Summary
Hidrodinamik gen aktarımı ile çıplak DNA vivo transfeksiyonu minimal bir enflamatuar cevap ile hayvanın doku içine genleri getirmektedir. Gen ürününün yeterli miktarda gen fonksiyonu ve düzenleme hem de protein yapısı ve fonksiyonu analiz edilebilir şekilde oluşturulur.
Abstract
In vivo olarak etkin transgenlerin ifadesi gen fonksiyonu çalışmalarında ve hastalıklar için tedavi geliştirilmesinde kritik bir önem taşımaktadır. Geçtiğimiz yıllarda, hidrodinamik gen teslimi (HGD) kemirgenler transgenlerin sunmak için, basit, hızlı, güvenli ve etkili bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, perfüze edilmiş organ, hücre membran geçirgenliğini artırmak için fizyolojik bir solüsyon büyük hacimde hızla enjeksiyon ile oluşturulan kuvvetin dayanır ve böylece hücrelere DNA sağlar. HGD en önemli avantajlarından biri, çıplak plazmid DNA (pDNA) kullanılarak memeli hücrelerine, transgenlerin sokulması için yeteneğidir. Bir plazmid kullanılarak bir dışsal gen tanıtan son derece güvenli, minimal yüksek verimli, zahmetli ve viral taşıyıcılar aykırıdır. HGD Başlangıçta farelere gen teslim etmek için kullanılmıştır, artık oligonükleotitlerin, yapay kromozomlar, RNA, protein ve farelere küçük moleküller dahil olmak üzere, maddeler, geniş bir yelpazede, fare teslim etmek için kullanılırve sınırlı bir dereceye kadar, diğer hayvanlar. Bu protokol farelerde HGD açıklar ve başarılı bir işlemi gerçekleştirmeden için kritik olan yönteminin üç önemli yönleri üzerinde duruluyor: damara iğne doğru yerleştirilmesi, enjeksiyon hacmi ve teslimat hızı. Örnek olarak, salgılanan, primat özgü proteinleri kodlayan iki genin geçici ifadesi için, bu yöntemin uygulanmasını göstermek için verilmiş olup, apolipoprotein LI (APOL-I) ve haptoglobin-ilişkili protein (HPR).
Introduction
Tarafından ilk tanımlanmasından bu yana Liu ve ark. Ve Zhang ve diğ., Hidrodinamik gen teslimi (HGD) kemirgen model sistemleri 1, 2 gen fonksiyonunu incelemek için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Bu teknik, hedef organ 1, 2 hücreleri tarafından plazmid DNA alımını kolaylaştırmak için farelerin kuyruk venine çözeltinin büyük bir miktarda (% 8-12 vücut ağırlığı) hızla enjeksiyon (5-7 saniye) içerir. Bu koşullar, böbrek, dalak, akciğer ve kalp, karaciğer ve daha az gen ifadesinde sağlam gen ekspresyonuna yol açar.
10 ug pCMV-LacZ plazmid enjeksiyonu HGD tarihinden 1 en verimli, viral olmayan, in vivo gen dağıtım yöntemi yapma, hepatositlerin 40'a kadar% transfect olabilir. Viral taşıyıcılar farklı olarak, pDNA hazırlanması kolaydır, kemirgen ana 3 bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak yoktur ve sonu ile tekrar birleştirme ile bir sağlık riski teşkil etmezogenous virüsler. HGD tarafından sağlanan DNA molekülleri paketleme gerekmez çünkü ek olarak, bu yöntem, 150 kb 4 kadar büyük bakteriyel yapay kromozom (BAC) verilmesi için uygundur. Bir hidrodinamik yöntem ile teslim edilmiştir moleküllerinin diğer tür RNA 5-10, morpholinos 11, proteinler 12, 13, ve diğer küçük moleküller 12, 14 içerir. Diğer dağıtım yöntemlerine göre HGD avantajları ve dezavantajları literatürde 15-20 mükemmel incelemelerde tartışılmış ve yazarların bir dizi prosedür 21-23 ayrıntılı bir açıklamasını sağladı.
HGD ile farelere transgenleri güvenli ve 1-3, 24 etkilidir ve yöntem, benzer başarılar 25 sıçanlarda kullanılmıştır. Bazı değişikliklerle birlikte, proof-of-concept deneyleri tavuk 26, rab olarak yürütülmüştürDaha büyük hayvanlarda, bu tekniğin in vivo uygulama için bir sorun olmaya devam etmektedir, her ne kadar, 27, domuz ve 28 bit. Bu yöntemi kullanılırken, başka bir ortak sınırlama mevcut memeli ekspresyon vektörleri çok gen ekspresyonunun bir kalıcı, yüksek düzeyde elde etmek için bileşenleri eksikliği olmasıdır. Hedef organlarda bir plasmid pCMV-Luc, gen ekspresyonunu kullanarak ancak başlangıç yüksek ifade seviyesi enjeksiyondan 1 sonraki ilk hafta içinde keskin bir şekilde düşmektedir, HGD on dakika sonra kadar erken belirgindir. Uzun vadeli bir transgen sentezleme plasmidi tasarım 3, 24. Bununla birlikte, yüksek düzeyde gen ifadesinin bakım gerektirir sık sık tekrarlanan enjeksiyonu kullanılan promoteri ve intron bağlı olarak değişiklik mümkündür. Bu nedenle, HGD zarar proteinler veya protein ürünlerine uzun süreli maruz kalmanın bir sonucu olan kronik hastalıklar incelemek için daha az uygun olabilir. Bu sınırlamalar, HGD po eğitim için son derece güçlü bir araçtırbir gen ve bunun etkisinin aşamasında potansiyel rolü (inceleme için, bakınız 15), in vivo, hem de tedavi edici etkileri ve proteinlerin düzenlenmesinde ve hastalığın hayvan modellerinde kurulması için mutantlarımn. Örneğin, tek tek HGD ilgili genlerin nakavt olan farelere çeşitli gen konstruktları getirerek etki ve proteinlerin amino asitlerine işlev atamak için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik, bir fare türünde kullanılabilir.
