Summary
שיטה מתוארת בליווי חזותי לניהול בחירות להרחבה, תפוקה גבוהות מספריות נוגדן סינתטיות קומבינטורית-מוצג הפאג נגד מאות אנטיגנים בו-זמנית. שימוש בגישה זו במקביל, יש לנו מבודד שברי נוגדן שמפגינים זיקה גבוהה וספציפיות לאנטיגנים שונים כי הם פונקציונליים בimmunoassays הסטנדרטי.
Abstract
הביקוש לנוגדנים אשר עונה על הצרכים של שני יישומי המחקר הבסיסיים וקליניים הוא גבוה ויגדיל באופן דרמטי בעתיד. עם זאת, נראה כי טכנולוגיות חד שבטיים מסורתיות לא לבד עד למשימה זו. זה הוביל לפיתוח שיטות חלופיות כדי לספק את הביקוש באיכות גבוהה וחומרים כימיים זיקה מתחדשים לכל האלמנטים הנגישים של proteome. לשם כך, שיטות תפוקה גבוהות לביצוע בחירות מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג כבר המציאו עבור יישומים הכוללים אנטיגנים מגוונים ומותאמות לתפוקה ולהצלחה מהירות. במסמך זה, פרוטוקול מתואר בפירוט שממחיש עם הפגנת וידאו בחירה המקבילה של שיבוטים Fab-הפאג מספריות גיוון גבוהות נגד מאות יעדים או באמצעות מערכת רובוטיקה אוטומטית מטפל נוזלי ידני 96 ערוצים או. שימוש בפרוטוקול זה, משתמש יחיד יכול ליצור מאות אנטיגנים,בחר נוגדנים להם במקביל ולאמת את הנוגדן מחייב בתוך 6-8 שבועות. מודגש הם: i) פורמט אנטיגן קיימא, ii) אפיון אנטיגן מראש בחירה-, iii) שלבים קריטיים המשפיעים על הבחירה של שיבוטים זיקה מסוימים וגבוהים, וiv) דרכים אפקטיביות בחירת ניטור ואפיון שיבוט נוגדן שלב מוקדם. עם גישה זו, השגנו ברי נוגדן סינטטיים (Fabs) לכיתות יעד רבות, כולל קולטנים יחידים לעבור קרום, הורמונים מופרשים חלבון, וחלבונים תאיים רב-תחום. הם שברים אלה יומרו בקלות לנוגדנים באורך מלא ואומתו להציג זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, הם כבר הוכיחו להיות פונקציונליים במגוון רחב של immunoassays הסטנדרטי כולל מערבי סופג, ELISA, immunofluorescence הסלולרי, immunoprecipitation מבחני בנושא. מתודולוגיה זו תאיץ גילוי נוגדנים וסופו של דבר יביא אותנו קרוב יותר למימוש המטרה of יצירת נוגדנים מתחדשים, באיכות גבוהה לproteome.
Introduction
עם תחילתו של עידן פוסט-גנומי, הזמינות של חומרים כימיים המחייבים באיכות גבוהה לאפיין ולווסת את החלבונים חיונית כדי לפתוח מחקר חדש ושדרות טיפוליות. נוגדנים ימשיכו להיות גורלי לשני חוקרים האקדמיים ותעשייתיים כמחקר בסיסי וכלי אבחון ותרופות פוטנציאליות. באופן לא מפתיע, חל גידול מרשים של חברות פיתוח נוגדן חוזה, שרובם להסתמך על טכנולוגיות hybridoma קונבנציונליות כדי לייצר נוגדנים מותאמים אישית. עם זאת, בחירה במבחנה באמצעות ספריות נוגדנים המוצגות הפאג הופכת טכנולוגיה חלופית רבת עוצמה שיכול להציע יתרונות ייחודיים והצלחה בו יכולות טכנולוגיות קונבנציונליות עומדות בפני מגבלות 1, 2.
לאור הביקוש הרב לנוגדנים באיכות גבוהה כמו כלי מחקר, שני אתגרים עיקריים ליצירת נוגדנים מתחדשים הם 1 תפוקת בחירה) ו -2) av אנטיגןailability. מספר הקבוצות עכשיו תאר בצינורות בחירת מבחנה שמטרתן להגדיל את התפוקה ושיעור זיהוי נוגדן. פירוט תיאורים אלה מגוון של גישות קיימא שכוללים בחירה על שני באורך מלא מטרות 3,4, או מבני הקשורים תחומים 5,6,7, או באמצעות 6,8 או צלחת מבוססת 3,4 תוכניות קיבוע אנטיגן מבוסס חרוז. בנוסף, האימוץ הגובר של טכנולוגיות סינתזת גן 9 הפך את דור אנטיגן שיטתי, במיוחד של תחומים מבודדים, עלות סבירה יעיל ואף עלול להקל על הקושי בהשגת כמות מספקת של אנטיגן המטוהר, באורך מלא. על ידי שימוש בשתי הטכנולוגיות במקביל, צינור עצמאי ודור אנטיגן מדרגי ובחירת הנוגדן תוכנן שיאפשר הבידוד המקביל של נוגדנים לקבוצות גדולות של תחומים אנטיגן הביעו ולהקל על הפיתוח של חומרים כימיים לצ'הracterizing מחלקות שלמות של חלבונים מבני או תפקודי הקשורות.
לקראת מטרה זו, צינור משולב שזוגות בזיהוי סיליקו של תחומים אנטיגן לבטאו, סינתזת גן, ביטוי חיידקי תפוקה גבוה של אנטיגנים ונוגדני בחירות המוצגות הפאג מדרגי פותחו. צינור זה דורש תשתית רק בסיסית זמינה לרוב מעבדות מדעי החיים (כוללים ספריות נוגדן אשר זמינות יותר ויותר באמצעות הסכם רישיון או העברת חומר), אבל הוא גם נוח לאוטומציה לשימוש בקנה מידה תעשייתית. שימוש בפרוטוקול זה, ניתן ליצור מאות תחומים אנטיגן-מתויג זיקה, והבודד באופן שגרתי שברי נוגדן ספציפיים מאוד לרב של אנטיגנים אלה.
טכנולוגיית תצוגת הפאג הראתה תאימות הפגינה עם מגוון רחב של פורמטים מגיב זיקת רקומביננטי כולל Fab, scFv, ותחומים Fv אוטונומיים ומערך הולך וגדל של "מסגרות אלטרנטיביות 'קטנות (חלבונים שנועדו חוזרים ankyrin (DARPINS), פיברונקטין (Fn), תחומים lipocalin ועוד 10). דיון מוגבל בדוגמא זו לבידודה של שברי נוגדן Fab, למרות שהוא בחזקת יכולות להיות מותאמות בשיטות אלה לסוגים אחרים של ספריות. באמצעות טכנולוגיה זו, Fabs עם זיקה של ננו-מולר נמוך לקטן, מתויג תחומים חלבון כוללים תחומים גורם שעתוק, תחומים SH2, חלבונים ואחרים מחייבים RNA נבחר בהצלחה, שרבים מהם לקשור חלבון באורך מלא ופונקציונליים בimmunoassays כגון immunofluorescence , Immunoprecipitation ואימונוהיסטוכימיה. חשוב לציין, שיבוטים המחייבים רקומביננטי מתחדשים באופן מלא ויכולים להיות מחדש שנוצרו מביטוי בונה באמצעות הנפקת ייצור חיידקים גדל עקביות, שחזור ועלות-תועלת, ובכך מצדיק את ההוצאה של אימות שיבוט קפדני.
בprot זהocol ווידאו המצורף, שיטות בסיסיות לבחירת נוגדנים מספריות המוצגות הפאג השתמשו בתחומי אנטיגן משותקים הם הפגינו. שיטה מסוימת זו מעסיקה תחומים חלבון מתויג GST משותקים על ידי ספיחה פסיבית בצלחות microwell, למרות תגים אחרים 11,12,13 ופורמטי בחירה 13,14,2 גם שימשו בהצלחה. שיקולים קריטיים להגדרה וההתנהגות של בחירות עם ניטור מקביל של פרמטרים בחירת מטרתו לאתר ובידוד נוגדנים משובטים במיוחד מועשר לאימות מפורטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antigen דור
הערה: תחומים Antigen יכולה להיות מסונתזת ומשובטת על ידי מגוון של ספקים מסחריים למבנה ביטוי IPTG-מושרה מתאים.
- להפוך מבני ביטוי לT1-הפאג כימי מוסמך, עמיד, BL21 E. תאי coli על ידי ערבוב 10 ng של קידוד DNA ב -20 μl של 1X KCM על קרח בצלחת גם PCR 96 ואחריו התוספת של 20 L של תאים כימיים מוסמכים.
