlevelse var signifikant forskjellig fra saltvann kontroll der det er angitt (* - P <0,05, log-rank test). Mus overlevelse på parasitt utfordring er et eksempel på hvordan suksessen til HGD påvirker data innhentet fra senere eksperimenter. Når bavian APOL-I blir injisert med hell, er genproduktet sekrert i museblod der det er tatt opp av og dreper human-infeksiøst trypanosomer. Overlevelsen kurven viser at mus injisert med 6xHIS tag versjon 3 av bavian APOL-Jeg var signifikant beskyttet mot TBB-SRA. Den eneste for tidlig død i denne gruppen tilsvarer den mus som ikke ble injisert med det plasmid som bærer transgenet (se figur 2). Denne musen bør utelukkes fra overlevelsesanalyse som sin overlevelse på parasitt utfordring ikke skyldes forskjeller i transgenet mottatt, men til svikt i genet levering.

Figur 4
APOL-I. Plasmidet carrier (pRG977) var identisk for alle genvarianter. Museplasmaprøver ble samlet to dager etter HGD. ASAT ble målt ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kolo kit. Legg merke til at økning i ASAT nivåer er assosiert med sekvens variasjoner i APOL-I-genet og ikke traumer av HGD selv. Dataene er fra en representativt eksperiment analysert in triplo ved å bruke følgende antall plasmaprøver: saltløsning (n = 6), K4 (n = 4) og WT (n = 3). De feilfelt representerer standardavvik. B.) Western blot analyse av plasma samles på dag 2 innlegg HGD fra mus som ble vurdert for ASAT i panel A. Protein uttrykk nivåer ble analysert ved immunoblot (plasma fortynnet 1:40) bruker 10% Tris-Glycine polyakrylamidgeler etter denaturering , ikke-reduserende betingelser. APOL-Jeg ble oppdaget ved hjelp av enkanin polyklonale antistoff mot N endestasjonen av menneskelig APOL-I.

Figur 5
En enkelt aminosyresubstitusjon i APOL-I-sekvensen resulterer i forskjellige nivåer i vev patologi Figur 5.. Figuren viser lever fra SW mus som fikk injeksjoner av hydrodynamiske saltvannsbærer (A), 50 pg human WT APOL-I (B), eller 50 ug av et syntetisk mutant variant av APOL-I, 4 r (C). Levere ble fjernet på dag 5 etter injeksjonen og bearbeidet for hematoxylin og eosin farging. Representative eksempler er vist i de samme mus ble analysert for ASAT i figur 4. Paneler (DF) viser ytterligere eksempler på ødelagte områder i WT mus. Nekrose foci i paneler (B), er (DF) merket med sorte rektangler og er forstørret. Hvite piler i disse panelene påpeke områder med makrofag infiltrasjon. For sammenligning, Normalt vev fra et representativt område av leveren av en saltløsning kjøretøy-injisert mus er preget av en lys blå firkant og er også utvidet. Panel (B) og (D) er representative bilder fra den samme WT mus, mens panelene (E) og (F) er fra to forskjellige WT mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når utført riktig, er HGD en bemerkelsesverdig trygg og effektiv måte å transgenet levering. De kritiske trinn til vellykket HGD er: 1) å levere den riktige mengde av DNA i et stort volum av saltløsningsbærer 2) inn i halevenen på mus 3) på mindre enn 8 sekunder.

Selv om prosessen med injeksjon seg unektelig krever litt fingerferdighet, suksessen av denne seks-andre prosedyre ofte ligger i grundige forberedelser av eksperimentet. Mengden av pDNA nødvendig for å oppnå maksimal genekspresjon, kan variere sterkt avhengig av plasmidet som brukes og genet som skal uttrykkes derfor bør den optimale mengde av DNA som skal injiseres bestemmes eksperimentelt for hver enkelt applikasjon. For mus, er den anbefalte DNA området generelt 5-50 mikrogram, utover som genuttrykk kan nå et platå. I våre hender, injeksjon av 50 mikrogram pRG977 bærer enten APOL-I eller HPR-genet fører til høye nivåer av circulating protein nivåer i de to første dager etter HGD. Blod nivåer av både proteiner reduseres betydelig i løpet av de neste par dagene til proteinnivået faller under påvisbare nivåer rundt dag 10 (38 og upubliserte data). Den optimale mengde av DNA skal bli levert i en fysiologisk oppløsning som tilsvarer 8-12% av kroppsvekt av musen 1, 2. Mens de fleste forskere, inkludert oss, bruke saltvann som injeksjons kjøretøyet, har Ringers løsning blitt brukt for HGD med sammenlign suksess to. Legg merke til at selv om det ikke er nødvendig å utføre HGD i et sterilt miljø, er det viktig å unngå endotoksin-kontaminering av injeksjonsoppløsningen i løpet av prosedyren. For dette formål bør den saltløsning som brukes for injeksjoner være av bedre renhet, og den DNA som skal injiseres bør fremstilles ved bruk av et kommersielt tilgjengelig kit som fjerner endotoksin. Et annet viktig forberedende trinn er imidlertid veiing av mus. Sidenvolum av injeksjon er en av de kritiske aspektene ved vellykket HGD, er det viktig å sørge for at musen er verken under-dosert eller over-dosert med saltvann. De tidligere feil resulterer i suboptimal transfeksjon, mens den sistnevnte i den mulige død av dyret. For å ivareta sikkerheten for dyrene lenger, anbefaler vi å laste inn sprøyter med små-gauge nål for å unngå å introdusere små luftbobler som er vanskelig å bli kvitt. HGD bør utføres med en 27 - gauge nål som beskrevet i protokollen.

