Summary
En metod beskrivs med visuell ackompanjemang för att bedriva skalbara, hög genomströmning val från faguppvisade kombi syntetiska antikroppsbibliotek mot hundratals antigener samtidigt. Med användning av detta parallellt tillvägagångssätt, har vi isolerat antikroppsfragment som uppvisar hög affinitet och specificitet för olika antigener som är funktionella i standardimmunanalyser.
Abstract
Efterfrågan på antikroppar som uppfyller behoven hos både grundläggande och klinisk forskningsansökningar är hög och kommer att dramatiskt öka i framtiden. Det är dock uppenbart att de traditionella monoklonala tekniker är inte ensam upp till denna uppgift. Detta har lett till utvecklingen av alternativa metoder för att tillgodose kraven på hög kvalitet och förnybara affinitetsreagens för alla tillgängliga delar av proteomet. För detta ändamål, har hög genomströmning metoder för att genomföra val från faguppvisade syntetiska antikroppsbibliotek tagits fram för tillämpningar där olika antigener och optimerad för snabb genomströmning och framgång. Häri är ett protokoll som beskrivs i detalj som illustrerar med videodemonstration parallell urvalet av Fab-fagkloner från höga bibliotek mångfalds mot hundratals mål med hjälp av antingen en manuell 96 kanals vätskehanterare eller automatiserade robotsystem. Med hjälp av detta protokoll, kan en enskild användare genererar hundratals antigener,Välj antikroppar mot dem parallellt och validera antikroppsbindning inom 6-8 veckor. Markerad är: i) en livskraftig antigenformat, ii) preliminära urvalet antigen karakterisering, iii) kritiska steg som påverkar valet av specifika och höga affinitet kloner, och iv) metoder för övervakning urvals effektivitet och tidigt antikropps klon karakterisering. Med denna metod har vi fått syntetiska antikroppsfragment (Fabs) till många målklasser inklusive enkelpassmembranreceptorer, utsöndrade proteinhormoner, och multi-domän intracellulära proteiner. Dessa fragment lätt omvandlas till fullängds antikroppar och har validerats för att uppvisa hög affinitet och specificitet. Vidare har de visats vara funktionell i en mängd olika standardimmunanalyser inklusive Western blotting, ELISA, cellulär immunfluorescens, immunfällning och besläktade analyser. Denna metod kommer att accelerera antikropps upptäckt och slutligen föra oss närmare att förverkliga målet of generera förnybar, högkvalitativa antikroppar mot proteomet.
Introduction
Med uppkomsten av efteriska åldern är viktigt att det finns bindande reagens högkvalitativa att karakterisera och modulera proteiner för att öppna ny forskning och terapeutiska avenyer. Antikroppar fortsätter att vara avgörande för både akademiska och industriella forskare som grundforskning och diagnostiska verktyg och potentiella läkemedel. Inte överraskande, har det skett en imponerande tillväxt på kontraktsantikropps utveckling företag, varav de flesta förlitar sig på konventionella hybridoma teknik för att generera egna antikroppar. Ändå är in vitro val med faguppvisade antikroppsbibliotek bli ett kraftfullt alternativ teknik som kan erbjuda unika fördelar och framgångar där konventionell teknik kan möta begränsningar 1, 2.
Mot bakgrund av den stora efterfrågan på högkvalitativa antikroppar som forskningsverktyg, två primära utmaningar för att generera förnybar antikroppar är 1) val genomströmning och 2) antigen AVtillgång-. Ett antal grupper har nu beskrivits i vitro urvalsledningar som syftar till att öka genomströmningen och hastigheten för identifierings antikropp. Dessa beskrivningar detalj en mängd livskraftiga metoder som inkluderar att välja på antingen fullängds riktar 3,4, eller strukturellt relaterade domäner 5,6,7, antingen pärla baserade 6,8 eller plattbaserade 3,4 antigen immobilisering system. Dessutom har den ökande införandet av gensyntes teknik 9 systematiseras antigen generation, särskilt av isolerade domäner, rimligen kostnadseffektivt och kan potentiellt minska svårigheten att få tillräckliga mängder av renat, hellång antigen. Genom att använda de två teknikerna i tandem, var ett fristående och skalbar antigengenerering och urval antikropps pipeline utarbetas som möjliggör parallell isolering av antikroppar för stora uppsättningar uttryckta antigen domäner och underlätta utvecklingen av reagens för characterizing hela klasser av strukturellt eller funktionellt relaterade proteiner.
Mot detta mål, en integrerad pipeline som par i silico identifiera uttryckantigendomäner, gen syntes, hög genomströmning bakteriell uttryck av antigener och skalbara faguppvisade val antikropps har utvecklats. Denna pipeline kräver endast grundläggande infrastruktur tillgänglig för de flesta life science laboratorier (inklusive antikroppsbibliotek som blir allt tillgängligt via licens eller materialöverlåtelseavtal), men är också mottaglig för automatisering för användning i industriell skala. Med hjälp av detta protokoll, är det möjligt att generera hundratals affinitets taggade antigendomäner, och rutinmässigt isolera mycket specifika antikroppsfragment till många av dessa antigener.
Fag display teknik har visat visat kompatibilitet med ett brett utbud av rekombinanta affinitet reagens format inklusive Fab, scFv, och autonoma Fv-domäner ochväxande utbud av små "alternativa ramar" (designade ankyrin upprepningsproteiner (DARPINS), fibronektin (FN), lipokalin domäner och mer 10). Diskussionen är begränsad i detta exempel till isoleringen av Fab-antikroppsfragment, även om det förutsätts att dessa metoder kan anpassas till andra typer av bibliotek. Med hjälp av denna teknik, Fabs med låg nanomolär affinitet till små, taggade proteindomäner inklusive transkriptionsfaktordomäner, SH2 domäner, RNA-bindande proteiner och andra har framgångsrikt utvalda, av vilka många binder fullängds protein och är funktionella i immun såsom immunofluorescens , immunoutfällning och immunohistokemi. Viktigt rekombinanta bindande kloner är helt förnybart och kan åter genereras från uttryckskonstruktioner via bakteriell produktion erbjudande ökad enhetlighet, reproducerbarhet och kostnadseffektivitet, vilket motiverar bekostnad av rigorös klon validering.
I denna protocol och medföljande video, är grundläggande metoder för val av antikropp från faguppvisade bibliotek använder immobiliserade antigendomäner demonstreras. Denna speciella metod använder GST-märkt proteindomäner immobiliserade genom passiv adsorption i mikrobrunnplattor, även om andra taggar 11,12,13 och selekteringsformat 13,14,2 har också använts med framgång. Kritiska överväganden för installation och genomförande av val med parallella övervakning av urvalsparametrar som syftar till att identifiera och isolera specifikt berikade klon antikroppar för validering är detaljerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antigen Generation
OBS: Antigen domäner kan syntetiseras och klonas genom en mängd olika kommersiella leverantörer i en lämplig IPTG-inducerbara expressionskonstruktion.
- Omvandla expressionskonstruktionerna i kemiskt kompetent, T1-fag resistenta, BL21 E. coli-celler genom att blanda 10 ng av kodande DNA i 20 ul av 1X KCM på is i en 96 väl PCR-platta följt av tillsats av 20 L av kemiskt kompetenta celler.
