Summary
Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado.
Abstract
Expressão eficiente de transgenes in vivo é de fundamental importância no estudo da função dos genes e desenvolvimento de tratamentos para doenças. Nos últimos anos, a entrega do gene hidrodinâmico (HGD) surgiu como um método simples, rápido, seguro e eficaz para a entrega de transgenes em roedores. Esta técnica baseia-se na força gerada pela rápida injecção de um grande volume de solução fisiológica para aumentar a permeabilidade das membranas celulares dos órgãos perfundidos e assim entregar o ADN em células. Uma das principais vantagens de HGD é a capacidade para introduzir os transgenes em células de mamíferos usando o DNA de plasmídeo despido (ADNp). A introdução de um gene exógeno usando um plasmídeo é minimamente trabalhoso, altamente eficiente e, ao contrário de transportadores virais, notavelmente segura. HGD foi inicialmente utilizado para entregar genes em ratos, é agora usado para proporcionar uma vasta gama de substâncias, incluindo oligonucleótidos, cromossomas artificiais, ARN, proteínas e pequenas moléculas em ratinhos, ratazanase, num grau limitado, de outros animais. Este protocolo descreve HGD em ratos e se concentra em três aspectos-chave do método que são fundamentais para realizar o procedimento com sucesso: correta inserção da agulha na veia, o volume de injeção ea velocidade de entrega. Os exemplos são apresentados para mostrar a aplicação deste método para a expressão transitória de dois genes que codificam para proteínas secretadas, primatas-específica, apolipoproteína LI (APOL-I) e proteína relacionada com haptoglobina (HPR).
Introduction
Desde sua primeira descrição por Liu et al. E Zhang et al., Entrega gene hidrodinâmico (HGD) tornou-se uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene em roedores sistemas modelo 1, 2. A técnica envolve a injecção rápida (5-7 segundos) de um grande volume (8-12% de peso corporal) de solução para a veia da cauda dos ratinhos a fim de facilitar a absorção de ADN de plasmídeo por as células de órgãos alvo 1, 2. Estas condições conduzem a expressão do gene robusto no fígado e menos expressão do gene no rim, baço, pulmão e coração.
A injecção de 10 ug de pCMV-LacZ plasmídeo pode transfectar tanto como 40% dos hepatócitos, tornando HGD o mais eficiente, não-viral in vivo, o método de entrega de genes para uma data. Ao contrário dos portadores virais, pDNA é fácil de preparar, não provocar uma resposta imunológica no hospedeiro roedor 3 e não representa um risco para a saúde por meio da recombinação com finalvírus ogenous. Além disso, uma vez que as moléculas de ADN entregue por HGD não precisa de embalagem, este método é adequado para a entrega de cromossomas artificiais bacterianos (BAC) tão grandes como 150 kb 4. Outros tipos de moléculas que foram entregues por um método de hidrodinâmica incluem ARN 5-10, morfolinos 11, proteínas de 12, 13 e outras moléculas pequenas, 12, 14. As vantagens e desvantagens de HGD sobre outros métodos de entrega tem sido discutido em excelentes revisões na literatura 15-20 e um número de autores fornecida uma descrição detalhada do procedimento 21-23.
Introduzindo transgenes em murganhos por HGD é segura e eficaz 1-3, 24 e o método tem sido utilizado com sucesso em ratos comparáveis 25. Com certas modificações, as experiências de prova-de-conceito foram realizadas em 26 galinhas, rabBits 27 e 28 porcos, embora, a aplicação vivo no da técnica em animais maiores continua a ser um desafio. Ao utilizar este método, uma outra limitação é comum que muitos dos vectores de expressão de mamíferos disponíveis não possuem os componentes para realizar um persistente, elevado nível de expressão do gene. Usando um plasmídeo, a expressão do gene de pCMV-Luc em órgãos alvo é evidente tão cedo quanto 10 minutos após HGD, no entanto, o elevado nível inicial, a expressão cai drasticamente, na primeira semana após a injecção 1. A expressão do transgene a longo prazo, é possível, dependendo do promotor e o intrão utilizado na criação do plasmídeo 3, 24 injecções no entanto, a manutenção da expressão de genes de alto nível geralmente requer repetidas. Por esta razão, HGD pode ser menos adequado para estudar doenças crônicas, que são resultado de exposição a longo prazo às proteínas prejudiciais ou produtos de proteína. Com estas limitações, HGD é uma ferramenta extremamente poderosa para estudar a pocial papel de um gene e o efeito de que os mutantes in vivo, bem como os efeitos terapêuticos e regulação de proteínas e para o estabelecimento de modelos animais da doença (para uma revisão, ver 15). Por exemplo, HGD pode ser utilizado para designar uma função de domínios e aminoácidos de proteínas através da introdução de várias construções de gene individualmente em ratinhos que têm os respectivos genes batido para fora. Além disso, esta técnica pode ser usada em qualquer estirpe de ratinho.
