Introduction
Optogenetics har revolusjonert systemer-nivå nevrovitenskap i sin søken etter de nevrale kretser kjøre normale og sykdoms relevant atferds stater. Oppdagelsen av at lysfølsomme mikrobielle opsins en kunne være funksjonelt uttrykt i pattedyrceller gitt plattformen for å bruke lys for å få enestående kontroll av nevral aktivitet med høy romlig og tidsmessig presisjon 2. I motsetning til tradisjonelle elektrofysiologiske og farmakologiske metoder for manipulering av nevral aktivitet, tillater optogenetics for kontroll av spesifikke celletyper (basert på genetiske identifisere eller romlig spring) i heterogene populasjoner og på fysiologisk relevante tidsrammer. Den påfølgende innføringen av en nevral-optisk grensesnitt gitt et praktisk verktøy for levering av lys til å oppføre dyr 3. Dette har gjort det mulig for sanntids modulering av definerte nevrale kretser i våken oppfører gnagere for å årsaks testerollen til disse nevrale kretser i styringen av atferdstilstander som er relevante for nevrologisk og psykiatrisk sykdom 4-6. Optogenetics derfor representerer et kraftig verktøy for innføring i ethvert laboratorium interessert i å undersøke den funksjonelle sammenhengen mellom hjerneaktivitet og atferdsmessige eller fysiologiske tiltak i dyremodeller.
Vellykket design og gjennomføring av en optogenetic eksperiment innebærer ulike trinn og hensyn (se figur 1). Målet med den gjeldende protokollen er å gi enkeltpersoner med de verktøy og komponenter, sammen med teoretisk og praktisk kunnskap, er nødvendig for å utføre optogenetic stimulering i våken oppfører gnagere. For tiden er det to dominerende bølgelengdeområder som brukes for å aktivere mikrobielle opsin kanaler: i det blå-spektra (vanligvis 473 nm) og grønn-gul-spektra (vanligvis 532 eller 591 nm). Både lasere og lysdioder (LED) kan brukes som lyskilder til deliver bestemte bølgelengder av lys til hjernevev. Den ikke-koherent lys som emitteres av LED-enhetene, men gjør effektiv overføring av lys vanskelig når kopling inn i de små kjernefibre som kreves for in vivo-gnager stimulering. Bestemme passende laser montering er et viktig første skritt, og vil avhenge av tiltenkt bruk av optogenetics i laboratoriet. Den nåværende protokoll beskriver to grunnleggende utforminger som varierer i deres lette montering og bruk: enkle forhåndskoblet med to lasere og lasersystemer (se figur 2). Enkeltlasersystemer som er pre-kombinert av produsenten er i hovedsak ready-to-go ved ankomst med liten eller ingen oppsett er nødvendig, men har den ulempen med minimal sluttbruker tilpasning. En dual lasersystem muliggjør levering av to ulike bølgelengder ned samme fiber. Dette vil bli stadig viktigere med bruk av kombi optogenetics der ulike bølgelengder kan brukes til å aktivere / hemme distinct celletyper som er romlig samlokalisert. Dette er også avgjørende for bruk med bi-stabile vise funksjons opsins hvor photocurrents er initiert og avsluttes av blått og gult lys, henholdsvis 7,8. Dual laser systemer er også tilpasses som brukeren kan legge til eller fjerne komponenter (f.eks eksterne skodder, bjelke filtre, inline kraft meter) fra strålebanen etter behov. På grunn av sin allsidighet, er det dobbel laser oppsett anbefales hvis optogenetics kommer til å være en fortsatt verktøy som brukes i laboratoriet. Kobling av lasere, derimot, kan være en utfordring, og så en rask, enkel og pålitelig koblingsmekanisme er gitt i denne protokollen. Merk, denne protokollen beskriver montering av optiske komponenter og utnytter patch ledninger og komponenter som er optimalisert for steg-indeksen flermodusfibere med en 200 mikrometer kjerne og en numerisk apertur (NA) på 0,22. Ulike kjerne størrelser og NA er tilgjengelig for kjøp, men alle komponenter bør passe perfekt sammen i form av kjernestørrelse og NA å unngå lystap ved fiberkontaktpunktene. Alternativt, ved en fiberforbindelse, kan lyset passere fra en mindre til en større kjernestørrelse; og / eller fra en lavere til en høyere NA NA-fiber uten ytterligere tap.
Tethering strategier er gitt som gir mulighet for samtidig stimulering av flere mus for høy gjennomstrømming atferds testing. Protokollene som tilbys anta bruk av kroniske implanterbare fibre for adferdstesting, men kan modifiseres for akutte stimuleringsregimer. Akutt implanterte fibre er fordelaktige for å kombinere optogenetic stimulering med farmakologisk manipulasjon, siden den samme kanyle kan brukes til å levere medikamenter og spissen av en optisk fiber til det samme sted. Anvendelsen av kronisk implanterte-fibre er imidlertid sterkt anbefalt for flere dagers adferdstesting som det reduserer vevskade assosiert med gjentatt innsetting og fjerning av fibrer og øker nøyaktigheten i form av konsistent anbringelse av fiberen forvev belysning tre. Når det kombineres med tethering konfigurasjoner som er beskrevet her, kan atferden bli registrert pålitelig over flere dager. Faktisk har pålitelig lysgjennomgang blitt rapportert måneder etter fiber implantasjon 9 slik at kronisk stimulering og atferds testing paradigmer kan teoretisk bli gjennomført over flere dager og uker. Flere merknader om maskinvarekomponentene har blitt lagt til i protokollen for å gi leseren valg i det beste produktet som passer deres individuelle behov, herunder kostnadseffektive alternativer og produkter som kan gjøres internt. Viktige tips som er nyttige under oppsett og gjennomføring er også gitt.