- Inkubera cell / DNA-blandningen på is under 20 min, vid RT i 10 min och därefter på is igen för 2 min före undsättning med 100 | il förvärmd super optimala buljong med glukos (SOC) media, täcker med andningsbar platta tätning och skakning vid 37 ° C under 1 h vid 200 rpm i en 2,5 cm orbitalskak.
- Plate 5 pl av transformerade celler på Luria-Bertani (LB) / agarplattor kompletterade med karbenicillin (100 g / ml) och växa O / N för erhållande av enskilda kolonier som används förgenerera glycerol lager.
- Inokulera 1 ml 2YT / carb media med 5 | il glycerolförråd och växa under 12 h vid 37 ° C i en 96 väl djupbrunnsblock med skakning vid 200 rpm i en 2,5 cm orbitalskak.
- Inokulera NZY media15 (kompletterad med 0,05% glukos, 2% laktos, och 100 g / ml karbenicillin) med en 1:40 utspädning av denna kultur, sedan skaka i 6-8 timmar vid 30 ° C och 200 rpm i en 2,5 cm orbital skakapparat.
- Pellets bakterier och rena antigena proteiner i hög genomströmning i en 96-brunnars filterplatta innehållande 100 | il av Ni-NTA-harts enligt tidigare publicerats protocols16,17.
- Bestäm koncentrationen av renade proteiner från Bradford färgämnesbindnings assay18 och karakterisera för storlek och renhet genom separation och visualisering av 10-50 ug med Coomassie fläck på en SDS-sida gel (se figur 2).
OBS: I det här skedet proteiner kan karakteriseras ytterligare genom metoder som utvärderar proteinaggregering 19 20, beroende på vilken typ av antigen och kraven i pipeline valet.
2. Upprättande och Titrering av fagbiblioteket
- Välj en enda koloni av T1 fag-resistenta E. coli-celler i en ml av 2YT-medium kompletterat med 50 | ig / ml tetracyklin.
- När celltillväxt visuellt etablerad, späd kultur i en större volym 2YT kompletteras med 50 mikrogram / ml tetracyklin för att säkerställa en tillräcklig volym av celler för infektion (vanligtvis 45 pl per biblioteks utspädning, se nedan.).
- Förbered biblioteket för användning genom utfällning av fag från förvaringsbuffert med en / 5. Volym autoklaverat 20% PEG-8000, 2,5 M NaCl (PEG-NaCI) inkubering på is under 30 min och pellete utfälldes fag genom centrifugering vid 12000 x g.
- Kassera supernatanten och resuspendera utfälld fag i en lämplig volym av 1x PBS pH 7,4, 0,2% BSA och 0,05% Tween (PBT), justera to en lämplig fag koncentration för val (om det behövs) för att säkerställa tillräcklig biblioteks täckning. Se Steg 2.9 och diskussion.
- Späd en 5 pl fag alikvot i 45 pl 1x PBS pH 7,4 i en steril flera brunnar, blanda och skapa en serie av 10-faldiga utspädningar i samma buffert.
- Tillsätt 5 ìl av varje fag utspädning till 45 pl T1 fag-resistenta E. coli-celler i logfas tillväxt (OD 600 = 0,4-0,8) i en annan multibrunnsplatta, täck med en andningsbar tätning och inkubera vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm under 30 min i en 2,5 cm orbitalskak.
- Plate 5 | il av infekterade celler från var och en av brunnarna på en förvärmda agarplatta kompletterat med 100 g / ml karbenicillin och växa O / N vid 37 ° C tills kolonier är synliga.
- Beräkna den totala fag / ml enligt följande:
Fag / ml = antal kolonier på en carbenicillin platta i det mest spädda provet x 200 x 10 i (där i = den maximala numBER av utspädningar i vilka kolonier är synliga). - För att bestämma antalet belagda antigenbrunnar för att säkerställa täckning av biblioteket mångfald, beräkna följande:
Antal belagda antigenbrunnar krävs =
Önskad faldig täckning * bibliotek mångfald
# Av fag per 100 l
3. Antikropp Urval från faguppvisade Bibliotek
3,1) Antigen Immobilisering
- För att undvika frys-tö-cykler som kan påverka antigen kvalitet och för att underlätta utspädningar, förbereda ett lager antigenprotein platta normaliserad till 100x arbets koncentrationer (t.ex. 500 g / ml) och delprov i icke-bindande 96-hålsplattor.
- Förbered antigenbelagda plattor från lager proteinlösningar en dag före varje urvalsomgång genom att späda från lagerplattor med PBS.
- Coat 96-brunnars höga proteinbindande polystyrenplattor med 100 | il av GST-märkt antigenprotein eller negativ kontroll protein (GST, BSA, neutravidin, etc.) på 5 mikrogram / ml i PBS. Skaka vid 250 rpm 4 ° CO / N på en mikroplattskakanordning.
- Avlägsna proteinlösning från belagda mikroplattor, blockera antigenbelagda och negativa selektionsplattor med 200 | il blockerande buffert (0,2% BSA i 1 x PBS, pH 7,4) och skaka vid 250 rpm vid rumstemperatur under 1-2 h.
- Efter blockering, tvätta de blockerade proteinbelagda plattorna fyra gånger med 200 ^ il 1 x PBS, pH 7,4 med 0,05% Tween (PT) buffert antingen manuellt eller med användning av en automatiserad mikro bricka.
3.2) Bibliotek Pre-clearance och Antigen-fag Inkubation
- Utarma bibliotek av icke (eller tag-) specifika bindnings faguppvisade antikroppsfragment kloner via överföring av 100 l (10 12 fag) av beredd fagbibliotek i PBT buffert till ett antal brunnar belagda med negativ kontroll protein eller fri affinitetsmarkör protein (t.ex. GST) motsvarar antalet mål och inkubera fagi brunnar för 1-2 h vid RT med skakning vid 250 rpm.
OBS: Som en alternativ eller ytterligare medel för negativ selektion, inkubation kan även utföras i närvaro av överskott (5-25 M) lösligt protein affinitet tagg (t.ex. GST) för att ytterligare avlägsna taggbindande kloner och öka återvinning av specifikt mål bindande kloner. - Transfer fagsupernatant från negativ selektion till antigenbelagda plattor och inkubera under 1-2 timmar vid RT med skakning vid 250 rpm för infångning av specifika bindande kloner.
- Avlägsna obunden fag och tvätta brunnarna i mikroplattan 8-15 gånger med PT-buffert antingen manuellt eller med hjälp av en mikroplatt-tvättmaskin. Ta bort överflödigt tvättbuffert strax före eluering.
3.3) Eluering, infektion och Fag Amplification
- Tidigt på dagen för val, välja en enda koloni av T1 fag-resistenta E. coli-celler i en ml av 2YT-medium kompletterat med 50 | ig / ml tetracyklin och växa vid 37 ° C With skakning vid 200 rpm i en 2,5 cm orbitalskakare eller motsvarande.
- När celltillväxt är etablerad och kan ses med ögat, öka volymen av media med 2YT kompletterat med 50 ug / ml tetracyklin för att säkerställa en tillräcklig volym av celler för infektion (vanligen 100 l per alternativ också).
- Odla cellerna tills en OD 600 av 0,4 till 0,8 har uppnåtts (ca 5-7 h), sedan för att eluera bunden fag till 100 ul av celler till den tvättade antigenplattan och skaka vid 37 ° C under 30 minuter.