Este protocolo descreve HGD em ratos com um foco sobre os aspectos técnicos necessários para alcançar a transfecção de sucesso: a inserção da agulha correta para a veia, o volume de injeção e velocidade de entrega. A aplicação deste método é demonstrado em um modelo do rato da tripanossomíase Africano, uma doença fatal dos seres humanos e de animais 29, 30. Enquanto várias espécies de tripanossomas causar doenças em animais, a maioria não pode causar a doença em humanos devido à inata complexos imunes em blood chamados fatores líticas tripanossomas (Tlfs) 29, 31, 32. Estes, lipoproteínas de alta densidade que formam poros (HDL) contêm dois, proteínas primatas específicas exclusivas:. HPR, o ligante, o que facilita a captação de FPTs em tripanossomas e APOL-I, o componente lítica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense é capaz de infectar seres humanos, devido à expressão de uma proteína associada a resistência soro (SRA), que se liga e neutraliza humano APOL-I 34, 39. Babuíno TLF não é neutralizado por SRA, devido à sua divergente APOL-I da proteína 40. Como relatado anteriormente, utilizando um vector de expressão de mamífero (pRG977), a expressão transgénica do babuíno componentes TLF em ratinhos confere protecção contra tripanossomas humanos-infeccioso 40. Os dados representativos aqui apresentados demonstram como a entrega do gene hidrodinâmico pode ser aplicado para estudar os efeitos terapêuticos de uma proteína.
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Protocol
Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso do Hunter College, Universidade da Cidade de Nova York.
1. Preparação de ADN plasmídico sem endotoxinas
- Escolha de uma única colónia de bactérias, contendo o gene de interesse num vector de expressão de mamífero a partir de uma placa recentemente riscada selectiva.
- Siga as recomendações encontradas no manual de um kit disponível comercialmente purificação plasmídeo livre de endotoxina para cultivo e colheita bactérias.
- Purifica-se o plasmídeo de ADN livre de endotoxinas a partir de células bacterianas, seguindo o protocolo do kit de purificação de plasmídeo isento de endotoxina disponível comercialmente.
- Use livre de endotoxina plásticas e lidar com DNA com cuidado para garantir que a endotoxina não é re-introduzida na amostra de DNA após a etapa de remoção.
- Medir a concentração de DNA plasmídico sem endotoxinas por determinação da sua absorvância a 260 nm usando um micro-volume do espectrofotómetro de UV, como descrito abaixo, ou um padrão, baseada em espectrofotômetro cuvete.
- Limpar as superfícies ópticas inferiores e superiores do sistema de retenção de amostra espectrofotômetro micro como se segue. Pipetar 1 mL de água deionizada limpo no sistema óptico menor. Feche o braço de alavanca e toque-o algumas vezes para banhar o sistema óptico superior, em seguida, alavanca de abertura e limpe com um lenço de papel.
- Abra o software do micro espectrofotómetro e seleccionar o módulo de ácidos nucleicos.
- Coloque 1 ml de água deionizada limpa no sistema óptico inferior, o braço de alavanca e selecione "inicializar" do software do programa. Uma vez que a inicialização estiver superfícies completas, limpas tanto ópticos com um lenço de papel ..
- Executar a medição em branco, carregando um ul de tampão TE isento de endotoxina (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM) e seleccionando "em branco" do software do programa. Uma vez que a medição é feita em branco, superfícies limpas tanto ópticos com umtecido.
- Realizar medição da amostra, carregando 1 ml de amostra de DNA livre de endotoxina e selecionando "medida" do software do programa. Registre a concentração de DNA. Avaliar a pureza do DNA através da gravação da relação absorbância 260/280 nm que aparece na tela. Uma vez que o uso de ADN puro (260/280 razão de 1,8) para HGD é altamente desejável, evitar a utilização de uma amostra de DNA com uma razão de 260/280 inferior a 1,7. Uma vez que a medição é feita, limpar ambas as superfícies ópticas com um tecido.
2. Pesando de ratos
- Mark camundongos em uma forma apropriada para a tensão. Nota: marcação da cauda não é recomendado para este procedimento.
- Marcar espécie de rato que têm pele branca (por exemplo, Swiss Webster) em suas costas com um marcador preto. Reaplicar marcas ao longo do tempo, se necessário.
- Mark espécie de rato que têm pele preta (por exemplo, C57BL / 6) pela orelha perfurando vários dias de antecedência.
- Pesar camundongos individually delicadamente colocando-os em um prato de pesagem ou animal balde colocado em uma balança de laboratório digital. Registar o peso de cada murganho utilizado na experiência, no dia da experiência.
3. Preparação de seringas
- Preparação da mistura de injeção
- Calcula-se a quantidade de DNA necessária, assumindo 5 - 50 ug livre de endotoxina plasmídeo de DNA para a injecção de cada rato.
- Determinar a quantidade óptima de DNA de plasmídeo experimentalmente.
- Ao determinar a quantidade de DNA necessário, assumir a injeção de um rato adicional por grupo, como o carregamento adequado das seringas vai exigir algum mix injeção extra. Para ajudar os cálculos, considere o seguinte exemplo: injetar 4 camundongos experimentais e 4 de controle, cada um pesando 25 g, com 50 mg de plasmídeo de DNA por mouse. Para determinar a quantidade de DNA necessária neste caso, calcular com cinco ratinhos por grupo de: 5 x 50 mg = 250 ug de ADN necessário para cada grupo.
- Determinar a quantidade de soro fisiológico (cloreto de sódio a 0,9%) necessária, assumindo 10% do peso do corpo para a injecção de cada rato.
- De acordo com o exemplo acima, injecta-se 25 g de cada ratinho, com 50 ug de DNA de plasmídeo em 2,5 ml de solução salina (2,5 g de líquido).
- Ao determinar a quantidade de soro necessária para todo um grupo de ratinhos, assumir a injecção de um rato por grupo adicional para permitir a colocação adequada das seringas. Considerando-se a experiência dada, calcular a quantidade de soro necessária para 5 ratinhos em cada grupo: 5 x 2,5 ml = 12.5 ml de solução salina por cada grupo (ou 25 ml no total). Nota: Se os ratos pertencentes ao mesmo grupo não são o mesmo peso (diferença de mais de 10% do peso corporal), preparar injecção mistura separadamente.
