Summary
В естественных условиях трансфекции голой ДНК по доставке гидродинамического гена вводит генов в ткани животного с минимальными воспалительной реакции. Достаточное количество продукта гена генерируются таким образом, что функция гена и регулирование, а также структура и функции белка могут быть проанализированы.
Abstract
Эффективное выражение трансгенов в естественных условиях имеет решающее значение в изучении функции генов и разработке методов лечения заболеваний. За последние годы, доставка гидродинамическая ген (HGD) стала простым, быстрым, безопасным и эффективным методом для доставки трансгенов в грызунов. Этот метод основан на силы, создаваемой быстрой инъекции большого объема физиологического раствора, чтобы увеличить проницаемость клеточных мембран перфузии органов и, таким образом доставки ДНК в клетки. Одним из основных преимуществ HGD является возможность вводить трансгенов в клетках млекопитающих с использованием обнаженной плазмидной ДНК (плазмидной). Представляя экзогенный ген с помощью плазмиды, минимально трудоемким, высокой эффективностью и, в отличие от вирусных носителей, удивительно безопасным. HGD изначально предназначался для доставки генов в организм мышей, в настоящее время используется для доставки широкого спектра веществ, в том числе олигонуклеотидов, искусственных хромосом, РНК, белков и малых молекул в мышей, крыси, в ограниченной степени, другие животные. Этот протокол описывает HGD у мышей и фокусируется на трех ключевых аспектах метода, имеют решающее значение для выполнения процедуры успешно: правильно введения иглы в вену, объем инъекции и скорость доставки. Приведены примеры, чтобы показать применение этого метода к временной экспрессии двух генов, которые кодируют секретируемые, приматов-специфических белков, аполипопротеина Л.И. (APOL-я) и гаптоглобина, связанных белка (HPR).
Introduction
С момента своего первого описания по Лю и др.., И Чжан и др.., Доставка гидродинамическая ген (HGD) стала бесценным инструментом для изучения функции генов в грызунов модельных систем 1, 2. Методика включает в быстрой инъекции (5-7 сек) большого объема (8-12% массы тела) раствора в хвостовую вену мышей, чтобы облегчить поглощение плазмидной ДНК на клетках органов-мишеней 1, 2. Эти условия приводят к надежной экспрессии генов в печени и менее экспрессии генов в почках, селезенке, легких и сердце.
Инъекция 10 мкг PCMV-LacZ плазмиды могут трансфекции целых 40% гепатоцитов, что делает HGD наиболее эффективным, невирусный, в естественных условиях способ доставки гена на сегодняшний день 1. В отличие от вирусных носителей, пДНК легко приготовить, не вызывает иммунного ответа у хозяина грызунов 3 и не представляют опасности для здоровья по рекомбинации с концаogenous вирусы. Кроме того, поскольку молекулы ДНК, поставляемые HGD не нужно упаковывать, этот метод подходит для доставки бактериальных искусственных хромосом (BAC) такого размера, как 150 кб 4. Другие типы молекул, которые были завезены гидродинамического способа включают РНК 5-10, Morpholinos 11, белки, 12, 13 и другие малые молекулы 12, 14. Преимущества и недостатки HGD по сравнению с другими методами доставки были обсуждены в превосходных отзывов в литературе 15-20 и ряд авторов предоставили подробное описание процедуры 21-23.
Представляя трансгены в мышах HGD является безопасным и эффективным 1-3, 24 и метод был использован у крыс с сопоставимой успеха 25. С некоторыми изменениями, доказательство правильности концепции эксперименты были проведены в кур 26, Раббиты 27 и свиней 28, хотя, естественных применение в этой техники в более крупных животных остается проблемой. При использовании этого метода, еще одним распространенным ограничением является то, многие из доступных векторов экспрессии млекопитающих не хватает компонентов для достижения постоянного, высокий уровень экспрессии генов. Использование плазмиды экспрессии генов, PCMV-Luc в органы-мишени, очевидно еще в десять минут после HGD, однако, первоначальный, высокий уровень экспрессии резко падает в течение первой недели после инъекции 1. Долгосрочный трансгенная экспрессия можно в зависимости от промоутера и интрона, используемого в плазмиды конструкции 3, 24 однако, поддержание экспрессии генов высокого уровня часто требует повторных инъекций. По этой причине, HGD может быть менее пригодны для изучения хронических заболеваний, которые являются результатом долгосрочного воздействия повреждающих белки или белковые продукты. С учетом этих ограничений, HGD является исключительно мощным инструментом для изучения роциала роль гена и эффект от него мутантов в естественных условиях, а также терапевтических эффектов и регулирования белков и для установления животных моделях болезни (для обзора см. 15). Например, HGD могут быть использованы, чтобы назначить функцию для доменов и аминокислот белков по отдельности введения различных генных конструкций в мышей, которые имеют соответствующие гены нокаут. Кроме того, этот метод может быть использован в любой штамм мыши.
Этот протокол описывает HGD у мышей с акцентом на технических аспектах, необходимых для достижения успешного трансфекции: правильно введения иглы в вену, объем впрыска и скорости доставки. Применение этого метода продемонстрирована на мышиной модели африканского трипаносомоза, смертельной болезни людей и скота 29, 30. В то время как несколько видов трипаносом вызывают заболевания у скота, большинство из них не может вызвать заболевание у человека в связи с врожденной иммунной комплексы в бLOOD называемые трипаносомная литические факторы (ФЦН) 29, 31, 32. Эти порообразующие, липопротеины высокой плотности (HDL) содержат два уникальных, приматов-специфических белков. HPR, лиганд, который облегчает поглощение ФЦН в трипаносом, и APOL-I, литический компонент 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense способен инфицировать людей в связи с выражением сопротивления связанных сывороточного белка (SRA), который связывается с и нейтрализует человеческий APOL-I 34, 39. Бабуин TLF не нейтрализуется SRA из-за его расходящихся APOL-I белка 40. Как сообщалось ранее, с использованием вектора экспрессии млекопитающих (pRG977), трансгенных выражение павиана компонентов TLF у мышей обеспечивает защиту против человека-инфекционный трипаносом 40. Представительные данные, представленные здесь продемонстрировать, как доставка гидродинамическая ген может быть применен для изучения терапевтические эффекты белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные здесь, были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Хантер-колледже, Городского университета Нью-Йорка.
1. Подготовка эндотоксинов ДНК плазмиды
- Выбрать одну колонию бактерий, содержащих нужный ген в экспрессирующий вектор млекопитающего с прожилками недавно селективной пластины.
- Следуйте рекомендациям, найденные в справочнике коммерчески доступного эндотоксинов очистки плазмиды комплект для выращивания и сбора урожая бактерии.
- Очищают эндотоксина плазмидной ДНК из бактериальных клеток, следуя протоколу коммерчески доступного эндотоксинов набора для очистки плазмид.
- Используйте эндотоксина без пластиковую посуду и обрабатывать ДНК с осторожностью, чтобы гарантировать, что эндотоксина повторно не вводят в образце ДНК после стадии удаления.
- Измерение концентрации эндотоксинов плазмидной ДНК путем определения его оптическую плотность при 260 нм с использованием MICRо-объем УФ спектрофотометра, как описано ниже, или стандартный, кювета на основе спектрофотометра.
- Очистите нижнюю и верхнюю оптические поверхности микро удерживающей системы образца спектрофотометр следующим образом. Пипетка 1 мкл чистой деионизированной воды на нижнюю оптической системы. Закройте рычаг и нажмите его несколько раз купаться верхнюю оптическую систему, затем откройте рычаг и протрите чистой тканью.
- Откройте программное обеспечение микро спектрофотометра и выберите нуклеиновой модуль кислот.
- Поместите 1 мкл чистой деионизированной воды на нижней оптической системы, снизить рычаг и выберите пункт "инициализировать" с помощью программного обеспечения программы. После завершения инициализации, чистые и оптические поверхности с ткани ..
- Выполните измерение бланка путем загрузки 1 мкл эндотоксина свободной ТЕ-буфера (10 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и выбрать "пустой" с помощью программного обеспечения программы. После того, как измерение бланка делается, чистые и оптические поверхности сткани.
- Выполните измерение образца путем загрузки 1 мкл эндотоксина образца ДНК и выбрав «меры» с помощью программного обеспечения программы. Запишите концентрацию ДНК. Оценить чистоту ДНК путем записи соотношение поглощения 260/280 нм, которая появляется на экране. Поскольку использование чистой ДНК (260/280 отношение 1,8) в течение HGD весьма желательно избегать использования образец ДНК с соотношением 260/280 ниже 1,7. После того, как измерение производится, очистить оба оптических поверхностей с тканью.
2. Взвешивание мышей
- Марк мышей в манере, подходящей для деформации. Примечание: маркировка хвоста не рекомендуется для этой процедуры.
- Все виды мыши, которые имеют белый мех (например Швейцарский Webster) на спине с черным маркером. Повторно знаки с течением времени по мере необходимости.
- Виды Марк мыши, которые имеют черный мех (например C57BL / 6) на слух пробивая несколько дней заранее.
- Взвесьте мышей индивидовLLY, осторожно ставя их в чашку весов животного или ведро помещается на цифровой лабораторных весах. Запись веса каждой мыши, используемой в эксперименте, в день эксперимента.
3. Подготовка шприцев
- Приготовление раствора для инъекций
- Рассчитайте количество ДНК, необходимую при условии, 5 - 50 мкг эндотоксина свободной ДНК плазмиды для введения каждой мыши.
- Определить оптимальное количество ДНК плазмиды экспериментально.
- При определении количества ДНК, необходимую, предположим, инъекцию одного дополнительного мыши на группу, как собственно загрузка шприцев потребует некоторого дополнительного впрыска смеси. Чтобы помочь расчеты, рассмотрим следующий пример: вводить 4 экспериментальных и 4 контрольных мышей, каждая из которых весит 25 г, 50 мкг ДНК плазмиды на мышь. Чтобы определить количество ДНК, необходимую в этом случае рассчитать с 5 мышей в каждой группе: 5 х 50 = 250 мкг мкг ДНК необходимы для каждой группы.
- Определить количество физиологического раствора (0,9% хлорид натрия), необходимую при условии, 10% от массы тела для инъекции каждой мыши.
- Согласно приведенному выше примеру, вводить каждый 25 г мышь с 50 мкг плазмидной ДНК в 2,5 мл физиологического раствора (2,5 г жидкости).
- При определении количества физиологического раствора, необходимого для всей группы мышей, предположим, инъекцию дополнительного мыши на группу для обеспечения надлежащего погрузки шприцев. Принимая во внимание данный эксперимент, вычислить количество физиологического раствора, необходимого для 5 мышей в каждой группе: 5 х 2,5 мл = 12,5 мл физиологического раствора для каждой группы (или 25 мл всего). Примечание: Если мыши в пределах одной группы не совпадают вес (разница в массе тела более 10%), подготовить впрыска смеси в отдельности.
- Используйте консервантов и эндотоксинов, стерильный физиологический раствор, который был одобрен для использования человеком, в 10 мл, несколько флаконов использования.
- Использование 20-иглы (0.9 мм х 25 мм), прикрепленный к Luer-Lock оконечности 20 мл шприц,вывести жидкость из соленых флаконах и пустые шприцы в 50 мл коническую трубку. Чтобы помочь пипетки физиологического раствора в процессе подготовки ДНК-солевой смеси для инъекций, физиологический раствор собирают больше, чем необходимо для инъекции всех мышей в эксперименте. Для приведенного выше эксперимента, снять физиологический раствор от 3, 10 мл флаконы (в общей сложности около 30 мл), даже если рассчитанное количество физиологического раствора, необходимое для эксперимента находится всего в 25 мл.
- Внесите расчетное количество ДНК в другую 50 мл коническую трубку. Будьте осторожны, не прикасайтесь к рабочей стороне трубы с телом пипетки, чтобы избежать введения эндотоксина. Согласно примеру, пипетки 250 мкг управления и 250 мкг экспериментальной плазмидной ДНК в отдельных конических труб.
- Добавить требуемое количество физиологического раствора с ДНК с использованием серологические пипетки. Учитывая образец эксперимент, пипетки 12,5 мл физиологического раствора к каждому из мастер-смеси (экспериментальное и контроль).
- Разрешить все решения, чтобы достичькомнатной температуры перед инъекцией.
- Рассчитайте количество ДНК, необходимую при условии, 5 - 50 мкг эндотоксина свободной ДНК плазмиды для введения каждой мыши.
- Подготовка шприцев
- Для каждой мыши, заполнить стерильный, 3 мл, Luer-Lock шприц с ДНК-солевой смеси, используя стерильный, 20-иглы (0,9 мм х 25 мм). Позаботьтесь, чтобы избежать воздушных пузырей. Не следует использовать более высокие объемные шприцы как скорость потока инъекции не может управляться очень хорошо, и трудно манипулировать большими шприцы в одной руке. Извлеките лишнюю смесь ДНК-солевой обратно в конической трубе, как это может быть использована повторно.
- Переключите иглу в стерильный, 27-иглы. Заполните иглу с жидкостью полностью без введения пузырьков воздуха. Настройка громкости ДНК-солевой смеси, рассчитанной на основе веса мыши.
- Не допускайте, чтобы без колпачков иглы коснуться любой нестерильный поверхность. При необходимости, иглы могут быть повторно ограничен использованием одной рукой технику: Место колпачок на плоской поверхности, вставить иглу, не держась крышки с другой стороны и нажмите увенчанный иглупротив твердой объекта обеспечения колпачок на иглу. Шприцы готовы к хвостовых вен инъекций.
4. Гидродинамический доставка ДНК
- Обратите внимание, что обезболивающие мышей может уменьшить жизнеспособность. Не выполняйте HGD в комнате, где слишком холодно, так как это также уменьшит жизнеспособность. Если комната имеет температуру окружающей среды 20 ° C или при использовании анестезии, поместите мышей на грелку при 37 ° C процедуры сообщению, чтобы избежать потери любых животных. При использовании анестезии, убедитесь, что рот и мордочка мыши находились в прямой видимости, а на площадку тепла и наблюдать мышь, пока она полностью не восстановится. Не отказывай в пищу или воду из мышей до HGD.
- Подогрейте мышей расширяют кровеносные сосуды.
- Поместите клетку мыши (с постельное белье включены) на площадку тепла в течение 5 мин, так что температура подстилки приблизительно 38-39 ° C. Температура должна быть достаточно низкой, чтобы держать мышей на тепловой площадку дляпродлен срок.
- С другой стороны, переместить мышь в фиксатор доступа спинной с минимальным ограничением. Теплый хвост мыши в течение 1 мин, осторожно держа его кусочком марли, смоченной в теплой воде. Разрешить мышь повторно положение, если это необходимо. Протрите хвост с ткани для просушки.
- Кроме того, теплый мыши, поместив в клетку под инфракрасной лампой не более чем на 2 мин. При использовании тепла лампы, проявлять осторожность, чтобы избежать перегрева мыши.
- Большой объем инъекции в хвостовую вену
- Обездвижить Restrainer доступа спинной на плоской поверхности с помощью лабораторного ленты.
- Проведение за хвост, поместите курсор мягко в фиксатор и вставьте вилку. Используйте как можно меньше сдержанность по мере необходимости, чтобы держать хвост обездвижен. Убедитесь, что мышь свободно дышать.
- Если мышь находится в тяжелой беде в любой момент во время процедуры, удалите мышь от фиксатор сразу и дайте ему отдохнуть.
- Поместите мышь такодин из боковой хвостовой вены видна. Расположить боковые хвостовые вены, глядя прямо вниз в задней части мыши: красная линия работает в середине хвоста артерии, в то время как синие линии по обе стороны от хвоста боковые хвостовые вены.
- Протрите хвост мыши тщательно спиртовым тампоном.
- Использование неинъекционных руку, держать хвост плотно между указательным и средним пальцами, так что хвост проходит под указательным пальцем, над серединой и третьими пальцами и под мизинцем. Разрешить большой палец оставаться свободно перемещаться. (Рис. 1А)
- Использование другой стороны, протрите, который будет введен снова спиртовым тампоном. Разрешить области, чтобы высохнуть.
- Поднимите загружалась шприц с инъекционным рук и держите его за баррель между большим и четырьмя другими цифр. Не держите на поршень.
- Поместите шприц параллельно хвоста с помощью указывающего иглы в направлении корпусе мыши искос (косые края) иглы вверх.
- Вставьте иглу в хвостовую вену. Продолжайте инъекции только тогда, когда вены правильно расположен, что видно из иглы скольжения в без сопротивления. Обратите внимание, что глубина введения иглы является вопросом личных предпочтений, однако, полный вставки не рекомендуется в связи с повышенным риском стрижки вены. Избегайте перемещения иглы.
- Используя большой палец хвостовой-холдинг стороны, закрыть на ступице иглы и пресс-концентратор против хвоста провести иглу в положении. Не применять экстремальное давление и не удержать вала иглы, так как они будут препятствовать потоку жидкости в вену. Держите хвост с указательного пальца свободно на данный момент, чтобы не препятствовать инъекции (рис. 1А).
- Повторно установите шприц-держа за руку так, чтобы указательный палец и средний палец держат на фланец и большой палец находится на конце плунжера (Figurе 1А).
- Надавите на поршень в одном, непрерывного движения и придать полный объем жидкости в 6-8 сек.
- Удалить иглу из вены и остановить кровотечение, слегка надавливая до хвоста с тканью.
- Удалить мышь от Restrainer и место мыши в Восстановление клетке, помещенной сверху грелку (постельные принадлежности должны быть 37-38 ° С). Если в комнате впрыска холодно, этот шаг имеет решающее значение для выживания мыши. Держитесь за хвост мыши, пока кровотечение не остановится полностью.
- Соблюдайте мышь в течение 1 часа после родов гидродинамического ДНК. Начальный период тяжело дыша и неподвижности нормально из-за временного аритмии, вызванной HGD но убедитесь, что мышь показывает признаки восстановления в примерно 5 мин. Если дыхание мыши становится чрезвычайно мелкий, нежно массировать живот мыши, чтобы облегчить дыхание. Следует отметить, что скорость восстановления может быть слегка зависит от используемого штамма мыши.
- Вернуться мышижилищного клетке и убедитесь, что мышь имеет богатый запас пищи и воды.
- Большой объем инъекции в хвостовую вену с использованием альтернативного положение рук
- Наведите курсор на фиксатор и подготовить для инъекций, следуя пунктам 4.3.1 через 4.3.5, как описано выше.
- Наведите неинъекционных руку на плоской поверхности с четырьмя пальцами, под углом девяносто градусов. Пальцы (все, за исключением большого пальца) должна лежать поверх друг друга, создавая платформу. Держите хвост мыши между большим и указательным пальцем (рис. 1В).
- Использование другой стороны, протрите, который будет введен снова спиртовым тампоном. Разрешить области, чтобы высохнуть.
- Захватите шприц с инъекционным рук и держите его за фланцем и концом поршня, готовой для инъекции.
- Завершите процедуру, следуя этот протокол с шага 4.3.9 через шаг 4.3.17, как описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Правильное позиционирование иглы в хвостовую вену мыши (как показано на рисунке 1) является необходимым условием для успешного предоставления трансген по гидродинамике основе трансфекции. Часто наиболее сложной частью техники, однако, является сохранение иглы в хвостовую вену без движения так, чтобы весь объем инъекции могут быть доставлены в течение 6-8 с. Мелкие ошибки в процессе инъекции может привести к значительно сниженной эффективности трансфекции и экспрессии белка. Поэтому, крайне важно, чтобы контролировать успех HGD для каждого эксперимента. Если трансгенные интерес белок трудно обнаружить с помощью вестерн-блоттинга из-за отсутствия чувствительных антител, как и в случае бабуина APOL-I, эффективность инъекции могут быть проверены при совместной инъекции плазмиды, несущей ген белка, который легко обнаруживается. В эксперименте, показанном на фиг.2, мышам вводили 50мкг плазмидой, несущей один из трех дифференцированно 6xHis отмеченных бабуина гены APOL-I и 50 мкг другой плазмиды (же вектор экспрессии дизайн), который вез бабуина HPR (bHPR без тегов). Основная цель данного эксперимента заключалась в оценке не влияет ли добавление тега 6xHis в местах, выбранных последовательностей с правильной обработки и секреции бабуина APOL-I белка. Если, однако, добавление тега нарушает правильную укладку и, следовательно, секрецию белка, становится трудно определить, произошло ли потеря экспрессии белка из-за нарушения обработки или неудачного HGD. Кроме того, из-за отсутствия достаточно чувствительных антител, прямое обнаружение бабуина APOL-I в плазме мыши, трансфицированных трудно даже в случае успешной доставки генов (как определено защиты мышей против трипаносом вызов от человека инфекционный). В этом эксперименте, эти вопросы были рассмотреныпутем добавления эквивалентного количества бабуина HPR плазмиды к смеси APOL-I HGD служить в качестве суррогатного управления впрыском. Как показано на рисунке, бабуин HPR был экспрессируется на высоком уровне в плазме почти все трансфицированных мышей, указывающее, что HGD была успешной. Мелкие капли в уровней экспрессии, как видно на одном из двух мышей в bAPOL-I 6xHis группы 1 на фиг.2А, как правило, относится к очень небольшому снижению (1-2 ов) в скорости впрыска. В рисунке 2B, первый плазмы образца переулок 1 (в bAPOL-я 6xHis группе 3) показывает полное отсутствие экспрессии белка указывает на неисправный HGD. В большинстве случаев это происходит из-за неполного инъекции полном объеме средства доставки. Поскольку этот эксперимент подтверждает успех HGD во всех случаях, кроме одного, эффект 6xHis пометки на секрецию bAPOL-I теперь могут быть оценены по борьбе с 6xHis иммуноблота (рис. 2С и D). Как виднона фиг 2D, единственной группой мышей, которые обладали обнаруживаемыми уровн ми 6xHis-меченого белка в их плазме была группа 3. Белок паттерн экспрессии в этой группе подтвердили, что введение одного из мышей в этой группе был неудачным. Полное отсутствие обнаруживаемых белков 6xHis в группах 1 и 2 (рис. 2С) подчеркивает важность включения меченых белков в смеси впрыска контролировать успех HGD. Без учета плазменные уровни bHPR (рис. 2А и В), данные из фиг.2С и D легко могут быть неправильно истолкованы как провал HGD в группах 1 и 2.
Успешное HGD павиана компоненты TLF1 bAPOL-I и bHPR, дает мышам сопротивление человека инфекционных паразитов Trypanosoma brucei brucei-SRA (ТВВ-SRA, лаборатория эквивалент Т. б. Rhodesiense) 40. Это сопротивление из-за трансгенной экспрессии bAPOL-I </ EM>, как введение bHPR одиночку не обеспечивает защиты от человека инфекционных паразитов. Чтобы оценить, насколько варианты 6xHis-помеченных из bAPOL-я все еще в состоянии функционировать как литические белки, мыши, которые получили как bAPOL-I и bHPR по HGD заражали 5000 ТВВ-SRA паразитов через два дня после доставки генов. Как видно на рисунке 3, мышей в 6xHis группы 2 поддался инфекции очень рано, в то время как большинство мышей в группах 1 и 3 выжили тех пор, пока непомеченной bAPOL-I положительного контроля. (Бабуин APOL-я дает частичную защиту в этой линии мышей.) Так как трансген выражение в группе 2 был повсеместно высока, отсутствие защиты у этих мышей могут быть правильно интерпретированы как потеря литической функции bAPOL-I в связи с тегом 6xHis в том, что положение. Необходимо соблюдать осторожность, однако, что преждевременное (день 7) смерть мышей в группе 3, не неправильно, так как это мышь не была успешно вводили трансгенов (см. рисЮр 2B, полоса 1). В свете сочетании данных рисунках 2 и 3, заключаем, что bAPOL-я может быть помечен в положении 3 (в 6xHis группе 3) без побочных эффектов, в то время как маркировка этого белка в положении 2 (в 6xHis группы 2) нарушает его литическое функция. В 6xHis группе 1, а данные наводят защиты количество мышей было недостаточно, чтобы получить значимые данные. Силовые анализы должны быть выполнены, чтобы определить количество мышей, необходимых для каждого эксперимента. В то время как очевидное отсутствие обнаруживаемого белка в плазме мышей из группы 1, может показаться противоречивым образцу защиты показано на рисунке 3, обратите внимание, что отрицательный анти 6xHis вестерн-блот в этой группе может быть результатом отсутствия обнаружения из-за обработки белка, а чем отсутствие экспрессии генов. В группе 1, тэг 6xHis был добавлен близко после сайта расщепления предсказанного сигнального пептида. Бабуин APOL-I аминокислотной последовательности содержит дополнительный predicteд сайт протеолитического расщепления приблизительно 20 аминокислот из сайта расщепления сигнального пептида 40. Таким образом, очевидно, что bAPOL-I у этих мышей секретируется и функциональный еще потерял тег 6xHis необходимую для его обнаружения. Таким образом, иллюстрирующий важность его размещения тега.
APOL-я убивает африканские трипаносомы образованием пор в паразит лизосом мембраны 36, 37. Природные варианты человеческого APOL-I, найденные у людей с недавнего африканского происхождения, были тесно связаны с заболеваниями почек в афро-американцев, хотя, механизм повреждения почек пока неясно 41, 42. С HGD приводит к высшей экспрессии генов в печени, мы хотели исследовать, если человеку APOL-я или его синтетический вариант последовательности приводит к повреждению в этом органе. С этой целью мышам вводили 50 мкг человеческого WT APOL-I или одной аминокислоты синтетического мутанта назначенныйс K4.To оценить повреждение печени, мы измерили аспартаттрансаминазу (AST) уровни в плазме мышей, собранные на 2 день после инъекции. В соответствии со своим литической функции, WT человеческий APOL-I вызывает повышение уровней AST в сыворотке (фиг. 4а) по сравнению с инъецированных физиологическим раствором мышей. В противоположность этому, инъекция мутантного K4, который отличается только в одном аминокислоты, вызвало очень мало высвобождение AST. Различия в повреждения печени вряд ли будут связаны с уровнями экспрессии белка, как уровни белка K4 эквивалентны или выше, чем у WT человека APOL-I (рис. 4б). Исследование печени мышей собирали HGD 5 дней после инъекции показывает, что человеческий WT APOL-I вызывает некроз ограниченное ткани с умеренной инфильтрации макрофагами (фиг. 5B) по сравнению с физиологическим раствором вводили мышам, которые показывают нормальную гистологическую картину печени (5А, фиолетовый области) . Подтверждение полученных путем измерения уровней плазмы АСТ данные, К4 вводят в той же плазмиды Backgкруглый как WT показывает нормальную гистологическую картину печени (рис. 5C).