- Lägg M13K07-hjälparfag till en slutlig koncentration av 1 x 10 10 ^ cfu / ml och inkubera vid 37 ° C under 45 min med skakning vid 200 rpm.
- Överför celler till 1,2 ml 2YT kompletterat med 150 ug / ml karbenicillin och 75 | ig / ml kanamycin i en 96-brunnars djupbrunnsblock med V-botten och växa O / N vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm i en 2,5 cm orbitalskak.
3.4) Fag Förberedelser och Upprepade rundor Selecning
- Pellets bakterier genom centrifugering vid 4000 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Blanda lika stora volymer av fag supernatanter från replikatplattor i en mini-tub 96-väl steril mikro blå rutan, neutralisera med 1/10: e volym 10X PBT och blanda. Upprepade rundor av val (med början från steg 3.1.1) för 3-4 omgångar eller tills anrikning observeras (se avsnitt 4. och 7.) jämfört med negativa kontrollprotein.
OBS: I de första omgångarna av val när betydande / detekterbara anrikning förväntas inte (dvs, rundar 1 och 2), kan kvantifiering av in- och utgående fag titrar (beskrivs i avsnitt 7 och representativa resultat visas i Figur 3) vara till hjälp för att säkerställa minimi fagkoncentrationer för framgångsrika val (som beskrivs i Diskussion) och är lämpligare än poolade ELISA.
4. Karakterisering av sammanslagen ELISA
- Coat 96 brunnar hög protein bindering polystyrenplattor med 100 | il av GST-märkt antigenprotein eller negativ kontrollprotein (GST, BSA, neutravidin, etc.) vid 2 | ig / ml enligt avsnitt 3.1 och skaka vid 4 ° CO / N.
- Avlägsna antigenöverskott, blockerar plattan med 200 | il av blockeringsbuffert med skakning under 1-2 timmar vid rumstemperatur vid 250 rpm på en mikroplattskakanordning och tvätta fyra gånger med 200 | il PT buffert antingen för hand eller genom automatiserad plattvättare.
- Applicera 100 | il av fagsupernatant (utspädd 1: 10-1: 20 i PBT-buffert), skaka vid 250 rpm under 15 min vid RT, och tvätta plattan åtta gånger med 200 | il PT-buffert.
- Tillsätt 100 fil anti-M13-HRP (1: 5000 i PBT-buffert). Skaka vid 200 rpm under 30 min vid RT, därefter tvätta plattan sex gånger med 200 | il PT buffert och två gånger med 200 | il PBS.
- Applicera 100 pl 1: 1 TMB substrat och utvecklas under 5-15 minuter (eller tills betydande färgen har utvecklats), sedan stoppa reaktionen genom tillsats av 100 ^ 1 MH 3 4 och läsa plattan vid 450 nm.
- Generellt kan observeras anrikning i fagpooler i omgångar 3-4 som ett förhållande mellan specifik bindning kontra icke-specifik bindning av> 2 (se figur 4)
OBS: Det är informativt att notera att hög absolut bindande signal på affinitetsmärkningen proteinet indikerar anrikning av taggspecifika bindemedel (snarare än mål- bindemedel), och att hög absolut bindande signal på den negativa kontrollproteinet indikerar anrikning av icke-specifika eller " klibbiga "bindemedel.
5. Klon Urval, sekvensering och karakterisering
5.1) Isolering av Single Fab-fagklonerna
- För att isolera enskilda kloner för sekvensering och karakterisering, infektera 1/10: e volymen av den förstärkta fag poolen i till T1 fag-resistenta E. coli celler i log tillväxtfas (OD 600 = 0,4-0,8) i en rundbottnad mikrotiterplatta, täck med ett Breathable platta tätningen och inkubera under skakning vid 200 rpm under 30 min vid 37 ° C.
- Förbered 10-faldiga seriespäd i 2YT-medium och platta ut på separata agarplattor kompletterade med 100 g / ml karbenicillin.
- Pick enstaka kolonier i till 450 | il 2YT / carb medium kompletterat med 1 x 10 9 M13K07 fag / ml och odla O / N i en mini-rör 96 väl steril mikroplatta blå rutan inkubering vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm.
- Pellets bakterier genom centrifugering vid 4000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Klon fagsupernatant kan användas för sekvensering av Fab-fagkloner (som beskrivs i avsnitt 5.4) eller för klonal direktbindande ELISA för att bestämma specificitet mot immobiliserade antigener (enligt beskrivningen i avsnitten 5.3 och 21) för vilka representativa resultat visas i figur 5.
5,2) Expression av Fab-kloner för karakterisering
- Efter kloning in till en lämplig eXpression vektor (se diskussion), plocka enstaka E. coli kolonier transformerade med expressionskonstruktioner i till 1 ml av 2YT / carb media i en 96 väl djupbrunnsplatta med användning av en steril tandpetare eller pipettspets och växa under 12-16 h vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm. Detta kan göras antingen manuellt eller med en automatiserad koloniväljaren.
- Överför 40 fil växande kultur till 1,5 ml NZY medium kompletterat med glukos / laktos / glycerol i en 96 väl Deepwell blocket per metodologi Studier et al. 15
OBS: Alternativt kan celler odlas för 3-4 h (OD 0,8-1,0) i icke-kompletterat och proteinuttryck inducerades genom tillsats av 1 mM IPTG. - Täck odlingsblock (er) med en andningsbar tätning och uttrycker Fab-kloner för 6-8 h vid 30 ° C med skakning vid 200 rpm. Spin plattorna vid 4000 xg under 15 min för att pelletera bakterieceller, avlägsna supernatanten, täckplattorna med en folietätning och frysa pellets vid -20 ° C tills lys.
- Befria uttryckta Fabs från insamlade pellets med 100 pl lyseringsbuffert (Tris HCl 50 mM, 200 mM NaCl, 1,25% Triton X-100 pH 8,0 med 1 mg / ml lysozym och 10 U bensonas / ml kultur och proteashämmare) och skaka för 2 h vid 4 ° C.
- Ta cellrester genom centrifugering vid 4000 xg under 15 minuter vid 4 ° C och samla rålysat supernatanten för användning i första karakterisering av specificitet genom ELISA-plattor (se avsnitt 5.3).
5.3) Clone Karakterisering genom Direkt Binding Klon Fab ELISA
- Immobilisera antigener som beskrivs i Avsnitt 3.1 i stället aliquotting 30 pl av 2 ^ g / ml antigen i PBS till brunnarna i en 384-brunnsplatta. Quad-baserade antigen layouter i plattan kan underlätta reagensöverföring när 96 kanalbaserade doseringshuvuden. Tvätta och blockera ELISA-plattor enligt avsnitt 3.1.
- Cleared lysat uppsamlade från Avsnitt 5.2 kan appliceras direkt på immobiliserade antigen för evaför omvärdering av bindning. Inkubera 30 pl av lysat per brunn under 15 min vid RT med skakning vid 200 rpm.