Riktig injeksjon er mye lettere hvis de caudal årer er klart synlig. Strekke blodårer ved forsiktig oppvarming av musen kan hjelpe til visualisering av årer hvis en rainer med en hale-illuminator ikke er tilgjengelig. Plassere museburet på en varmepute for noen minutter eller holde halen med en varm, våt klut arbeidet godt i våre hender. Hvis du bruker en varmelampe, må man utvise ekstrem varsomhet for ikke å overopphetes musene. Vi finner at ossing en varmelampe bevirker at musene unødvendig stress og ubehag, og derfor bør unngås. Tørke halen med 70% etanol hjelper visualisering ytterligere ved å øke kontrasten mellom halevenen og huden. Dette trinn er også kritisk for å unngå bakteriell forurensning under injeksjon. Når musen er klargjort for injeksjon, kan halevenen injiseres ved hjelp av det ene av de håndposisjoner som er beskrevet i denne protokollen. Legg merke til, at mens posisjon 2 vises enklere og mer oversiktlig, kan det være vanskeligere å injisere hele væskevolumet uten å bevege sprøyten. I motsetning til dette å etablere god nålens stilling ved hjelp av den første metode er mer tungvint men når nålen navet er sikkert holdt mot halen, injeksjon sjelden svikter. Den første metoden er også anbefalt for maksimal hastighet, selv om vellykket transfeksjon er mulig ved hjelp av enten håndstilling.

Den anbefalte hastighet HGD injeksjon i mus er 6-8 sek, selvmange Forfatterne foreslår at raskere injeksjoner gi enda bedre resultater 1, 12. Langsom injeksjon resulterer i vesentlig redusert genuttrykk. Imidlertid er den mest vanlige årsak til en fullstendig mangel på genekspresjon manglende evne til å levere den fulle volum av injeksjon. Dette skjer når nålen beveges, etter injeksjonen ble igangsatt. Riktig plassert, kommer inn i nålen i venen uten motstand. For å kontrollere at nålen er satt inn i venen på riktig måte, kan man sprøyte inn en meget liten mengde (100 ul) væske inn i venen før hele injeksjonen. Hvis du trykker ned stempelet møter med ekstrem motstand, er nålen i feil posisjon, og væsken går inn halen vev. Hvis nålen går venen mid-injeksjon, korrigering av den mislykkede HGD kan forsøkes etter at musa fikk lov til å hvile i et par timer. Re-injeksjon etter utilstrekkelig hvile fører til nød til mus, og kan resultere i tap av hydrodynamisk pressure ved å åpne opp den først viklet på halen av musen. Ved gjentatte injeksjoner er nødvendig, kan mus injiseres med det fulle volum av saltløsning (og mengde av DNA) enten nærmere roten av halen i den samme retning eller i den kontralaterale venen. Etter HGD bør mus observeres i et bur plassert på en varmepute i minst en time. HGD fører til en kraftig økning i intravaskulær press som resulterer i en akutt uregelmessighet av hjertefunksjon, lever ekspansjon, og en forstyrrelse av membranen porene i leverceller, sinusoids og fenestrae 12, 14, 43. Til tross for en dobling av sitt blodvolum i et par sekunder, mus tolerere HGD bemerkelsesverdig godt. Puls tilbake til normal i 2 min og intravaskulær press, som avtar raskt kort tid etter injeksjon, tilnærminger basale nivåer i 3 min 12, 43. De forstyrret hepatocytter forsegle på mindre enn to minutter, og de utvidede leverstørrelse avkastningtil normal størrelse i 30 min, etterfulgt av utvinning av sinusfunksjonen i løpet av ca 24 timer 43. Mens mange forskere bruker anestesi hell, i våre hender, forverrer isofluorane anestesi den åndenød av mus på grunn av HGD. Vi finner at bedøvede mus tar lengre tid å komme seg av og til krever gjenopplivning for å overleve. Ved å injisere en stor gruppe av mus ved hjelp av anestesi, kan det være nødvendig å ha en ekstra person i rommet opptatt av å overvåke velvære for utvinne dyr. Uten anestesi, selv etter gjentatte injeksjoner, er mus overlevelse 100% og gjenvinning av tiden er mindre enn 5 minutter.