- Use conservantes e sem endotoxinas solução salina, estéril, que foi aprovado para uso humano, em 10 ml, frascos de uso múltiplo.
- Utilizando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm) acoplada a uma ponta luer de uma seringa de 20 ml,retirar o líquido a partir de frascos de soro fisiológico e esvaziar as seringas para um tubo cónico de 50 ml. Para ajudar a pipetagem precisa de solução salina, durante a preparação das misturas de injecção de DNA com solução salina, solução salina recolher mais do que o necessário para a injecção de todos os ratinhos na experiência. Para o experimento acima, retirar salina de 3 frascos de 10 ml (um total de cerca de 30 ml), mesmo que o valor calculado de soro necessário para a experiência é de apenas 25 ml.
- Pipetar a quantidade calculada de DNA em um tubo de 50 ml diferente. Tome cuidado para não tocar no lado do tubo com o corpo da pipeta para evitar a introdução de endotoxina. De acordo com o exemplo, uma pipetagem de 250 ug de controlo e 250 ug de DNA do plasmídeo experimental em tubos cónicos separadas.
- Adicionar a quantidade necessária de solução salina para o ADN utilizando uma pipeta serológica. Considerando a experiência da amostra, pipeta 12,5 ml de solução salina a cada uma das misturas mestres (experimental e controle).
- Permitir todas as soluções para alcançartemperatura ambiente antes da injecção.
- Calcula-se a quantidade de DNA necessária, assumindo 5 - 50 ug livre de endotoxina plasmídeo de DNA para a injecção de cada rato.
- Preparação de seringas
- Para cada rato, preencher um, 3 ml, a seringa luer-lock esterilizado com a mistura de ADN-salina estéril usando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm). Tome cuidado para evitar bolhas de ar. Evitar o uso de seringas de volume mais elevadas que a taxa de fluxo de injecção não pode ser controlada muito bem, e é difícil de manipular as seringas maiores em um lado. Ejetar qualquer mistura DNA-salina em excesso de volta para o tubo cônico, pois isso pode ser reutilizado.
- Mudar a agulha a uma estéril, agulha de calibre 27. Encha a agulha com o líquido completamente sem a introdução de bolhas de ar. Ajustar o volume da mistura de ADN-salina como calculada com base no peso do rato.
- Não permita que a agulha desencapada para tocar em qualquer superfície não-estéril. Se necessário, as agulhas podem ser re-tampado, utilizando a técnica com uma só mão: coloque a tampa sobre uma superfície plana, insira a agulha sem segurar a tampa com a outra mão e pressione a agulha tampadacontra um objecto firme para fixar a tampa para a agulha. As seringas estão agora prontos para injectáveis-veia da cauda.
4. Entrega DNA hidrodinâmica
- Note-se que os ratos a anestesia podem reduzir a viabilidade. Evite realizar HGD em uma sala que é muito frio, pois isso também vai reduzir a viabilidade. Se a sala tem uma temperatura ambiente de 20 ° C ou se estiver usando anestesia, coloque os ratos em uma almofada de aquecimento fixada em 37 ° C pós procedimento para evitar a perda de quaisquer animais. Se estiver usando anestesia, garantir que a boca e focinho do mouse são enquanto desobstruída na almofada de calor e observe o mouse até que recupere totalmente. Não reter água ou comida dos ratos antes de HGD.
- Aqueça os ratos para dilatar os vasos sanguíneos.
- Coloque a gaiola do rato (com cama incluídos) sobre uma almofada de aquecimento durante 5 minutos de modo que a temperatura do leito é de cerca de 38-39 ° C. A temperatura deve ser baixa o suficiente para manter os ratos na almofada de calor para umperíodo prolongado.
- Alternativamente, coloque o mouse em um limitador de acesso dorsal com restrição mínima. Aqueça a cauda do rato por 1 min delicadamente segurando-a com um pedaço de gaze umedecida em água morna. Permitir mouse para reposicionar, se necessário. Seque a cauda com um lenço de papel para secar.
- Alternativamente, rato quente, colocando a gaiola sob uma lâmpada de calor para não mais de 2 min. Se estiver usando uma lâmpada de calor, tenha cuidado para evitar o superaquecimento do mouse.
- Grande volume de injecção na veia da cauda
- Imobilizar um acesso restrainer dorsal sobre uma superfície plana por fita laboratório.
- Segurando pela cauda, coloque o mouse suavemente para o limitador e insira a ficha. Usar a menor quantidade de retenção como necessário para manter a cauda imobilizada. Certifique-se de que o mouse está respirando livremente.
- Se o mouse está em perigo grave a qualquer momento durante o procedimento, remova o mouse do limitador imediatamente e deixe-a descansar.
- Posicione o mouse parauma das veias caudal lateral é visível. Localizar as veias caudais laterais pelo olhar directamente para baixo, para a parte traseira do rato: a linha vermelha em execução no meio da cauda é uma artéria, enquanto que as linhas azuis em ambos os lados da cauda são as veias caudais laterais.
- Limpe a cauda do rato cuidadosamente com um algodão embebido em álcool.
- Usando a mão não injetáveis, segure a cauda com força entre os dedos indicador e médio, de modo que a cauda passa sob o dedo indicador, mais de meio e terceiro dedos e sob o dedo mindinho. Permitir que o polegar para permanecer livre para se mover. (Figura 1A)
- Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque.