OBS: Renat Fab klon-protein kan alternativt användas genom spädning till 10 pg / ml i PBT-buffert och applicera 30 | il av varje klon till blockerade brunnar innehållande antigen eller negativ kontrollprotein (GST, BSA etc.) och utvecklas på samma sätt som beskrivits nedan. Alternativt kan Fab-fag också användas genom att späda 10 pl fagsupernatant (beskrivs i avsnitt 5.1) i 20 pl PBT buffert (1: 3) och detektion med anti-M13-HRP-antikroppar (beskrivs i steg 4,4-4,5) - Ta bort överflödigt lysat och tvätta brunnar antingen manuellt eller med hjälp av en automatiserad platta tvättas 8x med 100 pl PT buffert och ta bort överflödig buffert.
- Inkubera 30 | il av en 1: 5000 utspädning av sekundär anti-FLAG-antikropp i PBT-buffert under 30 min vid RT med skakning vid 200 rpm.
- Tvätta, utveckla och kvantifiera enligt §§ 4,3-4,5.
OBS: Representativa resultatillustrerar både specifika och icke-specifika bindande kloner visas i figur 5.
5,4) Klon Sekvense
- Förbered en PCR Master Mix som anges i tabell 2.
- Tillsätt 2 pl av lämplig PCR-mall (antingen fagsupernatant eller åter svävande enda fagemid innehållande bakteriekoloni) till 20 pl PCR Master Mix beredd med lämpliga primers i brunnar i en PCR-plattan.
NOTERA: Separata huvudmixarna krävs för sekvensering av både de tunga och lätta kedjegener. - Kör PCR-reaktionen med hjälp av de parametrar som anges i tabell 2 - PCR-inställningar.
- Verifiera framgång av PCR-reaktionen genom att blanda 5 | il av den fullbordade reaktionen med laddningsfärg på en 1% agarosgel kompletterat med DNA-visualisering fläcken och avbildning på en 300 nm transilluminator.
- Lägg 2 pl av PCR-produkt till 10 | il sterilt vatten innehållande 0,2; Il vardera av exonukleas och alkaliskt fosfatas från räka och inkubera vid 37 ° C under 20 min följt av enzyminaktivering vid 80 ° C under 10 min för att avlägsna överskott av primrar som förberedelse för sekvensering.
6. Skalning för Automated Selections
6.1) med pipett baserade Vätskehantering
- Bered en 1% (vikt / vol) bromfenolblått i vatten och avlägsnande av olösliga partiklar med användning av en 0,45 ml-filter.
- För att bestämma det linjära området för absorbans på plattläsare, förbereda en 1: 1000 spädning av 1% bromfenolblått lösning i vatten, och fortsätta med två-faldiga seriespädningar (16 utspädningar totalt).
- Överför 100 | il av varje spädning till en flatbottnad 96-brunnsplatta och läs av absorbansen vid 590 nm. Plot absolut absorbans kontra utspädningsfaktor och välj en utspädning på mitten till övre delen av det linjära intervallet för efterföljande tester.
- Lägg bromofenolblått till vatten eller till själva lösningensom kommer att pipetteras baserat på utspädning valts i föregående steg i tillräcklig volym för pipettering till tre 96-brunnsplattor, plus dödvolymen i reservoaren.
- Kalibrera en enkanalig pipett för att leverera testvolymen genom pipettering av vatten på en analysvåg (100 | il vatten väger 100 mg vid RT.)
- Använda kalibrerad pipett, överför testvolymen av den färgade lösningen till minst tre brunnar i en flatbottnad 96-brunnsplatta och läsa deras absorbanser vid 590 nm, i triplikat.
- Väg tre tomma flatbottnade 96 brunnar på en analysvåg och registrera deras massa.
- Pipette provvolym från reservoaren till var och en av tre 96-hålsplattor och mäta sina absorbanserna vid 590 nm, i tre exemplar.
- Väg varje platta och beräkna skillnaden i massa.
- Först utvärdera om absorbanserna i varje brunn är enhetliga inom intervallet tolerans (t.ex.., +/- 5%) och om de är förenliga med the absorbanser erhållna genom hand pipettering med kalibrerade pipetman. Om särskilda kanaler är konsekvent över- eller under leverera (t.ex. se figur 6), följ reparationsförfaranden och upprepa proceduren utvärdering, tills alla kanaler leverera enhetliga volymer.
- För det andra, när alla kanaler är bekräftat att leverera enhetliga volymer, kontrollera riktigheten av denna volym genom att beräkna den genomsnittliga vikten skillnaden, per brunn. Till exempel kommer en perfekt kalibrerad vätskehanterare set till 100 | il leverera 9,60 g vatten per platta, eller 0,10 g vatten per brunn. Om den verkliga volymen är konsekvent över eller under den avsedda volymen, sedan en korrektionsfaktor kan tillämpas, det vill säga, programmering 110 pl för att faktiskt leverera 100 l.
NOTERA: För små volymer, t.ex., 10 | il, använd tio-faldigt mer bromfenolblå i den färgade lösningen, och pre-alikvot 90 | il vatten till 96 brunnars plattor för hand, för att säkerställa att absorbances är mätbara och nedgång i det linjära området.
6,2) Automatiserad tavla Tvättning
- Immobilisera positiva mål och negativa kontrollproteiner i separata brunnar av 96 väl mikroplattor (två plåtar för varje tillstånd som skall testas) som beskrivs i avsnitt 3.1.
- Blockera icke-specifika bindningsställen genom inkubering med blockeringslösning under en timme vid RT.
- Lägg identiska 100 il alikvoter av en 10 13 CFU / mL målbindande Fab-fag lösning i PBT till samtliga brunnar i alla plattor och inkubera med försiktig omrörning vid RT under 2 h.
- Tvätta två plattor enligt varje tillstånd, en platta för infektion och titrering och en platta för ELISA.
- Utvärdera effekten av tvätt genom direkt infektion i bakterier och titrering (som beskrivs i avsnitt 3.3 (utan M13K07 tillägg) och 7.2.1) eller utveckling med anti-M13 HRP antikropp och kolorimetriska substrat (som beskrivs i avsnitt 4).
- Fag titrar frabout specifika kloner ger ofta i intervallet 10 5 -10 7 fag / ml från ett immobiliserat protein mot vilken klonen binder specifikt. Några kvarvarande bindning till negativa kontrollprotein (t.ex. BSA) är att vänta och generellt 10 2 -10 5 fag / ml observeras, dock mycket låg titer (ie., <10 1) kan signalera alltför stringent tvätt, vilket kan äventyra ett urval.
- För fagbindning bestäms av ELISA, jämföra absoluta bindande signalerna för positiva och negativa kontrollproteiner för att avgöra om robot tvätt motsvarar etablerade handen tvättresultat (Figur 7).
6,3) plattvättare Sanering
- För att starta, driva saneringsprotokoll som ska testas.
OBS: Vi rekommenderar att du använder minst det dubbla totala ledningsvolymen, och prime och njuta brickan huvudet i 5 min i 0,5% natriumhypoklorit, nyspätt frabout kommersiella blekmedel (vanligtvis 6% natriumhypoklorit). - Prime och njuta brickan huvudet i 5 min i steril (autoklaveras) vatten och slutligen, prime systemet tills linjerna är fulla av luft.
- Prime raderna med sterilt vatten eller tvättbuffert.
- Tvätta en steril 96 väl mikro gång, ta bort från brickan och försegla med steril platta tätning. Detta är den före nedsmutsningen kontrollplatta.
- Alikvot 100 pl av O / N amplifierade fag kultursupernatant till alla brunnar i en 96-brunnsplatta.