Protocol
! ADVARSEL: Denne protokollen innebærer bruk av klasse 3b lasere og vil kreve riktig trening og sikkerhetsmessige retningslinjer som skal følges. Vernebriller må brukes til enhver tid når du bruker lasere, med oppretting presentere en spesielt høy risiko. Kontakt laser for å finne ut briller som vil gi maksimal demping for en gitt laser. Hvis tilgjengelig, melde deg på en institusjonell laser sikkerhetskurset. Bruk aldri en laser uten den aktuelle sikkerhetsbriller og trening.
1. Laser Apparatus Set-up
Der det er hensiktsmessig, er fremgangsmåten i avsnitt 1 betegnet som (A) eller (B) å skille mellom en eller to lasersystem, respektivt.
- Fest og sikre lasere til breadboard. Koblingsbrett er gode varmeledere og fungere som en kjøleribbe for å unngå skade på interne laserkomponenter med langvarig bruk.
- (A) Sikre pre-koblet laser til en 10 "x 12" breadboard (eller etter behov) med ¼-20 "cap skruer og skiver (Figur 2A). Hvis oppsett hull ikke justere med laser monteringshull, bruke små 'bordfester "for å sikre laser til brødfjel.
- (B) Hvis de to lasere som skal brukes har svært ulike bjelkehøyder (> ~ 1 cm), bruker små 4 "x 6" brødfjel å skape en plattform for en av lasere. Fest disse styrene til de viktigste store 12 "x 18" brødfjel bruker ¼-20 "cap skruene med skiver, deretter feste laser til de mindre styrene bruker cap skruer eller bordfester som vist i figur 2B. Fest den andre laser direkte til brødfjel hjelp cap skruer eller en variabel høyde bordfeste.
Kritisk Step: Koblingsbrett, skruer, og optiske komponenter kan kjøpes som imperial eller metriske så være konsekvent når du kjøper elementer; standard for denne protokollen er imperialistisk. - (A)Feste en tykk kappe flat-spalter / fysisk kontakt (FC / PC) patch ledningen til kobleren (referert til som en kopler ledningen; se figur 3) som er fysisk festet til fronten av laseren (figur 2A).
- (B) Tre kobling på en ¾ "optisk innlegg, så epoxy skjøten mellom Coupler og toppen av innlegget ved hjelp av JB Kwik, eller lignende epoxy, for å hindre løsne og forskyvning under bruk. Fest innlegget til breadboard (som oppsett hullene vil ikke alltid stille opp med nødvendig plassering av optiske komponenter, en post holder, sokkelen adapter, og klem gaffel benyttes for å sikre koblingen optiske innlegget på plass). Feste en tykk kappe patch ledningen (coupler ledning) til baksiden av kobleren.
- (B) Sett den første styre speil for den blå laseren i den kinematiske holderen, og fest den til brødfjel bruker en ¾ "optisk innlegg. Fest dette innlegget til en base ADAPter og klem gaffel. Plasser klem gaffel og legg montering rett foran den blå laser med speil vinklet 45 ° for å styre laseren mot dichroic speil. Bruk rutenett mønster av hull på breadboard som en grov justering guide. Når omtrent posisjonert, bruker en ¼ "-20 cap skruen for å feste klem gaffel til breadboard (se figur 2B, C).
- (B) Sett dichroic speil i en kinematisk holderen og feste den til en 1 "optisk post og sikre direkte til breadboard. Plasser dichroic speil helt til venstre av, og i tråd med den blå laser speil. Vinkel dichroic speil i en 45 graders vinkel slik at blått lys reflekteres av den første speilet reflekteres i koblingen, stram skruen feste kinematiske holder til innlegget (se figur 2B, C).
- (B) Fest den første styre speil for den gule laser til en ¾ "optisk innlegg. Fest optical post til en base adapter og klem gaffel. Plasser klem gaffel og post-ensemble rett foran den gule laser og vinkel speilet i en 45 graders vinkel slik at gult lys vil bli rettet mot den andre styre speil. Lås klem gaffel på plass med en ¼ "-20 cap skrue og skive.
- (B) Fest den andre styre speil for den gule laser til en 1 "optisk innlegg. Vinkel speilet slik at den gule lysstråle fra første speilet vil bli reflektert gjennom dichroic og inn i koblingen (Figur 2C). Fest post direkte til breadboard og stram festeskruen når speilet er vinklet på riktig måte. Fin speil justeringer vil bli gjort ved hjelp av de kinematiske speil mounts i et senere trinn.
- (B) Fest en nøytral tetthet filter hjulet til en ¾ "optisk post og legg innlegget inn et innlegg holder festet til en monteringssokkelen. Fest ensemble til breadboard mellom den første og sedirigent gule speil hjelp av en enkelt ¼ "-20 cap skrue. Dette hjulet brukes til å justere strømmen av gult laser lyset som når kobleren.
Tips: Individuelt stramme alle komponenter (for eksempel skruene som holder kinematiske speilholdere til toppen av innlegg, og gjengene som holder basen adaptere til bunnen av innlegg) før du fester dem til basen. Bruk en aksel av en liten sekskantnøkkel i de angitte gjennom-hull i optiske innlegg å få nok moment. Dette vil hindre at komponentene løsner under bruk, nødvendig omstilling. - Fest en FC / PC til FC / PC L-braketten adapter til breadboard.
- Valgfritt: Sikre en 1 x 2 50/50 mini kube fibersplitter direkte på koblingsbrettet for samtidig in vivo stimulering av to eller flere dyr. I tillegg kan håndtakene tilsettes for å hjelpe til bevegelse av oppsett sammenstillingen (som vist i figur 2A).
2. Laser Kobling (Non-kontakt stil Coupling)
Dette avsnittet gjelder for dual-laseroppsett (figur 2B). Juster indre blå laser banen før samkjøre ytre gul laser banen.
! FORSIKTIG: Bruk et lite lys makt kopling (~ 1 mW) for å sikre øye sikkerhet. Bruk vernebriller til makten på laser og inntil lysintensiteten måles og anses for å være trygg.
- Velgerbryterne på baksiden av laseren til "Curr" (strøm) og en transistor-transistor logiske modus (TTL) + for konstant belysning (i motsetning til analog modus). Kontroller at strømbryteren på forsiden av driveren er satt til null. Slå på laseren ved å slå på sjåføren først og deretter laser tasten.
- Sakte justere strømbryteren befinner seg på forsiden av laserdriveren, slik at ~ en mW laserlyset blir sluppet ut. Vent 10 - 15 min (eller som spesifisert av produsenten) for laser for å varme opp.
- Kobler den fiberoptiske kabel tester direkte til free enden av koplings patch ledningen og slå på kabel tester (figur 3A). Justere vinkelen på kopleren, slik at den røde stråle reiser rett bakover mot midten av det dikroiske speilet. Strålebanen av det røde lyset som sendes ut fra kabel tester er den nøyaktige banen at den innkommende laserlys må følge for å bli koblet inn i laser.
- Utføre en grov innretting: bruke laterale og horisontale knotter på de kinematiske speil for å styre strålen av laserlys inn i kopleren. De pidestall klemmer kanskje må løsnes til litt omplassere speil og koblingen. De kinematiske mounts bør fortsatt ha noen reise tilgjengelig for ytterligere finjusteringer. Ikke vær bekymret hvis ingen blå lyset som slippes ut av Coupler-festet patch ledningen på dette tidspunktet.
- Plassere et enkelt stykke av semi-gjennomskinnelige papir direkte foran det dikroiske speil, mellom den dikroiske kopler og. Det vil være både en blå og ared dot på dette papiret fra laseren og kabelen tester, respektivt. Bruk papir som er gjennomsiktig nok til å se både de røde og blå flekker samtidig fra samme side av papiret.
- Foreta finjusteringer til første styre speil (dvs. en nærmere til laseren, ikke dichroic) ved forsiktig justering laterale og horisontale knotter å justere sentrum av den røde prikken med den blå prikken.
- Flytt papir tilbake mot koblingen, slik at det er rett foran koblingen og justere knottene på den andre (dvs. dichroic) speil for å justere laserstrålen med den røde strålen.
- Iterere over trinn 2.6 og 2.7 inntil sentrum av de blå / gule og røde bjelkene er nøyaktig justert i begge posisjoner (dvs. inntil de røde og blå bjelker er kolineær).
- Ta av kabel tester fra koblingen ledningen. Laserlys skal nå bli avgitt fra enden av kobleren patch ledningen.
- Determine koblingseffektivitet ved å måle den lyseffekt som emitteres fra fiberenden av kobleren patch ledningen ved hjelp av en kraftmåler. Bruk 500 mW innstillingen på strømmåleren sin fotodiode og endre bølgelengde innstilling (λ) til blå (473 nm) eller gul (635 nm) spektrum lys avhengig av laser som brukes.
- Plasser fiberenden loddrett på fotodiode for å oppnå en strøm lesing. Sammenlign lyset strøm kommer inn i kobleren til den lyseffekt som emitteres fra fiberenden. En koblingsgrad på> 80% er vurdert som svært gode. Svært små ytterligere justeringer av den andre styre speil kan noen ganger litt bedre kobling. Generelt, når strålemønsteret fra enden av koblingsfiber er et lite, tett, sentralt sted (med ingen ringer som omgir den), koplingsvirkningsgrad i fiberkjernen er optimal.
- Gjenta trinn 02.01 til 02.11 for gul laser koblinger, bortsett fra å bruke de to styre speil for den gule laser (se Figur 2C). Gjør ingent justere posisjonen til det dikroiske speil eller innretting av det blå laser, går tapt.
3. I vivo optogenetic Stimulering
Sørg for at alle prosedyrer som involverer dyr bruk er utført i henhold til lokale og nasjonale retningslinjer og godkjent av tilsvarende Institutional Animal Care og bruk komité.
- Optisk fiber satt opp (se figur 3B for identifisering av de forskjellige typer av koblingssnorer referert til nedenfor). For å stimulere til et enkelt muse, kobler Coupler patch ledningen til en tykk kappe patch ledningen med FC / FC L-brakett adapter direkte knyttet til breadboard (se Figur 4A). Å stimulere to dyr fra en laser, kobler Coupler patch ledningen til to tykk kappe patch ledninger ved hjelp av 1 x 2 50/50 mini kube (se figur 4B). Å stimulere tre eller flere dyr, fest coupler ledningen til en multimode fiber splitter hjelp av 1 x 2 mini kuben allerede festet til koblingsbrettet (se figur 4C).
- Feste en kommutator / dreieleddet til de frie ender av den tykke kappe patch ledningen / fibersplitter. Brytere er nødvendig da de tillater rotasjon av fiberen med gnager bevegelse, som hindrer ansamling av dreiemoment på plasteret ledningen. For høyt moment kan vri ledninger, føre til brudd, og forstyrre dyrets naturlige bevegelsesmønster under testing.
- Fest dyr patch ledningen til kommutatoren.
- Fest en tilkobling split ermet til den frie metallhylse enden av dyret patch ledningen (Figur 5). Ikke tving ermet hele veien opp hylsen; la ~ 0,5 cm av hylsen utsettes da dette er det kobles til det implanterte fiberoptisk festet til dyr (figur 6).
Kritisk Step: Alltid kjøpe hylser som inneholder en splitt for å tillate utvidelse av ermet over implantert fiberhylse under tilkobling ogfjerning. For stramt av et anfall kan forårsake alvorlig skade på dyret dersom implantatet løsner fra skallen når du forsøker å koble ermet fra implantatet. Hvis dette forekommer, bør dyret fjernet fra studiet og får umiddelbar veterinær behandling. Tilsvar, før du bruker en ny ermet for første gang, 'bryte den i "ved tilkobling og frakobling en hylse før det kobler med ønsket mengde kraft.
Tips: Det er lett å bryte en fiber mens du fjerner en hylse som er tett knyttet til en hylse. For å unngå dette, skyv hylsen ut ved å sette inn en liten trepinne inn i den åpne enden av ermet (håndtaket på en standard bomullspinne er riktig størrelse). - Koble den blå laseren sjåføren til en pulsgenerator med en BNC kabel og slå pulsgeneratoren på.
- Sette egnede vernebriller på. Velgerbryterne på baksiden av laseren til "Curr" og "TTL +" modus. Sørg for at that strømknappen på forsiden av driveren er satt til null andturn laseren på (slå sjåføren på først og deretter laser-tasten).
- Juster strømbryteren på forsiden av laseren, slik at 5 - 10 mW blir utsendt fra dyret patch ledningen fiberenden som målt ved hjelp av en lett kraftmåler. 5-10 mW er en generell retningslinje - s strømintensitet som kreves for å påvirke et gitt volum av vev bør beregnes før starten av forsøket, som i Aravanis et al tre.
- Slå den blå laser til "Analog" -modus for in vivo stimulering. Merk: Gule dpss lasere drives i TTL + modus for konstant belysning. Vent 10-15 min for laseren å varme opp.
- Forsiktig holde musen og koble split-ermet på dyret patch ledningen til den kronisk implanterbare fiber (se figur 6). Sørg for at endene av begge fibrene gjør fysisk kontakt med hverandre. Bruk splitten på forbindelses ermet som envinduet for å visualisere direkte kontakt mellom de to kritiske trinnet:. Noen ganger rusk kan samle seg på metallhylse av dyrets implanterbar fiber og forstyrre skikkelig forbindelse. I dette tilfellet bruker en etanol tørk å rengjøre forsiktig hylsen på dyrets hode før vedlegg. Tving aldri en tilkobling ermet over hylse da dette kan forårsake alvorlig skade på dyret. Hvis en fysisk forbindelse mellom fiberendene ikke kan gjøres etter rengjøring, fjerne dyret fra studien.
Tips: Lys lekkasje kan oppstå på koblingspunktet mellom den implanterte fiber og dyr patch ledningen. Visualisering av dette lyset av gnagere kan presentere en eksperimentell forvirre 10. Krympeslange kan festes til koblingssnorer og gled over koblingspunktet for å minimere eksternt lys. - Tillat musen for å gjenopprette i noen minutter før starten av adferdstesting.
Tips: Depending på atferds test som skal administreres, er det best å tilvenne mus til tilkoblingen og tethering prosess 2 - 3 dager før, som håndteringen nødvendig for å koble dyr kan forårsake stress og forvirre atferds testing. - Plasser musen i atferds testing apparat som sikrer at kontakten ledningen er fri for snags. Forlat aldri et dyr uten tilsyn under stimulering. Selv med bruk av commutators, trenger patch ledninger har en tendens til å vri seg under lengre perioder og kan forstyrre atferds testing.
- Bruke en pulsgenerator for å pulsere den blå laser ved en forutbestemt frekvens som vil aktivere opsin av valget. For gul laserbruk: puls gult laser med utvendige persienner eller ved å blokkere laserstrålen med et opakt, ikke-reflekterende, ikke-brennbart objekt.
4. Post In vivo Stimulering Betraktninger
Denne delen er ikke ment å være en fullstendig protocol men tilbys som veiledning for ytterligere prosedyrer som bør vurderes etter in vivo optogenetic stimulering.
- Ved gjennomføring av et eksperiment, bekrefter viral og fiber plassering histologisk for nøyaktig tolkning av atferdsmessige resultater. Avlive dyret i henhold til institusjonens retningslinjer og perfuse dyret med iskaldt fosfat-bufret saltvann (PBS) og 4% (w / v) paraformaldehyd i PBS.
- Fjern implantert fiberoptisk ved å ta godt tak den eksponerte metallhylse med tang eller hemostats. Trekke opp i en jevn, men likevel rask, bevegelse. Det er viktig å teste integriteten til den implanterte fiber ved å måle lys ved slutten av hvert eksperiment.
- Post-fikse hjernen i paraformaldehyde i minst 24-48 timer før seksjonering gjennom regionen av interesse. (Hvis du bruker en frysing mikrotom, ruge hjerner i en 30% sukrose løsning for flere dager før seksjonering). Utføre immunhistokjemi hjelp standard protokoller for påvisning av de aktuelle opsin-merket fluoroforene, dvs. grønt fluoriserende protein (GFP), forbedret gul fluoriserende protein (EYFP) eller mCherry.
- Sjekk stedet opsin uttrykk og fiber implantat under et mikroskop og visuelt bekrefte hensiktsmessig plassering av virus injeksjon og implantat basert på utvalgte koordinater.
Representative Results
Atferdsmessige resultater oppnådd med in vivo optogenetic stimulering er helt avhengig av det nevrale krets blir målrettet, dyremodellen som brukes, og de modulasjonsparametere. For nåværende demonstrasjonsformål, dopaminneuroner i det ventrale tegmentale område, eller VTA, av tyrosinhydroksylase :: Cre-mus ble transdusert med en stabil trinn-funksjon opsin (SSFO) 8, eller kontrollvirus (EYFP), og en fiber implantat var kronisk implantert. Bruken av TH :: Cre transgene mus sikrer at opsin ekspresjon er begrenset til TH + -celler (dopamin) i VTA. Figur 7 viser representative atferds resultater oppnådd ved bruk av den aktuelle beskrevne laseroppsett for samtidig stimulering av multiple mus. Her ble mus tjoret og stimulert på samme tid ved hjelp av separate lasere (3 mus / laser som i figur 4C) og bevegelsesatferd ble tatt opp i 1 time. Gjentatt stimulering av dopamin-neuroner i VTA resulterte i enhyperaktiv fenotype som vedvarte gjennom hele varigheten av stimulering. Ingen endring i bevegelsesatferd ble sett i EYFP mus (se video 1). Etter atferds testing, ble immunhistokjemi utført for å bekrefte nøyaktig viral målretting til VTA dopaminneuroner og fiber emisjonen ble visuelt bekreftet (se figur 7).
Figur 1. Eksperimentelle skritt for in vivo optogenetic stimulering. Det er fire generelle trinnene involvert når man utformer og utfører in vivo optogenetic stimulering. Denne protokollen spesifikt detaljer trinnene involvert i levering av lys fra en laser lyskilde til dype strukturer i hjernen i den oppfører gnager og inkluderer 1) lasersystem montering og lys kopling; 2) tethering strategier for connecting flere dyr til en lyskilde for høy gjennomstrømming atferds testing og 3) gir retningslinjer for å bekrefte målrettingsstrategien for lys levering - et skritt som er nødvendig for tolking. MERK: Selv om denne protokollen er ikke eksklusivt for kroniske implanterbare fibre for tethering formål, anbefales det og lagt til grunn ved å kombinere optogenetic stimulering med atferds testing. Se både Ung & Arenkiel 2012 18 og Sparta et al., 2012 9 for egenproduksjon og implantasjon av kroniske optiske fibre. Heltrukne linjer = trinnene dekket i denne protokollen.
Figur 2. Laser systemer som benyttes for in vivo optogenetic stimulering. (A) Enkeltlasersystem for in vivo stimulering. Denne laseren er ph ysically pre-coupled av produsenten og krever lite sluttbruker oppsett. (B) Dual laser system. To lasere er koplet til en enkelt fiber ved bruk av speil som virker til å styre hver strålebane inn i en ikke-kontakt-stil kobler. Dette er den mest allsidige satt opp som optiske komponenter kan fjernes eller legges til etter behov, men presenterer mer av en utfordring når det gjelder effektiv laser kopling. (C) Skjematisk av dobbel laser system vist i (B) som indikerer plassering av lasere og speil med tilsvarende laserlys strålebanen (piler) er vist. Her blir det dikroiske speil "D" anvendt for å avbøye blå bølgelengder av lys, mens overføring av gule bølgelengder gjennom til kobleren "C" og inn i den tilknyttede kopler patch ledningen. B = blå laser; C = ikke-kontakt stil kobler; D = dichroic speil; FW = filter hjulet; M = Mirror; Y = gul laser.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. (A) Kabel tester som brukes i den ikke-fysiske koblingsprotokollen Bunn:. Kabeltestare direkte koblet til en patch ledningen. Sett viser tilkoblingspunkt av tester til kabel (B) Patch ledninger referert til gjennom protokoll fra ytre til indre:.. Multimode fiber splitter, svart kappe dyr patch ledningen med hvit zirkonia split ermet festet til flat-Cleave (FC) enden, tykk kappe patch ledningen (også referert til som en "kopler ledningen"). Tykke kappe patch ledninger er belagt med polyvinylklorid (PVC) rør for ekstra beskyttelse. For disse kablene, er industristandard fargekoder som brukes til å skille mellom ulike fibertyper, hvor orange = multimode fiber. Animal patchkablene tynnere mantlet å tillate fleksibilitet for dyr bevegelse under atferds testing. Merk at støv caps er plassert på FC / PC slutter når kablene ikke er i bruk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Forankring strategier for in vivo optogenetic stimulering av (A) et enkelt dyr, (b) to dyr; . (C) tre eller fire dyr Mulige konfigurasjoner er ikke begrenset til de som er vist over - flere konfigurasjoner er mulig gjennom den unike kombinasjonen av adaptere, fibersplittere og forgrening patch ledninger som er tilgjengelig kommersielt eller ved egendefinert rekkefølge. Merk: patch ledninger og fibersplittere inneholde FC / PC-kontakter i begge ender (kun den ene enden er avbildet).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Korrekt og ukorrekt (rød x) tilkobling av en patch ledningen til en implanterbar fiberoptisk ved hjelp av en split-ermet. (Venstre panel) En zirkonia split-ermet brukes til å koble en patch ledningen til hylse av en implanterbar fiberoptisk (vist her ikke festet til et dyr). Pilen peker til tilknytningspunktet mellom patch ledningen og implanterbare fiberoptisk. Sammenlign med (høyre panel) der et gap mellom den patch ledningen og implanterbare fiberoptisk, som visualiseres gjennom splitt av ermet forbindelse. Oppmerksom på at lyset lekkasje som kan oppstå med en utilbørlig tilkobling (nederst til høyre). Bottom innsats på upper venstre panel viser individuelle komponenter som brukes. Fra topp til bunn av innsatsen: doriske implanterbare fiberoptisk kanyle, hvit zirkonia split-ermet, flatskjerm-Cleeve (FC) enden av en svart-mantlet dyr patch ledningen (full patch ledningen avbildet i figur 3B). I alle paneler, merk at den kobler ermet er ikke i flukt med FC enden av patch ledningen. La ~ 0,5 cm av en over-henge for tilkobling til den implanterbare fiberoptisk festet til dyret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Side (til venstre) og frontal (høyre) visning av en mus med en implantert fiberoptisk forbindelse til en patch ledningen. Bruk splitt på forbindelses ermet for å hjelpe visualisere riktig tilkobling av patch ledningen to hylsen av den implanterte fiberoptikk. Tilkoblingspunkt er markert med en rød stiplet boks og også avbildet i den øvre innsatsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Representative resultater. (Venstre) Behavioral avlesning av in vivo optogenetic stimulering. Eksempel på oppførsel som kan oppnås ved bruk av den beskrevne laser oppsett og tethering protokollen. Lokomotoraktivitet ble spilt inn under optogenetic stimulering av ventral tegmentale området (VTA) i tyrosinhydroksylase (TH) :: Grobunn mus (n = 7-8 / gruppe) transdusert med enten en step-funksjon opsin (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) eller kontroll virus (AAV5-DIO-EYFP) i VTA. Grupper av tre mus ble samtidig bundet til en enkeltlaser som vist i figur 4C og stimulert med en 5 sek puls 447 eller 473 nm lys levert en gang hvert 15 min. To-veis gjentatte målinger ANOVA viste en signifikant gruppe x tids interaksjon (F 3,39 = 15,27, p <0,0001), og en signifikant hovedeffekt av tid (F 3,39 = 4,67, p = 0,007), hvorved optogenetic stimulering øket lokomotorisk aktivitet bare i SSFO mus (Bonferroni post-hoc p <0,0001, i forhold til t = 0 - 15 tiden bin) som resulterer i en generell økning i bevegelsesaktivitet sammenlignet med EYFP mus (viktigste effekten av gruppen: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061, Bonferroni post-hoc p <0,01 ved t = 15-30 og p <0,001 ved t = 30 - 45 og t = 45 - 60). Fiber specs: 200 mikrometer kjerne, 0,22 NA. Lys irradians = 6-66 mW / mm 2, svarende til fiberenden avstand på 0,1 til 0,6 mm fra viral injeksjonsstedet med 5 mW lyseffekt som emitteres ved fiberenden før deling. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. EYFPvs. SSFO: ** p <0,01; *** P <0,001; engangseffekt: #### p <0,0001 (Høyre) Histologisk bekreftelse av viral og fiberoptisk plassering.. Konfokalmikroskoper fluorescens bilde ervervet på en Leica TCS SP5 scanning laser mikroskop ble brukt til å visualisere fiber plassering (stiplet linje) og viral-mediert uttrykk (grønn) i mus ventral tegmentale området etter in vivo optogenetic stimulering. Dopaminneuroner (TH +) er sett i blått. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. I vivo optogenetic stimulering. Hyperaktivitet under VTA stimulering ved hjelp SSFO i TH :: Grobunn mus Klikk her for å se denne videoen.