- דגירה את תערובת התא / DNA על קרח למשך 20 דקות, בRT למשך 10 דקות ולאחר מכן על קרח שוב למשך 2 דקות לפני החילוץ עם מרק סופר אופטימלי מראש חימם 100 μl עם גלוקוז תקשורת (SOC), מכסים עם חותם צלחת לנשימה ורועד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ב 200 סל"ד בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר.
- μl 5 הצלחת של תאים הפכו לוריא-Bertani (LB) / צלחות אגר בתוספת carbenicillin (100 ג '/ מיליליטר) ולגדול O / N להשיג מושבות אחת המשמשות ליצירת מניות גליצרול.
- לחסן 1 מיליליטר של תקשורת / פחמימות 2YT עם מניית גליצרול 5 μl ולגדול במשך שעה 12 על 37 מעלות צלזיוס בבלוק 96 גם עמוק היטב עם הרועד בסל"ד 200 בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר.
- לחסן media15 NZY (בתוספת גלוקוז 0.05%, לקטוז 2%, ו- 100 גר '/ מיליליטר carbenicillin) עם דילול 01:40 של תרבות זו, ולאחר מכן ללחוץ במשך 6-8 שעות על 30 מעלות צלזיוס ו -200 סל"ד ב2.5 סנטימטר מסלולית שייקר.
- חיידקי גלולה ולטהר חלבוני אנטיגני בתפוקה גבוהה בצלחת מסנן 96-היטב המכילה שרף Ni-נ.ת.ע 100 μl לפי protocols16,17 שפורסם בעבר.
- קבע את הריכוז של חלבונים מטוהרים על ידי assay18 מחייב לצבוע ברדפורד ולאפיין לגודל ובטהרה על ידי הפרדה ויזואליזציה של מיקרוגרם 10-50 עם כתם Coomassie על ג'ל SDS-דף (ראה איור 2).
הערה: בשלב זה חלבונים יכולים להיות מאופיינים יותר על ידי שיטות שלהעריך צבירת חלבון 19 20, בהתאם לאופי של אנטיגן והדרישות של צינור הבחירה.
2. הכנה וכותרות של ספריית הפאג
- פיק מושבה אחת של E. T1 הפאג עמיד coli תאים לתוך 1 מיליליטר של תקשורת 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין.
- ברגע שצמיחת תאים הוקמה חזותית, לדלל את התרבות בנפח גדול יותר של 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין על מנת להבטיח נפח מספיק של תאים לזיהום (בדרך כלל 45 μl לדילול ספרייה, ראה להלן.).
- הכן את הספרייה לשימוש על ידי מזרז הפאג ממאגר אחסון עם 1 / נפח 5 של 20% PEG-8000 autoclaved, 2.5 M NaCl (PEG-NaCl) דוגרים על קרח למשך 30 דקות וpelleting זירז הפאג ידי צנטריפוגה ב 12,000 x ז.
- בטל supernatant וגלול זירז הפאג בנפח מתאים של pH 7.4 1x PBS, BSA 0.2% ו 0.05% Tween (PBT), התאמת to ריכוז הפאג מתאים לבחירות (במידת צורך), כדי להבטיח כיסוי ספרייה הולם. ראה שלב 2.9 ודיון.
- לדלל aliquot הפאג 5 μl לμl 45 של 1x PBS pH 7.4 בצלחת רב גם סטרילי, לערבב, וליצור סדרה של 10 דילולים לקפל באותו המאגר.
- הוסף 5 μl של דילול כל הפאג 45 μl של E הפאג עמיד T1. coli תאים בגידול שלב יומן (OD 600 = 0.4-.8) בצלחת אחרת multiwell, מכסים בחותם לנשימה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד בסל"ד 200 למשך 30 דקות בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר.
- צלחת 5 μl של תאים נגועים מכל אחת מהבארות לצלחת אגר מראש חימם בתוספת 100 ג '/ מיליליטר carbenicillin ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עד מושבות גלויות.
- לחשב את סך הפאג / ml כדלקמן:
הפאג / ml = מספר מושבות בצלחת carbenicillin במדגם x 200 x 10 i (כאשר i = num המקסימום לדלל ביותרבער של דילולים שבמושבות הן לכאורה). - כדי לקבוע את מספר בארות אנטיגן מצופים, כדי להבטיח כיסוי של גיוון הספרייה, לחשב באופן הבא:
נדרש מספר בארות אנטיגן מצופים =
כיסוי של פי רצוי * גיוון ספרייה
# של הפאג ל -100 μl
3. נוגדן מבחר מתוך ספריות-מוצג הפאג
3.1) Antigen קיבוע
- כדי להימנע להקפיא להפשיר מחזורים שיכולים להשפיע על איכות אנטיגן וכדי להקל על דילולים, להכין צלחת חלבון אנטיגן המניה מנורמלת ל100x ריכוזי עבודה (לדוגמא, 500 ג '/ מיליליטר) aliquot ולבלתי מחייבים 96-גם צלחות.
- הכן צלחות מצופים אנטיגן מפתרונות חלבון המניה ביום קודמים לכל סיבוב של בחירות על ידי דילול מצלחות המניה עם PBS.
- מעיל 96-גם צלחות קלקר גבוהות מחייב חלבון עם חלבון אנטיגן GST מתויג או p בקרה השלילי של 100 μlrotein (GST, BSA, neutravidin, וכו ') בשעה 5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS. Shake ב 250 סל"ד 4 ° CO / N על שייקר microplate.
- הסר פתרון חלבון ממצופה microplates, לחסום את הצלחות מצופים אנטיגן וסלקציה שלילית עם 200 μl חיץ חסימה (BSA 0.2% ב 1x PBS pH 7.4) ולנער ב 250 סל"ד ב RT במשך 1-2 שעות.
- לאחר החסימה, לשטוף את הצלחות מצופים חלבון החסום ארבע פעמים עם 200 μl של 1x PBS pH 7.4 עם Tween 0.05% (PT) חיץ באופן ידני או באמצעות מכונת כביסה microplate אוטומטית.
3.2) הספרייה טרום אישור וAntigen-הפאג דגירה
- רוקן את הספרייה של אי (או tag-) שיבוטים ספציפיים מחייבים-מוצג הפאג בר נוגדן באמצעות העברה של 100 μl (10 12 הפאג) של ספריית הפאג מוכנה במאגר PBT למספר הבארות מצופים בחלבון בקרה שלילי או תג זיקה חופשי חלבון (לדוגמא, GST) שווה ערך למספר מטרות דגירה הפאגבבארות במשך 1-2 שעות בRT עם הרעד ב 250 סל"ד.
הערה: כחלופי או אמצעים נוספים של סלקציה שלילית, דגירה יכולה גם להתבצע בנוכחות עודפת (5-25 מיקרומטר) תג חלבון מסיס זיקה (למשל, GST) כדי להסיר נוסף שיבוטים מחייבים תג ולשפר את התאוששות של יעד ספציפי מחייב שיבוטים. - supernatant ההעברה הפאג מסלקציה שלילית לצלחות מצופים אנטיגן דגירה במשך 1-2 שעות בRT עם הרועד בסל"ד 250 ללכידתו של שיבוטים המחייבים ספציפיים.
- הסר הפאג מאוגד ולשטוף בארות של microplate 8-15 פעמים עם חיץ PT באופן ידני או באמצעות מכונת כביסה microplate. הסר חיץ לשטוף עודף רק לפני elution.
3.3) Elution, זיהום והפאג הגברה
- מוקדם ביום בחירות, לאסוף מושבה אחת של E. T1 הפאג עמיד coli תאים לתוך 1 מיליליטר של תקשורת 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין ולגדול ב 37 מעלות wi Cה רועד ב 200 סל"ד בייקר מסלולית 2.5 סנטימטר או שווה ערך.
- ברגע שצמיחת תאים הוקמה וניתן לראות על ידי העין, להגביר את עוצמת הקול של מדיה עם 2YT בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר טטרציקלין על מנת להבטיח נפח מספיק של תאים לזיהום (בדרך כלל לבחירה 100 μl היטב).
- לגדול התאים עד OD 600 של .4-0.8 הוא הגיע (כ 5-7 שעות), ולאחר מכן לelute הפאג כבול להוסיף תאי 100 μl לצלחת אנטיגן שטף ולנער על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- להוסיף הפאג עוזר M13K07 לריכוז סופי של 1 x 10 10 CFU / ml ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות עם הרעד ב 200 סל"ד.
- העברת תאי 1.2 מיליליטר של 2YT בתוספת 150 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו -75 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin ב96-גם לחסום גם עמוק עם V-תחתון ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד בסל"ד 200 בכ -2.5 סנטימטר ייקר מסלולית.