- Tvätta fag innehållande platta gång, sedan bort från brickan och försegla med en plast eller folie platta tätning. Detta är den förorening kontrollplattan.
- Utför saneringsprotokoll som testas. I detta exempel upprepa steg 6.3.1 och 6.3.2.
- Tvätta sterila mikro gång, sedan bort från bricka och tätning. Detta är den saneringstestplattan.
- Plate 50 pl av log-fas E. coli till titreringsstegen plattor; detta är pre-infektionstionskontrollplatta.
- Bryta förseglingen före nedsmutsningen, förorening och sanering 96-brunnars plattor och tillsätt 100 | il av E. coli i tillväxtstadiet till alla brunnar log-fas, med hjälp av nya tips för varje brunn.
- Försegla och inkubera vid 37 ° C under 30 min vid 200 rpm.
- Plate 50 | il av infekterade celler från tre slump brunnar av varje 96-brunnars platta till 10 cm 2YT / carb plattor och inkubera vid 37 ° CO / N.
- Överför 50 ul av infekterade celler från samtliga brunnar i varje platta till djupa brunnsplattor innehållande 1 ml 2YT plus 100 g / ml karbenicillin per brunn och växa O / N vid 37 ° C.
- Upprepa saneringsprotokollet och lämna brickan linjerna torka.
OBS: Ingen O / N tillväxt på plattor eller i flytande medium bör observeras på förhand infektionskontroll, kontroll pre-kontaminering eller sanering testplattor. Många kolonier och tillväxt bör observeras på föroreningskontrollplattan; om inte, inga slutsatser om effekten avsaneringsprotokoll kan göras. Helst ska de saneringsplattorna ger inga kolonier och ingen O / N-tillväxten i någon av brunnarna i O / N-plattor. Den stringens saneringsprotokoll kan ökas med högre blekmedel koncentrationer, längre utsättningstider och ytterligare cykler.
7. Input / Output Titreringar
7.1) Ingångs Fag Titreringar
- Späd en 5 pl alikvot av fag till 50 pl med sterilfiltrerad PBS och blanda.
- Förbered seriell 10-faldig utspädning i sterilfiltrerad PBS till 10 10 med användning multikanalpipett eller en 96 kanal pipett.
- Inokulera 5 pl utspätt fag i 45 pl T1 fag-resistenta E. coli-celler i log-fas av tillväxt (OD 0,6-0,8) och inkubera täckt med andningsbar tätning för 30 min vid 37 ° C.
- Plate 5 | il av infekterade celler på till en LB / agarplatta kompletterat med 100 ug / ml karbenicillin och inkubera O / N ^t 37 ° C.
- Fag Koncentrationen kan uppskattas från den mest utspädda provet i vilka kolonier förefaller enligt beräkningarna anges i avsnitt 2.8.
7.2) Utgång Fag Pitrations
- Efter eluering av plattbundet fag genom tillsats av E. coli celler, späd en 5 pl alikvot av fag-infekterade celler till 50 pl med autoklave 2YT media
- Förbered seriell 10-faldig utspädning i autoklaverade 2YT-medium till 10 6 med användning av en multikanalpipett eller 96 kanal pipett.
- Plate 5 | il av infekterade celler på till en agarplatta kompletterat med 100 ug / ml karbenicillin och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Fag Koncentrationen kan uppskattas från den mest utspädda provet i vilka kolonier förefaller enligt beräkningarna anges i avsnitt 2.8.
OBS: I båda fallen (dvs, input och output fag titer, jämfört med koloni siffror på både tetracyklin (totalt cell nummer) och kanamycin (hjälparfag titer) kan också vara informativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs häri har använts för att isolera antikroppsfragment till en variation av både strukturlika och funktionellt relaterade antigendomäner från kombinatoriska faguppvisade Fab-bibliotek i parallell. Frågor som rör antigen tillgänglighet kan kringgås, i många fall, med in silico identifiering av uttryckantigendomäner som är lämpliga för val antikropp 23. Genom att koppla antigenuttryck till val antikropp inom samma laboratorium (Figur 1) blir det möjligt att konstruera en integrerad pipeline, där antigenparametrar kritiska till valet lättare kan kontrolleras. I de flesta fall, möjliggör noggrann bestämning av domängränser uttrycket och isolering av tillräckliga mängder av tillräckligt rent antigen från hög genomströmning uttryck i 96 eller 24 väl Deepwell-plattor (Figur 2) för framgångsrik användning i val antikropps. Under successivaomgångar av urvalsprocessen, kan eluerade fagkoncentrationer och berikning av fag som specifikt binder antigen övervakas antingen fag titrering (Figur 3) eller med fagpooler i en ELISA-analys (Figur 4). En bindningsförhållande (> 2) betyder i allmänhet närvaron av specifika bindnings kloner. Omvänt kan en låg ratio (<2) hjälpa till att avgöra orsaken till ett urval misslyckande. Till exempel kan ett förhållande <2 med hög ospecifik OD indikerar otillräcklig avlägsnande av icke-specifika kloner (eller klibbiga bindemedel) och kan motivera ytterligare optimering av urvalsprotokoll. Ändå, när anrikning detekteras individuella högaffinitets kloner kan därefter isoleras för sekvensering och karakterisering. Klon bindning kan kännetecknas i en kolorimetrisk immunanalys och möjliggör jämförelse av bindningen av Fab-fag eller Fab till immobiliserade antigen kontra negativa kontrollprotein, vilket gav ett mått på anrikning (förhållandet mellan bindning till TArget kontra negativ kontroll protein eller affinitetstaggprotein) (Figur 5).
Under skalning och automatisering av denna metod kan bedöma nyckelfunktioner i enheten vätskehantering vara till hjälp för att säkerställa korrekt och noggrann drift med lösningar liknande de som används under verkliga val. Användningen av absorberande kromoforer i lösningar kan hjälpa till att upptäcka när specifika kanaler i fluidik (aspiration eller dispense) är antingen igensatt eller har förlorat tätning resulterar i partiell volymleverans som illustreras i figur 6. Automatiserade tvätt enheter kan också vara en källa till variabilitet och kan kräva uppmärksamhet. Användningen av kända bindande kloner möjliggör jämförelse av bindning mellan Måltemperaturreglering protein för att se till att målet bindande bibehålls medan bakgrunden bindning bort (Figur 7), när tvättparametrar såsom dispensehastighet, tvättvolymer och antal tvättar optimeras. Efteranvändning av en automatiserad plattvättare med fag lösningar, effektiva saneringsprotokoll är nödvändiga för att säkerställa frånvaron av korskontaminering från successiva val eller olika urvalsförfaranden och en felsöknings / tolkning guiden finns i tabell 3.