Рисунок 1. Иллюстрация положений рук для HGD. А.) Позиция 1. Рекомендуемое положение рук, чтобы достичь максимальной скорости впрыска и избежать движение иглы после инъекции была начата. Стрелка указывает предложенный движение пальца после введения иглы в вену. Большой палец должен обездвижить иглу, осторожно держа ступицу против хвоста мыши. Рука шприц следует вновь, чтобы иметь возможность давить на поршень до инъекции. Б) Позиция 2. Это положение рекомендуется при инъекции в хвостовую вену должны производиться ближе к основанию хвоста из-за повторных инъекций. После того, как игла вставлена в вену, это положение рук не нуждается в мехугие корректировки.
Рисунок 2 Вестерн-блот анализ плазмы собраны из пяти недельных, женщина, Швейцарский Webster (SW) мышей, которым вводили смесь двух отдельных плазмид:. 50 мкг бабуин HPR и 50 мкг дифференцированно 6xHis отмеченных бабуина гены APOL-I. Мышам вводили физиологический раствор с транспортного средства в качестве отрицательного контроля. Чтобы подтвердить успех HGD, этот эксперимент показывает, циркулирующие уровни плазмы белка бабуин HPR, как бабуин APOL-я трудно обнаружить. Образцы плазмы мыши были собраны уровни экспрессии 2 дня после HGD и белка анализировали с помощью вестерн-блоттинга (плазмы разводили 1:20) на 10% Трис-глицин полиакриламидном геле в денатурирующих, невосстанавливающих условиях. HPR был обнаружен с помощью кроличьих поликлональных антител против человеческого гаптоглобина (HP), которая также выздоровеетgnizes бабуин HPR. Tagged bAPOL-я была обнаружена с помощью кроличьих поликлональных антител против тега 6xHis. Молекулярные массы контролем 6xHis белки включены в 40 и 50 кДа. A.) Панель показан пример Вестерн-блот-анализа секретируемый белок (HPR), когда все мыши в группе вводили успешно. Обратите внимание на равномерно высокую экспрессию белка во втором His-меченого группы (bAPOL-I 6xHis группа 2), где впрыск была очень успешной. В первой группе (bAPOL-I 6xHis группа 1), экспрессия белка от одного из мышей известный, но несколько снижается, вероятно, из-за пониженной скорости инъекции. Б) панель показывает пример уровней экспрессии белка, когда один из инъекций (в bAPOL-I 6xHis группа 3) была неудачной. С) Панель демонстрирует важность включения меченых белков (bHPR) следить за успех HGD когда определение интересующего белка (bAPOL-I) является неопределенным. Несмотря на подтвержденный успех HGD в bAPOL-I
Рисунок 3. Выживание мышей, экспрессирующих бабуина варианты APOL-я 6xHis и бабуина HPR. Пять недельного возраста, женщины, Швейцарский Вебстер мыши получали 50 мкг каждого из двух отдельных плазмид HGD в том же смеси инъекции. Мыши в этом эксперименте использовали соответствуют плазме анализируемого на рисунке 2. На 2 день после-инъекций мышей инфицировали 5000 человека-инфекционный ТВВ-SRA паразитов и паразитемия контролировали. Когда паразитемия достиг 10 9 паразитов / мл, мышей умерщвляли. Выживание было значительно отличается от физиологического контроля, где указано (* - Р <0,05, лог-Тестовый ранг). Мышь выживание на паразита вызов является примером того, как успех HGD влияет данные, полученные из последующих экспериментах. Когда бабуин APOL-я успешно вводили, продукт гена секретируется в кровь мыши, где она, занимаемого и убивает человека-инфекционный трипаносомы. Кривая выживаемости показывает, что мыши вводили с 6xHis тега версии 3 бабуина APOL-я были значительно защищены от ТВВ-SRA. Единственное преждевременной смерти в этой группе соответствует мышь, которая не была успешно вводили в плазмиды, несущей трансген (см. рисунок 2). Эта мышь должны быть исключены из анализа выживаемости, как его выживание на паразита вызов не может быть отнесена к перепадам трансгена получены, но к провалу доставки генов.