- Pegue a seringa carregada com a mão-de injecção e segurá-la por barril entre o polegar e os outros quatro dígitos. Não se agarre o êmbolo.
- Colocar a seringa de paralelo para a cauda com a agulha apontando para o corpo do rato eo bisel (borda inclinada) da agulha virado para cima.
- Insira a agulha na veia da cauda. Continuar com a injecção apenas se a veia está localizada correctamente, o que é evidente a partir da agulha deslizante em qualquer resistência. Note-se que a profundidade de inserção da agulha é uma matéria de preferência pessoal no entanto, a inserção completa não é recomendada devido a um risco aumentado de ruptura da veia. Evite mover a agulha.
- Usando o polegar da mão-holding cauda, fechar-se no centro da agulha e pressione hub contra a cauda para manter a agulha na posição. Não aplique pressão extrema e não se apegar eixo da agulha, como estes irão impedir o fluxo de líquido na veia. Segurar a cauda com o dedo indicador frouxamente neste ponto de modo a não impedir a injecção (Figura 1A).
- Re-posicione a mão segurando uma seringa de modo que o dedo indicador eo dedo médio estão segurando o flange eo polegar está na extremidade do êmbolo (Figure 1A).
- Pressionar para baixo sobre o êmbolo de um, um movimento contínuo e de injectar o volume total de líquido em 6-8 seg.
- Retire a agulha da veia e parar o sangramento aplicando pressão suave para a cauda com um tecido.
- Remover mouse do limitador e local rato em uma gaiola de recuperação colocado em cima de uma almofada de aquecimento (roupa de cama deve ser 37-38 ° C). Se a sala de injeção é frio, esta etapa é fundamental para a sobrevivência do mouse. Segure a cauda do rato até que o sangramento parar completamente.
- Observe o mouse por 1 hora após o parto DNA hidrodinâmico. Um período inicial de respiração ofegante e imobilidade é normal devido à arritmia temporária causada por HGD mas certifique-se que o rato mostra sinais de recuperação em cerca de 5 min. Se a respiração do mouse torna-se extremamente superficial, massageie suavemente o abdome do mouse para facilitar a respiração. Observam que a taxa de recuperação pode ser ligeiramente influenciada pela estirpe de ratinho utilizada.
- Voltar ratoa gaiola de habitação e garantir que o mouse tem uma abundante oferta de alimentos e água.
- Grande volume de injeção na veia da cauda usando uma posição alternativa mão
- Coloque o mouse no limitador e se preparar para injeção seguindo os passos 4.3.1 através 4.3.5, conforme descrito anteriormente.
- Descanse a mão não injetáveis em uma superfície plana, com quatro dedos dobrados em um ângulo de noventa graus. Os dedos (todos excepto o polegar) deve assentar em cima uns dos outros, criando uma plataforma. Segure a cauda do rato entre o polegar eo dedo indicador (Figura 1B).
- Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque.
- Agarrar a seringa com a mão-de injecção e segurá-la até ao rebordo e a extremidade do êmbolo, pronto para injecção.
- Conclua o procedimento, seguindo este protocolo a partir do passo 4.3.9 até a etapa 4.3.17, conforme descrito anteriormente.
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Representative Results
O posicionamento correcto da agulha na veia da cauda do rato (conforme ilustrado na Figura 1) é um pré-requisito para o sucesso de entregar um transgene através de transfecção à base de hidrodinâmica. Muitas vezes, a parte mais difícil da técnica, no entanto, é a retenção da agulha dentro da veia da cauda, sem movimento, de modo que todo o volume de injecção pode ser entregue dentro de um período de 6-8 s. Os pequenos erros durante o processo de injeção pode resultar em muito reduzida eficiência de transfecção e expressão da proteína. Portanto, é imperativo para monitorizar o sucesso da HGD para cada experimento. Se a proteína transgénica de interesse é de difícil detecção por Western blot, devido à falta de anticorpos sensíveis, como no caso de babuíno APOL-I, a eficácia da injecção pode ser monitorizada por co-injecção de um plasmídeo portador de um gene de uma proteína que é facilmente detectável. Na experiência apresentada na Figura 2, os ratinhos foram injectados com 50mg de um plasmídeo contendo um dos três genes diferencialmente 6xHis marcado APOL-I babuíno e 50 mcg de outro plasmídeo (mesmo design vetor de expressão), que estava transportando babuíno HPR (bHPR, não marcada). O principal objetivo deste trabalho foi avaliar se a adição de uma tag 6xHis nos locais escolhidos seqüência interfere com o processamento e secreção do babuíno APOL-I proteína correta. Se, no entanto, a adição do marcador perturba a dobragem correcta e, consequentemente, a secreção da proteína, torna-se difícil determinar se a perda de expressão da proteína ocorreu devido ao processamento auditivos ou vencida HGD. Além disso, devido à falta de anticorpos suficientemente sensível, a detecção directa do babuíno APOL-I no plasma de rato transfectada é difícil, mesmo no caso de uma entrega bem sucedida do gene (tal como determinado pela protecção de ratinhos contra um desafio tripanossoma humano infeccioso). Neste experimento, estas questões foram abordadaspela adição de uma quantidade equivalente de babuíno HPR plasmídeo para a mistura APOL-I HGD para servir como um controlo de injecção de substituto. Tal como demonstrado na figura, babuíno HPR foi altamente expressa no plasma de praticamente todos os ratinhos transfectados indica que o HGD foi bem-sucedida. Pequenas gotas nos níveis de expressão, como visto de um dos dois ratinhos do grupo I bAPOL-6xHis 1 Na Figura 2A, é geralmente atribuível a uma diminuição muito pequena (1-2 s) com velocidade de injecção. Na Figura 2B, a primeira amostra de plasma pista 1 (no grupo bAPOL-I 6xHis 3) mostra uma completa ausência de expressão de proteína, indicando um HGD falhou. Na maioria dos casos, isto é devido à injecção incompleta de todo o volume do veículo de entrega. Uma vez que esta experiência confirma o sucesso de HGD em todos os casos apenas um, o efeito de marcação na bAPOL 6xHis-I secreção pode agora ser avaliado por imunotransferência anti-6xHis (Figura 2C e D). Como pode ser vistona Figura 2D, o único grupo de ratinhos que tinham níveis detectáveis de proteína 6xHis-tag no seu plasma foi grupo 3. O padrão de expressão de proteínas dentro deste grupo confirmou que a injecção de um dos ratinhos neste grupo não foi bem sucedida. A completa falta de proteínas 6xHis detectáveis nos grupos 1 e 2 (Figura 2C) sublinha a importância da inclusão de uma proteína marcadora no mix de injeção para monitorar o sucesso do HGD. Sem considerar os níveis plasmáticos de bHPR (Figura 2A e B), os dados da Figura 2C e D pode ser facilmente interpretado como um fracasso de HGD nos grupos 1 e 2.