Figur 1. Översikt -. Hög kapacitet antigenproduktion och urval antikropps pipeline Denna översikt visar en steg-för-steg-visualisering av ett representativt antigen generation och urval antikropps pipeline. Den in silico identifiera domängränser antigen möjliggör gen syntes, uttryck och urval på domäner för proteiner som kan vara dåligt karakteriserade. Uttryckt antigendomäner är immobiliserade och används för att isolera pooler av specifika kloner hög affinitet antikropps från en combinatorial antikroppsbibliotek visade på ytan av filamentös fag. Pooler av antikropp-fag elueras och amplifierats från individuella antigener kan sedan användas för att övervaka rund till Ligt anrikning av specifika bindande kloner i ELISA-baserade analyser jämföra immobiliserat mål kontra negativa kontrollprotein före isolering av individuella bindnings kloner för karaktärisering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. SDS-PAGE-visualisering av affinitetsmärkta antigener. En representativ SDS-PAGE av uttryckta och renade 6X-HIS-GST-märkt antigen domäner (5-10 kDa domän + 26 kDa GST) ursprungligen identifierades genom in silico analys av antigen domängränser. Proteindomäner uttrycks och isoleras genom Affiskaps rening karaktäriseras av SDS-PAGE före val för att säkerställa storleksbaserad identitet, adekvata utbyten och renhet för att möjliggöra användning i fag-antikropps val. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Visualisering av fag utgångs titer. Fag utgångs titrar bestäms av bordläggningen ut celler infekterade med fag under en 10-faldig spädningsserie på agar medium kompletterat med olika antibiotika (tetracyklin, karbenicillin och kanamycin) för att bestämma den lägsta spädningen med kolonier kan observeras och uppskatta antalet fag bunden att rikta antigen och elueras. Klicka här för att se en storr version av denna siffra.
Figur 4. Bindande förhållande mellan mål till negativa kontroll protein genom poolade ELISA. Förloppet anrikning kan utvärderas efter rundor av val genom screening individuella förstärkta eluenter mot både de specifika mål och negativa kontrollproteiner och / eller isolerade affinitetsmarkör. Visas i komplotten är anriknings nyckeltal för bindning av 96 individuella fag-antikropps pooler mot sina 96 respektive antigener kontra negativ kontroll protein parallellt. Varje förhållande värde härleds från två absorbansmätningar som kvantifiera bindning av fagen poolen till antingen målet eller negativ kontrollprotein med användning av en HRP-sammansmält antikropp specifik för M13-fag-höljesprotein. Ett förhållande tröskel på 2 eller högre (ofta sträcker sig från 2 till 10 eller mer såsom visas i rött) användes som en indikation på berikningoch den sannolika förekomsten av specifika bindande kloner. Lesser förhållanden kan betyda fel på eller särskilda problem med det val som kan motivera ytterligare optimering av protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Direkt bindning klonal Fab-fag eller Fab-ELISA. Bindningen av enskilda kloner (antingen i Fab-fag eller Fab-format) kan utvärderas genom ELISA-baserad analys kontra immobiliserat protein i 384-brunnsplattor. Bindning detekteras med hjälp av en sekundär HRP-smält antikropp mot M13 höljeproteinet på Fab-fag eller en affinitetsmarkör på Fab. Raw absorbansvärden för bindning av klonal Fab-fag att rikta antigen, negativt kontrollprotein och antigenaffinitetsmärkning (GST) avbildas illustrerar specifika binders (A01, A04, A06) och klibbiga bindemedel (A05).
Figur 6. Utvärdering av expedierade volymer genom automatiserad vätskebehandlingsaggregat. Konsekvent och korrekt leverans av avsedda volymer av robot eller manuella 96 brunnar pipettersystem kan utvärderas med hjälp av färgade lösningar och en plattläsare. I detta exempel, är 10 | j, l av en lösning innehållande bromfenolblått pipetterad sekventiellt till alla brunnar i två 96-brunnars plattor med en enda spets låda. Varje brunn innehåller 90 ^ il / brunn dH 2 O, analogt med tillsats av hjälparfag för infekterat E. coli. Varje platta är absorbanser vid 590 nm läses i tre exemplar, och volymerna interpoleras från en standardkurva beredd med hjälp av en kalibrerad enda kanal pipetman. Volymerna som levereras till en enda rad på den första och andra plattan är visade. Observera att om granarnat platta, väl E04 får ingen färgade lösningen, och på den andra plattan, tar den emot en dubbel volym. Detta indikerar att spetsen touch är inte tillräckligt för konsekvent leverans, och kräver ytterligare optimering. 95% konfidensintervall för triplikat absorbansmätningar är visade.
Figur 7. Utvärdering av automatiserad platt tvätt. Effektiv borttagning av obundet fag kan bedömas med hjälp av en ELISA för att mäta Fab-fag bindning till immobiliserade positiva (anti-FLAG antikropp) och negativa (BSA) kontrollproteiner samtidigt variera tvättförhållanden. I detta exempel är ingångs fag analogt med naiva bibliotek (10 13 cfu / ml i PBT) bort med hjälp åtta eller sexton tvättar, för hand eller med hjälp av roboten. Rest fagbindning till BSA är samma i alla förhållanden, som är specifik bindning till immobiliserade anti-FLAG antikropp, indicrande att vid denna låga flödeshastighet, båda metoderna är ekvivalenta och är tillräckligt hårda. 95% konfidensintervall från duplikatbrunnar visas.
| LÖSNINGAR | |||
| 2YT media - Tillsätt vatten till 1 L, justera pH till 7,0, och autoklav. | jästextrakt | 10 g | |
| trypton | 16 g | ||
| NaCl | 5 g | ||
| NZY media (1 L) | NZ Amine | 10 g | |
| jästextrakt | 5 g | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 ml | ||
| 20 salt lager | 50 ml | ||
| 50x ZYM-5052 socker lager (1 L) | glukos | 25 g | |
| laktos | 100 g | ||
| glycerol | 250 ml | ||
| 20x salt lager (1 L) | Na 2 HPO 4 | 500 mM | |
| KH 2 PO 4 | 500 mM | ||
| NH4CI | 1 M | ||
| Na 2 SO 4 | 100 mM | ||
| Karbenicillin (Carb): | 100 mg / ml i vatten. Filter-sterilisera. | ||
| Kanamycin (Kan): | 25 mg / ml i vatten. Filter-sterilisera. | ||
| Tetracyklin (Tet): | 10 mg / ml i vatten. Filter sterilisera. | ||
| PEG-NaCI | PEG | ||
| NaCl | 2,5 M | ||
| 1x PBS (pH 7,2) | NaCl | 137 mM | |
| KCl | 3 mM | ||
| Na 2 HPO 4 | 8 mM | ||
| KH 2 PO 4 | 1,5 mM | ||
| 1X KCM | KCl | 500 mM | |
| CaCl2 | 150 mM | ||
| MgCl2 | 250 mM | ||
| SOC media | jästextrakt | 5 g / L | |
| trypton | 20 g / L | ||
| NaCl | 10 mM | ||
| KCl | 2,5 mm | ||
| MgSO 4 | 20 mM | ||
| Glukos | 20 mM | ||
| Blockeringsbuffert | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| PBT-buffert | PBS | 1x | |
| BSA | 0,20% | ||
| Tween | 0,05% | ||
| PT-buffert | PBS | 1x | |
| Tween | 0,05% | ||
| Fosforsyra | H 3 P0 4 | 1 M | |
Tabell 1. Medier och lösningar.