| Tabell 1. Lys irradianser kreves for å aktivere brukte opsins. | ||||
| Opsin Variant | λ | Effekttetthet (/ mm 2) | Egenskaper | |
| On / Off Kinetics | ||||
| Optisk eksitasjon: hurtigvirkende channelrhodopsins | ||||
| ChR2 2 | 470 | 1 - 5mW | 1.21 / 12 msek | Branner opp til 40 Hz |
| Cheta 19 | 490 | 5 mW | 0.86 / 8.5 msek | Branner opp til 200 Hz |
| Chief 20 | 450 | 1,65 mW | 1.62 / 12 msek | Non-desensibiliserende form av ChR2 |
| C1V 18 | 540-630 | 8 mW (540 nm) | 5/34 msek ved 540nm | Rød-forskjøvet |
| 3,2 mW (630 nm) | 67 msek (ON) ved 630 nm | |||
| Optisk eksitasjon: Slow virkende kanal rhodopsins | ||||
| Stabil skritt funksjon opsin (SFO) 8 | 470/590 | 8 μW (470nm) | 20 msek / 29 min | Ny SFO variant; lenger åpen tilstand. Åpnet av 470 nm, stengt ved 590 nm |
| Optisk Hemming | ||||
| eNpHR3.0 21 | 560-630 | 3-5 mW | 2,5 ms / <10 msek | Vedvarende hemming for 30 min 22 med konstant lys * |
| ArchT3.0 11, 23 | 520-560 | 1-5 mW | 2 / <10 msek | Mer følsom med større photocurrents enn eNpHR3.0 </ Td> |
| Denne tabellen er gitt som en veiledning; spesifikke lys irradianser kreves for nevrale module bør være uavhengig bekreftet. | ||||
| Eksperimentell validering er viktig å kontrollere at opsin, målrettingsstrategien, og lette stimuleringsparametere modulere nevrale avfyring etter dens formål fem. | ||||
| Effekttetthet (mW / mm 2) refererer til kraften av lys lyser på et gitt område av hjernevev og refererer ikke til lyseffekt som emitteres fra fiber spissen. | ||||
| * Bruk alltid den laveste lysintensiteten mulig, spesielt med langvarig lys stimulering. | ||||
Tabell 1. Lys irradianser kreves for å aktivere brukte opsins.
Forkortelser
AAV = adenoassosiert virus
DPSS = diode-pumpet solid state
FC / PC = flat cleave / fysisk kontakt
GFP = grønn fluoriserende protein
PBS = fosfatbuffret saltvann
PVC = polyvinylklorid
mW = milliwatt
NA = numerisk apertur
SSFO = stabil step-funksjon opsin
TH = tyrosin hydroksylase
TTL = transistor-transistor logikk
V = spenning
VTA = ventral tegmentale område
Discussion
Dagens beskrevet laser set-ups og tethering strategier er kompatibel med et bredt spekter av gnager atferdstester. Faktisk har en rekke atferdstester blitt brukt følgende, eller medfølgende, til in vivo optogenetic stimulering som inkluderer emotive atferds oppgaver, atferds conditioning, læring og hukommelse paradigmer, søvn, opphisselse, og appetitive oppgaver nevne noen (se Nieh et al. 6 for en omfattende gjennomgang). Optogenetics har endret måten tradisjonelle atferds tester er utført ved at flere-dagers studier kan nå kondenseres til en enkelt sesjon i hvilken atferd sammenlignes, innenfor-fagene, under forskjellige epoker av lys 'på' versus 'off' 5. Av notatet, atferds apparater som inneholder døråpninger, lukkede avdelinger eller andre hindringer kan måtte endres for å imøtekomme passering av tethered fibre.