3.4) הפאג הכנה וסיבובים חוזרים ונשנים של Selection
- חיידקי גלולה ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לערבב כמויות שווה של supernatants הפאג מצלחות לשכפל במיני-צינור 96-גם קופסא הכחולה microplate סטרילי, לנטרל עם 1/10 ה נפח של 10X PBT ומערבבים. סיבובים חוזרים של בחירה (החל מהשלב 3.1.1) במשך 3-4 סיבובים או עד ההעשרה הוא ציין (ראו סעיפים 4. ו7.) בהשוואה לחלבון בקרה שלילית.
הערה: בסיבובים המוקדמים של בחירה כאשר העשרה משמעותית / זיהוי לא צפויה (כלומר, סיבובים 1 ו -2), כימות של כתוביות קלט והפלט הפאג (שתוארו בסעיף 7 ותוצאות נציג שמוצג באיור 3) עשויה להיות מועילה בהבטחה ריכוזי מינימום הפאג לבחירות מוצלחות (שתוארו בדיון) והם יותר מתאימים מאשר ELISAs נקווה.
4. אפיון על ידי נקווה ELISA
- חלבון נקשרים 96-גם מעיל גבוהing צלחות קלקר עם של GST מתויג חלבון אנטיגן או חלבון בקרה שלילית (GST, BSA, neutravidin וכו ') 100 μl ב -2 מיקרוגרם / מיליליטר כאמור בסעיף 3.1 ולנער על 4 מעלות CO / N.
- הסר אנטיגן העודף, לחסום את הצלחת עם 200 μl של חיץ חסימה עם הרעד במשך 1-2 שעות בRT ב 250 סל"ד על שייקר microplate ולשטוף ארבע פעמים עם חיץ PT 200 μl ביד או על ידי מכונת כביסה צלחת אוטומטית.
- החל מsupernatant הפאג 100 μl (בדילול 1: 10-1: 20 במאגר PBT), לנער ב 250 סל"ד במשך 15 דקות ב RT, ולשטוף את הצלחת שמונה פעמים עם חיץ PT 200 μl.
- הוספה של אנטי-M13-HRP 100 μl (1: 5,000 במאגר PBT). Shake ב 200 סל"ד במשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת שש פעמים עם חיץ PT 200 μl ופעמים עם 200 μl של PBS.
- החל מיום 1 ב100 μl: מצע TMB 1 ולפתח במשך 5-15 דקות (או עד שצבע משמעותי פיתח), ואז לעצור את התגובה על ידי תוספת של של 1 MH 3 100 μl 4 ולקרוא את הצלחת ב 450 ננומטר.
- באופן כללי, להעשרה בבריכות הפאג ניתן לצפות בסיבובים 3-4 כיחס ספציפי מחייב לעומת מחייב הלא ספציפית של> 2 (ראה איור 4)
הערה: זה אינפורמטיבי לציין אות מחייבת מוחלטת שגבוהה בחלבון תג הזיקה מציין העשרת קלסרים תג ספציפי (ולא קלסרים יעד), ושהאות מחייבת המוחלטת גבוהה בחלבון הבקרה השלילי מצביעה על העשרה שאינה ספציפי או " קלסרים דביקים ".
5. Clone בחירה, סידור ואפיון
5.1) בידוד של המשובטים Fab-הפאג יחיד
- כדי לבודד שיבוטים בודדים עבור סידור ואפיון, להדביק 1/10 ה נפח של בריכת הפאג המוגבר לE. הפאג עמיד T1 coli תאים בשלב יומן של צמיחה (OD 600 = 0.4-.8) בצלחת microtiter מסביב לתחתית, מכסים בbreathaחותם צלחת ble דגירה עם הרועד ב 200 סל"ד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הכן דילולים סדרתי של פי 10 בתקשורת 2YT וצלחת על צלחות אגר נפרדות בתוספת 100 ג '/ מיליליטר carbenicillin.
- פיק מושבות אחת בעד 450 μl של תקשורת 2YT / פחמימות בתוספת 1 x 10 9 M13K07 הפאג / מ"ל ולגדול O / N במיני-צינור 96 קופסא הכחולה microplate היטב סטרילי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 200 סל"ד.
- חיידקי גלולה ידי ספינינג ב 4000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- supernatant הפאג המשובט יכול לשמש לריצוף של שיבוטים Fab-הפאג (כמתואר בסעיף 5.4) או למשובט ELISAs כדי לקבוע סגוליות נגד אנטיגנים משותקים (כמתואר בסעיפים 5.3 ו -21) שלתוצאות נציג מוצגות באיור מחייב ישיר 5.
5.2) ביטוי של השיבוטים Fab לאפיון
- בעקבות שיבוט לדואר מתאיםוקטור Xpression (ראה דיון), להרים E. אחת coli מושבות הפכו עם ביטוי בונה בעד 1 מיליליטר של תקשורת / פחמימות 2YT בצלחת 96 עמוקה היטב היטב באמצעות קצה קיסם או פיפטה סטרילית ולגדול ל12-16 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 200 סל"ד. ניתן לעשות זאת באופן ידני או עם בורר מושבה אוטומטית.
- ההעברה 40 μl של תרבות גדלה ל -1.5 מיליליטר של תקשורת NZY בתוספת גלוקוז / לקטוז / גליצרול בבלוק גם deepwell 96 לפי המתודולוגיה של et al למדן. 15
הערה: לחלופין, ניתן לגדל תאים במשך 3-4 שעות (OD .8-1.0) בביטוי בתוספת שאינו וחלבון הנגרם על ידי התוספת של 1 מ"מ IPTG. - מכסה את גוש התרבות (ים) עם חותם לנשימה ולהביע את השיבוטים Fab במשך 6-8 שעות על 30 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 200 סל"ד. צלחות ספין ב 4000 XG במשך 15 דקות עד גלולה תאי חיידקים, להסיר את supernatant, צלחות כיסוי עם חותם נייר כסף ולהקפיא כדורים ב -20 ° C עד תמוגה.
- לשחרר Fabs הביע מכדורים שנאספו עם של חיץ תמוגה 100 μl (טריס HCl 50 מ"מ, 200 מ"מ NaCl, pH 1.25% Triton X-100 8.0 עם 1 מ"ג / מיליליטר יזוזים ו -10 מעכבי benzonase / תרבות ופרוטאז מיליליטר U) ורועד עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
- הסר פסולת תא על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולאסוף supernatant lysate הגולמי לשימוש באפיון ראשוני של הספציפיות על ידי צלחות ELISA (ראה סעיף 5.3).
5.3) אפיון Clone על ידי ישיר כריכה המשובטת Fab ELISA
- לשתק אנטיגנים כמתואר בסעיף 3.1 במקום aliquotting 30 μl של 2 מיקרוגרם אנטיגן / מיליליטר PBS לבארות של צלחת גם 384. פריסות אנטיגן מבוסס Quad בצלחת יכולות להקל על העברה מגיב בעת שימוש 96 ראשים מחלק המבוסס על ערוץ. לשטוף וצלחות ELISA בלוק כאמור בסעיף 3.1.
- lysates פינה נאסף מ סעיף 5.2 ניתן ליישם ישירות לאנטיגן המשותק לevaluation של כריכה. דגירה 30 μl של lysate לכל גם במשך 15 דקות ב RT עם הרעד ב 200 סל"ד.
הערה: חלבון שיבוט מזוקק Fab יכול לחלופין לשמש על ידי דילול עד 10 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר PBT ויישום 30 μl של כל שיבוט לבארות חסמו המכיל אנטיגן או חלבון בקרה שלילי (GST, BSA וכו ') ופיתוח באותו אופן שתואר להלן. לחלופין, Fab-הפאג יכול לשמש גם על ידי דילול 10 μl של supernatant הפאג (שתואר בסעיף 5.1) ב -20 חיץ μl PBT (1: 3) וגילוי עם נוגדנים אנטי-M13-HRP (שתואר בשלבי 4.4-4.5) - הסר lysate העודף ולשטוף בארות באופן ידני או באמצעות צלחת אוטומטית שטפה 8x עם 100 μl של חיץ PT ולהסיר חיץ עודף.
- דגירה 30 μl של דילול 1: 5000 של נוגדן אנטי דגל המשני במאגר PBT למשך 30 דקות ב RT עם הרעד ב 200 סל"ד.
- לשטוף, לפתח ולכמת לפי סעיפים 4.3-4.5.
הערה: נציגי תוצאותשיבוטים המחייבים שני ספציפיים ולא ספציפיים הממחישים מוצגים באיור 5.
5.4) רצף Clone
- הכן תערובת אמן PCR כפי שצוין בטבלה 2.
- הוסף 2 μl של תבנית PCR המתאימה (או supernatant הפאג או מושבה המכיל phagemid אחת מחדש מושעה חיידקים) 20 μl של תמהיל אב PCR מוכן עם פריימרים המתאימים בבארות של צלחת PCR.
הערה: תערובות הורים נפרדות הנדרשות לקביעת רצף של שני גני השרשרת הכבדים וקלים. - הפעל את תגובת PCR באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 2 - הגדרות PCR.
- ודא הצלחה של תגובת PCR על ידי ערבוב 5 μl של התגובה השלימה עם צבע טעינה על 1% agarose ג'ל בתוספת כתם ההדמיה DNA והדמיה על transilluminator 300 ננומטר.
- הוסף 2 μl של מוצר ה- PCR עד 10 μl של מים סטריליים המכילים 0.2; Μl כל אחד מphosphatase exonuclease ואלקליין השרימפס ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ואחריו איון אנזים ב 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר פריימרים עודפים כהכנה לריצוף.
6. Scaling לבחירות אוטומטיות
6.1) טיפול נוזלי מבוסס פיפטה
- הכן 1% (w / v) bromophenol הכחול במים ולהסיר חלקיקים מסיסים באמצעות מסנן 0.45 מיליליטר.
- כדי לקבוע את הטווח ליניארי של הספיגה על קורא הצלחת, להכין דילול 1: 1000 של הפתרון הכחול bromophenol 1% במים, ולהמשיך עם שני פי דילולים סדרתי (16 דילולים סך הכל).
- העבר את כל דילול 100 μl לצלחת גם שטוחה 96 תחתון ולקרוא את הספיגה ב 590 ננומטר. ספיגת העלילה מוחלטת מול גורם לדילול ולבחור דילול באמצע לקצה גבוה של הטווח ליניארי לבדיקות שלאחר מכן.
- להוסיף bromophenol הכחול למים או לפתרון האמיתישיהיה pipetted מבוסס על הדילול נבחר בשלב הקודם בנפח מספיק לpipetting לשלוש 96 צלחות גם, בתוספת הנפח המת במאגר.
- לכייל pipettor ערוץ אחד כדי לספק את בדיקת הנפח ידי pipetting מים על איזון וניתוח (מים 100 μl שוקל בRT 100 מ"ג.)
- השימוש בpipettor המכויל, להעביר את בדיקת הנפח של הפתרון הצבוע לפחות שלוש בארות של צלחת גם שטוחה 96 תחתון ולקרוא absorbances ב590 ננומטר, בשלושה עותקים.
- שוקל שלוש צלחות גם ריקות שטוחות תחתונה 96 על איזון אנליטיים ולהקליט ההמונים שלהם.
- פיפטה בדיקת נפח ממאגר לכל אחת משלוש 96 צלחות גם ולמדוד absorbances ב590 ננומטר, בשלושה עותקים.
- לשקול כל צלחת ולחשב את ההבדל במסה.
- ראשית, להעריך אם absorbances בכל טוב הוא אחידים בטווח של סובלנות (לדוגמא., +/- 5%) ובין אם הם עולים בקנה אחד עם הabsorbances דואר מתקבל על ידי יד pipetting עם pipetman המכויל. אם ערוצים מסוימים הם מעל או מתחת למתן-באופן עקבי (למשל ראה איור 6), בצע את הליכי תיקון ולחזור על תהליך ההערכה עד שכל הערוצים לספק כמויות אחידות.
- שנית, ברגע שכל הערוצים אישרו לספק כרכים אחידים, לבדוק את הדיוק של נפח שעל ידי חישוב ההפרש המסה הממוצע, בכל טוב. לדוגמא, קבוצת מטפל הנוזלי מכויל באופן מושלם עבור 100 μl תספק 9.60 גרם של מים לכל צלחת, או 0.10 גרם של מים בכל טוב. אם הנפח האמיתי נמסר הוא מעל או מתחת לנפח המיועד באופן עקבי, אז גורם תיקון יכול להיות מיושם, כלומר, תכנות 110 μl כדי לספק בעצם 100 μl.
הערה: לנפחים קטנים, למשל, 10 μl, השתמש פי עשרה יותר bromophenol כחול בפתרון הצבוע, ולפני aliquot 90 μl מים ל96 הצלחות גם ביד, על מנת להבטיח כי absorbances הוא למדידה וירידה בטווח ליניארי.
6.2) כביסה צלחת אוטומטית
- לשתק יעד חיובי וחלבוני בקרה שליליים בבארות נפרדות של 96 גם microplates (שתי צלחות לכל מצב להיבדק) כמפורט בסעיף 3.1.
- לחסום אתרי קישור הלא ספציפי על ידי דגירה עם חסימת פתרון עבור שעה אחת ב RT.
- להוסיף aliquots 100 μl הזהה של 10 13 CFU / mL פתרון Fab-הפאג בPBT לכל הבארות בכל הצלחות מחייבים לכוון ודגירה עם תסיסה עדינה ב RT עבור שעה 2.
- לשטוף שתי צלחות על פי כל תנאי, צלחת אחת לזיהום וטיטרציה וצלחת אחת לELISA.
- להעריך את היעילות של השטיפה על ידי זיהום חיידקים ישיר ולטיטרציה (כמתואר בסעיף 3.3 (ללא תוספת M13K07) ו7.2.1) או פיתוח עם אנטי-M13 נוגדן HRP ומצע colorimetric (כמפורט בסעיף 4).
- fr כתוביות הפאגאום שיבוטים ספציפיים לעתים קרובות להניב בטווח של 10 הפאג 5 -10 7 / מיליליטר מחלבון משותק נגד שהשיבוט נקשר באופן ספציפי. חלק שייר הקישור לחלבון שלילי שליטה (לדוגמא, BSA) הוא צפוי ובדרך כלל 10 2 -10 5 הפאג / ml הם נצפו, אך כתוביות נמוכות מאוד (כלומר., <10 1) יכולות לאותת כביסה יתר על המידה מחמירה, שיכול להתפשר בחירה.
- להפאג הכריכה נקבע על ידי ELISA, להשוות את האותות המחייבים מוחלטים לחלבוני בקרה חיוביים ושליליים כדי לקבוע אם הכביסה רובוטית היא שווה ערך לתוצאות הוקמו שטיפת ידיים (איור 7).
6.3) חיטוי מכונת כביסת פלייט
- כדי להתחיל, להפעיל את פרוטוקול הטיהור להיבדק.
הערה: אנו ממליצים על שימוש לפחות פעמיים בסך הכל קו הנפח, וראש ולספוג את הראש מכונת הכביסה במשך 5 דקות ב0.5% נתרן היפוכלוריט fr, טרי מדוללאקונומיקה מסחרית om (בדרך כלל 6% היפוכלוריט נתרן). - ראש ולספוג את הראש מכונת הכביסה במשך 5 דקות במים סטריליים (autoclaved) ולבסוף, ראש המערכת עד הקווים מלאות באוויר.
- ראש הקווים עם מים סטריליים או חיץ לשטוף.
- לשטוף microplate 96 גם סטרילי פעם, להסיר ממכונת הכביסה וחותם עם חותם צלחת סטרילית. זה צלחת השליטה מראש זיהום.
- Aliquot של O 100 μl / N מוגבר supernatant תרבות הפאג לכל הבארות של צלחת 96 באר.
- לשטוף את הצלחת המכיל הפאג פעם אחת, ולאחר מכן להסיר ממכונת הכביסה וחותם עם חותם צלחת פלסטיק או נייר. זה צלחת שליטת זיהום.
- לבצע את פרוטוקול הטיהור נבדק. בדוגמא זו, חזור על השלבים 6.3.1 ו6.3.2.
- לשטוף microplate סטרילי פעם אחת, ולאחר מכן להסיר ממכונת כביסה וחותם. זהו מבחן צלחת טיהור.
- צלחת 50 μl של שלב א 'יומן coli לצלחות טיטרציה; זה מראש infecצלחת שליטת tion.
- לפרוץ דרך מראש זיהום, זיהום וטיהור 96-גם צלחות ולהוסיפו של ע '100 μl coli בשלב צמיחת יומן-שלב לכל הבארות, באמצעות טיפים חדשים לכל אחד.
- לאטום ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 200 סל"ד.
- צלחת 50 μl של תאים נגועים משלוש בארות של כל צלחת 96-גם לצלחות 2YT / פחמימות 10 סנטימטרים אקראיים ולדגור על 37 מעלות CO / N.
- העברת 50 μl של תאים נגועים מכל הבארות של כל צלחת לצלחות גם עמוקות המכילות 1 מיליליטר 2YT בתוספת 100 ג '/ מיליליטר carbenicillin לכל טוב ולגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס.
- חזור על פרוטוקול הטיהור ולהשאיר את מכונת הכביסה קווי ייבוש.
הערה: לא O צמיחה / N על צלחות או במדיום נוזלי יש לשים לב על צלחות שליטה מראש זיהום, שליטה מראש זיהום או מבחן טיהור. רבות מושבות וצמיחה צריכים להיות שנצפו על צלחת שליטת זיהום; אם לא, אין מסקנות לגבי היעילות שלפרוטוקול טיהור יכול להתבצע. באופן אידיאלי, צלחות הטיהור תניב שום מושבות ולא O צמיחה / N בכל אחת מהבארות בO / צלחות N. ההחמרה של פרוטוקול הטיהור יכולה להיות מוגברת עם ריכוזים גבוהים יותר אקונומיקה, יותר לספוג פעמים ומחזורים נוספים.
7. קלט / פלט titrations
7.1) titrations הפאג הקלט
- לדלל aliquot 5 μl של הפאג 50 μl עם PBS-מסונן סטרילי ומערבבים.
- הכן דילול של פי 10 סידורי בPBS-מסונן סטרילי עד 10 10 באמצעות פיפטה רבת-ערוצית או pipettor 96 ערוץ.
- לחסן 5 μl של הפאג מדולל בעד 45 μl של א 'T1 הפאג עמיד תאי coli ביומן-שלב של צמיחה (OD .6-.8) ודגירה מכוסה חותם נשימה למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- 5 μl הצלחת של תאים נגועים ל/ צלחת אגר LB בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin דגירה O / NC ° 37 t.
- ריכוז הפאג ניתן להעריך מהמדגם לדלל ביותר שבו מופיעות מושבות על פי החישובים המפורטים בסעיף 2.8.
7.2) פלט הפאג Pitrations
- בעקבות elution של הפאג-מחויב צלחת על ידי התוספת של א ' coli תאים, לדלל aliquot 5 μl של תאים נגועים בהפאג 50 μl עם תקשורת 2YT autoclaved
- הכן דילול של פי 10 סידורי בתקשורת 2YT autoclaved 10 6 בעזרת פיפטה רבת-ערוצית או 96 pipettor ערוץ.
- צלחת 5 μl של תאים נגועים לצלחת אגר בתוספת 100 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
- ריכוז הפאג ניתן להעריך מהמדגם לדלל ביותר שבו מופיעות מושבות על פי החישובים המפורטים בסעיף 2.8.
הערה: בשני המקרים (כלומר, כתוביות קלט והפלט הפאג, (cel כולל השוואה עם מספרי מושבה בשני טטרציקליןמספר יב) וkanamycin (titre הפאג עוזר) יכולים גם להיות אינפורמטיבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר במסמך זה נעשה שימוש כדי לבודד ברי נוגדנים למגוון רחב של תחומים שני אנטיגן structurally- והקשורים-תפקודי מספריות Fab קומבינטורית-מוצג הפאג במקביל. נושאים הקשורים לזמינות אנטיגן ניתן לעקוף, במקרים רבים, על ידי זיהוי בסיליקון ושל תחומים אנטיגן לבטאו שמתאימים לבחירת נוגדן 23. על ידי צימוד ביטוי אנטיגן לבחירת נוגדנים באותה המעבדה (איור 1) הוא הופך להיות אפשרי על מנת לבנות צינור משולב, שבו ניתן לשלוט בפרמטרי אנטיגן קריטיים לבחירה בקלות רבה יותר. ברוב המקרים, נחישות זהירה של גבולות תחום מאפשרת ביטוי ובידוד של כמויות מספיקות של אנטיגן מספיק טהור מביטוי תפוקה הגבוהה ב 96 או 24 צלחות גם deepwell (איור 2) לשימוש מוצלח בבחירות נוגדן. במהלך רצוףסיבובים של תהליך הבחירה, ניתן לנטר ריכוזי eluted הפאג והעשרה של הפאג שדווקא לקשור אנטיגן או על ידי טיטרציה הפאג (איור 3) או עם בריכות הפאג בassay ELISA (איור 4). יחס מחייב (> 2) בדרך כלל מעיד על קיומו של שיבוטים המחייבים ספציפיים. לעומת זאת, יחס נמוך (<2) יכול לעזור לקבוע את הגורם לכישלון בחירה. לדוגמא, יחס <2 עם OD שאינו ספציפי גבוה יכול להצביע על ההסרה מספקת של שיבוטים שאינם ספציפיים (או קלסרים דביקים) ועשוי להצדיק אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול הבחירה. עם זאת, ברגע שההעשרה מזוהה, אז יכולים להיות מבודדים שיבוטים זיקה גבוהה בודדים עבור סידור ואפיון. Clone כריכה יכול להיות מאופיין בimmunoassay colorimetric ומאפשר השוואה של מחייב של Fab-הפאג או Fab לאנטיגן המשותק לעומת חלבון בקרה שלילי, מניב מידה של העשרה (יחס של היקשרות לת"אr קבל לעומת חלבון בקרה שלילי או חלבון תג זיקה) (איור 5).
במהלך קנה מידה ואוטומציה של שיטה זו, הערכה של פונקציות מפתח של יחידת טיפול בנוזל יכולה להיות מועילה כדי להבטיח פעולה תקינה ומדויקת עם פתרונות דומים לאלה המשמשים בבחירות בפועל. השימוש בchromophores קליטה בפתרונות יכול לעזור לזהות כאשר ערוצים ספציפיים בfluidics (שאיפה או מחלק) סתומים או איבדו את החותם וכתוצאה מכך משלוח נפח חלקי כפי שמודגמים באיור או 6. יחידות שטיפה אוטומטיות יכולות להיות גם מקור של השתנות ויכול לדרוש תשומת לב. השימוש בשיבוטים המחייבים ידועים מאפשר השוואה של מחייב בין חלבון בקרת היעד כדי להבטיח יעד שמחייב נשמר תוך רקע הכריכה הוסר (איור 7), כאשר פרמטרים לשטוף כגון מהירות מחלק, כרכים לשטוף ומספר שוטף מתבצעים מותאמים. הבאהשימוש במכונת כביסה צלחת אוטומטית עם פתרונות הפאג, פרוטוקולי טיהור יעילים נחוצות כדי להבטיח את היעדרם של זיהום צולב מסיבובים רצופים של בחירות או הליכי בחירה שונים ומדריך / פרשנות פתרון בעיות מסופק בטבלה 3.
סקירה כללית 1. איור -. ייצור אנטיגן תפוקה גבוהה וצינור בחירת נוגדן סקירה זו מציגה הדמיה צעד-אחר-צעד של דור אנטיגן ונוגדן בחירת צינור נציג. זיהוי בסיליקון ושל גבולות תחום אנטיגן מאפשר סינתזת גן, ביטוי ובחירה על תחומים לחלבונים שעשויים להיות מאופיינים בצורה גרועה. תחומים אנטיגן הביעו הם משותקים ומשמשים כדי לבודד בריכות של שיבוטים נוגדן זיקה גבוה ספציפיים משיתוףספריית נוגדן mbinatorial מוצגת על פני השטח של הפאג פילמנטיות. בריכות של נוגדן-הפאג eluted והמוגברים מאנטיגנים בודדים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לפקח על העשרה עגולה לסיבוב-שיבוטים המחייבים ספציפיים במבחנים מבוססי ELISA השוואת יעד משותק לעומת חלבון בקרה שלילי לפני הבידוד של שיבוטים המחייבים פרט לאפיון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ההדמיה SDS-PAGE של אנטיגנים מתויג זיקה. SDS-PAGE נציג-6X HIS-GST מתויג תחומים הביעו ומטוהרים אנטיגן (5-10 תחום kDa + 26 kDa GST) זוהה במקור על ידי בניתוח סיליקו של אנטיגן גבולות תחום. תחומים חלבון ביטאו ומבודדים על ידי Affiטיהור nity מתאפיינת בSDS-PAGE לפני בחירות כדי להבטיח את זהות המבוסס על גודל, תשואות נאותות וטוהר כדי לאפשר שימוש בבחירות הפאג-נוגדן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ויזואליזציה של כתוביות פלט הפאג. כתוביות פלט הפאג נקבעות על ידי ציפוי את התאים נגועים בהפאג על סדרת דילול של פי 10 על תקשורת אגר בתוספת אנטיביוטיקה שונות (טטרציקלין, carbenicillin וkanamycin) כדי לקבוע את הדילול הנמוך ביותר שבו מושבות ניתן לצפות ולהעריך את מספר הפאג מחויב למקד אנטיגן וeluted. אנא לחץ כאן לצפייה גדולהגרסת r של נתון זה.
איור 4. יחס עקידת היעד לחלבון בקרה שלילי על ידי ELISA ונקווה. התקדמות ההעשרה ניתן להעריך סבבי הבחירה הבאים על ידי הקרנת eluents מוגברת פרט נגד שני מטרות הספציפיות וחלבוני בקרה שליליים ו / או תג זיקה מבודד. מוצגים בעלילה הם יחסי העשרה לכריכה של 96 בריכות הפאג-נוגדן בודדים נגד 96 אנטיגנים שלהם לעומת חלבון בקרה שלילי במקביל. כל ערך יחס נגזר משתי מדידות ספיגה שלכמת מחייב של בריכת הפאג לאו יעד או חלבון בקרה שלילי באמצעות נוגדן התמזגו-HRP ספציפי לחלבון מעיל הפאג M13. סף יחס של 2 או יותר (לעתים קרובות הנע 2-10 או יותר כפי שהוא מתואר באדום) משמש כאינדיקציה להעשרהוהנוכחות הסבירה של שיבוטים המחייבים ספציפיים. יחסים פחותים יכולים לסמן כישלון או נושאים ספציפיים עם הבחירה שעשויה להצדיק אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. Fab-הפאג ישיר מחייב משובט או Fab ELISA. מחייב של שיבוטים בודדים (בין אם בFab-הפאג או בפורמט Fab) יכול להיות מוערך על ידי assay מבוסס ELISA לעומת חלבון משותק ב384 צלחות גם. כריכה מזוהה באמצעות נוגדן התמזגו-HRP המשני נגד חלבון מעיל M13 על Fab-הפאג או תג זיקה על Fab. ערכי ספיגת גלם לכריכה של Fab-הפאג משובט למקד אנטיגן, חלבון בקרה שלילי ותג זיקת אנטיגן (GST) מתוארים ממחישים דו ספציפייםnders (A01, A04, A06), וקלסרים דביקים (A05).
איור 6. הערכת הכרכים לוותר על ידי יחידת טיפול הנוזלי אוטומטית. משלוח עקבי ומדויק של כרכים שהתכוונו מערכות pipetting 96-היטב רובוטית או ידניות ניתן להעריך באמצעות פתרונות צבועים וקורא צלחת. בדוגמא זו, 10 μl של bromophenol כחול תמיסה המכילה הוא ברצף pipetted לכל הבארות של שתי 96 צלחות גם באמצעות תיבת קצה אחד. כל הטוב מכיל 90 μl / גם DH 2 O, מקביל לתוספת של הפאג העוזר לE. הנגוע coli. absorbances של כל צלחת ב590 ננומטר נקרא בשלושה עותקים, וכרכי אינטרפולציה מעקומת סטנדרט מוכנים באמצעות pipetman ערוץ אחד מכויל. כרכים נמסרו לשורה אחת על הצלחת הראשונה ושנייה מוצגים. שים לב שעל עצי האשוחצלחת t, גם E04 מקבל שום פתרון צבוע, ועל הצלחת השנייה, הוא מקבל נפח כפול. זה מצביע על כך מגע הקצה אינו מספיק למסירה עקבית, ודורש אופטימיזציה נוספת. מרווחי ביטחון של 95% למדידות ספיגה שלושה עותקים מוצגים.
איור 7. הערכה של שטיפת צלחת אוטומטית. ההסרה יעילה של הפאג מאוגד ניתן להעריך באמצעות ELISA למדוד Fab-הפאג מחייב חיובי משותק (נוגדן אנטי-FLAG) וחלבונים שליליים שליטה (BSA), בעוד שישנה את התנאים לשטוף. בדוגמא זו, קלט הפאג מקביל לספרייה נאיבית (10 13 CFU / ml בPBT) מוסר באמצעות שמונה או שישה עשר שטיפות, ביד או באמצעות הרובוט. הפאג שיורי מחייב BSA הוא זהה בכל התנאים, כפי שהוא ספציפי מחייבים נוגדן אנטי דגל משותק, הודיating כי בקצב זרימה נמוך, שתי השיטות הן שווי ערך ומספיק מחמירות. מרווחי ביטחון של 95% מבארות כפולות מוצגים.
| פתרונות | |||
| תקשורת 2YT - מוסיף מים עד 1 ליטר, להתאים את ה- pH 7.0, וחיטוי. | תמצית שמרים | 10 גרם | |
| tryptone | 16 g | ||
| NaCl | 5 גרם | ||
| תקשורת NZY (1 ליטר) | NZ אמין | 10 גרם | |
| תמצית שמרים | 5 גרם | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 מיליליטר | ||
| מניית 20 מלח | 50 מיליליטר | ||
| 50x מניית סוכר ZYM-5052 (1 ליטר) | גלוקוז | 25 גרם | |
| לקטוז | 100 גר ' | ||
| גליצרול | 250 מיליליטר | ||
| מניית 20x מלח (1 ליטר) | Na 2 4 HPO | 500 מ"מ | |
| KH 2 PO 4 | 500 מ"מ | ||
| NH 4 Cl | 1 M | ||
| Na 2 SO 4 | 100 מ"מ | ||
| Carbenicillin (פחמימות): | 100 מ"ג / מיליליטר במים. סנן לעקר. | ||
| Kanamycin (Kan): | 25 מ"ג / מיליליטר במים. סנן לעקר. | ||
| טטרציקלין (ט): | 10 מ"ג / מיליליטר במים. סנן לעקר. | ||
| PEG-NaCl | PEG | ||
| NaCl | 2.5 M | ||
| 1x PBS (pH7.2) | NaCl | 137 מ"מ | |
| KCl | 3 מ"מ | ||
| Na 2 4 HPO | 8 מ"מ | ||
| KH 2 PO 4 | 1.5 מ"מ | ||
| 1X KCM | KCl | 500 מ"מ | |
| CaCl 2 | 150 מ"מ | ||
| MgCl 2 | 250 מ"מ | ||
| SOC מדיה | תמצית שמרים | 5 גר '/ ליטר | |
| tryptone | 20 g / L | ||
| NaCl | 10 מ"מ | ||
| KCl | 2.5 מ"מ | ||
| 4 MgSO | 20 מ"מ | ||
| גלוקוז | 20 מ"מ | ||
| חסימת חיץ | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| מאגר PBT | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| Tween | 0.05% | ||
| מאגר PT | PBS | 1x | |
| Tween | 0.05% | ||
| חומצה זרחתית | H 3 P0 4 | 1 M | |
מדיה טבלה 1. ופתרונות.
| MASTER-MIX SET-UP PCR </ Strong> | |||
| רכיב | μl לכל תגובה | ||
| מים | 19.45 | ||
| חיץ 10x תקי | 2.5 | ||
| dNTPs (10 מניות מ"מ) | .675 | ||
| DMSO | 0.75 | ||
| אנזים תקי | 0.125 | ||
| קדימה פריימר (100 מניות אום) | 0.25 | ||
| פריימר ההפוך (100 מניות אום) | 0.25 | ||
| Primers רצף שרשרת כבדה | |||
| פריימר M13 קדימה | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| פריימר M13 ההפוך | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Primers רצף שרשרת אור | |||
| פריימר M13 קדימה | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| פריימר M13 ההפוך | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| הגדרות PCR | |||
| שלב 1. | 94 מעלות צלזיוס למשך 3:00 דק ' | ||
| שלב 2. | 94 מעלות צלזיוס במשך 00:30 דקות | ||
| שלב 3. | 55 מעלות צלזיוס במשך 00:30 דקות | ||
| שלב 4. | 72 מעלות צלזיוס במשך 01:00 דקות | ||
| חזור לשלב 2 וחזור 24x | לקפוץ לשלב 2 | ||
| שלב 5. | 72 ° C ל7:00 דק ' | ||
| שלב 6. | |||
טבלת 2. PCR מיקס מאסטר והגדרות.
| פרשנות של תוצאות טיהור | |||
| צלחת | כייל carbenicillin צפוי | אם לא? | |
| שליטה טרום זיהום | 0 | תאים היו מראש נגועים; שום דבר לא ניתן להסיק מהניסוי. | |
| שליטת זיהום | דשא | זיהום לא מספיק כדי להיות מסוגל להעריך את היעילות של טיהור שלאחר מכן; לשקול הצללה סעפת בפתרון הפאג ולא aspirating זה. | |
| מבחן טיהור | 0 | טיהור לא להשלים; להגדיל להשרות זמן, Concentra אקונומיקהSDS tion או לנסות ושוטף EtOH במקום. | |
טבלת 3. הערכה של טיהור מכונת כביסה. כדי לקבוע את היעילות של טיהור, יש צורך להראות מכונת הכביסה שהייתה מזוהם בהפאג, וכי פרוטוקול הטיהור בוטל בהצלחה כי זיהום. באמצעות הפאג מקנות carbenicillin התנגדות, התוצאות הצפויות ממבחן כזה מופיעות, יחד עם הצעות שונות צריכה התוצאה האמיתית מהתוצאה הצפויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעת ביצוע בבחירות נוגדן מבחנה, שני גורמים העיקריים להצלחה הם בחירת 1) הבידוד של מטרות אנטיגני מקופלות היטב לבחירה על ו -2) הזמינות של ספריית נוגדן גיוון תפקודית גבוהה. במקרים רבים, את הזמינות של כמויות מספיקות של מקופל היטב, חלבון באורך מלא יכולה להיות מגבילה. גישה אחת להתגברות על מגבלה זו היא להשתמש בתחומים שזוהו מניתוח bioinformatic 22 ומסונתזים להכנסה לתוך וקטור ביטוי חיידקים עם תג זיקה מתאים.
יש מגוון של תגים שמשמשים ביישומים ביוטכנולוגיים להגדלת מסיסות, להקל על טיהור ולייצב תחומים יציבים. 11 היכולת לסנתז כמעט כל רצף להכניס רצוי מאפשר פלטפורמת דור אנטיגן תכליתית מאוד. למרות שהפורמט מתויג GST הוא נפוץ, תוצאות מוצלחות היו בעברשהושג באמצעות hexahistidine, Fc, Halo, חלבון קושר מלטוז ותגי biotinylation ספציפי לאתר והוא האמין כי תגי זיקה אחרים עצום עשויים להיות מותאמים לשימוש בפלטפורמה דומה. עם זאת, תגי זיקה יכולים להיות גם השלכות שליליות מועילות ולא מכוונות ביישומים במורד הזרם 11 ויש לחקור ביסודיות לפני הקמת צינור המבוסס על פורמט מסוים.
לעתים קרובות משתמשים חדשים יהוו את השאלה כיצד להעריך את האיכות של ספריית נוגדן ולמרות שאין תשובה פשוטה, יש לנסות להעריך כמה תכונות עיקריות (בין אם טבעי או סינטטי) כוללים מגוון כולל, רמות תצוגה היחסית, הטבע של ואקראי מידה (כלומר, עיצוב ספרייה לעומת תוכן ספרייה שנקבע על ידי רצף) ואת מאפייני physicochemical של הנוגדן לעומת יישום מיועד. למרות שמעבר להיקף של פרוטוקול זה, treatme מפורט יותרניתן למצוא NT של תכונות אלה וכיצד הם יכולים להשפיע על הבחירה של נוגדנים כאן 2,23. ידע של גיוון ספרייה, בפרט, חשוב להבטיח כיסוי הולם של המגוון בבחירות. בדרך כלל, ריכוז הפאג המספק 100-1,000 עותקים של כל שיבוט הפאג בספרייה רצוי וצריך להבטיח שניתן לשחזר כל קלסרים חיוביים אמיתיים קיימים בספרייה. עם זאת, המחייב הלא ספציפי של הפאג לmicroplate עליות משטחים באופן דרמטי מעל 10 13 הפאג / מיליליטר, ולספריות מגוונות מאוד, יותר מ גם יחיד לאנטיגן עשוי להיות נחוץ כדי להבטיח כיסוי מספיק. מצד השני, אם ספריית הקלט גם לדלל, הריכוז המוחלט של קלסרים חיוביים אמיתיים יהיה כל כך הרבה מתחת לKD (בדרך כלל ננומטר) שהם לא יהיו התאוששו. בהתחשב באילוצים אלה, בדרך כלל צריכים להיות resuspended ספריות הפאג ל12-13 אוקטובר הפאג / מיליליטר לסיבוב הראשון של בחירות.0; בריכוז זה, aliquot 100 L של הפאג מייצג כיסוי 1,000-100 קפל של ספריית גיוון 10 9 -10 10 ושגרתי יכול להניב שיבוטים המחייבים לאנטיגנים שונים. בריכוזים פחותים, או הבדלים מוגברים, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את מספר הבארות של אנטיגן נבחרו בסיבוב הראשון נגד (ראה סעיף 2.9). לאחר סיבוב 1, לעומת זאת, רוב הגיוון בלתי מחייב של הספרייה הוסר; כיסוי עודף של גיוון תפוקת סיבוב 1 הוא לרוב השגה בקלות באמצעות היטב בודד. במקרים של בחירות מקבילות ב 96 צלחות גם, זה יכול להפחית את מספר צלחות אנטיגן בחירה נדרשות רק אחד, לאחר הסיבוב הראשון.
במהלך בחירות בפועל, טיטרציה הפאג יכולה להציע מדדים אובייקטיביים לאפיין ולעקוב אחר התקדמות, תוך כדי לסייע לזהות אזורים של דאגה במיוחד בסיבובים המוקדמים של בחירה שבו ההעשרה אינה מספיק כדילהיות מזוהה. זה יכול להיות שימושי במיוחד בקנה המידה של בחירות כדי לקבוע ביצועי פרוטוקול. באופן כללי, כתוביות הפאג קלט (כלומר, ספרייה נאיבית או פוסט-הגברה של הפאג eluted) צריכה להישאר קבועות יחסית (10 12 13 -10 הפאג / ml) בין סיבובים, עם צמיחת תאים עניה / כתוביות הפאג נמוכות המצביעות על אפשרות של זיהום ו / או תפוקה ירודה מהסיבוב הקודם. למרות כתוביות הפאג התפוקה צפויות לגדול במהלך העשרה בסבבים מאוחרים יותר של בחירה, טווח של 10 3 -10 5 CFU / ml בשני הסיבובים הראשונים צפוי. חריגה מהטווח הזה יכול להצביע על בעיות אפשריות בבחירה כגון זיהום או החמרה לשטוף עודפת. בסיבובים מאוחרים יותר של בחירה (כלומר, סיבובים 3 ו -4), ההעשרה של שיבוטים שדווקא יחייב את אנטיגן היעד ניתן להעריך באמצעות ELISAs נקווה שמודדים מחייב של בריכת הפאג נגד שני אנטיגן היעד ושליליחלבון שליטה (ראה סעיף 4).
לאחר 3-4 סיבובים של בחירה (או פעם אחת העשרה על חלבון המטרה הגיעה לאנטיגן יעד: יחס אות חלבון בקרה שלילית של 2: 1 או גבוה יותר בהשוואה לחלבון רקע), תאי חיידקיים נגועים הם מצופים לבודד מושבות phagemid בודדים עבור סידור , אפיון ראשוני ושיבוט במידת צורך. בשלב זה, רצוי מאוד להמיר Fab-הפאג לשחרר Fab לפני אפיון נוסף. למרות Fab-הפאג יכול לשמש לאפיון ראשוני על ידי דילול 10 μl של supernatant הפאג (שתואר בסעיף 5.1) במאגר PBT 20 μl וגילוי עם נוגדנים אנטי-M13-HRP (שתואר בשלבי 4.4-4.5), בניסיון שלנו, מאפייני מחייב יכולים לשנות באופן משמעותי בכל מקום בין 5-20% של שיבוטים עם שחרור מחלקיקי הפאג וההמרה מוקדמת יכולים לייתר בעיות עם תוצאות חיוביות שגויות. המתודולוגיה הספציפית המשמשת להמרה תהיה תלויה בuniquארכיטקטורת דואר של phagemid ולכן לא תטופל באופן מפורש כאן. עם זאת, בווקטורים הנפוצים ביותר, זה בדרך כלל ניתן להשיג זאת על ידי 1) שינוי של phagemid המטוהר (או בריכת phagemid) למי שאינו מוסמך מדכא E. זן coli כגון HB2151 או 55,244 אם תחנת ענבר (TAG) קודון מתערב חלבון Fab וPIII, 2) ההחדרה של קודון עצירת ענבר בין חלבוני Fab וPIII כדי לאפשר ביטוי של שברי נוגדן מסיסים במתח שאינו מדכא או 3) על ידי שיבוט גני אימונוגלובולינים (מphagemid הבודד או בריכת phagemid) לוקטור ביטוי מתאים. כדי לייעל את הבחירה ואפיון נוסף, שיטות שיבוט נקוו עשויות להציע אמצעי יעיל להמרת שיבוטים המחייבים בהמוניהם לבונת ביטוי, שניהם מבטלים את הפוטנציאל מחייב חיוביות שגויה של חלקיקי Fab-הפאג ובי lysates ביטוי המשמשים לאפיון מוקדם, אפילו העלות והמאמץ של טיהוריכול בתחילה להימנע.
לשיבוטים מבודדים ישירות מספריית F (שתואר ב -24), יכולים להיות רצף תחומים משתנים נוגדן באמצעות 1-2 μl של supernatant הפאג כתבנית לPCR להגביר השלמת קביעת האזורים (CDRs) (ראה טבלה 2 של חומרים לפריימרים מכוונים-F הספרייה ). שימוש בצבעי יסוד אלה, האזורים משתנים כבדה וקלת השרשרת יניבו מוצרים של ~ 700 ~ 500 נ"ב ו, בהתאמה מכסים את כל שלוש CDRs. Primers כולל אתרי חישול לפריימרים M13 כזה שיכול להיות רצף מוצרים לאחר הניקוי (כמתואר בסעיף 5.4.5) באמצעות פריימרים סטנדרטיים זמינים ברוב מתקני גרעין הרצף. לחלופין, לבריכות Fab-הפאג כי כבר משובטות לוקטור ביטוי והפכו ישירות לE. coli לביטוי, יכול להיות מבודד מושבות אחת וresuspended ב -15 μl של 2YT ו1-2 μl של ההשעיה התא המשמש באופן ישיר כתבנית לג הבודדolony PCR באמצעות פריימרים מתאימים.
בחירות אוטומציה תדרוש אופטימיזציה ואימות של מספר פונקציות רובוטית מפתח. באופן כללי, טיפול הנוזלי מבוסס פיפטה חייב להיות מדויק ועקבי בכל 96 הערוצים, שטיפת צלחת חייבת להסיר את הפאג מאוגד ביעילות ללא הפשטת אנטיגן adsorbed או Fab-הפאג מחויב מצלחת הבחירה. טיהור יעילה של מכונת הכביסה הצלחת היא גם הכרחית בין סיבובים כדי לאפשר בחירות שלאחר מכן העשרה ונגד בחירה יעילה, ובין על מנת למנוע זיהום צולב. כדי לעזור לייעל את הליך בחירת תפוקה הגבוהה, גישות פשוטות להערכת פונקציות אלה היו בשימוש בעבר ומתוארים להלן ומפורט בתוך הפרוטוקול.
כדי להעריך את העקביות של כרכים מועברים על ידי כל הערוצים של ראש מחלק / שאיפת נוזל, פתרון צבעוני pipetted לצלחת שטוח תחתונה 96 היטב וabsorbance בכל נמדד גם על קורא צלחת. Chromophore כגון bromophenol הכחול הוא מועיל עבור פתרונות צביעה דומים לאלה המשמשים לבחירות אמיתיות להעריך את ההשפעות של מאפייני מתח פנים ולכידות שונים באמצעי האחסון נמסר. לאחר האישור כל הערוצים מחלק כרכים עקביים, דיוק בסך הכל נמסר הנפח ניתן לקבוע על ידי מדידת המסה של נוזל שהועבר לכל צלחת.
אוטומציה של שטיפת צלחת כדי להסיר שיבוטים מאוגד בעיקר דורשת אופטימיזציה של הקצב שבו לשטוף חיץ הוא לוותר ומספר שוטף להיות מועסק. שיטה סבירה להערכת פרמטר זה מעסיקה בקרות חיוביות (Fab-הפאג ספציפי מחייב שיבוטים) כדי להעריך את ההשפעות של משתנה השיעור ו / או מספר שוטף לוותר כדי לקבוע אם 1) נספח אנטיגן או הפאג הכפות הוא להיות להסיר על ידי שטיפת יתר על המידה מחמירה או 2) שאינו ספציפי מחייבים חלבונים שאינם מאותו המקור הוא ד מוגזםue לשטוף תנאים שהם לא מספיק מחמירים. הפאג שיורי / מחויב ניתן לאתרם ולכמת או על ידי זיהום חיידקים ולציפוי לספירת מושבה אחת, או על ידי ELISA באמצעות נוגדנים ספציפיים למשניים תגי זיקת נוגדן או חלבוני מעיל הפאג. בקרות שליליות משמשות כדי להעריך רמות שייר של Fab-הפאג בלתי מחייב למקד חלבונים או Fab-הפאג מחייב ספציפי לחלבונים שאינם מאותו המקור / רקע, אשר עשוי להיות גבוהות אם הכביסה היא לא מספיק מחמירה. במקרה זה, השתמשנו משותק BSA כביקורת על כריכה שאינה ספציפיים ונוגדן אנטי דגל שמכיר תג epitope FLAG על Fab-הפאג כביקורת חיובית. אנחנו לעומת שמונה ושישה עשרה מחזורי שטיפה באמצעות הרובוט לעומת כביסה ביד, בקצב זרימה בינוני, כדי להראות שהטכניקות הללו היו שווי ערך. לחלופין, מדידת קלט ופלט כתוביות הפאג (ראה סעיף 7) במהלך בחירות מתמשכות יכולה גם לעזור כדי לבצע התאמות עדינות בפרמטרים לשטוף. לבסוף, טיהור של מנקי צלחת המשמשת לבחירות חייבת להיות יעילה כדי לחסל לשאת על של הפאג מבחירות קודמות. hypochlorite נתרן 0.5% מניסיוננו, בדילול הטרי הוא מהיר, יעיל וזול. חומרי ניקוי כגון SDS הם גם יעילים אך דורשים שטיפה הרבה יותר נרחבת כדי להסיר מהמערכת. בדוק את התאימות מגיב למערכת לפני כל בדיקות. כדי להעריך טיהור, אנו בוחנים את קיומו של הפאג שייר בפתרונות מטופלים על ידי מערכת fluidics ולפרש את תוצאות על פי טבלה 3.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה להרחבה לבידוד Fabs מספריות קומבינטורית על ידי מקביל בבחירות מבחנה נגד תחומים חלבון ומציע טכניקות לאימות מערכת בחירת הפאג אוטומטית. מחסומי עלות ותשתיות שמתקני חיה נרחבים יכולים להוות מתקזזים מאחר ושיטה זו אינה מחדשly על החיסון של בעלי חיים. יתר על כן, על ידי שילוב של דור אנטיגן עם מבחר נוגדן-הפאג, גורמים המשפיעים על איכות הצלחת בחירה מנוטרים בקלות רבה יותר ומותאמים. כאשר מסגרת הזמן מביטוי אנטיגן לבחירה ואפיון ראשוני היא בסדר הגודל של 6-8 שבועות, מערכת מגיבה יותר של ייצור עשויה להתממש. נוגדנים מבודדים מבחירות במבחנה גם שני לשנות בקלות (עקב הצמדת גנוטיפ, פנוטיפ) ומתחדשים, הדורשים DNA רק מאוחסן של מבנה הביטוי מחדש ליצור נוגדן שוב ושוב וreproducibly. לבסוף מראה כי פרוטוקול זה יכול להיות שנערך תוך שימוש בגישה מעין-ידנית או אוטומטית לחלוטין שמעסיקה, מערכת בחירה רובוטית אישית מעוצב, התפוקה יכולה להיות מדרגי ונגישים למעבדות אקדמיות ותעשייתיות קטנות כאחד.
שימוש בשיטות התפוקה גבוהה שתוארו לעיל והספרייה F ספריית נוגדן סינטטי 24 במבחנה - ובחלבונים באתר -expressed. למרות ששיעורי הצלחה לכל בחירה ניתנת יהיו תלויים גם באיכות (טוהר, foldedness, וכו 'מונו-dispersity) של מטרות אנטיגן כמו גם האיכות והגיוון של ספריית הנוגדנים, זה נצפה כי בכל מקום 25-80 % מאנטיגנים יניבו קלסרים לבחירת תפוקה גבוהה. חשוב לציין, ראוי לציין כי שיבוטים עם היכולת לווסת את פונקציית המטרה יכולים גם להיות לעתים קרובות נבחרו. ספרייה זו נבנתה באמצעות מסגרת אנושית באופן מלא, מה שהופך את הנוגדנים אלה ניתנים ליישום טיפולי פוטנציאל 25, ובכך מדגישה את חשיבותו של צינור זה כגישה חלופית לייצור חומרים כימיים זיקה עם רחב מבוססערך.
לסיכום, את האיתנות והרבגוניות של הגישה שהוצגה בפרוטוקול זה ימשיך לסייע בייעול, התיעוש והשימוש נרחב אולטימטיבי של טכנולוגיה זו כאמצעי קיימא להשגת המטרה ארוך הטווח של יצירת חומרים כימיים זיקה לכמעט כל החברים proteome האנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות NIH Common הקרן - תכנית ריאגנטים לכידת חלבון למימון פעילות הפיתוח של נוגדן בחירה ואפיון צינור רשת נוגדן רקומביננטי והקרן הקנדית לחדשנות לרכישת מימון של הפלטפורמה רובוטית הבחירה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