Teslim ven, enjeksiyon hacmi ve hız içine doğru iğne ekleme: Bu protokol, başarılı transfeksiyonunu ulaşmak için gerekli teknik yönleri odaklanarak farelerde HGD açıklanır. Bu yöntemin uygulanması Afrika trypanosomiasis, insan ölümcül bir hastalık ve çiftlik hayvanları 29, 30 sahip bir fare modelinde gösterilmiştir. Trypanosom birkaç tür hayvan hastalığa neden olsa da, çoğu b immün komplekslerin doğuştansa nedeniyle insanlarda hastalığa neden olmazlood adı tripanosom litik faktörleri (TLFs) 29, 31, 32. Bu gözenek oluşturucu, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) iki eşsiz, primat özgü protein içerir:. Trypanosom TLFs içine alınmasını kolaylaştıran HPR, ligand, ve APOL-I, litik bileşen 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense nedeniyle bağlanan ve insan APOL I-34, 39 nötralize eden bir serum direnci ile ilişkili protein (SRA) sentezlenmesi için insanları enfekte edebilmektedir. Babun TLF nedeniyle farklı APOL-I protein 40 SRA ile nötralize edilmez. Bir memeli ifade vektörü (pRG977), farelerde babun TLF bileşenlerinin transgenik ekspresyonunu kullanarak, daha önce belirtildiği gibi bir insan-enfektif trypanosom 40 karşı koruma sağlamaktadır. Burada sunulan veriler için temsili hidrodinamik gen verici bir proteinin tedavi edici etkilerini incelemek için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada anlatılan deneyler Hunter College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, New York Şehir Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Endotoksin serbest plazmid DNA 'sının 1. Hazırlanması
- Yeni boyanmış bir seçici levhasından bir memeli ifade vektörü içinde, ilgi konusu geni içeren bir bakteri tek bir koloni seçin.
- Bakterilerin büyüyen ve hasat için bir ticari olarak temin edilebilir, endotoksin içermeyen plazmid saflaştırma kitinin el kitabında bulunabilir uyun.
- Bir ticari olarak temin edilebilen, endotoksin içermeyen plazmid saflaştırma kitinin protokolü izleyerek bakteriyel hücrelerden endotoksin içermeyen plazmid DNA arındırın.
- Endotoksin içermeyen plastik eşya kullanın ve endotoksin çıkarma aşamasından sonra DNA örnek yeniden dahil değildir sağlamak için dikkatle DNA kolu.
- MICR kullanılarak 260 nm'de emiciliğin saptanmasıyla endotoksin içermeyen plasmid DNA konsantrasyonu ölçüno-ses UV aşağıda açıklandığı gibi spektrofotometre veya standart, küvet-tabanlı spektrofotometre.
- Aşağıdaki gibi mikro spektrofotometre numune tutma sistemi alt ve üst optik yüzeylerini temizleyin. Düşük bir optik sistem üzerine temiz deiyonize su Pipet 1 ul. Manivela kolunu kapatın ve üst optik sistemi yıkanmak için onu birkaç kez dokunun, daha sonra açma kolu ve bir doku ile silin.
- Mikro spektrofotometre yazılımını açın ve nükleik asitler modülünü seçin.
- Manivela kolunu indirin ve program yazılımından "başlatılamadı" seçeneğini seçin, alt optik sistemde 1 ul deiyonize temiz su koyun. Başlatma bir doku ile, tam bir temiz hem optik yüzeyler bir kez ..
- Ve program yazılımı, "boş" seçilmesi; endotoksin içermeyen TE tampon maddesi (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0) ve 1 ul yüklenerek boş bir ölçüm yapın. Bir ile boş ölçüm yapıldıktan sonra, temiz, hem optik yüzeyleridoku.
- Program yazılım endotoksin serbest DNA örneği ve seçme "ölçü" 1 ul yükleyerek örnek ölçümü gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu kaydedin. Ekranda emme oranı 260/280 nm kaydederek DNA saflığı değerlendirin. HGD saf DNA (1.8 arasında 260/280 oranı) kullanımı yüksek ölçüde tercih edilir olduğundan, 1.7 altında bir 260/280 oranında bir DNA örneği kullanmayın. Ölçüm yapıldıktan sonra, bir doku ile hem optik yüzeyleri temizleyin.
2.. Farelerin Tartım
- Soyu için bir şekilde uygun Mark fareler. Not: kuyruk işaretlenmesi Bu işlem için tavsiye edilmez.
- Siyah bir işaretleyici ile sırtlarında beyaz kürkü (örneğin İsviçre Webster) sahip Mark fare türleri. Gerekirse zamanla işaretleri yeniden uygulayın.
- Kulak siyah kürk (örneğin C57BL / 6) sahip Mark fare türleri birkaç gün önceden delme.
- Fareler individua tartılırLly nazikçe bir hayvan tartı tava veya kova yerleştirerek bir dijital laboratuar denge üzerine yerleştirilir. Deney gününde, Deneyde kullanılan her fare ağırlığını kaydedin.
Şırınga 3. Hazırlanması
- Enjeksiyon karışımı hazırlanması
- Her bir fare, enjeksiyon için 50 ug endotoksin içermeyen plazmid DNA - 5 varsayarak gerekli DNA miktarını hesaplayın.
- Deneysel olarak plazmid DNA uygun miktarını belirleyin.
- Gerekli DNA miktarını belirlerken, şırınga uygun yükleme fazladan püskürtme karışımı gerektirir gibi, grup başına ek bir fare enjeksiyon varsayalım. Hesaplamalar yardımcı olmak için, aşağıdaki örneği düşünün: fare başına 50 ug plazmid DNA ile, 4 deney ve 4 kontrol fareleri, her birinin ağırlığı 25 g enjekte. Her bir grup için gerekli 5 x 50 ug = 250 ug DNA: Bu durumda gerekli DNA miktarını belirlemek için, her grupta 5 fare ile hesaplar.
- Her bir fare, enjeksiyon için vücut ağırlığının% 10 kabul edilerek gereken tuz miktarı (% 0.9 sodyum klorür) belirler.
- Yukarıdaki örneğe göre, 2.5 ml tuz çözeltisi (2.5 g, sıvı) içinde plasmid DNA, 50 ug her biri 25 g fare enjekte edilir.
- Farelerin bütün bir grup için gerekli tuz miktarı belirlerken, şırınga uygun yükleme sağlamak için grup başına ek bir fare enjeksiyon varsayalım. Verilen deney göz önüne alındığında, her bir grupta 5 fare için gerekli tuz miktarının hesaplanması: 5 x 2.5 mi = her grup için 12.5 ml tuzlu su (ya da 25 ml toplam) hazırlandı. Not: aynı grup içinde farenin aynı ağırlık (vücut ağırlığı% 10'dan fazla bir fark) değil ise, enjeksiyon karışımları ayrı ayrı hazırlanır.
- 10 ml viyaller içinde çoklu kullanım, insan kullanımı için onaylanmıştır koruyucu-ve endotoksin içermeyen, steril tuzlu su kullanın.
- 20 ml'lik bir şırınga bir Luer-kilit ucuna bağlı bir 20 gauge iğne (25 mm x 0.9 mm) kullanılarak,tuzlu su şişelerine sıvıyı çekmek ve 50 ml konik bir tüp içine şırınga boşaltın. DNA-tuz püskürtme karışımlarının hazırlanması sırasında tuzlu su doğru pipetleme yardımcı olmak için, bir deneyde, tüm farelerin enjeksiyon için gerekli olandan daha fazla tuz toplar. Deney için gerekli tuz hesaplanan miktarı sadece 25 mi olsa bile, yukarıda deney için, 3 ila 10 mi küçük şişeler (yaklaşık 30 ml 'lik bir toplam) tuz çözeltisi geri.
- Farklı bir 50 ml konik tüp içine DNA hesaplanan miktarı Pipet. Endotoksin giriş önlemek için pipet vücut ile tüpün yanından dokunmamaya özen gösterin. Örneğe göre, ayrı ayrı, konik tüplere deneysel plasmid DNA 250 kontrol ug ve 250 ug pipetle.
- Serolojik bir pipet kullanarak DNA salin gerekli miktarını ekleyin. Göz önüne alındığında, örnek bir deney, ana karışımlar (deney ve kontrol) her birine pipetle 12.5 ml salin enjekte edilmiştir.
- Tüm çözümleri ulaşmasına izinenjeksiyondan önce oda sıcaklığı.
- Her bir fare, enjeksiyon için 50 ug endotoksin içermeyen plazmid DNA - 5 varsayarak gerekli DNA miktarını hesaplayın.
- Şırınga hazırlanması
- Her bir fare için, steril, 20-gauge iğne (0.9 mm x 25 mm) kullanılarak DNA-tuzlu su karışımı ile steril, 3 mi, luer-lock şırınga doldurun. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkat edin. Enjeksiyon akış hızı çok iyi kontrol edilemez ve bu bir yandan daha büyük bir şırınga işlemek zor olduğu için daha yüksek hacimli şırıngalar kullanılarak kaçının. Bu yeniden kullanılabilir olabilir gibi geri konik tüp içine herhangi bir aşırı DNA-tuz karışımı çıkarın.
- Steril, 27-gauge iğne ile iğne geçin. Tamamen hava kabarcıkları tanıtan olmadan sıvı ile iğne doldurun. Fare ağırlığına göre hesaplanan DNA-tuzlu karışımı ses seviyesini ayarlayın.
- Değişkenliklidir iğne herhangi bir non-steril yüzeyine temas etmesine izin vermeyin. Diğer elinizle kapağı tutmadan iğne takın ve şapkalı iğne basın, düz bir yüzeye yerleştirin kap: Gerekirse, iğneler tek-el tekniği kullanılarak yeniden kapatılmış olabiliriğne üzerine kapağını sabitlemek için sağlam bir nesneye karşı. Şırıngalar artık kuyruk ven enjeksiyonlar için hazırız.
4.. Hidrodinamik DNA verme
- Anestezi fareler canlılığı azaltabileceğini unutmayın. Bu da canlılığı azaltmak gibi, çok soğuk bir odada HGD performans kaçının. Oda 20 ° C ortam sıcaklığı veya anestezi kullanarak, eğer herhangi bir hayvan kaybını önlemek için 37 ° C sonrası prosedür ayarlanmış bir ısıtma yastığı fareler koyarsanız. Anestezi kullanıyorsanız, fare, ağız ve burun ısı yastığı kapatılmamış iken ve tamamen iyileşene kadar fareyi gözlemlemek emin olun. Önce HGD için farelerin yiyecek veya su kesintisi yok.
- Kan damarlarını genişletmek için fareler ısıtın.
- Yatak sıcaklığı, yaklaşık 38-39 ° C olacak şekilde 5 dakika için bir ısı pedi üzerinde fare kafes (yatak dahil) ile yerleştirin Sıcaklık, bir ısı için ped üzerindeki fareler tutmak için yeterince düşük olmalıdıruzatmıştır.
- Alternatif olarak, en az kısıtlama ile bir dorsal erişim süzgeç içine fare yerleştirin. Yavaşça sıcak suda nemlendirilmiş gazlı bir parça ile tutarak, 1 dakika boyunca fare kuyruk ısıtın. Gerekirse, yeniden pozisyon fare izin verin. Kuruması için bir doku ile kuyruk silin.
- Alternatif olarak, en fazla 2 dakika boyunca bir ısı lambası altında kafes yerleştirilerek sıcak mouse. Bir ısı lambası kullanıyorsanız, fare aşırı ısınmasını önlemek için dikkatli.
- Geniş hacimli kuyruk ven enjeksiyon
- Laboratuvar bant ile düz bir yüzey üzerinde bir dorsal erişim koruyucularını hareketsiz.
- Kuyruk tarafından tutarak, yavaşça süzgeç içine fare koyun ve fişi takın. Hareketsiz kuyruk tutmak için gerekli olduğu kadar az kısıtlama kullanın. Fare özgürce nefes emin olun.
- Fare işlem sırasında herhangi bir noktada ciddi bir sıkıntı içinde olduğunu, hemen süzgeç fare kaldırmak ve dinlenmeye bırakın.
- Fareyi yerleştirin böyleceyanal kuyruk damarlarının bir görülebilir. Kuyruğun her iki tarafındaki mavi çizgiler, yanal kuyruk damarlar iken kuyruk ortasında çalışan kırmızı çizgi, bir arter: fare arkasında aşağı doğru bakarak, yanal kuyruk venleri bulun.
- Iyice bir alkollü bez ile fare kuyruğu silin.
- Kuyruk orta ve üçüncü parmakları üzerinde ve küçük parmak altında, işaret parmağı altından geçecek şekilde olmayan enjekte elinizi kullanarak, işaret ve orta parmakları arasında sıkıca tutun kuyruk. Başparmak hareket serbest kalmasını sağlar. (Şekil 1A)
- Diğer elinizi kullanarak, bir alkollü bez ile tekrar enjekte edilecek bölgeyi silin. Alan kurumasını bekleyin.
- Enjekte el ile yüklenen şırınga Pick up ve başparmak ve diğer dört basamak arasındaki varil tutun. Pistonun üzerine tutmayın.
- Fare gövdesine doğru iğne işaret ile kuyruk şırınga paralel yerleştirin veyukarı bakacak şekilde iğne konik (eğik kenar).
- Kuyruk damarı içine iğne yerleştirin. Hiçbir direniş ile sürgülü iğne bellidir ven doğru bulunduğu sadece enjeksiyon ile devam edin. Iğne yerleştirme derinliği, ancak tam ekleme nedeniyle damar kesme riski tavsiye edilmez kişisel tercih meselesi olduğunu unutmayın. Iğne hareket kaçının.
- Kuyruk tutan elin başparmağını kullanarak, pozisyonda İğneyi tutmak için kuyruk karşı iğne ve basın göbeğin göbeği üzerine kapatmak. Aşırı basınç uygulamayın ve bu ven içine sıvı akışını engelleyeceği gibi, iğne miline tutmayın. Enjeksiyon (Şekil 1A) engel olmayacak şekilde gevşek bu noktada parmağı ile kuyruk tutun.
- Parmağı ve orta parmak flanş tutunarak ve başparmak pistonun ucunda (Figür üzerine böylece şırınga tutan el yeniden konumlandırmake 1A).
- Biri, sürekli hareket halinde piston üzerine bastırın ve 6-8 saniye içinde sıvı dolu hacmi enjekte.
- Damardan iğne çıkarın ve bir doku ile kuyruk hafif bir basınç uygulayarak kanamayı durdurun.
- Bir ısıtma yastığı üstüne yerleştirilen bir kurtarma kafesine restrainer ve yerde fare fareyi çıkarın (yatak 37-38 ° C olmalıdır.) Enjeksiyon odası soğuk ise, bu adım fare hayatta kalmak için çok önemlidir. Kanama tamamen durana kadar fare kuyruğu üzerine tutun.
- Hidrodinamik DNA doğumu takiben 1 saat boyunca fareyi gözlemleyin. Soluk soluğa ve hareketsizlik bir başlangıç dönemi nedeniyle HGD nedeniyle geçici aritmi normaldir ama fare, yaklaşık 5 dakika içinde iyileşme belirtileri gösterir emin olun. Fare nefes derece sığ olur, yavaşça nefes kolaylaştırmak için fare karın masaj. Iyileşme bu oran biraz kullanılan fare suşu etkilenmiş olabilir edin.
- Dönüş farekonut kafesine ve fare yiyecek ve su bol miktarda kaynağı vardır emin olun.
- Alternatif bir el konumunu kullanarak büyük hacimli kuyruk ven enjeksiyon
- Süzgeç fare içine yerleştirin ve daha önce tarif edildiği gibi, 4.3.5 arasındaki adımları 4.3.1 izleyerek enjeksiyon için hazırlar.
- Bir doksan derecelik bir açıyla bükülmüş dört parmak ile düz bir yüzeye olmayan enjekte elini dinlendirin. Parmaklar (başparmak hariç tüm) bir platform oluşturarak, birbirlerinin üstüne durmalıdır. Başparmak ve işaret parmağı (Şekil 1B) arasındaki fare kuyruğu tutun.
- Diğer elinizi kullanarak, bir alkollü bez ile tekrar enjekte edilecek bölgeyi silin. Alan kurumasını bekleyin.
- Enjekte el ile şırınga kapmak ve flanş ve enjeksiyon için hazır pistonun, sonuna tutun.
- Daha önce açıklandığı gibi, adım 4.3.17 boyunca adım 4.3.9 bu protokolü izleyerek prosedürü uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare kuyruk venine iğnenin doğru pozisyonu (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) başarılı bir hidrodinamik bazlı transfeksiyon ile bir transgen sağlanması için bir ön koşuldur. Enjeksiyon hacmi tüm bir 6-8 s bir süre içinde teslim edilebilir, böylece genellikle tekniğin en zor parçası, ancak hareket olmadan kuyruk damarı içinde iğnenin tutma olduğunu. , Enjeksiyon işlemi sırasında küçük hatalar çok düşük transfeksiyon verimi ve protein ekspresyonu neden olabilir. Bu nedenle, her bir deney için HGD başarısını izlemek için zorunludur. Ilgi konusu transgenik protein nedeniyle hassas antikorların olmadığı için western blot ile tespit edilmesi zor ise, babun APOL-I durumunda olduğu gibi, püskürtme verimliliği bir protein için bir gen taşıyan bir plasmidin birlikte-enjeksiyon ile gözlenmiş olabilir kolayca tespit edilebilir. Şekil 2 'de gösterilen deneyde, fareler, 50 ile enjekte edilmiştirÜç farklı olarak 6xHis birini taşıyan bir plazmidin ug babun APOL-I genleri ve babun HPR (bHPR, etiketsiz) taşıyan bir plazmid (aynı ekspresyon vektörü tasarımı), 50 ug etiketlendi. Bu deneyin en temel amacı seçilen sekansı konumlarda bir 6xHis etiketi ilavesinin doğru işleme ve babun APOL-I protein salgılanması ile müdahale olup olmadığını araştırmaktır. Bununla birlikte, etiketin eklenmesi doğru katlanmasına ve, sonuç olarak, proteinin salgılanmasını bozar, bu protein ifade kaybı nedeniyle bozulmuş işleme veya başarısız HGD olup olmadığını belirlemek için zor olur. (Insan enfeksiyöz tripanosom yüklemeye karşı farelerinin korunması ile belirlendiği gibi) Üstelik, yeterince hassas antikorların olmadığı için, transfekte edilmiş fare plazması içinde babun APOL-I'in doğrudan tespiti bile başarılı bir gen aktarımı durumunda zordur. Bu deneyde, bu konular ele alındıAPOL-I HGD karışımına babun HPR plazmid eşdeğer miktarda ilavesiyle, bir taşıyıcı enjeksiyon kontrol olarak hizmet vermektedir. Şekilde gösterildiği gibi, babun HPR yüksek hemen hemen tüm transfekte edilmiş farelerin HGD başarılı olduğunu bildiren bir plazma şeklinde ifade edilmiştir. Ekspresyon seviyeleri küçük damlalar, Şekil 2A'da bAPOL-I 6xHis grup 1'de iki farelerin bir görüldüğü gibi, genel olarak enjeksiyon hızı çok küçük bir azalma (1-2 s) bağlanabilir. Şekil 2B'de, (bAPOL-I 6xHis Grup 3), birinci şerit 1 plazma numunesi, bir başarısız HGD gösteren protein ifade tam bir eksikliği göstermektedir. Çoğu durumda, bu da bir teslimat taşıtma tam hacim eksik enjeksiyon kaynaklanmaktadır. Bu deney, her durumda HGD başarılı ancak bir, bAPOL-I salgılanması üzerindeki 6xHis etiketleme etkisinin artık, bir anti-6xHis immunoblot (Şekil 2C ve D) ile değerlendirilebilir teyit beri. Görüldüğü gibi,Şekil 2D'de, plazmalarında 6xHis-etiketli proteini tespit edilebilir düzeyde sahip farelerde tek grup grup 3 oldu. bu grup içinde protein ekspresyonu desen bu gruptaki farelerin bir enjeksiyon başarısız olduğunu doğruladı. Grup 1 ve 2'de tespit 6xHis proteinlerin eksikliği tamamlamak (Şekil 2C) HGD başarısını izlemek için enjeksiyon karışımı bir izleyici protein içeren öneminin altını çiziyor. BHPR (Şekil 2A ve B) plazma düzeylerini dikkate almadan, Şekil 2C ve D verileri kolayca grup 1 ve 2 HGD bir başarısızlık olarak yanlış olabilir.
Babun TLF1 bileşenler bAPOL-I ve bHPR Başarılı HGD, insan-enfeksiyöz Tripanozom brucei brucei-SRA parazitler (TBB-SRA, T. b bir laboratuvar eşdeğer. Rhodesiense) 40 farelere direnç verir. Bu direnç bAPOL-I <transgenik ekspresyonu nedeniyle/ Em>, yalnız bHPR enjeksiyon insan bulaşıcı parazitler karşı koruma sağlar gibi. Of 6xHis etiketli varyantları bAPOL-ben hala parçalayıcı proteinler işlev mümkün olup olmadığını değerlendirmek için, HGD tarafından bAPOL-I ve bHPR hem alınan fareler 5000 ile TBB-SRA iki gün gen doğumdan sonra parazitleri itiraz edildi. Şekil 3'te görüldüğü gibi gruplar 1 ve 3, en fazla farenin sürece etiketsiz bAPOL-I, pozitif kontrol olarak hayatta iken, 6xHis grup 2'de farenin, çok erken enfeksiyona yenik düştü. (Baboon APOL-Ben bu fare zorlanma kısmi koruma bahşeder.) Grup 2 içinde transgen ifadesi evrensel yüksek olduğu için, bu farelerde koruma eksikliği nedeniyle doğru Şuna 6xHis etiketi bAPOL-I litik fonksiyon kaybı olarak yorumlanabilir pozisyon. Care (bakınız Şek bu fare transgenlerin başarılı bir şekilde enjekte değildi gibi grup 3 içinde bir fare erken (Gün 7) ölüm, yanlış değildir, ancak, alınmalıdırure 2B, hat 1). Şekiller 2 ve 3 toplanan verilerin ışığında, (6xHis grup 2) konum 2 de bu proteinin etiketleme sırasında bAPOL-I olan litik bozar, olumsuz etkiler olmadan (6xHis grup 3) 3 pozisyonunda etiketli olabilir sonucuna fonksiyonu. 6xHis 1 grubunda, veri koruma düşündüren ise farelerin sayısı önemli veri elde etmek yeterli oldu. Güç analizler, her bir deney için gerekli olan farelerin sayısını belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Grup 1'den fare plazmasında saptanabilir proteinin bariz olmaması Şekil 3'te görülen koruma desene çelişkili görünse de, bu grupta negatif bir anti 6xHis western blot dolayı oldukça protein işleme algılama eksikliğinin sonucu olabilir dikkat Gen ifadesinin eksikliğine daha. Grup 1'de, 6xHis etiketi tahmin edilen sinyal peptidi, yarılma sitesi sonrasında yakın ilave edildi. APOL-I amino asit dizisini babun ek predicte içerird proteolitik bölünme bölgesi, sinyal peptidinin 40 yarılma sitesinden yaklaşık 20 amino asit. Bu nedenle, bu farelerde bAPOL-I salgılanan ve fonksiyonel henüz tespit edilmesi için gerekli olan 6xHis etiketi kayıp olduğu açıktır. Böylece HIS etiketi yerleştirme önemini gösteren.
APOL-I parazit lizozom zarı 36, 37 gözenek oluşumu ile Afrika trypanosom öldürür. Böbrek hasarının mekanizması henüz 41, 42 belirsiz, ancak son Afrika kökenli olan kişilerde bulunan insan APOL-I doğal varyantları, güçlü, Afrikalı Amerikalılar böbrek hastalığı ile ilişkili olmuştur. HGD karaciğerde yüksek gen ekspresyonu ile sonuçlanır beri insan APOL-I ya da sentetik dizisi varyantı bu organda hasara neden olup olmadığını incelemek istedik. Bu amaçla, farenin bir belirlenmiş 50 WT insan APOL-I ug ya da tek bir amino asit sentetik mutant enjekte edilmiştirs K4.To karaciğer hasarı değerlendirmek, biz aspartat transaminaz (AST) günlük 2 enjeksiyon sonrası toplanan fare plazmada düzeyleri ölçüldü. Bu litik fonksiyonu ile tutarlı olarak, WT insan APOL-I serum fizyolojik enjekte edilen farelere kıyasla serum AST düzeylerinin yükselmesine (Şekil 4A) neden olur. Buna karşılık, sadece bir amino asit farklılık mutant K4, enjeksiyon çok az AST serbest neden oldu. K4 protein düzeyleri eşit veya WT insan APOL-I (Şekil 4B) 'in daha yüksek olarak karaciğer hasarı farklılıklar, protein ekspresyon seviyelerine atfedilebileceğine olması pek olası değildir. HGD farelerin karaciğer incelenmesi 5 gün enjeksiyon sonrası insan WT APOL-I, normal karaciğer histolojisi gösterecektir salin enjekte edilmiş fareler ile karşılaştırıldığında, orta makrofaj infiltrasyonu (Şekil 5B) ile sınırlı doku nekrozuna neden olduğunu göstermektedir toplanmıştır (Şekil 5A, mor alanlar) . Plazma AST seviyelerini ölçerek elde edilen verileri doğrular, K4 aynı plazmid backg enjekteWT gibi yuvarlak normal karaciğer histolojisi (Şekil 5C) gösterir.
HGD için el pozisyonları Şekil 1.. İllüstrasyon. A.) maksimal enjeksiyon hızı elde etmek ve enjeksiyondan sonra iğne hareketi önlemek için Konum 1. Tavsiye el pozisyonu başlatılmıştır. Ok, ven içine iğnenin sokulmasından sonra başparmak önerilen hareketi gösterir. Başparmak hafifçe fare kuyruk karşı göbeği tutarak iğne hareketsiz olmalıdır. Şırınga tutan eli enjeksiyondan önce pistonu bastırın edebilmek için yeniden konumlandırılmış olmalıdır. Kuyruk damarı enjeksiyonu yakın kuyruk tabanına nedeniyle tekrar enjeksiyonları için gerçekleştirilmelidir halinde B) Pozisyon 2. Bu pozisyon önerilir. İğne damara takıldıktan sonra, bu el pozisyonu yok kürk ihtiyacıorada ayarlamaları.
Şekil 2, beş haftalık, dişi Swiss Webster (SW) iki ayrı plasmidlerin bir karışımı ile enjekte edilmiş farelerden alınan plazmanın Western blot analizi:. 50 ug babun HPR ve diferansiyel 6xHis 50 ug babun APOL-I genleri etiketlendi. Fareler tuz bir araç olarak, negatif kontrol ile enjekte edilmiştir. HGD başarısını doğrulamak için, bu deney, babun APOL-I tespit edilmesi zor olduğu için, babun HPR proteinin dolaşımdaki plazma seviyelerini gösterir. Fare plazma numuneleri, 2 gün sonra HGD ve protein ekspresyon seviyeleri denatüre, indirgeyici olmayan koşullar altında,% 10 Tris-Glisin poliakrilamid jeller üzerinde western blot (plazma 1:20 seyreltilmiş) ile analiz edilmiştir toplanmıştır. HPR da reco insan haptoglobin (HP) karşı bir tavşan poliklonal antikor kullanılarak tespit edildibabun HPR gnizes. Takip bAPOL-I a 6xHis etiketi karşı bir tavşan poliklonal antikor kullanılarak tespit edildi. 6xHis proteinleri dahil kontrol moleküler ağırlıkları 40 kDa ve 50 bulunmaktadır. A.) Panel, bir salgılanan proteinin bir gruptaki tüm farenin başarılı bir şekilde enjekte edilmiştir (HPR) ve western blot analizi bir örneğini göstermektedir. Enjeksiyon son derece başarılı oldu ikinci HIS-etiketli grubuna (bAPOL-I 6xHis Grup 2), içinde homojen yüksek protein ifadesini unutmayın. Birinci grup (bAPOL-I 6xHis Grup 1) 'de, farelerin birinden protein ekspresyonu nedeniyle enjeksiyon düşük bir hızda olasıdır, ancak belirgin bir şekilde azaltılır. B.) Panel bAPOL-I 6xHis Grup 3'deki enjeksiyon () bir başarısız protein ifade seviyelerinin bir örneği göstermektedir. C) Panel ilgilenilen proteinin (bAPOL-I) tespiti belirsizse HGD başarısını izlemek için bir izleme protein (bHPR) de dahil olmak üzere önemini ortaya koymaktadır. BAPOL-I HGD doğruladı başarısına rağmen
Babun APOL-I 6xHis varyantlarını ve babun HPr ifade farelerin Şekil 3.. Survival. Swiss Webster fareler aynı enjeksiyon karışımında HGD iki ayrı plasmidlerin her birinden 50 ug alınan Beş haftalık, dişi,. Bu deneyde kullanılan Fareler, Şekil 2'de analiz plazmaya tekabül eder. 2 gün sonrası enjeksiyon olarak, fareler 5000 insan-enfektif TBB-SRA parazitler ve parazitemi gözlenmiş ile enfekte edilmiştir. Parazitemi 10 9 parazit / ml 'ye ulaştığında, fareler kurban edilmiştir. Log-, p <0.05 - * (belirtilmediği Survival tuzlu kontrolden önemli derecede farklı oldurank testi). Parazit tehdidi üzerine Fare hayatta kalma HGD başarısı sonraki deneylerde elde edilen verilerin nasıl etkilediğini bir örneğidir. Babun APOL-başarılı bir şekilde enjekte edildiğinde, bu gen ürünü tarafından alınan ve insan-enfektif trypanosom öldürür fare kan içine salgılanır. Sağkalım eğrisi fareler APOL-I anlamlı TBB-SRA karşı korunan babun 6xHis etiketi sürüm 3 ile enjekte olduğunu göstermektedir. Bu grupta tek erken ölüm başarılı bir şekilde (bkz. Şekil 2) transgeni taşıyan plazmid enjekte olmayan fare karşılık gelir. Parazit meydan okuma üzerine onun hayatta alınan transgeninin farklılıklar ancak gen teslim başarısızlık ilişkilendirilemeyen olduğu gibi bu fare hayatta kalma analize dahil edilmelidir.
Şekil 5,. Doku patolojisi farklı düzeylerde APOL-I sırası sonuçlar, tek bir amino asit ikamesi içerir. Şekil tuzlu su taşıtı (A) hidrodinamik enjeksiyonlar, 50 ug insan WT APOL-I (B) 'yi, ya da-I APOL, K4 (C), bir sentetik mutant varyantın 50 ug alan farelerin karaciğerleri GB göstermektedir. Karaciğerler gün 5 enjeksiyon sonrası kaldırılmış ve hematoksilen ve eozin boyama için işlendi. Örnek örnek WT farelerinde hasarlı alanların ek örneklerini gösterir, Şekil 4'te AST seviyeleri. Paneller (DF) için tahlil aynı farelerin gösterilmiştir. Paneller (B) nekroz odakları, (DF) siyah dikdörtgenler ile işaretlenmiş ve genişlemiş vardır. Bu paneller Beyaz oklar makrofaj infiltrasyonu alanlarına işaret etmektedir. Karşılaştırma için, Bir tuzlu su aracı ile enjekte edilmiş fare karaciğer temsil eden bir alan, normal doku, açık mavi bir dikdörtgen tarafından işaretlenir ve büyütülür. Paneller (E) ve (F), iki farklı WT farelerden ise paneller (B) ve (D), aynı WT fareden temsil görüntülerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doğru yapıldığında, HGD transgen teslim derece güvenli ve etkili yoludur. Başarılı HGD için kritik adım vardır: 1) en az 8 saniye içinde fare 3) kuyruk damarına) tuzlu su taşıtı 2 büyük bir hacim içinde DNA doğru miktarda da sunmaktadır.
Enjeksiyon kendisinin işlem inkar edilemez bir el becerisi gerektirir, bu altı ikinci prosedürün başarısı genellikle Deneyin dikkatli bir hazırlık yatmaktadır. Maksimal gen ekspresyonunu elde etmek için gerekli pDNA miktarı, kullanılan plazmid ve bu nedenle ifade edilecek genin bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir, enjekte edilecek DNA'nın optimal miktarı, her bir uygulama için deneysel olarak tespit edilmelidir. Fareler için, genel olarak tavsiye edilen DNA dizi gen ifadesi bir platoya ulaşabilir ötesinde 5-50 ug vardır. Bizim ellerde, APOL-I veya HPR geni ya taşıyan 50 ug pRG977 enjeksiyon circulatin yüksek düzeyde yol açarİlk iki günde g protein seviyeleri HGD gönderebilir. Her iki proteinin kan seviyeleri gün 10 (38 ve yayınlanmamış veriler) etrafında saptanabilir seviyelerin altına düşmesi protein düzeylerinin kadar gün sonraki çift üzerinde önemli ölçüde azalır. DNA miktarı, uygun bir fare 1, 2 vücut ağırlığının% 8-12 bir fizyolojik çözelti eşdeğer teslim edilmelidir. Bize dahil olmak üzere çoğu araştırmacı, enjeksiyon malzemesi olarak kullanmak da tuzlu su, Ringer çözeltisi benzer başarı 2 HGD için kullanılmıştır. Bu, steril bir ortamda HGD gerçekleştirmek için gerekli değil ise, bu işlem boyunca enjeksiyon çözeltisi endotoksin kirlenmesini önlemek için zorunlu olduğunu, dikkat edin. Bu amaçla, enjeksiyon için kullanılan tuzlu su çözeltisi üstün saflıkta olmalı ve enjekte edilecek olan DNA endotoksini kaldıran bir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak hazırlanmalıdır. Bir diğer önemli hazırlık adım farelerin ağırlığında dikkatli. Yanaenjeksiyon hacmi başarılı HGD kritik yönlerinden birinin, bu fare doz-altında ne de aşırı doz serum fizyolojik ile ne olduğundan emin olmak önemlidir. Hayvanın olası ölüm ise ikinci suboptimal transfeksiyon, en eski hata oluşur. Ayrıca hayvanların güvenliğini sağlamak için, kurtulmak zor küçük hava kabarcıkları tanıtan önlemek için, küçük-gauge iğne ile şırınga yükleme öneririz. Protokolde tarif edildiği gibi bir iğne - HGD 27 ile yapılmalıdır.
Kuyruk damarları açıkça görülebilir eğer doğru enjeksiyon ölçüde kolaylaştırılır. Bir kuyruk ışığı ile bir süzgeç mevcut değilse, fare hafif hafif ısıtılarak kan damarları genişletici venlerin yardımcı olabilir. Birkaç dakika için bir ısı pedi üzerinde fare kafes yerleştirilmesi veya elinde iyi bir sıcak, ıslak bez çalışmaları ile kuyruğunu tutan. Bir ısı lambası kullanarak ise, bir fareler yanmamasına çok dikkatli olmalıdır. Biz bulmak bize bunubir ısı lambası ing farenin gereksiz stres ve rahatsızlığa neden olur ve bu nedenle, kaçınılmalıdır. % 70 etanol ile kuyruk silinmesi daha sonra kuyruk damarından ve cilt arasındaki kontrastı artırarak görselleştirme yardımcı olur. Bu adım, enjeksiyon sırasında bakteri bulaşmasını önlemek için de önemlidir. Fare enjeksiyon için hazırlandıktan sonra, kuyruk ven Bu protokolde tarif edilen el pozisyonları biri kullanılarak enjekte edilebilir. Konum 2 daha kolay ve daha basit görünürken, bu şırınga taşımadan sıvının hacmini enjekte edilmesi daha zor olabilir, dikkat edin. Bunun aksine, ilk yöntemini kullanarak iyi bir iğne pozisyonunu oluşturan iğne göbek güvenli bir kuyruk karşı tutulur, bir kez enjeksiyon nadiren başarısız olur, ancak daha çok zahmetlidir. Başarılı transfeksiyon el konumunu kullanarak mümkün olmasına rağmen Birinci yöntem, aynı zamanda, en yüksek hız için tavsiye edilir.
Farelerde HGD enjeksiyonu tavsiye edilen hız birlikte, 6-8 snBirçok yazar hızlı enjeksiyonları da iyi sonuçlar 1, 12 verim öneririz. Belirgin bir şekilde azaltılmış gen ekspresyonu yavaş enjeksiyon ile sonuçlanır. Ancak, gen ifadesinin bir tam olmaması için en yaygın nedeni enjeksiyon tam ses sunmak için başarısızlık. Enjeksiyon başlatıldı sonra iğne, taşındığında gerçekleşir. Doğru konumlandırılmış, iğne hiçbir direnişle ven girer. İğne doğru damar içine yerleştirilen kontrol etmek için, tam bir enjeksiyondan önce damar içine çok küçük bir miktar (100 ul) sıvı enjekte edebilir. Pistonu bastırarak aşırı direnci ile karşılaşırsa, iğne yanlış pozisyonda ve sıvı kuyruk doku giriyor. Iğne başarısız HGD ven orta-enjeksiyon, düzeltme bırakırsa fare birkaç saat dinlenmek için izin verildi sonra denenebilir. Yetersiz dinlenme fare sıkıntıya neden olur ve hidrodinamik Gerilim kaybına neden olabilir re-enjeksiyon sonrasıe fare kuyruğu ilk yarayı açarak. Tekrar enjeksiyonları gerekli olan, fare tam tuzlu su hacmi (ve DNA miktarı), aynı damarda veya karşı taraftaki vende kuyruk tabanına yakın ya da enjekte edilebilir. HGD sonra, fare, en azından bir saat için bir ısı pedi üzerine yerleştirilen bir kafes içinde dikkat edilmelidir. HGD kalp fonksiyonu, karaciğer genişleme ve karaciğer hücreleri, sinüs ve Fenestrae 12, 14, 43 membran gözenekleri bir bozulma akut bir düzensizlik ile sonuçlanan intravasküler basıncında bir artış olur. Birkaç saniye içinde kan hacminin iki katına rağmen, fareler oldukça iyi tolere HGD. 2 dakika ve yakında enjeksiyondan sonra hızla azalır intravasküler basıncı normale döner kalp hızı, 3 dakika 12, 43 bazal seviyelerine yaklaşır. Kesintiye hepatositler az 2 dakika ve genişletilmiş karaciğer boyutu getirileri yeniden mühürlemekYaklaşık olarak 24 saat 43 sinüs eğrisi işlevinin geri kazanımı, ardından 30 dakika içinde normal boyutuna. Birçok araştırmacı başarıyla anestezi kullanırken, bizim ellerde, izofluoran anestezi nedeniyle HGD farelerin solunum sıkıntısı şiddetlendirir. Biz anestezi fareler kurtarmak ve bazen hayatta kalmak için resüsitasyon gerektiren uzun sürer bulabilirsiniz. Anestezi altında farelerin büyük bir grup enjekte edilmesi, bu iyi geri kazanılmasını hayvan olmak denetlemek için adanmış odasında ek bir kişi için gerekli olabilir. Anestezi olmadan, sonra bile tekrarlanan enjeksiyonlar, fare sağkalım% 100 ve iyileşme süresi en az 5 dakikadır.