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ Strong> | |||
| Komponent | il per reaktion | ||
| Vatten | 19,45 | ||
| 10x Taq buffert | 2,5 | ||
| dNTP (10 mM lager) | 0,675 | ||
| DMSO | 0,75 | ||
| Taq-enzym | 0,125 | ||
| Forward Primer (100 pM stock) | 0,25 | ||
| Omvänd primer (100 pM stock) | 0,25 | ||
| Tung kedja sekvenseringsprimrar | |||
| M13 Forward primer | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| M13 Omvänd primer | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Lätt kedja sekvenseringsprimrar | |||
| M13 Forward primer | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| M13 Omvänd primer | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| PCR INSTÄLLNINGAR | |||
| Steg 1. | 94 ° C under 3:00 min | ||
| Steg 2. | 94 ° C under 0:30 min | ||
| Steg 3. | 55 ° C under 0:30 min | ||
| Steg 4. | 72 ° C under 1:00 min | ||
| Återgå till steg 2 och upprepa 24x | hoppa till steg 2 | ||
| Steg 5. | 72 ° C under 7:00 min | ||
| Steg 6. | |||
Tabell 2. PCR Master Mix och inställningar.
| Tolkning av saneringsresultat | |||
| Tallrik | Förväntad karbenicillin titer | Om inte? | |
| Pre-infektionskontroll | 0 | Cellerna pre-smittade; ingenting kan man dra slutsatsen från experimentet. | |
| Förorening kontroll | gräsmatta | Otillräcklig förorening för att kunna bedöma effekten av efterföljande sanering; överväga nedsänkning grenrör i fag lösning snarare än att aspirera den. | |
| Dekontaminering testet | 0 | Sanering inte slutföra; öka blöt tid, blekmedel koncentions eller prova SDS och EtOH tvättar istället. | |
Tabell 3. Utvärdering av spolar sanering. För att bestämma effekten av sanering, är det nödvändigt att visa att brickan var kontaminerat med fag, och att saneringsprotokoll framgångsrikt elimineras att förorening. Använda fag som ger carbenicillin resistens, är de förväntade resultaten från ett sådant test listas, tillsammans med förslag bör den verkliga utfallet avviker från det förväntade resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid genomförande in vitro val antikropps, de två primära faktorerna för val framgång är 1) isolering av väl vikta antigena mål för val på och 2) att det finns en hög funktionell mångfald antikroppsbibliotek. I många fall kan begränsa tillgången på tillräckliga mängder av väl vikta, fullängdsproteinet. Ett tillvägagångssätt för att övervinna denna begränsning är att använda domäner identifierats från bioinformatikanalys 22 och syntetiserade för insättning i en bakteriell expressionsvektor med en lämplig affinitetsmarkör.
Det finns en mängd olika taggar som används i biotekniktillämpningar för att öka lösligheten, underlätta rening och stabilisera instabila domäner. 11 Förmågan att syntetisera praktiskt taget varje önskad insats sekvens möjliggör en mycket mångsidig antigen generations plattform. Trots att GST-märkt formatet är vanligt, har framgångsrika resultat varit tidigareerhållits med användning hexahistidin, Fc, Halo, maltosbindande protein och platsspecifika biotinylering taggar och det förmodas att myriad andra affinitetsmarkörer kan optimeras för användning i en liknande plattform. Däremot kan affinitetstaggar har både positiva och oavsiktliga negativa konsekvenser i senare led tillämpningar 11 och bör undersökas grundligt innan upprättande av en rörledning baserad på ett visst format.
Ofta kommer nya användare ställa frågan om hur man ska bedöma kvaliteten på ett antikroppsbibliotek och även om det inte finns något entydigt svar, bör man försöka bedöma flera nyckelfunktioner (antingen naturliga eller syntetiska) inklusive övergripande mångfald, relativa visningsnivåerna, vilken typ av och omfattningen av randomisering (dvs biblioteks designen kontra biblioteks innehåll bestäms av sekvense) och de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos antikroppen kontra avsedd applikation. Även utanför ramen för detta protokoll, en mer detaljerad treatment av dessa funktioner och hur de kan påverka valet av antikroppar kan hittas här 2,23. Kunskap om biblioteks mångfalden, i synnerhet viktigt för att säkerställa tillräcklig täckning av mångfalden under valen. Vanligtvis är en fag koncentration som ger 100-1000 kopior av varje fagklon i biblioteket önskvärda och bör se till att alla sant positiva bindemedel som finns i biblioteket kan återvinnas. Emellertid, icke-specifik bindning av fag till mikroplatt ytor ökar dramatiskt över 10 13 fag / ml och för mycket olika bibliotek, mer än en enda väl per antigen kan behövas för att säkerställa tillräcklig täckning. Å andra sidan, om ingångsbiblioteket är alltför utspädd, kommer den absoluta koncentrationen av sant positiva bindemedel vara så långt under KD (typiskt nM) att de inte kommer att återvinnas. Givet dessa begränsningar bör fagbibliotek allmänhet suspenderas till 12-13 OKTOBER fag / ml för den första urvalsomgång.0; Vid denna koncentration, en 100 L alikvot av fag representerar en 1,000-100 faldig täckning av ett 10 9 -10 10 mångfaldsbibliotek och kan rutinmässigt ge bindande kloner till olika antigener. Vid lägre koncentrationer, eller ökade skillnader, kan det vara nödvändigt att öka antalet brunnar av antigen som valts mot i första omgången (se avsnitt 2.9). Efter runda 1, dock de flesta av de icke-bindande mångfald av biblioteket har avlägsnats; överskotts täckning av rundan 1 utgång mångfald är oftast lätt att uppnå med hjälp av en enda väl. I fall av parallella markeringar i plattor med 96 brunnar, kan detta minska antalet antigenselektionsplattor som krävs för att bara en, efterföljande till den första omgången.
Under faktiska val, kan fag titrering erbjuda objektiva mått för att karakterisera och övervaka utvecklingen, samtidigt som det hjälper att identifiera problemområden i synnerhet i de tidiga omgångarna av val där anrikning är inte tillräckligt för attdetekteras. Detta kan vara särskilt användbart vid skalning av val att bestämma protokollprestanda. I allmänhet, ingång fag titrar (dvs, naiva bibliotek eller efter förstärkning av eluerad fag) bör förbli relativt konstant (10 12 -10 13 fag / ml) mellan omgångarna, med dålig celltillväxt / låg fag titrar indikerar potentiell förorening och / eller sämre utskrifts från föregående omgång. Även utgång fag titrar förväntas öka under anrikning i senare rundor av val, är ett område av 10 3 -10 5 cfu / ml i de två första rundorna förväntat. Avvikelse från detta intervall kan indikera potentiella problem med valet, såsom förorening eller överskott tvätt stringens. I senare omgångar av val (dvs, rundar 3 och 4), kan anrikning av kloner som specifikt binder målantigenet bedömas via poolade ELISA som mäter bindning av fag poolen mot både målantigenet och negativkontrollprotein (se avsnitt 4).