Рисунок 5. Единственную аминокислотную замену в APOL-I последовательность результатов в разных уровнях ткани патологии. На рисунке показано, печени SW мышей, получавших инъекции гидродинамические солевым транспортного средства (а), 50 мкг человеческого WT APOL-I (B), или 50 мкг синтетического мутантного варианта APOL-I, K4 (C). Печень удал ли на день 5 после инъекции и обработаны для окрашивания гематоксилином и эозином. Типичные примеры приведены из тех же самых мышей анализировали на уровни AST на рисунке 4. Панели (DF) показать дополнительные примеры поврежденных областей в мышей дикого типа. Некроз очаги в панелях (B), (DF) отмечены черными прямоугольниками и увеличены. Белые стрелки в этих панелей указывают на области инфильтрации макрофагов. Для сравнения, Нормальная ткань из репрезентативной области печени соленого автомобиля с впрыском мыши отмечен голубым прямоугольником и также увеличены. Панели (В) и (D) являются представительными изображения с тем же WT мыши, в то время как панели (Е) и (F) из двух разных WT мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При правильном выполнении HGD является чрезвычайно безопасным и эффективным средством доставки трансгенов. Критические шагов к успешному HGD являются: 1) поставлять нужное количество ДНК в большом объеме физиологического транспортного средства 2) в хвостовую вену мыши 3) менее чем 8 сек.
Хотя сам процесс инъекции бесспорно требует ловкости рук, успех этого шесть-второй процедуры часто заключается в тщательной подготовке эксперимента. Количество пДНК необходимо для достижения максимальной экспрессии гена может значительно варьироваться в зависимости от плазмиды, использованной и экспрессируемого гена, следовательно, оптимальное количество ДНК, который будет введен должно быть определено экспериментально для каждого приложения. Для мышей, рекомендуемый диапазон ДНК в целом составляет 5-50 мкг, за которой экспрессия гена может достигают плато. В наших руках, инъекция 50 мкг pRG977 несущих либо APOL-I или ген HPR приводит к высоким уровням circulatinг уровни белка в первых двух дней после HGD. Уровень в крови обоих белков не уменьшится значительно в течение ближайших нескольких дней, пока уровни белка опускаться ниже обнаружению уровней вокруг 10-й день (38 и неопубликованных данных). Оптимальное количество ДНК должен быть доставлен в физиологическом растворе эквивалента до 8-12% от массы тела мыши 1, 2. В то время как большинство исследователей, в том числе нас, использовать физиологический раствор в качестве инъекции автомобиля, раствор Рингера был использован для HGD с сопоставимой успеха 2. Примечание, что, хотя она не является необходимым для выполнения HGD в стерильной среде, крайне важно, чтобы избежать эндотоксина загрязнения раствора для инъекций на протяжении всей процедуры. С этой целью использовали физиологический раствор для инъекций должны быть высшего чистоты и ДНК, который будет введен должны быть получены с использованием коммерчески доступного набора, который удаляет эндотоксин. Еще одним важным подготовительным шагом является тщательного взвешивания мышей. ПосколькуОбъем инъекции одного из важных аспектов успешного HGD, важно, чтобы убедиться, что мышь не является ни под-дозируется, ни избыточная вводили физиологический раствор. Бывшие ошибочные результаты неоптимального трансфекции, в то время как последние в возможной смерти животного. Для дальнейшего обеспечения безопасности животных, мы рекомендуем загрузке шприцы с малой иглой, чтобы избежать введения малых воздушных пузырьков, которые трудно избавиться. HGD должна быть выполнена с 27 - иглы, как описано в протоколе.
Правильное инъекции значительно облегчается, если хвостовой вены хорошо видны. Расширяя кровеносные сосуды на слабом нагревании мыши может помочь визуализации вены если фиксатор с хвостовым осветитель не доступен. Размещение клетку мыши на площадку тепла в течение нескольких минут или держа хвост с теплой, влажной тканью работы хорошо в наших руках. При использовании тепла лампу, нужно проявлять крайнюю осторожность, чтобы не перегреть мышей. Мы считаем, что намING тепловой лампу вызывает у мышей ненужного стресса и дискомфорта, и поэтому его следует избегать. Вытирая хвост с 70% этанола в дальнейшем помогает визуализация усиливает контраст между хвостовой вены и кожу. Этот шаг также имеет важное значение, чтобы избежать бактериального загрязнения во время инъекции. Как только мышь подготовлен к инъекции, хвостовую вену можно вводить с использованием либо одна из позиций руки, описанных в данном протоколе. Обратите внимание, что в то время как в положении 2 появляется легче и проще, это может быть более трудно вводить полный объем жидкости без перемещения шприца. В противоположность этому, создание хорошего положение иглы использовании первого способа является более громоздким однако, как только втулка иглы надежно удерживается на хвосте, инъекции редко терпит неудачу. Первый метод рекомендуется также для максимальной скорости, хотя успешно трансфекции можно, используя либо положение рук.