HGD bem sucedida do babuíno componentes TLF1 bAPOL-I e bHPR, dá camundongos resistência a parasitas Trypanosoma brucei brucei-SRA humanos infecciosa (BTB-SRA, um equivalente de laboratório de T. b. Rhodesiense) 40. Esta resistência é devida à expressão transgénica de bAPOL-I </ Em>, como a injeção de bHPR sozinho não oferece proteção contra parasitas humanos infecciosa. Para avaliar se as variantes 6xHis-marcadas de bAPOL-I são ainda capazes de funcionar como proteínas liticas, os ratos que receberam tanto bAPOL-I e bHPR por HGD foram desafiados com 5000 Tbb-SRA parasitas, dois dias após a entrega do gene. Como pode ser visto na Figura 3, os ratos no grupo de 6xHis 2 sucumbiu à infecção muito precoce, ao passo que a maioria dos murganhos dos grupos 1 e 3 sobreviveram, enquanto o controlo não marcado bAPOL-I positivo. (Baboon APOL-I confere proteção parcial em esta estirpe do mouse.) Uma vez que a expressão do transgene no grupo 2 foi universalmente elevada, a falta de proteção nestes ratos podem ser corretamente interpretadas como perda de bAPOL-I função lítica devido à tag 6xHis naquele posição. Cuidados devem ser tomados, no entanto, que o prematuro (dia 7) a morte de um rato dentro do grupo 3 não é mal interpretado, como este rato não foi injetado com sucesso com os transgenes (ver Fig.2B ure, pista 1). À luz dos dados combinados das Figuras 2 e 3, podemos concluir que bAPOL-I pode ser marcado na posição 3 (em grupo 6xHis 3), sem efeitos adversos, durante a marcação dessa proteína na posição 2 (em grupo 6xHis 2) interrompe a sua lítico função. No grupo 6xHis 1, enquanto que os dados são sugestivos de protecção do número de ratos era insuficiente para obter dados importantes. Análises de energia devem ser realizados para determinar o número de ratos necessários para cada experimento. Embora a falta aparente de proteína detectável no plasma do rato do grupo 1 pode parecer em contradição com o padrão de protecção visto na Figura 3, observar que um anti 6xHis western blot negativo neste grupo podem ser o resultado de uma falta de detecção, devido à transformação de proteínas, em vez do que a falta de expressão do gene. No grupo 1, a etiqueta 6xHis foi adicionado depois de fechar o local de clivagem do péptido de sinal previsto. O babuíno APOL-I sequência de aminoácidos contém um predicte adicionald sítio de clivagem proteolítica de cerca de 20 aminoácidos do local de clivagem do péptido de sinal 40. Portanto, é evidente que bAPOL-I nestes ratos é segregada e funcional, mas perdeu a marca 6xHis necessário para a sua detecção. Assim, ilustrando a importância de sua colocação tag.
APOL-I mata tripanossomas africanos, formação de poros na membrana do lisossoma parasita 36, 37. Variantes naturais de humano APOL-I, encontrados em pessoas com ascendência Africano recente, têm sido fortemente associada à doença renal em afro-americanos, embora, o mecanismo de lesão renal é ainda incerto 41, 42. Desde HGD resulta em maior expressão do gene no fígado, queríamos investigar se humano APOL-I ou a sua variante de sequência sintética provoca danos neste órgão. Para este fim, os ratos foram injectados com 50 ug de WT humana APOL-I ou de um único mutante sintético de aminoácidos designada umas K4.To avaliar danos no fígado, que mediram os níveis de plasma do rato coletados no dia 2 pós-injeção de aspartato transaminase (AST). Consistente com a sua função lítica, WT humana APOL-I causa uma elevação dos níveis séricos de AST (Figura 4A), em comparação com ratinhos injectados com soro fisiológico. Em contraste, a injecção de mutante K4, que difere em apenas um aminoácido, causado muito pouca libertação de AST. Diferenças na lesão do fígado é improvável que seja atribuível aos níveis de expressão de proteína, tal como os níveis da proteína K4 são equivalentes ou superiores às do WT humana APOL-I (Figura 4B). Exame de fígados de ratinhos HGD recolhidos 5 dias após a injecção, que mostra humano WT APOL-I causa a necrose de tecidos limitado à infiltração de macrófagos moderada (Figura 5B), em comparação com ratinhos injectados com soro fisiológico, que mostram a histologia do fígado normal (Figura 5A, as áreas de cor roxa) . Confirmando os dados obtidos pela medição dos níveis de plasma de AST, K4 injectadas no mesmo plasmídeo furodada como o WT mostra histologia hepática normal (Figura 5C).