Burada açıklanan protokol fare karaciğer molekülleri geniş bir yelpazede sunmak için kullanılabilir. Bir örnek olarak salgılanmış protein APOL-I kullanarak, HGD bir fare modeli oluşturmak ve bir koruyucu protein işlevini incelemek için kullanılabilir gösterdi. Çeşitli gen ürünlerinin işlevi, succe karşılaştırırkenMümkün HGD ss değerlendirilmelidir. Salgılanan proteinler için, western blot kullanılarak fare plazma analiz ederek ifade düzeylerini izlemek kolaydır (Şekil 2 ve 4B.), Tedavi edici bir proteinin doğal veya sentetik türevleri tahlil zaman transfeksiyon verimlilik gibi, HGD başarı sağlamak için özellikle önemlidir yapabilirsiniz ciddi hastalık sonucunu etkilemeye (Şekil 2 ve 3). Örnekler, bu yöntem, bir gözenek oluşturucu protein (Şekiller 4 ve 5) olduğu Apoli neden olduğu karaciğer hasarı analiz etmek için genişletilebilir göstermek için verilmiştir. Seri belirgin bir şekilde farklı bir hasar profillerde aynı plazmid arka sonucu APOL-I varyantlarını içerir. Bu doku hasarı, protein fonksiyonunun ve ekspresyon vektörü ya da enjeksiyon kendisinin değil, travma ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Bizim ellerde, AST seviyeleri 1 gün sonrası enjeksiyon (veriler gösterilmemiştir) üzerinde evrensel yüksek, unutulmamalıdır. Farelerin 2 gün, ancak, AST seviyelerituzlu normale dönüş ve gen varyantları arasındaki farklılıklar ile giriyorlardı (Şekil 4) kolayca ayırt edilir. 3. gün sonrası enjeksiyon olarak, tüm tedavilerin ölçülen AST, bazal seviyesinde (veriler gösterilmemiştir) döndürür. Karaciğerde nekrotik doku iltihabı ve daha AST geçici bir artış daha belirgin olduğu nedeniyle sürekli gen ekspresyonu, karaciğer hasarı günde 5 enjeksiyon sonrası üzerinde toplanan karaciğerinin lekelenmesi ile, kalitatif olarak olmasa da, güvenilir bir şekilde değerlendirilebilir. Örnekler, AST artan bir salınmasına neden APOL-I varyantları kez verilen hematoksilin ve eosin ile lekeleme ile değerlendirildi enjeksiyon sonrası da daha fazla sürekli karaciğer hasarına neden 2 gün.
Hidrodinamik gen teslim in vivo gen ifadesinin hızlı analizini sağlar. Bir ökaryotik ekspresyon vektörü içine çalışılan genin basit yapısı ve yukarıda belirtildiği gibi enjeksiyon gerçekleştirme yeteneğini gerektirir. Transge Üretimiörneğin HIV-1 ya da rekombinant adeno-ilişkili viral vektörlerden türetilmiş rekombinant lentiviral vektörleri gibi gen verici diğer formları kullanılarak nic fareler, daha özel bir uzmanlık gerektirir. Viral gen ekspresyonu nedeniyle genellikle konakçı bir viral enfeksiyonun algılamak ve 15-19 yanıt bir iltihap tepkisine neden olmasına rağmen Ancak, avantaj, gen ekspresyonunu devam eder. 150kb of BAC'ler başarılı HGD 4 kullanılmıştır ise Ayrıca, viral vektörler, sınırlı bir paketleme yeteneği ve bu nedenle gen ebatları sınırlıdır sahiptir. Bu teknik hakim sonra, kullanıcı, in vivo olarak herhangi bir nükleik asit (cDNA ya da RNA ya da gDNA) transfekte ve protein üretimi ve biyolojik sonuçlara yol takip edebilir. Protein, hücre içi olabilir, zara bağlı veya hücre dışı; Bu etiketlenmiş veya modifiye edilmiş nükleik asit de ve bu nedenle amino asit düzeyinde olabilir. En önemlisi, bu çok hızlı ve basit bir tekniktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz başlangıçta bize teknolojinin çeşitli alanlarında yaptığı sürekli rehberlik HGD tekniği ve Dr Russell Thomson (Albert Einstein Tıp Koleji) öğretim için Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) teşekkür ederim. Bu çalışma Hunter Koleji tarafından finanse edildi, CUNY fonları kurmak ve NSF Ekmek ödül IOS-1249166. Biz fare karaciğerleri üzerinde histoloji için NYULMC Histopathology Çekirdek NYUCI Merkezi Destek Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther. 3, 947-957 (2001).
- Magin-Lachmann, C., et al. In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods. J Gene Med. 6, 195-209 (2004).
- Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences. J Virol. 75, 3469-3473 (2001).
- Giladi, H., et al. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 8, 769-776 (2003).
- Kobayashi, N., et al. Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression. J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).
- Layzer, J. M., et al. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. Rna. 10, 766-771 (2004).
- McCaffrey, A. P., et al.
- McCaffrey, A. P., et al. Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice. Mol Ther. 5, 676-684 (2002).
- McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice. Hepatology. 38, 503-508 (2003).
- Zhang, G., et al. Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery. Gene Ther. 11, 675-682 (2004).
- Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures. J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery. J Gene Med. 6, 584-592 (2004).
- Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research. Pharm Res. 28, 694-701 (2011).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. Aaps J. 11, 671-681 (2009).
- Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. Nonviral gene delivery: what we know and what is next. Aaps J. 9, (2007).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 14, 99-107 (2007).
- Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels. Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).
- Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D.
- Bell, J. B., et al. Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection. Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).
- Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach. Cell Commun Signal. 11, (2013).
- Knapp, J. E., Liu, D.
- Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth. Hepatology. 33, 848-859 (2001).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4, 333-341 (2002).
- Hen, G., et al. Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo. Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).
- Eastman, S. J., et al. Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA. Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).
- Vanden Bossche, P. Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa. Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).
- Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control. Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).
- Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. Characterization of primate trypanosome lytic factors. Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).
- Pays, E., et al. The trypanolytic factor of human serum. Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).
- Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum. Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).
- Vanhamme, L., et al. Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum. Nature. 422, 83-87 (2003).
- Nielsen, M. J., et al. Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein. Blood. 108, 2846-2849 (2006).
- Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes. Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).
- Perez-Morga, D., et al. Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes. Science. 309, 469-472 (2005).
- Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model. J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).
- Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei. Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).
- Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).
- Genovese, G., et al. Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans. Science. 329, 841-845 (2010).
- Tzur, S., et al. Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene. Hum Genet. 128, 345-350 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14, 129-137 (2007).