Den beskrevne tethering strategier tillatelse sien samtidig stimulering av multiple mus fra en enkelt laser. Høy gjennomstrømning optogenetic atferds testing kan derfor oppnås gjennom bruk av flere lasere og testing av utstyr. Antallet dyr som kan stimuleres samtidig, vil imidlertid være begrenset av den maksimale kraft som lett kan oppnås ved hver fiberenden. Maksimal effekt på fiberenden er avhengig av 1) startkraft av laseren; 2) kobling effektivitet og 3) antall bjelke splittelser. For en 100 mW blå laser med ~ 80% kopling effektivitet og opptil 4 stråle spagaten (som avbildet i Figur 4C), gjennomsnittlig strøm på fiber spissen kan variere mellom 5-10 mW ved bruk av 200 mikrometer core, 0,22 NA fiber patch ledninger (nb forventer tap ved overføring fra roterende ledd for å være <15%). Måling av lysmengden på fiberenden er avgjørende for bestemmelse av tilstrekkelig lys kraft for opsin aktivering som opsins varierer i lysfølsomhet og derfor lyset strømtetthet (mW/ Mm 2) som kreves for aktivering 11. For eksempel, den stabile trinn-funksjon opsin (SSFO) virker som en foton akkumulator og krever derfor svært lite lys effekttetthet for aktivering (<8 μW / mm 2) 8. Sammenligne dette med den tradisjonelle kanalen rhodopsin (ChR2) som krever minimum 1 mW / mm 2 av lys for å lokke fram aksjonspotensialer 2. Tabell 1 er gitt som en hurtigreferanse for kjente minimums lys irradianser kreves for å aktivere de vanligste opsins tiden i bruke. Til slutt, må man vurdere at lys blir spredt og absorberer som den reiser gjennom hjernevevet slik at mer lys kraft er nødvendig for dypere strukturer i hjernen tre. En nyttig online ressurs er tilgjengelig på http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php som skal beregne lysintensiteten på ulike dyp gjennom hjernevev ved å ta innutgjøre fiberkjernestørrelse, numerisk apertur, bølgelengden til lyset som brukes, og det anvendte utgangs lys kraft på fiberenden. For en utmerket oversikt over de teoretiske prinsippene bak disse beregningene, se Foutz et al. (2012) 12. Eksempler på hvordan du bruker disse prinsipper og beregninger til eksperimentell design er demonstrert i Aravanis et al. (2007) tre og Tye et al. (2012) 13. Utføre disse beregningene før starten av et eksperiment er avgjørende for å sikre tilstrekkelig lys irradians for opsin aktivering. Gitt disse hensyn, er det fordelaktig å kjøpe høyere-drevet laser for å sikre tilfredsstillende effekt. Lasere med en utgangseffekt på mellom 100 til 200 mW er generelt tilstrekkelig til å kompensere for små kjernefibre, multiple fiber splitting, koblings ineffektivitet og overføring taper 7. Hvis du bruker høy effekt lasere, men forsiktighet må tas for å unngå nerveskade eller varme og lys-medarbeiderd gjenstander som kan oppstå ved langvarig og / eller høy drevet lys belysning 7. Et sikkert område for in vivo-eksperimenter er opp til 75 mW / mm2. 14
Bestemme på hvilken type laser til kjøp kan være en komplisert sak som det er mange faktorer å vurdere. For eksempel lede diode lasere gi mer stabil og repeterbare pulsutgang enn gjør diode-pumpet solid-state (DPSS) lasere, og er mer pålitelig over tid i en lab miljø. I noen tilfeller kan imidlertid direkte diodelasere avgir en lavere lyseffekt, ~ 0,1 mW, selv når ledespenning er 0 V på grunn av en konstant forspenning strøm blir sendt til dioden ved laserstyringselektronikk. Denne "spontan" emisjon har et bredere spekter enn det laser utslipp fra den samme laseren, så kan spesielt reduseres ved å installere et smalt bånd-pass (eller 'opprydding') filter mellom laser og kobleren (se liste deler). Dette filteret vil ogsåredusere strømproduksjonen med ~ 50% når lasing, så kjøpe en høyere-drevet laser tilsvarende. Det bør bemerkes at gule dpss lasere er ekstremt sensitiv og kan virke uregelmessig og har redusert levetid hvis hurtig modulert av en pulsgenerator. Justering av gule laser makt bør gjøres gjennom eksterne tetthet filter hjul plassert i strålebanen (punkt 1.7) når du bruker laseren i TTL + modus. Alternativt kjøpe en grønn 532 nm DPSS laser er et kostnadseffektivt alternativ som kan aktivere begge halorhodopsins og archaerhodopsins.
Den numeriske apertur (NA) av en fiber er viktig å vurdere når du utformer og kjøpe fiber komponenter for laser montering set-up. NA av en optisk fiber bestemmer vinklene av lysstrålene som kan aksepteres, og slippes ut i spissen av en fiber. Hvis en høyere-NA fiber er parret med et lavere-NA fiber, vil betydelig tap finne sted på dette grensesnitt, så det er viktig å være konsistent wi th fiber NA innenfor et enkelt oppsett (eller for å sikre at NA øker langs lysbanen). Virkningen av fiber NA på volumet av hjernevev belyst er mindre viktig, siden hjernevev er meget spredning, og siden lyset koplet fra en laserkilde vil ha en tendens til å "underfylling" high-NA-fibre; imidlertid optiske fibre med en NA på 0,22 og 0,37 er ofte brukt. Tilsvarende kobling fra en større-core til en mindre-core fiber vil også resultere i betydelige tap, så alltid være sikker på å bruke økende eller lik kjernediametere når framdrift fra laserkilden til dyret implantatet. På et generelt notat, bør fiber ender alltid bli avkortet når den ikke er i bruk for å hindre at støv og partikler oppbygging. Det er en god idé å regelmessig rene fiberender og kontakter (70% isopropylalkohol fungerer godt) for å sikre maksimal lys effekt, og for å teste lys effekt gjennom en "dummy implantat" før du starter hver dag med eksperimenter.