Figura 1. Ilustração de posições das mãos para HGD. A.) Posição 1. Recomendada posição da mão para alcançar a velocidade máxima de injeção e para evitar o movimento da agulha após a injeção foi iniciada. A seta indica o movimento sugerido do polegar após a inserção da agulha no interior da veia. Polegar deve imobilizar a agulha segurando com cuidado o hub contra a cauda do rato. A mão, segurando a seringa tem de ser reposicionada para ser capaz de pressionar para baixo sobre o êmbolo antes da injecção. B.) Posição 2. Esta posição é recomendado se a injecção na veia da cauda deve ser realizada mais perto da base da cauda devido a injecções repetidas. Uma vez que a agulha é inserida na veia, esta posição da mão não precisa de peleajustes Ther.
Figura 2 análise de Western blot de plasma coletado de cinco semanas de idade, do sexo feminino, a Swiss Webster (SW) camundongos injetados com uma mistura de dois plasmídeos distintos:. 50 mg babuíno HPR e 50 mg de diferencialmente 6xHis marcado genes babuíno APOL-I. Os ratinhos foram injectados com veículo de solução salina como controlo negativo. Para confirmar o sucesso de HGD, este experimento mostra os níveis plasmáticos circulantes do babuíno proteína HPR, como babuíno APOL-I é difícil de detectar. As amostras de plasma de rato foram recolhidos os níveis de expressão de dois dias pós HGD e de proteína foram analisados por Western blot (plasma diluído 1:20) em 10% de Tris-Glicina a géis de poliacrilamida desnaturantes, sob condições não redutoras. HPR foi detectada utilizando um anticorpo policlonal de coelho contra a haptoglobina humana (HP), o qual também recognizes babuíno HPR. Tagged bAPOL-I foi detectada usando um anticorpo policlonal de coelho contra um tag 6xHis. Os pesos moleculares das proteínas de controlo 6xHis incluídos são 40 e 50 kDa. A.) Painel mostra um exemplo de análise Western blot de uma proteína segregada (HPR), quando todos os ratinhos num grupo foram injectados com sucesso. Note-se a expressão da proteína uniformemente no segundo grupo marcado com His (bAPOL-I 6xHis Grupo 2), em que a injecção foi altamente bem sucedida. No primeiro grupo (I-bAPOL 6xHis Grupo 1), a expressão de proteínas a partir de um dos ratos é importante, mas um pouco reduzida, provavelmente devido a uma redução da velocidade de injecção. Painel B.) mostra um exemplo de níveis de expressão de proteína, quando uma das injecções (em bAPOL-I 6xHis Grupo 3) foi bem sucedido. Painel C) demonstra a importância da inclusão de uma proteína de marcador (bHPR) para monitorizar o sucesso de HGD quando a detecção da proteína de interesse (bAPOL-I) é incerto. Apesar do sucesso confirmado de HGD em bAPOL-I
Figura 3. Sobrevivência de ratos que expressam babuíno variantes APOL-I 6xHis e babuíno HPR. Cinco semanas de idade, fêmea, Swiss Webster ratinhos receberam 50 ug de cada um dos dois plasmídeos separados por HGD na mesma mistura de injecção. Os ratinhos utilizados nesta experiência correspondem ao plasma analisado na figura 2. No dia 2 pós-injecções, os ratinhos foram infectados com 5000 parasitas infecciosos humanos Tbb-SRA e a parasitemia foi monitorizada. Quando a parasitemia atingiu 10 9 parasitas / ml, os ratinhos foram sacrificados. A sobrevivência foi significativamente diferente do controle salina onde indicado (* - P <0,05, log-teste rank). Rato sobrevivência após desafio com o parasita é um exemplo de como o sucesso de HGD influencia os dados obtidos a partir de experiências posteriores. Quando babuíno APOL-I é injectado com sucesso, o produto do gene é excretado no rato no sangue, onde ele é tomado pelos humanos e mata tripanossomas-infeccioso. A curva de sobrevida mostra que os ratos injetados com a tag 6xHis versão 3 do babuíno APOL-I foram significativamente protegidos contra Tbb-SRA. A única morte prematura neste grupo corresponde ao ratinho que não foi injectado com sucesso com o plasmídeo contendo o transgene (ver Figura 2). Este rato devem ser excluídos da análise de sobrevivência como a sua sobrevivência após o desafio parasita não é atribuível a diferenças do transgene recebidas, mas para o fracasso da entrega do gene.
Figura 5. Uma substituição única de aminoácidos nas APOL-I sequenciar os resultados em diferentes níveis de patologia do tecido. A figura mostra os fígados dos ratos que receberam injecções de SW hidrodinâmicas de um veículo salino (A), 50 ug humano WT APOL-I (B), ou 50 mg de uma variante mutante sintético de APOL-I, K4 (C). Os fígados foram removidos no dia 5 pós-injeção e processados para hematoxilina e eosina. Exemplos representativos são mostrados do mesmo ratinhos ensaiados para níveis de AST na Figura 4. Painéis (DF) mostram outros exemplos de áreas danificadas em ratinhos WT. Focos de necrose em painéis (B), (DF) são marcadas com retângulos pretos e são ampliadas. Setas brancas nestes painéis apontam para áreas de infiltração de macrófagos. Para efeitos de comparação, Tecido normal a partir de uma área representativa de fígado de um ratinho com injecção de veículo salino é marcada por um rectângulo a luz azul e também é aumentada. Os painéis (B) e (D) são imagens representativas do mesmo rato WT, enquanto que os painéis (E) e (F) são de dois ratinhos WT diferentes.