Den protokoll som er beskrevet her kan brukes til å levere et bredt spekter av molekyler til muselever. Ved hjelp av det utskilte protein APOL-I som et eksempel, viste vi hvordan HGD kunne brukes til å etablere en musemodell og studere funksjonen av et beskyttende protein. Ved sammenligning av funksjonen av en rekke genprodukter, er success av HGD bør vurderes når det er mulig. For utskilte proteiner, er det lett å overvåke uttrykk nivåer ved å analysere mus plasma ved hjelp av western blot (figurene 2 og 4B.) Det er særlig viktig å sikre suksess for HGD når analysere naturlige eller syntetiske varianter av et terapeutisk protein, som transfeksjon effektivitet kan alvorlig påvirke sykdoms utfall (figurene 2 og 3). Eksempler er gitt for å vise hvordan denne fremgangsmåte kan utvides til å analysere leverskade forårsaket av APOLI, som er et pore-dannende protein (figur 4 og 5). Sekvens varianter av APOL-I i samme plasmid bakgrunn resultere i markert forskjellige skade profiler. Dette tyder på at vevsskade er forbundet med proteinfunksjon og ikke ekspresjonsvektoren eller traumer av injeksjonen selv. Det bør bemerkes at, i våre hender, ASAT er universelt høyt på dag 1 post-injeksjon (data ikke vist). På dag to, derimot, ASAT av mus ikastes med saltvann tilbake til normal og forskjeller mellom genvarianter er lett merkbar (figur 4). Dag 3 post-injeksjon, AST målt i alle behandlinger vende tilbake til sin basale nivå (data ikke vist). Siden nekrotisk vev og betennelse i leveren er tydelig lenger enn en forbigående økning i AST-, lever-skade på grunn av vedvarende genekspresjon vurderes mer pålitelig måte, riktignok kvalitativ, ved farging av leveren som samles på dag 5 etter injeksjon. Eksemplene gitt viser at varianter av APOL-Jeg som forårsaker økt frigjøring av AST to dager etter injeksjon også føre til mer varig leverskade som vurderes ved farging med hematoxylin og eosin.

Hydrodynamisk genet arrangementet tillater rask analyse av gen-ekspresjon in vivo. Videre krever den enkle konstruksjon av genet som studeres i en eukaryot ekspresjonsvektor, og evnen til å utføre injeksjonen, som beskrevet ovenfor. Generering av transgenic mus ved hjelp av andre former for genet levering, for eksempel rekombinante lentiviral vektorer avledet fra HIV-1, eller rekombinante adeno-assosierte virale vektorer, krever mye mer spesialistkompetanse. Imidlertid er deres nytte vedvarende genekspresjon, men viral genekspresjon fører ofte til en inflammatorisk respons på grunn av den verten avføling av en viral infeksjon og svarer 15-19. Videre er de virale vektorer har en begrenset evne til emballasje, og derfor er begrenset i genet størrelse, mens BACS av 150KB har blitt brukt i HGD 4.. Etter å mestre denne teknikken, kan brukeren transfektere en hvilken som helst nukleinsyre (cDNA eller gDNA, eller RNA) in vivo og følge produksjonen av protein og den biologiske konsekvenser. Proteinet kan være intracellulært, membranbundet eller ekstracellulært; det kan være merket eller modifisert ved nukleinsyre, og dermed aminosyrenivå. Viktigst, er dette en veldig rask og grei teknikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) for å begynne å lære oss den HGD teknikk og Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) for sin vedvarende veiledning i ulike aspekter av teknologien. Dette arbeidet ble finansiert av Hunter College, CUNY starte opp midler og NSF Brød award IOS-1249166. Vi takker NYULMC Histopathology Kjerne NYUCI senter Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 for histologi på mus lever.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol Prep Wipe Webcol 6818
AST kit, Amplite Colorimetric AAT Bioquest 13801
Conical Tube, 50 ml BD Falcon 352070
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
KimWipes KIMTECH 34120
Mouse Tail Illuminator Braintree Scientific MTI RST Or equivalent
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) BD 305175
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) BD 305109
pRG977 (mammalian expression vector) Regeneron Pharmaceuticals Material Transfer Agreement required
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira  Fisher NC9054335
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip BD 309657 Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  3. Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
  4. Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
  5. Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
  6. Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
  7. Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
  8. Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
  9. McCaffrey, A. P., et al. RNA interference in adult mice. Nature. 418, 38-39 (2002).
  10. McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
  11. McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
  12. Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
  13. Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
  14. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
  15. Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
  16. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
  17. Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
  18. Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
  19. Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
  20. Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery. Adv Genet. 54, 65-82 (2005).
  21. Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
  22. Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
  23. Knapp, J. E., Liu, D. Hydrodynamic delivery of DNA. Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).
  24. Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
  25. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
  26. Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
  27. Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
  28. Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
  29. Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
  30. Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
  31. Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
  32. Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
  33. Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
  34. Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
  35. Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
  36. Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
  37. Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
  38. Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
  39. Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
  40. Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
  41. Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
  42. Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
  43. Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).

Tags

Genetikk hydrodynamisk genet levering hydrodynamikk-baserte transfeksjon mus genterapi plasmid DNA forbigående genuttrykk hale vene injeksjon
Gående uttrykk av proteiner ved Hydrodynamisk Gene Levering i Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kovacsics, D., Raper, J. Transient… More

Kovacsics, D., Raper, J. Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice. J. Vis. Exp. (87), e51481, doi:10.3791/51481 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter