Summary
En la transfección in vivo de ADN desnudo por la entrega de genes hidrodinámico introduce genes en el tejido de un animal con una respuesta inflamatoria mínima. Cantidades suficientes de producto génico se generan de tal manera que la función y regulación, así como la estructura y la función de la proteína del gen pueden ser analizados.
Abstract
La expresión eficiente de los transgenes in vivo es de importancia crítica en el estudio de la función génica y el desarrollo de tratamientos para las enfermedades. En los últimos años, la entrega de genes hidrodinámico (DAG) ha emergido como un método sencillo, rápido, seguro y eficaz para la entrega de transgenes en roedores. Esta técnica se basa en la fuerza generada por la inyección rápida de un gran volumen de solución fisiológica para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares de órganos perfundidos y por lo tanto introducir ADN en las células. Una de las principales ventajas de DAG es la capacidad de introducir transgenes en células de mamífero utilizando el ADN plásmido desnudo (pADN). La introducción de un gen exógeno utilizando un plásmido que es mínimamente laborioso, altamente eficiente y, en contra de los transportistas virales, muy segura. DAG se utilizó inicialmente para suministrar genes en ratones, que se utiliza ahora para ofrecer una amplia gama de sustancias, incluyendo oligonucleótidos, cromosomas artificiales, ARN, proteínas y pequeñas moléculas en ratones, ratasy, en un grado limitado, otros animales. Este protocolo describe HGD en ratones y se centra en tres aspectos claves del método que son fundamentales para realizar el procedimiento con éxito: la correcta inserción de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. Se dan ejemplos para mostrar la aplicación de este método para la expresión transitoria de dos genes que codifican proteínas secretadas, primates específica, la apolipoproteína LI (apoL-I) y la proteína relacionada con haptoglobina-(HPR).
Introduction
Desde su primera descripción por Liu et al. Y Zhang et al., La entrega de genes hidrodinámico (DAG) se ha convertido en una herramienta muy valiosa para el estudio de la función génica en sistemas de modelos de roedores 1, 2. La técnica consiste en la inyección rápida (5-7 segundos) de un volumen grande (8-12% de peso corporal) de solución en la vena de la cola de los ratones para facilitar la captación de ADN plásmido por las células de órganos diana 1, 2. Estas condiciones conducen a robusto expresión génica en el hígado y menos la expresión de genes en el riñón, bazo, pulmón y corazón.
La inyección de 10 mg plásmido pCMV-lacZ puede transfectar tanto como 40% de los hepatocitos, lo que hace HGD el método más eficiente, no viral, en la entrega de genes in vivo hasta la fecha 1. A diferencia de los portadores virales, pDNA es fácil de preparar, no provocar una respuesta inmune en el huésped roedor 3 y que no constituya un riesgo para la salud mediante la recombinación con el extremovirus exógenas. Además, ya que las moléculas de ADN entregadas por DAG no necesitan envasado, este método es adecuado para la entrega de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) tan grandes como 150 kb 4. Otros tipos de moléculas que han sido entregados por un método hidrodinámico incluyen ARN 5-10, morfolinos 11, proteínas de 12, 13 y otras moléculas pequeñas 12, 14. Las ventajas y desventajas de DAG con respecto a otros métodos de entrega se han discutido en las excelentes críticas en la literatura 15-20 y un número de autores han proporcionado una descripción detallada del procedimiento 21-23.
La introducción de transgenes en ratones por DAG es seguro y eficaz 1-3, 24 y el método se ha usado en ratas con éxito comparable 25. Con algunas modificaciones, los experimentos de prueba de concepto se han llevado a cabo en pollos 26, rablos bits 27 y 28 cerdos, aunque, la aplicación in vivo de esta técnica en animales más grandes sigue siendo un reto. Cuando se utiliza este método, otra limitación común es que muchos de los vectores de expresión de mamíferos disponibles carecen de los componentes para lograr una, persistente alto nivel de la expresión génica. El uso de un plásmido, la expresión génica pCMV-Luc en los órganos diana es evidente tan pronto como diez minutos después de la DAG, sin embargo, el nivel de expresión inicial, alta cae bruscamente en la primera semana después de la inyección 1. Expresión de los transgenes a largo plazo es posible, dependiendo del promotor y el intrón utilizado en el diseño de plásmido 3, 24 inyecciones sin embargo, el mantenimiento de la expresión génica de alto nivel a menudo requiere repetidas. Por esta razón, HGD puede ser menos adecuado para estudiar enfermedades crónicas que son un resultado de la exposición a largo plazo a las proteínas perjudiciales o productos de la proteína. Con estas limitaciones, DAG es una herramienta excepcionalmente poderosa para el estudio de la popapel potencial de un gen y el efecto de que los mutantes in vivo, así como los efectos terapéuticos y la regulación de proteínas y para el establecimiento de modelos animales de la enfermedad (para una revisión, ver 15). Por ejemplo, HGD puede utilizarse para asignar la función a los dominios y aminoácidos de las proteínas mediante la introducción de forma individual diferentes construcciones de genes en ratones que tienen los respectivos genes noqueado. Además, esta técnica puede ser utilizado en cualquier cepa de ratón.
Este protocolo describe HGD en ratones con un enfoque en los aspectos técnicos necesarios para lograr la transfección exitosa: la inserción correcta de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. La aplicación de este método se demostró en un modelo de ratón de la tripanosomiasis africana, una enfermedad mortal de los humanos y el ganado 29 de 30. Aunque varias especies de tripanosomas causan enfermedades en el ganado, la mayoría no puede causar enfermedad en seres humanos debido a los complejos inmunes innatas en blood llamadas factores líticos tripanosoma (Tlfs) 29, 31, 32. Estos, lipoproteínas de alta densidad de formación de poros (HDL) contienen dos proteínas únicas, primates específica:. HPR, el ligando, lo que facilita la absorción de Tlfs en tripanosomas, y apoL-I, el componente lítico 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense es capaz de infectar a los humanos debido a la expresión de una proteína asociada a la resistencia sérica (SRA) que se une y neutraliza humana apoL-I 34, 39. Baboon TLF no es neutralizada por SRA por su divergente proteína apoL-I 40. Como se informó anteriormente, el uso de un vector de expresión de mamíferos (pRG977), la expresión transgénica de componentes TLF babuino en ratones confiere protección contra los tripanosomas humanos infecciosa 40. Los datos representativos presentados aquí demuestran cómo se puede aplicar la entrega de genes hidrodinámico para estudiar los efectos terapéuticos de una proteína.
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Protocol
Todos los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Hunter College Institutional Animal Care y Uso de la City University de Nueva York.
1. Preparación de ADN de plásmido libre de endotoxinas
- Elige una sola colonia de bacterias que contienen el gen de interés en un vector de expresión de mamífero a partir de una placa selectiva recién rayada.
- Siga las recomendaciones que se encuentran en el manual de un kit disponible en el mercado de purificación de plásmido libre de endotoxina para el cultivo y la cosecha de las bacterias.
- Se purifica el plásmido de ADN libre de endotoxina a partir de células bacterianas siguiendo el protocolo de un kit de purificación de plásmido libre de endotoxina comercialmente disponible.
- Utilice artículos de plástico libre de endotoxinas y manejar ADN con cuidado para garantizar que la endotoxina no se vuelve a introducir en la muestra de ADN después de la etapa de eliminación.
- Medir la concentración de ADN de plásmido libre de endotoxinas mediante la determinación de su absorbancia a 260 nm utilizando un MICRespectrofotómetro o-volumen de UV como se describe a continuación o un estándar, basado en la cubeta de espectrofotómetro.
- Limpiar las superficies ópticas inferior y superior del sistema de retención de la muestra espectrofotómetro micro de la siguiente manera. Pipetear 1 l de agua desionizada limpia en el sistema óptico más bajo. Cierre el brazo de palanca y toque un par de veces para bañar al sistema óptico superior, entonces la palanca de apertura y limpie con un pañuelo de papel.
- Abra el software del espectrofotómetro micro y seleccionar el módulo de ácidos nucleicos.
- Coloque 1 l de agua desionizada limpia en el sistema óptico inferior, baje el brazo de palanca y seleccione "initialize" en el software del programa. Una vez que la inicialización es superficies completas, limpias, tanto ópticos con un pañuelo de papel ..
- Realizar la medición en blanco mediante la carga de 1 l de-endotoxina libre de tampón TE (10 mM de Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM) y seleccionando "en blanco" desde el software de programa. Una vez que la medición se realiza en blanco, limpie las superficies ópticas con un tantotejido.
- Lleve a cabo la medición de la muestra mediante la carga de 1 l de muestra de ADN libre de endotoxinas y seleccionando "medida" en el software del programa. Se registrará la concentración de ADN. Evaluar la pureza del ADN mediante el registro de la relación de absorbancia 260/280 nm que aparece en la pantalla. Dado que el uso de ADN puro (260/280 proporción de 1,8) para DAG es muy deseable, evitar el uso de una muestra de ADN con una relación de 260/280 por debajo de 1,7. Una vez que la medición se hace, limpie ambas superficies ópticas con un pañuelo de papel.
2. Con un peso de los ratones
- Marcar los ratones de una manera apropiada para la cepa. Nota: el marcado de la cola, no se recomienda para este procedimiento.
- Especies ratón Marcar que tienen la piel blanca (por ejemplo, Suiza Webster) en la espalda con un marcador negro. Vuelva a aplicar marcas en el tiempo que sea necesario.
- Especies Marcos ratón que tienen pelaje negro (por ejemplo C57BL / 6) por el oído perforación de varios días de antelación.
- Pesar individua ratoneslly colocando suavemente en una sartén pesada de animales o un cubo colocado en una balanza de laboratorio digital. Registrar el peso de cada ratón utilizado en el experimento, en el día del experimento.
3. Preparación de jeringas
- Preparación de la mezcla de inyección
- Calcular la cantidad de ADN necesaria asumiendo 5-50 g de ADN de plásmido libre de endotoxinas para la inyección de cada ratón.
- Determinar la cantidad óptima de ADN de plásmido experimentalmente.
- Al determinar la cantidad de ADN necesario, asumir la inyección de un ratón adicional por grupo, como la carga adecuada de las jeringas requerirá cierta mezcla de inyección extra. Para ayudar a los cálculos, considere el siguiente ejemplo: inyectar 4 ratones experimentales y 4 de control, cada una pesa 25 g, con 50 microgramos de ADN plásmido por ratón. Para determinar la cantidad de ADN necesaria en este caso, calcular con 5 ratones por grupo: 5 x 50 g = 250 g de ADN necesaria para cada grupo.
- Determinar la cantidad de solución salina (cloruro de sodio 0,9%) necesaria asumiendo 10% de peso corporal para la inyección de cada ratón.
- De acuerdo con el ejemplo anterior, inyectar cada 25 g de ratón con 50 g de ADN plasmídico en 2,5 ml de solución salina (2,5 g de líquido).
- Cuando la determinación de la cantidad de solución salina necesaria para todo un grupo de ratones, asumir la inyección de un ratón adicional por grupo para permitir la carga apropiada de las jeringas. Considerando el experimento dado, calcular la cantidad de solución salina necesaria para 5 ratones en cada grupo: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml de solución salina para cada grupo (o 25 ml en total). Nota: Si los ratones de un mismo grupo no son el mismo peso (diferencia de más de 10% en el peso corporal), preparar la inyección se mezcla por separado.