Рекомендуемая скорость HGD инъекции у мышей составляет 6-8 сек, хотямногие авторы полагают, что быстрее инъекции дают еще лучшие результаты 1, 12. Медленные результаты инъекций в заметно сниженной экспрессии генов. Однако наиболее распространенной причиной полного отсутствия экспрессии генов является неспособность предоставить полный объем инъекции. Это происходит, когда игла перемещается, после инъекции был инициирован. Правильно позиционируется, игла входит в вену без сопротивления. Чтобы убедиться, что игла правильно вставлен в вену, можно придать очень небольшое количество (100 мкл) жидкости в вену до полного инъекции. Если при нажатии на поршень встречается с наивысшим сопротивлением, игла находится в неправильном положении и жидкость выходит на хвост ткани. Если игла оставляет вены среднего впрыска, коррекция неудачной HGD можно попытаться после мышь была оставляют на пару часов. Обратная закачка после недостаточный отдых вызывает дистресс к мыши и может привести к потере гидродинамической давлене, открыв первый рану на хвосте мыши. Если повторные инъекции необходимы, мышь может быть введен при полном объеме физиологического раствора (и количества ДНК) или ближе к основанию хвоста в том же ключе или в контралатеральной вену. После HGD, мышь следует соблюдать в клетке, размещенной на площадку тепла в течение по крайней мере одного часа. HGD вызывает резкое увеличение внутрисосудистого давления, в результате чего под острым неравномерности функции сердца, расширение печени и нарушению поры мембраны клеток печени, синусоиды и fenestrae 12, 14, 43. Несмотря на удвоение своего объема крови в несколько секунд, мыши терпеть HGD на удивление хорошо. Отдача частоты сердечных сокращений снижается до нормального в 2 мин и внутрисосудистого давления, которое быстро падает вскоре после инъекции, подходы базальные уровни в 3 мин 12, 43. Разрушенные гепатоциты запечатать менее чем 2 мин и расширенных возвращается размеров печеник нормальному размеру в течение 30 мин с последующим восстановлением функции в синусоиды приблизительно 24 часов 43. В то время как многие исследователи успешно использовать анестезию, в наших руках, изофлуораном анестезия усугубляет расстройство дыхания мышей из-за HGD. Мы считаем, что наркозом мышей занять больше времени, чтобы оправиться, а иногда и требуют реанимационных мероприятий за выживание. Если инъекционных большую группу мышей с использованием анестезии, может быть необходимо иметь дополнительное человека в номере, посвященном надзор благополучия выздоравливающих животных. Без анестезии, даже после того, как повторные инъекции, выживание мышей на 100% и время восстановления меньше 5 минут.
Протокол, описанный здесь, может быть использован для доставки широкий спектр молекул в печени мыши. Использование секретируемый белок APOL-I в качестве примера, мы показали, как HGD могут быть использованы для установления модель мыши и изучения функции защитного белка. При сравнении функции различных генных продуктов, то succeсс от HGD следует оценивать по мере возможности. Для секретируемых белков, легко контролировать уровни экспрессии на основе анализа мыши плазмы с помощью вестерн-блот (рис. 2 и 4B.) Особенно важно, чтобы обеспечить успех HGD когда опробование природные или синтетические варианты терапевтического белка, как эффективность трансфекции может серьезно повлиять исход заболевания (рис. 2 и 3). Примеры даны, чтобы показать, как этот метод может быть расширен, чтобы проанализировать повреждение печени, вызванное Apoli, который является порообразующий белка (фиг. 4 и 5). Последовательность вариантов из APOL-I в той же плазмиды фоне результате в заметно различных профилей повреждения. Это предполагает, что повреждение ткани связана с функцией белка и не экспрессирующего вектора или травмы самой инъекции. Следует отметить, что в наши руки, уровень АСТ универсально высоко на 1-й день после инъекции (данные не показаны). На 2-й день, однако, АСТ уровни мышей вотвергается с физиологическим возвращения к нормальной жизни и различия между вариантами гена легко различимы (рис. 4). По 3-й день после инъекции, АСТ измеряется во всех процедур вернуться к их исходному уровню (данные не представлены). Поскольку некротических тканей и воспаление в печени очевидны дольше, чем транзиторное повышение АСТ, повреждение печени из-за экспрессии гена устойчивого может быть оценена более надежно, хотя и качественно, окрашиванием печени, собранных на 5-й день после инъекции. Приведенные примеры показывают, что варианты APOL-I, которые вызывают повышенный выброс АСТ 2 дня после инъекции также привести к более устойчивого повреждения печени по оценке окрашивания гематоксилином и эозином.
Гидродинамическая доставки генов позволяет быстрый анализ экспрессии генов в естественных условиях. Она требует простую конструкцию гена изучаемого в эукариотической вектор экспрессии и способность выполнять инъекцию как описано выше. Генерация transgeNIC мышей с использованием других форм доставки генов, таких как рекомбинантных лентивирусов, взятых у ВИЧ-1 или рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы, требуют гораздо более специализированные знания. Тем не менее, их преимущество выдержан экспрессию генов, хотя экспрессия вирусных генов часто вызывает воспалительную реакцию из-за хозяин чувствуя вирусной инфекции и реагирования 15-19. Кроме того, вирусные векторы имеют ограниченную способность упаковки и поэтому, ограничены в размерах гена, в то время как ВАС из 150Кб успешно используются в HGD 4. После освоения этой техники, пользователь может трансфекции любую нуклеиновую кислоту (кДНК или гДНК или РНК) в естественных условиях и следовать производство белка и биологических последствий. Белок может быть внутриклеточным, связанный с мембраной или внеклеточного; это могут быть помечены или изменения в нуклеиновой кислоте и, таким образом, уровень аминокислота. Самое главное, это очень быстрый и простой метод.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим Ся Лю (Regeneron Pharmaceuticals) для изначально учит нас технику HGD и д-р Рассел Томсон (Альберт Эйнштейн медицинский колледж) для его постоянного руководства по различным аспектам технологии. Эта работа финансировалась по Хантер-колледже, CUNY запуска средства и NSF Хлеб награда IOS-1249166. Мы благодарим NYULMC Гистопатология Ядро NYUCI Центр поддержки Грант, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 для гистологии на печени мышей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al.
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D.
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D.
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