"> Under atferds testing, er det viktig at det treffes tiltak for å kontrollere for effekten av viral infeksjon, eksogene protein uttrykk, synlig lys, og mulige vev oppvarming effekter og gjenstander på dyrs atferd. Derfor bør den riktige kontrollgruppe består av dyr transdusert med en kontrollvirus (f.eks, GFP, EYFP, mCherry) som mottar identiske lys stimuleringsparametere. Eksperimentell verifisering er et avgjørende avsluttende trinn som de atferdsdata som brukes for analysen er helt avhengig av riktig opsin og fiberoptisk plassering i regionen av interesse . Nærmere bestemt, i dyr, hvor ingen immunhistokjemisk signal blir detektert, og hvor plassering av signal eller fibre er ikke i området av interesse, og deretter adferdsdata for at dyret skal fjernes fra forsøket. I tillegg er det viktig å teste lysutbytte på fiber tips både før kirurgisk implantering og igjen obduksjon for å sikre tilstrekkelig lys makt for opsin aktivering. I animals hvor alvorlig lystap har oppstått gjennom fiber etter eksperimentering (> 30%) 9, bør vurderes data for at dyret skal fjernes. Kriterier for fjerning bør etableres en priori. Til slutt må man ta hensyn til pulsfrekvens som kreves for å modulere signalimpulsene, som vil avhenge av hjernestrukturen og neuronal sub-typer blir målrettet. Publiserte optogenetic lette stimuleringsparametere eksisterer for flere neuronal sub-typer, men bør evnen til å modulere signalimpulsene være uavhengig bekreftet ved in vivo eller hjerneskiveelektrofysiologiske opptak.Som man blir dreven laserbruk og modifikasjon av laseroppsett, kan kombinasjoner av forskjellige bølgelengder bli bundet til flere fibre av et enkelt dyr, eller levert ned samme fiber for kombinatorisk optogenetics 8. Multi-bølgelengde stimulering vil bli stadig viktigere gitt den raske utviklingen av rød-shifted channelrhodopsins 8, prosjektering av blå-skiftet hyperpolariserer opsins 15, bruk av bistabile step-funksjon opsins 8,16,17, og den generelle utvide listen over opsins med distinkt aktivering spektra 11. Denne utvidelsen av optogenetic verktøykassen vil tillate enestående kontroll over flere nevrale sub-typer både innenfor og på tvers av hjernen for å bestemme deres rolle i styrende komplekse atferds stater.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Laser Set-up | |||
| 100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1) | Omicron | Luxx/Phoxx 473/488-100 | Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display |
| 100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1) | Colbolt | 0594-04-01-0100-300 | 04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers |
| 200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1) | Shanghai Lasers | GL532T3-200 | Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins |
| Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1) | OZ Optics | HPUC-23-400/700-M-20AC-11 | For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11 |
| Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1) | Thorlabs | MB1213 | For dual laser system |
| Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1) | Thorlabs | MB1012 | For single laser system |
| Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2) | Thorlabs | MB4 | For blue laser; dual laser system |
| Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4) | Thorlabs | CL3 | |
| 3/4" stainless post (quantity: 1) | Thorlabs | TR075 | |
| 1" stainless post (quantity: 4) | Thorlabs | TR1 | |
| Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2) | Thorlabs | PH1 | |
| Pedestal Base Adapter (quantity: 3) | Thorlabs | BE1 | |
| Small Clamping Fork (quantity: 3) | Thorlabs | CF1253 | |
| Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3) | Thorlabs | KM100-E02 | |
| Neutral filter density wheel (quantity: 1) | Thorlabs | NDC-50C-2M | |
| 1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1) | Thorlabs | DMLP505 | |
| Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1) | Thorlabs | KM100 | For dichroic mirror |
| 20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1) | Thorlabs | TC2 | |
| 1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1) | Thorlabs | HW-KIT2 | |
| Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1) | Thorlabs | BA1S | |
| FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2) | Thorlabs | ADAFCB1 | Dual FC/PC L-bracket also available |
| Breadboard lifting handles (quantity: 3) | Thorlabs | BBH1 | |
| Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1) | Thorlabs | FB450-10 | For use with diode lasers that spontaneously emit |
| 2. Laser Coupling | |||
| ! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength) | Various | ! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser | |
| Fiber optic cable tester (quantity: 1) | Eclipse | 902-186N | |
| One-step fiber connector cleaner (quantity: 1) | Thorlabs | FBC1 | |
| Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1) | Thorlabs | 0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system | |
| Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1) | Thorlabs | 0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system | |
| Doric mini cube (quantity: 2) | DORIC | DMC_1x2_FC-2FC | |
| Compact power and energy meter console (quantity: 1) | Thorlabs | PM100D | Digital 4" LCD |
| C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1) | Thorlabs | S130C | Multiple detectors types are available; check with vendor |
| 3. In vivo Optogenetic Stimulation | |||
| Multimode fiber splitters (quantity: 2) | FONT Canada | Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available | |
| Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1) | Rigol | DG1022 | Can control up to 2 lasers at once |
| Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8) | DORIC* | FRJ_1X1_FC-FC | *Also available through Thorlabs and Prizmatix |
| Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8) | DORIC | MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5 | Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9. |
| PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1) | Precision fiber Products | SM-CS1140S1 | Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end |
| Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1) | Thorlabs | CAPF | |
| Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1) | Thorlabs | CAPF1 | |
| Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4) | Thorlabs | 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering | |
References
- Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J Neural Eng. 4, S143-156 (2007).
- Sidor, M. M. Psychiatry's age of enlightenment: optogenetics and the discovery of novel targets for the treatment of psychiatric disorders. J Psychiatry Neurosci. 37, 4-6 (2012).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, 251-266 (2012).
- Nieh, E. H., Kim, S. Y., Namburi, P., Tye, K. M. Optogenetic dissection of neural circuits underlying emotional valence and motivated behaviors. Brain Res. 1511, 73-92 (2013).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 477, 171-178 (2011).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nat Protoc. 7, 12-23 (2012).
- Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Res. 1511, 21-32 (2013).
- Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nat Methods. 9, 159-172 (2012).
- Foutz, T. J., Arlow, R. L., McIntyre, C. C. Theoretical principles underlying optical stimulation of a channelrhodopsin-2 positive pyramidal neuron. J Neurophysiol. 107, 3235-3245 (2012).
- Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature. 471, 358-362 (2011).
- Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5, 247-254 (2010).
- Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463, 98-102 (2010).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14, 387-397 (2011).
- Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. A., Hegemann, P., Deisseroth, K.
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. J Vis Exp. , e50004 (2012).
- Gunaydin, L. A., et al.
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96, 1803-1814 (2009).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Goshen, I., et al. Dynamics of retrieval strategies for remote memories. Cell. 147, 678-689 (2011).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).