- Utilice solución salina sin conservantes y sin endotoxina, estéril, que ha sido aprobado para uso humano, en 10 ml, viales de múltiples usos.
- Usando una aguja de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm) unido a una punta de cierre luer de una jeringa de 20 ml,retirar el líquido de los viales de solución salina y vaciar las jeringas en un tubo cónico de 50 ml. Para ayudar a pipeteado preciso de solución salina durante la preparación de las mezclas de inyección de ADN solución salina, solución salina recoger más de lo necesario para la inyección de todos los ratones en el experimento. Para el experimento anterior, retirar la solución salina de 3, 10 ml viales (un total de aproximadamente 30 ml), incluso si la cantidad calculada de solución salina necesaria para el experimento es de sólo 25 ml.
- Pipetear la cantidad calculada de ADN en un tubo cónico de 50 ml diferente. Tenga cuidado de no tocar el lado del tubo con el cuerpo de la pipeta para evitar la introducción de la endotoxina. De acuerdo con el ejemplo, pipetear 250 g de control y 250 g de plásmido de ADN experimental en tubos cónicos separados.
- Añadir la cantidad requerida de solución salina para el ADN usando una pipeta serológica. Considerando el experimento de la muestra, pipeta 12,5 ml de solución salina a cada una de las mezclas de reacción (experimental y de control).
- Permitir que todas las soluciones para llegar atemperatura ambiente antes de la inyección.
- Calcular la cantidad de ADN necesaria asumiendo 5-50 g de ADN de plásmido libre de endotoxinas para la inyección de cada ratón.
- Preparación de las jeringas
- Para cada ratón, llenar una, 3 ml, jeringa luer-lock estéril con la mezcla de ADN-solución salina usando una aguja estéril de calibre 20-(0,9 mm x 25 mm). Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire. Evitar el uso de jeringas de mayor volumen como la velocidad de flujo de inyección no se puede controlar muy bien, y es difícil de manipular jeringas más grandes en una mano. Expulsar el exceso de cualquier mezcla de ADN-salina en el tubo cónico, ya que puede ser reutilizado.
- Cambie la aguja para una aguja de calibre 27 estéril. Llenar la aguja con el líquido por completo sin introducir burbujas de aire. Ajustar el volumen de la mezcla de ADN-solución salina tal como se calcula en base al peso del ratón.
- No permita que la aguja no tapada toque ninguna superficie no estéril. Si es necesario, las agujas pueden volver a tope con la técnica de una sola mano: coloque la tapa en una superficie plana, inserte la aguja sin agarrarse de la tapa con la otra mano y presione la aguja tapadacontra un objeto firme para asegurar la tapa sobre la aguja. Las jeringas están ahora listos para inyecciones de cola-vena.
4. Entrega de ADN hidrodinámica
- Tenga en cuenta que los ratones anestésicos pueden reducir la viabilidad. Evite realizar DAG en una habitación que es demasiado frío, ya que esto también reducirá la viabilidad. Si la habitación tiene una temperatura ambiente de 20 ° C o si se utiliza anestesia, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica a 37 ° C después del procedimiento para evitar la pérdida de los animales. Si se utiliza anestesia, asegúrese de que la boca y hocico del ratón mientras están sin obstáculos en la pista de calor y observar el ratón hasta que se recupere por completo. No retener el alimento o el agua de los ratones antes de la DAG.
- Calentar los ratones para dilatar los vasos sanguíneos.
- Coloque la jaula del ratón (con ropa de cama incluida) en una almohadilla de calor durante 5 minutos para que la temperatura de la ropa de cama es de aproximadamente 38 a 39 ° C. La temperatura debe ser suficientemente baja para mantener a los ratones en la almohadilla de calor para unperíodo extendido.
- Como alternativa, coloque el ratón en una inmovilización acceso dorsal con moderación mínima. Se calienta la cola del ratón durante 1 min suavemente sujetándolo con un trozo de gasa humedecida en agua tibia. Permitir ratón para volver a la posición, si es necesario. Limpie la cola con un pañuelo de papel para secarse.
- Alternativamente, ratón caliente mediante la colocación de la jaula bajo una lámpara de calor durante no más de 2 min. Si se utiliza una lámpara de calor, tenga cuidado para evitar el sobrecalentamiento del ratón.
- A gran volumen de inyección en la vena de la cola
- Inmovilizar un acceso restrainer dorsal sobre una superficie plana con cinta de laboratorio.
- La celebración por la cola, coloque el ratón suavemente en la inmovilización e inserte el conector. Utilizar la menor restricción como sea necesario para mantener la cola inmovilizada. Asegúrese de que el ratón está respirando libremente.
- Si el ratón está en peligro grave en cualquier momento durante el procedimiento, retire el ratón desde la inmovilización de inmediato y deje reposar.
- Pasa el raton por louna de las venas caudales lateral es visible. Localice las venas caudales laterales mirando hacia abajo en la parte posterior del ratón: la línea roja que se ejecuta en el medio de la cola es una arteria, mientras que las líneas azules en ambos lados de la cola son las venas caudales laterales.
- Limpie la cola del ratón con una toallita de alcohol.
- Con la mano que no se inyectan, sostenga la cola con fuerza entre los dedos índice y medio para que la cola pasa por debajo del dedo índice, más de la mitad y la tercera los dedos y debajo del dedo meñique. Deje que el dedo pulgar se mantenga libre de moverse. (Figura 1A)
- Con la otra mano, limpie el área a inyectar de nuevo con un algodón empapado en alcohol. Permita que el área se seque.
- Tome la jeringa cargada con la inyección a mano y sujételo por barril entre el pulgar y los otros cuatro dígitos. No retener el émbolo.
- Coloque la jeringa paralela a la cola con la aguja apuntando hacia el cuerpo del ratón yel bisel (borde oblicuo) de la aguja hacia arriba.
- Inserte la aguja en la vena de la cola. Proceder con la inyección sólo si la vena está situado correctamente, lo que es evidente a partir de la aguja deslizante en sin resistencia. Tenga en cuenta que la profundidad de inserción de la aguja es una cuestión de preferencia personal, sin embargo, la inserción completa no se recomienda debido a un aumento del riesgo de corte de la vena. Evitar mover la aguja.
- Usando el dedo pulgar de la mano de la cola de retención, cierre en el cubo de la aguja y presione buje contra la cola para mantener la aguja en su posición. No aplique una presión extrema y no te detengas en el eje de la aguja, ya que impide el flujo de líquido en la vena. Sostenga la cola con el dedo índice ligeramente en este punto a fin de no obstaculizar la inyección (Figura 1A).
- Vuelva a colocar la mano jeringa sosteniendo de manera que el dedo índice y el dedo medio se están aferrando a la brida y el pulgar está en el extremo del émbolo (Figure 1A).
- Presione hacia abajo el émbolo en un movimiento continuo e inyectar el volumen total de líquido en 6-8 segundos.
- Retire la aguja de la vena y detener la hemorragia aplicando presión suave en la cola con un pañuelo de papel.
- Retire del ratón de la inmovilización y el lugar del ratón en una jaula de recuperación colocado encima de una almohadilla eléctrica (ropa de cama debe ser de 37-38 ° C). Si la sala de inyección es frío, este paso es fundamental para la supervivencia de los ratones. Apóyese en la cola del ratón hasta que el sangrado se detiene por completo.
- Observar el ratón durante 1 hora después de la entrega de ADN hidrodinámico. Un período inicial de jadeos y la inmovilidad es normal debido a la arritmia temporal causada por DAG, pero asegúrese de que el ratón muestra señales de recuperación en aproximadamente 5 min. Si la respiración del ratón llega a estar muy bajo, masajear suavemente el abdomen del ratón para facilitar la respiración. Tenga en cuenta que la tasa de recuperación puede ser un poco influenciado por la cepa de ratón utilizada.
- Ratón Retornoenjaular a la vivienda y garantizar que el ratón tiene un abundante suministro de alimentos y agua.
- A gran volumen de inyección en la vena de la cola usando una posición alternativa mano
- Coloque ratón en la inmovilización y prepararse para la inyección siguiendo los pasos 4.3.1 a través de 4.3.5, tal como se describe anteriormente.
- Descanse la mano que no se inyectan en una superficie plana con cuatro dedos doblados en un ángulo de noventa grados. Los dedos (excepto el pulgar) todos deben descansar en la parte superior de uno al otro, la creación de una plataforma. Sostenga la cola del ratón entre el pulgar y el dedo que señala (fig. 1B).
- Con la otra mano, limpie el área a inyectar de nuevo con un algodón empapado en alcohol. Permita que el área se seque.
- Coge jeringa con la inyección a mano y mantenerla por la brida y el extremo del émbolo, lista para la inyección.
- Complete el procedimiento siguiendo este protocolo desde el paso 4.3.9 al paso 4.3.17, como se describió anteriormente.
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Representative Results
La colocación correcta de la aguja en la vena de la cola del ratón (como se ilustra en la Figura 1) es un requisito previo para el éxito la entrega de un transgén por transfección basado hidrodinámica-. A menudo la parte más difícil de la técnica, sin embargo, es la retención de la aguja dentro de la vena de la cola y sin movimiento para que todo el volumen de la inyección puede ser entregado en un plazo de 6-8 s. Los errores menores durante el proceso de inyección pueden resultar en muy reducido la eficacia de transfección y expresión de proteínas. Por lo tanto, es imperativo para monitorear el éxito de la DAG para cada experimento. Si la proteína transgénica de interés es difícil de detectar por Western blot debido a la falta de anticuerpos sensibles, como en el caso de babuino apoL-I, la eficiencia de inyección puede ser controlado por la co-inyección de un plásmido que lleva un gen para una proteína que es fácilmente detectable. En el experimento mostrado en la Figura 2, los ratones fueron inyectados con 50g de un plásmido que lleva una de las tres diferencialmente 6XHIS etiquetada babuino genes apoL-I y 50 g de otro plásmido (mismo diseño vector de expresión) que transportaba babuino HPR (Bhpr, sin etiquetar). El objetivo principal de este experimento fue evaluar si la adición de una etiqueta 6XHIS en los lugares de secuencias elegidas interfiere con el procesamiento y la secreción de la proteína babuino APOL-I correcto. Si sin embargo, la adición de la etiqueta interrumpe el plegamiento correcto y, en consecuencia, la secreción de la proteína, se hace difícil determinar si la pérdida de expresión de la proteína se produjo debido al proceso de alteración o sin éxito DAG. Además, debido a la falta de anticuerpos suficientemente sensibles, la detección directa de la babuino apoL-I en plasma de ratón transfectadas es difícil, incluso en caso de una entrega exitosa del gen (como se determina por la protección de ratones contra una exposición tripanosoma-infecciosa humana). En este experimento, se abordaron estos temaspor la adición de una cantidad equivalente de babuino HPR plásmido a la mezcla de apoL-Me DAG para servir como un control de la inyección sustituto. Como se demuestra en la figura, babuino HPR fue altamente expresado en el plasma de casi todos los ratones transfectadas lo que indica que el DAG se ha realizado correctamente. Gotas menores en los niveles de expresión, como se ve en uno de los dos ratones en bAPOL-Me 6XHIS grupo 1 En la Figura 2A, son generalmente atribuible a una reducción muy pequeña (1-2 s) en la velocidad de inyección. En la Figura 2B, la primera muestra de plasma carril 1 (en el grupo bAPOL-Me 6XHIS 3) muestra una completa falta de expresión de la proteína que indica un DAG fallado. En la mayoría de los casos, esto es debido a la inyección incompleta de todo el volumen del vehículo de entrega. Desde este experimento confirma el éxito de la DAG en todos los casos excepto uno, el efecto de 6XHIS etiquetado sobre la secreción bAPOL-ahora se puede evaluar una inmunotransferencia anti-6XHIS (Figura 2C y D). Como se ha vistoen la Figura 2D, el único grupo de ratones que tenían niveles detectables de proteína marcada-6xHIS en su plasma era grupo 3. El patrón de expresión de la proteína dentro de este grupo confirmó que la inyección de uno de los ratones en este grupo no tuvo éxito. La completa falta de proteínas 6XHIS detectables en los grupos 1 y 2 (Figura 2 C) subraya la importancia de incluir una proteína del marcador en la mezcla de inyección para controlar el éxito del DAG. Sin tener en cuenta los niveles plasmáticos de Bhpr (Figura 2 A y B), los datos de la Figura 2C y D podrían ser fácilmente malinterpretados como un fracaso de la DAG en los grupos 1 y 2.
El éxito de la DAG del babuino componentes TLF1 bAPOL-I y Bhpr, da ratones resistencia a los parásitos Trypanosoma brucei brucei-SRA-humanos infecciosa (TBB-SRA, un equivalente de laboratorio de T. b. Rhodesiense) 40. Esta resistencia se debe a la expresión transgénica de bAPOL-I </ Em>, como la inyección de Bhpr sola no proporciona protección contra los parásitos humanos infecciosa. Para evaluar si las variantes 6XHIS con etiqueta de bAPOL-todavía son capaces de funcionar como proteínas líticas, los ratones que recibieron tanto bAPOL-I y Bhpr por DAG se expusieron a 5000 Tbb-SRA parásitos dos días después de la entrega de genes. Como se ve en la Figura 3, los ratones en el grupo 6XHIS 2 sucumbieron a la infección muy temprana, mientras que la mayoría de los ratones en los grupos 1 y 3 sobrevivieron tanto tiempo como el control positivo sin etiquetar bAPOL-I. (Babuino apoL-que confiere protección parcial en esta cepa de ratón.) Puesto que la expresión del transgén dentro del grupo 2 era universalmente alta, la falta de protección en estos ratones puede interpretarse correctamente como pérdida de la función lítica bAPOL-I debido a la etiqueta 6XHIS en ese posición. Se debe tener cuidado, sin embargo, que la prematura (día 7) la muerte de un ratón dentro del grupo 3 no se interpreta erróneamente, como este ratón no se inyectó con éxito con los transgenes (ver Fig.2B ure, carril 1). A la luz de los datos combinados de las figuras 2 y 3, se concluye que bAPOL-I podrán ser marcados en la posición 3 (en el grupo 6xHIS 3) sin efectos adversos, mientras que el etiquetado de esta proteína en la posición 2 (en el grupo 6xHIS 2) interrumpe su lítico función. En 6xHIS grupo 1, mientras que los datos son indicativos de la protección el número de ratones era insuficiente para obtener datos significativos. Análisis de alimentación se deben realizar para determinar el número de ratones que se requieren para cada experimento. Mientras que la aparente falta de proteína detectable en plasma de ratón del grupo 1 puede parecer contradictorio con el patrón de protección visto en la Figura 3, en cuenta que un 6xHIS contra western blot negativo en este grupo puede ser el resultado de una falta de detección debido al procesamiento de la proteína en lugar que una falta de expresión de genes. En el grupo 1, se añadió cerrar la etiqueta 6xHIS después de que el sitio de escisión del péptido señal predicho. El babuino APOL-I de secuencia de amino ácido contiene un predicte adicionald proteolítica sitio de escisión de aproximadamente 20 aminoácidos desde el sitio de escisión del péptido señal de 40. Por lo tanto, es evidente que bAPOL-I en estos ratones se secreta y funcional todavía perdido el marcador 6XHIS necesaria para su detección. Así que ilustra la importancia de su colocación de etiquetas.
ApoL-Me mata tripanosomas africanos por la formación de poros en la membrana del lisosoma parásito 36, 37. Variantes naturales del ser humano APOL-I, que se encuentran en las personas con ascendencia africana reciente, han sido fuertemente asociados con la enfermedad renal en los afroamericanos, aunque el mecanismo de daño renal es todavía poco clara 41, 42. Desde DAG se traduce en más alta expresión de genes en el hígado, queríamos investigar si APOL humano-I o su variante de la secuencia sintética causa daños en este órgano. Para este fin, los ratones fueron inyectados con 50 g de PESO humana apoL-I o un único aminoácido mutante sintético designado uns K4.To evaluar el daño hepático, que mide la aspartato transaminasa (AST) en plasma de ratón recogidos en el día 2 después de la inyección. De acuerdo con su función lítica, WT humana apoL-I causa una elevación de los niveles de AST en suero (Figura 4A), en comparación con los ratones inyectados con solución salina. En contraste, la inyección de mutante K4, que difiere en sólo un aminoácido, causada muy poca liberación de AST. Las diferencias en el daño hepático son poco probable que sea atribuible a los niveles de expresión de la proteína, como los niveles de proteína K4 son equivalentes o superiores a los de el WT humana apoL-I (Figura 4B). El examen de los hígados de los ratones HGD recogió 5 días después de la inyección que muestra humana PESO apoL-I causa necrosis de los tejidos limitada con la infiltración de macrófagos moderada (Figura 5B) en comparación con los ratones inyectados con solución salina que muestran la histología hepática normal (Figura 5A, las zonas de color púrpura) . Confirmación de los datos obtenidos mediante la medición de los niveles de AST en plasma, K4 inyecta en el mismo plásmido backgredondo como el WT muestra la histología hepática normal (Figura 5C).
Figura 1. Ejemplo de posiciones de las manos para la DAG. A.) Grupo 1. Recomendada posición de la mano para lograr la velocidad de inyección máxima y para evitar el movimiento de la aguja después de la inyección se ha iniciado. La flecha indica el movimiento sugerido del pulgar después de la inserción de la aguja en la vena. Pulgar debe inmovilizar la aguja, sujetando suavemente el buje contra la cola del ratón. La mano que sostiene la jeringa se debe volver a colocar para poder presionar el émbolo hacia abajo antes de la inyección. B.) Posición 2. Se recomienda esta posición si la inyección en la vena de la cola debe ser llevada a cabo más cerca de la base de la cola debido a inyecciones repetidas. Una vez que la aguja se inserta en la vena, esta posición de la mano no necesita pielesajustes Ther.
Figura 2 Western blot de plasma recogido de cinco semanas de edad, sexo femenino, Swiss Webster (SW) los ratones inyectados con una mezcla de dos plásmidos separados:. 50 ug HPR babuino y 50 g de diferencialmente 6XHIS etiquetada babuino genes APOL-I. Los ratones fueron inyectados con vehículo de solución salina como control negativo. Para confirmar el éxito de DAG, este experimento muestra los niveles plasmáticos circulantes de la proteína HPR babuino, como babuino apoL-I es difícil de detectar. Se recogieron muestras de plasma de ratón niveles de expresión de 2 días después de HGD y de proteínas se analizaron por Western blot (plasma diluido 1:20) en 10% geles de poliacrilamida de Tris-glicina bajo condiciones desnaturalizantes, condiciones no reductoras. HPR se detectó usando un anticuerpo policlonal de conejo contra haptoglobina humana (HP), que también recognizes babuino HPR. Etiquetado bAPOL-I se detectó utilizando un anticuerpo policlonal de conejo contra una etiqueta 6xHIS. Los pesos moleculares del control 6xHis proteínas incluidos son 40 y 50 kDa. A.) Grupo muestra un ejemplo de análisis de transferencia de Western de una proteína secretada (HPR) cuando todos los ratones en un grupo se inyectaron con éxito. Tenga en cuenta el elevado y uniforme de la expresión de proteínas en el segundo grupo HIS-etiquetado (bAPOL-I 6XHIS Grupo 2), donde la inyección fue de gran éxito. En el primer grupo (bAPOL-I Grupo 6XHIS 1), expresión de la proteína a partir de uno de los ratones es prominente, pero algo reducida, probablemente debido a la reducida velocidad de la inyección. B.) El panel muestra un ejemplo de los niveles de expresión de proteínas cuando una de las inyecciones (en bAPOL-I 6XHIS Grupo 3) no tuvo éxito. C) Grupo Especial demuestra la importancia de incluir una proteína trazador (Bhpr) para monitorear el éxito de DAG cuando la detección de la proteína de interés (bAPOL-I) es incierto. A pesar del éxito confirmado de DAG en bAPOL-I
Figura 3. La supervivencia de ratones que expresan babuino variantes APOL-I 6XHIS y babuinos HPR. Cinco semanas de edad, hembra, ratones Swiss Webster recibió 50 g de cada uno de dos plásmidos separados por DAG en la misma mezcla de inyección. Los ratones utilizados en este experimento se corresponde con el de plasma analizadas en la Figura 2. En el día 2 post-inyecciones, los ratones fueron infectados con 5.000 parásitos TBB-SRA-humanos infecciosa y la parasitemia se controló. Cuando la parasitemia alcanzó 10 9 parásitos / ml, se sacrificaron los ratones. La supervivencia fue significativamente diferente del control de solución salina que se indique (* - P <0,05, log-rank test). Ratón de supervivencia a partir del desafío parásito es un ejemplo de cómo el éxito de DAG influye en los datos obtenidos de los experimentos posteriores. Cuando babuino apoL-que se inyecta con éxito, el producto del gen se secreta en la sangre de ratón en el que se recoge por tripanosomas y mata-humanos infecciosa. La curva de supervivencia muestra que los ratones inyectados con la etiqueta de versión 6xHIS 3 de babuino APOL-I se protegieron significativamente contra Tbb-SRA. La única muerte prematura en este grupo corresponde al ratón que no fue inyectado con éxito con el plásmido que lleva el transgén (véase la Figura 2). Este ratón debe ser excluido del análisis de supervivencia como la supervivencia a partir del desafío parásito no es atribuible a diferencias del transgén recibido pero al fracaso de la entrega de genes.
Figura 5. Una única sustitución de aminoácido en las apoL-Me secuencia de resultados en diferentes niveles de la patología del tejido. La figura muestra los hígados de los ratones que recibieron inyecciones SW hidrodinámicas de vehículo de solución salina (A), 50 g humana PESO apoL-I (b), o 50 g de una variante mutante sintético de apoL-I, K4 (C). Los hígados fueron retirados el día 5 después de la inyección y se procesaron para tinción con hematoxilina y eosina. Los ejemplos representativos se muestran de los mismos ratones se ensayaron para los niveles de AST en la Figura 4. Paneles (DF) mostrar ejemplos adicionales de las áreas dañadas en los ratones WT. Focos de necrosis en los paneles (B), (DF) se marcan con rectángulos negros y se agrandan. Flechas blancas en estos paneles apuntan a las áreas de infiltración de macrófagos. Para la comparación, Tejido normal de un área representativa del hígado de un ratón inyectados con vehículo de solución salina está marcada por un rectángulo de color azul claro y también se agranda. Paneles (B) y (D) son imágenes representativas del mismo ratón WT, mientras que los paneles (E) y (F) son de dos ratones WT diferentes.
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Discussion
Cuando se realiza correctamente, DAG es un medio muy seguro y eficaz de la prestación de los transgenes. Los pasos críticos para el éxito de DAG son: 1) la entrega de la cantidad correcta de ADN en un gran volumen de vehículo de solución salina 2) en la vena de la cola del ratón 3) en menos de 8 segundos.
Aunque el proceso de inyección en sí requiere sin duda alguna destreza manual, el éxito de este seis segundos procedimiento a menudo se encuentra en una cuidadosa preparación del experimento. La cantidad de pADN necesario para alcanzar la máxima expresión génica puede variar en gran medida dependiendo del plásmido utilizado y el gen que se expresa, por lo tanto, la cantidad óptima de ADN para ser inyectada debe ser determinado experimentalmente para cada aplicación. Para los ratones, el intervalo recomendado de ADN en general es 5-50 mg, más allá del cual la expresión de genes podría alcanzar una meseta. En nuestras manos, la inyección de 50 mg pRG977 que transportan ya sea la apoL-I o gen HPR conduce a altos niveles de circulating niveles de proteína en los dos primeros días después de la DAG. Los niveles sanguíneos de ambas proteínas disminuyen significativamente durante el próximo par de días hasta que los niveles de proteína caer por debajo de los niveles detectables alrededor de 10 días (38 y datos no publicados). La cantidad óptima de ADN debe ser entregado en una solución fisiológica equivalente a 8-12% del peso corporal del ratón 1, 2. Aunque la mayoría de los investigadores, incluyendo nosotros, utilizan una solución salina como vehículo de inyección, solución de Ringer se ha utilizado para DAG con éxito comparable 2. Tenga en cuenta, que si bien no es necesario para llevar a cabo DAG en un entorno estéril, es imperativo para evitar la contaminación por endotoxinas de la solución de inyección durante todo el procedimiento. Para este fin, la solución salina utilizada para inyecciones debe ser de calidad superior y el ADN para ser inyectada debe ser preparado utilizando un kit disponible comercialmente que elimina la endotoxina. Otro paso importante es la preparación cuidadosa ponderación de los ratones. Desde elvolumen de inyección es de uno de los aspectos críticos de éxito DAG, es importante asegurarse de que el ratón no es ni bajo-dosis, ni sobre-dosificados con solución salina. Los resultados anteriores de error en la transfección subóptima, y el segundo en la posible muerte del animal. Para garantizar aún más la seguridad de los animales, se recomienda cargar las jeringas con aguja de calibre pequeño para evitar la introducción de pequeñas burbujas de aire que son difíciles de eliminar. DAG se debe realizar con un 27 - aguja de calibre como se describe en el protocolo.
Inyección correcta se facilita mucho si las venas caudales son claramente visibles. La dilatación de los vasos sanguíneos por calentamiento suave del ratón puede ayudar a la visualización de las venas si un restrictor con una cola de AF no está disponible. La colocación de la jaula del ratón sobre una almohadilla de calor durante unos minutos, o la celebración de la cola con una obra paño caliente, húmedo bien en nuestras manos. Si se utiliza una lámpara de calor, hay que tener mucho cuidado de no sobrecalentar los ratones. Nos encontramos con que nosing una lámpara de calor hace que el estrés innecesario ratones y el malestar y, por lo tanto, debe evitarse. Si se limpia la cola con 70% de etanol contribuye adicionalmente a la visualización aumentando el contraste entre la vena de la cola y la piel. Este paso también es fundamental para evitar la contaminación bacteriana durante la inyección. Una vez que el ratón se prepara para la inyección, la vena de la cola se puede inyectar usando ya sea una de las posiciones de la mano descritos en este protocolo. Tenga en cuenta, que mientras que la posición 2 parece más fácil y más sencillo, puede ser más difícil de inyectar el volumen lleno de líquido sin mover la jeringa. En contraste, el establecimiento de una buena posición de la aguja con el primer método es más engorroso Sin embargo, una vez que el cubo de la aguja está firmemente sujeta contra la cola, la inyección raramente falla. El primer método se recomienda también para la velocidad máxima, a pesar de la transfección con éxito es posible con cualquiera de las posiciones de mano.