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Discussion
Quando realizada corretamente, HGD é um meio extremamente eficaz e segura de entrega transgene. Os passos críticos para o sucesso do HGD são: 1) fornecer a quantidade certa de ADN em um grande volume de veículo salino 2) na veia da cauda do rato 3) em menos de 8 segundos.
Embora o próprio processo de injecção inegavelmente requer alguma destreza manual, o sucesso deste procedimento de seis segunda encontra-se frequentemente em uma preparação cuidadosa da experiência. A quantidade de ADNp necessário para conseguir a expressão do gene máxima pode variar muito, dependendo do plasmídeo utilizado e o gene a ser expresso, por conseguinte, a quantidade óptima de ADN a ser injectado devem ser determinadas experimentalmente para cada aplicação. Para ratos, a faixa DNA recomendado em geral é 5-50 mg, além de que a expressão do gene pode atingir um platô. Em nossas mãos, a injeção de 50 mg pRG977 transportando tanto a APOL-I ou gene HPR leva a altos níveis de circulating níveis de proteína nos dois primeiros dias após a HGD. Os níveis sanguíneos de ambas as proteínas diminuir significativamente ao longo dos próximos dois dias, até que os níveis de proteína cair abaixo de níveis detectáveis ao redor do 10 º dia (38 e dados não publicados). A quantidade óptima de DNA deve ser entregue numa solução fisiológica equivalente a 8-12% do peso do corpo do rato 1, 2. Embora a maioria dos investigadores, como nós, utilizar solução salina como o veículo de injecção, solução de Ringer foi usado para HGD com sucesso similar 2. Note-se, que embora não seja necessária a realização de HGD num ambiente estéril, é imperativo, para evitar a contaminação com endotoxinas da solução de injecção ao longo do procedimento. Para este fim, a solução salina utilizada para as injecções devem ser de pureza superior, e o ADN a ser injectado deverá ser preparado usando um kit disponível comercialmente que remove endotoxina. Outro passo importante é a preparação cuidadosa ponderação dos ratos. Uma vez que ovolume de injeção é de um dos aspectos críticos de sucesso HGD, é importante ter certeza de que o mouse não é nem sub-dosado nem over-tratados com solução salina. Os resultados anteriores de erro na transfecção de qualidade inferior, enquanto o último na possível morte do animal. Para garantir ainda mais a segurança dos animais, recomendamos carregar as seringas com agulha de pequeno calibre para evitar a introdução de bolhas de ar pequenas que são difíceis de se livrar. HGD deve ser realizada com um 27 - agulha de calibre, tal como descrito no protocolo.
Injeção correta é muito facilitada se as veias caudais são claramente visíveis. Dilatando os vasos sanguíneos por aquecimento suave do mouse pode ajudar a visualização das veias se um limitador com um rabo-iluminador não está disponível. Colocar a gaiola do rato sobre uma almofada de calor por alguns minutos ou segurando a cauda com um trabalho pano molhado quente bem em nossas mãos. Se estiver usando uma lâmpada de calor, deve-se ter muito cuidado para não superaquecer os ratos. Nós achamos que nósing uma lâmpada de calor faz com que o estresse desnecessário camundongos e desconforto e, portanto, deve ser evitado. Limpando a cauda com 70% de etanol ainda ajuda a visualização, aumentando o contraste entre a veia da cauda e a pele. Este passo é também crítica para evitar a contaminação bacteriana durante a injecção. Uma vez que o rato é preparado para injecção, a veia da cauda pode ser injectada utilizando qualquer uma das posições da mão descritos neste protocolo. Note que enquanto que a posição 2 parece mais fácil e mais simples, pode ser mais difícil de injectar o volume total de líquido, sem mover a seringa. Por outro lado, estabelecer uma boa posição da agulha usando o primeiro método é mais complicado no entanto, uma vez que o hub agulha é firmemente mantida contra a cauda, injeção raramente falha. O primeiro método é também recomendado para a velocidade máxima, apesar de transfecção de sucesso é possível usando a posição da mão.