La velocidad recomendada de la inyección de DAG en ratones es de 6-8 segundos, aunquemuchos autores sugieren que las inyecciones rápidas producen mejores resultados 1, 12. Resultados inyección lenta en una marcada reducción de la expresión génica. Sin embargo, la razón más común por la ausencia absoluta de la expresión génica es la falta de entrega del volumen total de la inyección. Esto ocurre cuando se mueve la aguja, después de iniciada la inyección. Correctamente colocado, la aguja entra en la vena sin resistencia. Para comprobar que la aguja se inserta en la vena correctamente, se puede inyectar una cantidad muy pequeña (100 l) de líquido en la vena antes de la inyección completa. Si al presionar el émbolo se encuentra con resistencia extrema, la aguja está en la posición incorrecta y el líquido entra en el tejido de la cola. Si la aguja sale de la vena mediados de la inyección, la corrección de la fracasada DAG se puede intentar después de que el ratón se dejó en reposo durante un par de horas. Re-inyección después de un descanso insuficiente provocan malestar al ratón y puede resultar en la pérdida de pressur hidrodinámicoe mediante la apertura de la primera herida en la cola del ratón. Si inyecciones repetidas son necesarias, el ratón se puede inyectar con el volumen total de solución salina (y la cantidad de ADN) o bien más cerca de la base de la cola en el mismo sentido o en la vena contralateral. Después de DAG, el ratón debe ser observado en una jaula colocada en una almohadilla de calor durante al menos una hora. HGD causa un fuerte aumento de la presión intravascular que resulta en una irregularidad aguda de la función del corazón, la expansión del hígado, y una interrupción de los poros de la membrana de las células del hígado, sinusoides y fenestras 12, 14, 43. A pesar de la duplicación de su volumen de sangre en unos pocos segundos, los ratones toleran DAG notablemente bien. El ritmo cardíaco vuelva a la normalidad en 2 min y la presión intravascular, lo que disminuye rápidamente poco después de la inyección, enfoques niveles basales en 3 min 12, 43. Los hepatocitos alterados vuelven a sellar en menos de 2 minutos y los ampliados retornos de tamaño del hígadoa su tamaño normal en 30 min seguido por la recuperación de la función sinusoide en aproximadamente 24 horas 43. Mientras que muchos investigadores utilizan la anestesia con éxito, en nuestras manos, la anestesia con isofluorano agrava la dificultad respiratoria de los ratones debido a la DAG. Encontramos que los ratones anestesiados tardan más en recuperarse y en ocasiones requerir reanimación por la supervivencia. Si la inyección de un gran grupo de ratones utilizando anestesia, puede ser necesario tener una persona adicional en la habitación dedicada a supervisar el bienestar de los animales en recuperación. Sin anestesia, incluso después de inyecciones repetidas, la supervivencia del ratón es 100% y el tiempo de recuperación es inferior a 5 minutos.
El protocolo descrito aquí puede usarse para suministrar una amplia gama de moléculas para el hígado de ratón. Uso de la proteína secretada apoL-I como un ejemplo, mostramos cómo DAG podría ser usado para establecer un modelo de ratón y estudiar la función de una proteína protectora. Al comparar la función de varios productos génicos, la success del DAG debe evaluarse siempre que sea posible. Para las proteínas secretadas, es fácil de controlar los niveles de expresión mediante el análisis de plasma de ratón mediante Western blot (Figuras 2 y 4B.) Es particularmente importante para asegurar el éxito de DAG cuando ensayar variantes naturales o sintéticas de una proteína terapéutica, como la eficiencia de transfección puede influir gravemente resultado de la enfermedad (Figuras 2 y 3). Se dan ejemplos para mostrar cómo este método se puede ampliar para analizar daño hepático causado por Apoli, que es una proteína formadora de poros (Figuras 4 y 5). Variantes de la secuencia de APOL-I en el mismo plásmido resultado fondo en muy diferentes perfiles de daño. Esto sugiere que el daño tisular se asocia con la función de la proteína y no el vector de expresión o el trauma de la propia inyección. Cabe señalar que, en nuestras manos, los niveles de AST son universalmente alta en el día 1 después de la inyección (datos no mostrados). El día 2, sin embargo, los niveles de AST de ratones enproyectada con solución salina de retorno a la normalidad y las diferencias entre las variantes genéticas son fácilmente discernible (Figura 4). Por día 3 después de la inyección, AST medido en todos los tratamientos de regreso a su nivel basal (datos no mostrados). Dado que el tejido necrótico y la inflamación en el hígado son evidentes ya que un aumento transitorio de la AST, daños en el hígado debido a la expresión génica sostenida puede ser evaluada de forma más fiable, aunque cualitativamente, por tinción de los hígados recogidas en el día 5 después de la inyección. Los ejemplos demuestran que las variantes de APOL-I que causan un aumento en la liberación de AST 2 días después de la inyección también provocar daño hepático más sostenida según la evaluación de la tinción con hematoxilina y eosina.
La entrega de genes hidrodinámico permite el rápido análisis de la expresión génica in vivo. Se requiere la construcción simple del gen bajo estudio en un vector de expresión eucariótico y la capacidad de realizar la inyección como se describe más arriba. Generación de transgeratones NIC por medio de otras formas de entrega de genes, tales como vectores lentivirales recombinantes derivados de VIH-1 o recombinantes vectores virales adeno-asociados, requieren mucho más especializado experiencia. Sin embargo, su ventaja se mantiene la expresión de genes, aunque la expresión génica viral a menudo causa una respuesta inflamatoria debido a la acogida de detección de una infección viral y responder 15-19. Además, los vectores virales tienen una capacidad limitada de envasado y por lo tanto, están limitados en tamaño gen, mientras que los BAC de 150kb se han utilizado con éxito en DAG 4. Después de dominar esta técnica, el usuario puede transfectar cualquier ácido nucleico (ADNc o ADNg o ARN) in vivo y seguir la producción de proteínas y las consecuencias biológicas. La proteína puede ser intracelular, extracelular o unida a la membrana; también puede ser marcado o modificadas en el ácido nucleico y por lo tanto el nivel de ácido amino. Lo más importante, esta es una técnica muy rápida y sencilla.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Liu Xia (Regeneron Pharmaceuticals) para inicialmente nos enseña la técnica de DAG y el Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) por su orientación continua en diversos aspectos de la tecnología. Este trabajo fue financiado por el Hunter College, CUNY puesta en marcha de fondos y adjudicación NSF Pan IOS-1249166. Damos las gracias a la subvención de apoyo NYULMC Histopatología Core NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para la histología en el hígado del ratón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
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