A velocidade de injecção recomendado HGD em ratinhos é de 6-8 segundos, emboramuitos autores sugerem que as injeções mais rápidas produzir resultados ainda melhores 1, 12. Resultados injecção lenta na expressão gênica acentuadamente reduzida. No entanto, a razão mais comum para uma completa falta de expressão do gene é a incapacidade de fornecer o volume máximo de injeção. Isto ocorre quando a agulha é deslocada, após a injecção foi iniciado. Posicionada corretamente, a agulha entra na veia sem resistência. Para verificar que a agulha é inserida na veia correctamente, pode-se injectar uma quantidade muito pequena (100 ul) de líquido para dentro da veia, antes da injecção completo. Se você pressionar o êmbolo encontra-se com extrema resistência, a agulha estiver na posição errada e que o líquido está entrando no tecido cauda. Se a agulha deixa a veia no meio da injeção, a correção da HGD vencida pode ser tentada após o mouse foi autorizado a descansar por um par de horas. Re-injeção após o descanso insuficiente causa sofrimento para o mouse e pode resultar em perda de pressur hidrodinâmicoe, abrindo a primeira ferida na cauda do rato. Se as injecções repetidas são necessárias, o rato pode ser injectado com o volume total de solução salina (e quantidade de ADN) ou para mais perto da base da cauda, na mesma linha ou na veia contralateral. Seguindo HGD, o rato deve observar-se numa gaiola colocada sobre uma almofada de aquecimento durante pelo menos uma hora. HGD provoca um nítido aumento da pressão intravascular, resultando em uma irregularidade aguda da função cardíaca, dilatação do fígado, e uma perturbação dos poros da membrana de células do fígado, sinusóides e fenestrações 12, 14, 43. Apesar da duplicação do seu volume de sangue em alguns segundos, ratos tolerar HGD muito bem. O ritmo cardíaco volte ao normal em 2 min e a pressão intravascular, o que diminui rapidamente logo após a injecção, se aproxima de níveis basais em 3 min 12, 43. Os hepatócitos interrompidas feche em menos de 2 min e do tamanho do fígado retornos expandidasao tamanho normal em 30 min seguido da recuperação da função senoidal em cerca de 24 horas 43. Embora muitos pesquisadores usam anestesia com sucesso, em nossas mãos, anestesia isoflurano exacerba o desconforto respiratório de ratos devido a HGD. Nós achamos que os ratos anestesiados levar mais tempo para se recuperar e, ocasionalmente, requerem ressuscitação para a sobrevivência. Se a injeção de um grande grupo de ratos usando anestesia, pode ser necessário ter uma pessoa adicional na sala dedicada a supervisionar o bem-estar dos animais em recuperação. Sem anestesia, mesmo após injecções repetidas, sobrevivência do ratinho é de 100% e o tempo de recuperação é inferior a 5 minutos.
O protocolo aqui descrito pode ser usado para fornecer uma ampla variedade de moléculas para o fígado do rato. Usando a proteína secretada APOL-I, como um exemplo, mostramos como HGD podia ser usado para estabelecer um modelo de ratinho e estudar a função de uma proteína de protecção. Ao comparar a função de vários produtos de genes, o success do HGD deve ser avaliada sempre que possível. Para as proteínas segregadas, que é fácil de monitorizar os níveis de expressão por análise de plasma de rato utilizando Western blot (Figuras 2 e 4B.) É particularmente importante para garantir o sucesso de HGD quando ensaiando as variantes naturais ou sintéticas, de uma proteína terapêutica, tal como a eficiência da transfecção pode influenciar gravemente a evolução da doença (Figuras 2 e 3). Os exemplos são apresentados para mostrar como este método pode ser expandido para analisar os danos do fígado causada por apolipo, que é uma proteína de formação de poros (Figuras 4 e 5). Seqüência de variantes de APOL-I no mesmo plasmídeo resultado fundo em marcadamente diferentes perfis de danos. Isto sugere que os danos do tecido está associada com a função da proteína e não o vector de expressão ou o trauma da própria injecção. Deve notar-se que, nas nossas mãos, níveis de AST são universalmente alta no dia 1 pós-injecção (dados não mostrados). No dia 2, no entanto, os níveis de AST de ratos emprojetada com solução salina de retorno ao normal e as diferenças entre as variantes do gene são facilmente discernível (Figura 4). Pelo dia 3 após a injecção, AST medido em todos os tratamentos de retornar ao seu nível basal (dados não mostrados). Como o tecido necrosado e inflamação no fígado são evidentes mais do que um aumento transitório na AST, danos no fígado devido à expressão de genes sustentada pode ser avaliada de forma mais confiável, embora qualitativamente, através da coloração dos fígados coletados no dia 5 pós-injeção. Os exemplos dados mostram que as variantes de APOL-I, que causam um aumento da liberação de AST 2 dias pós-injeção também resultar em danos ao fígado mais sustentado, avaliada pela coloração com hematoxilina e eosina.
Entrega de genes hidrodinâmico permite a rápida análise da expressão do gene in vivo. Ela exige uma construção simples do gene em estudo em um vector de expressão eucariótica e a capacidade de realizar a injecção, como descrito acima. Geração de transgenic ratinhos utilizando outras formas de entrega de genes, tais como vectores lentivirais recombinantes derivadas de HIV-1 recombinantes ou vectores virais adeno-associados, exigem muito mais especializado perícia. No entanto, sua vantagem é sustentada a expressão do gene, embora a expressão do gene viral muitas vezes provoca uma resposta inflamatória devido ao acolhimento sentindo uma infecção viral e respondendo 15-19. Além disso, os vectores virais possuem uma capacidade limitada de embalagem e, por conseguinte, são limitados em tamanho do gene, enquanto que BAC de 150 kb têm sido utilizados com sucesso em HGD 4. Depois de dominar esta técnica, o utilizador pode transfectar qualquer ácido nucleico (ADNc ou ADNg ou ARN) in vivo e acompanhar a produção de proteínas e as consequências biológicas. A proteína pode ser intracelular, extracelular ou ligada a membranas; pode-se, assim, o nível de ácido amino marcado ou alterações no ácido nucleico e. Mais importante ainda, esta é uma técnica muito simples e rápida.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) para, inicialmente, nos ensinando a técnica HGD e Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine), por sua orientação contínua em vários aspectos da tecnologia. Este trabalho foi financiado pelo Hunter College, CUNY arranque fundos e prêmio NSF Pão IOS-1249166. Agradecemos o apoio Grant NYULMC Histopatologia Núcleo NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para histologia em fígado de camundongos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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