Efter 3-4 rundor av val (eller en gång anrikning på målprotein har nått ett mål antigen: negativ kontroll proteinsignalförhållande på 2: 1 eller högre i jämförelse med bakgrunds protein), är infekterade bakterieceller pläterade att isolera enstaka fagemid kolonier för sekvense , initial karakterisering och kloning vid behov. Vid denna tid, är det mycket lämpligt att omvandla Fab-fag att frigöra Fab innan ytterligare karakterisering. Även Fab-fag kan användas för första karakterisering genom att späda 10 pl fagsupernatant (beskrivs i avsnitt 5.1) i 20 pl PBT buffert och detektering med anti-M13-HRP-antikroppar (beskrivs i steg 4,4-4,5), i vår erfarenhet, bindningsegenskaper kan förändras väsentligt i allt från 5-20% av kloner efter frigörelse från fagpartikeln och förtida konvertering kan undvika problem med falska positiva. Den specifika metod som använts för konvertering beror på unique arkitektur fagemiden och därför kommer inte att behandlas explicit här. Men i de vanligaste vektorer, detta kan i allmänhet åstadkommas genom 1) omvandling av renat fagmid (eller fagemid pool) i en kompetent icke-suppressor E. coli-stam såsom HB2151 eller 55244 om en amber stopp (TAG) kodon ingriper Fab och plll-protein, 2) insättning av en amber-stoppkodon mellan Fab- och pIII proteinerna för att möjliggöra uttryckning av lösliga antikroppsfragment i en icke-suppressorstam eller 3) genom kloning immunglobulingener (från individuella fagemid eller fagemid poolen) in till en lämplig expressionsvektor. För att ytterligare effektivisera val och karakterisering, kan poolade kloningsmetoder erbjuda effektiva medel för att omvandla bindande kloner en masse i till uttryckskonstruktioner, både eliminera risken för falskt positiva bindning av Fab-fagpartiklar och där uttrycks lysaten används för tidig karakterisering, även kostnaden och ansträngning för reningkan initialt undvikas.
För kloner isolerade direkt från Library F (beskriven i 24), kan variabla antikroppsdomäner sekvenseras med användning av 1-2 pl av fagsupernatant som templat för PCR amplifiera komplementaritetsbestämmande regionerna (CDR) (se Tabell 2 för material för bibliotek F-riktade primrar ). Med användning av dessa primrar, kommer de variabla regioner i tung och lätt kedja i utbyte ge produkter av ~ 700 och ~ 500 bp, vilka omfattar alla tre CDR. Primers inkluderar glödgning platser för M13 primers så att produkterna kan sekvens efter rengöring (som beskrivs i Avsnitt 5.4.5) med hjälp av standard primers som är tillgängliga i de flesta sekvense core faciliteter. Alternativt, för Fab-fagpooler som har klonats in i en expressionsvektor och transformerade direkt i till E. coli för expression, kan enstaka kolonier isoleras och återsuspenderades i 15 | il 2YT och 1-2 | il av cellsuspensionen som används direkt som mall för enstaka colony PCR med användning av lämpliga primrar.
Automatisera val kräver optimering och validering av flera viktiga robotfunktioner. I allmänhet måste pipett baserad vätskehantering vara korrekt och enhetligt för alla 96 kanaler, måste platt tvätt avlägsna obunden fag effektivt utan stripp adsorberat antigen eller bundet Fab-fag från valet plattan. Effektiv sanering av plattvättare är också nödvändigt mellan omgångarna för att möjliggöra anrikning och effektiv kontra urval, och mellan efterföljande val för att förhindra korskontaminering. För att hjälpa till att optimera urvalsförfarandet hög genomströmning, har enkla metoder för att utvärdera dessa funktioner tidigare använts och beskrivs nedan och detaljerad i protokollet.
För att utvärdera konsistens volymer som levereras av alla kanaler i en flytande dispense / aspiration huvudet, är en färgad lösning pipetteras till en flatbottnad 96 brunnar och absorbance i varje brunn mättes på en plattläsare. En kromofor såsom bromofenolblått är till hjälp för färgning lösningar liknande de som används för verkliga val att utvärdera effekterna av olika ytspänning och sammanhållningsegenskaper på volym,. Efter att ha bekräftat att alla kanaler är dispense konsekventa volymer, kan noggrannheten av den totala levererade volymen bestämmas genom att mäta massan av vätska överförs till varje platta.
Automatisering av platt tvättning för att avlägsna obundna kloner förutsätter i huvudsak optimering av den hastighet med vilken tvättbuffert skall dispenseras och antalet tvättar som skall användas. En rimlig metod för att utvärdera denna parameter sysselsätter positiva kontroller (specifika Fab-fagbindning kloner) att bedöma effekterna av varierande dispenseringshastighet och / eller antal tvättar för att avgöra om 1) adsorberat antigen eller bunden fag tas bort av alltför stränga tvättning eller 2) icke-specifik bindning till icke-besläktade proteiner är överdriven due att tvätta villkor som inte är tillräckligt stränga. Rest / bunden fag kan detekteras och kvantifieras antingen genom infektion i bakterier och plätering för enstaka kolonier, eller med ELISA med hjälp sekundära antikroppar specifika för antikroppsaffinitetstaggar eller fag höljeproteiner. Negativa kontroller används för att bedöma resthalter av icke-bindande Fab-fag till målproteiner eller specifik bindning Fab-fag till icke-besläktade / bakgrunds proteiner, som kan vara hög om tvätt inte är tillräckligt stränga. I detta fall använde vi immobiliserat BSA som en kontroll för icke-specifik bindning och en anti-FLAG-antikropp som känner igen en FLAG-epitop-tagg på Fab-fag som en positiv kontroll. Vi jämförde åtta och sexton tvättcykler med roboten kontra tvätta för hand, med en medelhastighet flöde, för att visa att dessa tekniker var likvärdiga. Alternativt, mäta input och output fag titrar (se avsnitt 7) under pågående val kan också bidra till att göra finjusteringar i tvättparametrar. Slutligen måste sanering av platt brickor som används för val vara effektiva för att eliminera överföring av fag från tidigare val. Enligt vår erfarenhet, nyspätt 0,5% natriumhypoklorit är snabb, effektiv och billig. Detergenter såsom SDS är också effektiva men kräver mycket mer omfattande tvättning för avlägsnande från systemet. Kontrollera reagenskompatibilitet för systemet innan några tester. För att bedöma sanering, testar vi för förekomst av rest fag i lösningar som hanteras av flödessystemet och tolka resultat enligt tabell 3.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en skalbar metod för att isolera Fabs från kombinatoriska bibliotek genom parallellt in vitro val mot proteindomäner och erbjuder tekniker för validering ett automatiserat system fagselektion. Kostnad och infrastrukturhinder som omfattande djuranläggningar kan utgöra mildras eftersom denna metod inte rely på immunisering av djur. Vidare, genom att integrera antigen generationen med antikropps fagselektion, kvalitetsfaktorer som påverkar valet framgång är lättare övervakas och justeras. När tidsramen från antigenuttryck till val och första karakterisering är i storleksordningen 6-8 veckor, kan en mer lyhörd produktionssystem realiseras. Antikroppar isolerade från in vitro-val är också både lätt modifierad (pga genotyp-fenotyp koppling) och förnybar, kräver endast lagras DNA av uttrycket konstruktion för att upprepade gånger och reproducerbart åter generera antikroppar. Slutligen genom att visa att detta protokoll kan utföras med hjälp av antingen en kvasi-manuell eller helautomatisk metod som sysselsätter ett skräddarsytt, roboturvalssystem, kan genomströmning vara skalbar och tillgänglig för små akademiska och industriella labs lika.
Använda hög kapacitet metoder som beskrivs ovan och biblioteket F syntetiska antikroppsbibliotek 24 in vitro - och in situ -expressed proteiner. Även svarsfrekvensen för varje given val beror både på kvaliteten (renhet, foldedness, mono-dispersitet etc.) av antigenmålen samt kvaliteten och mångfalden av antikroppsbiblioteket, har det visat sig att någonstans 25-80 % av antigener kommer att ge bindemedel för en hög genomströmning val. Viktigt är det värt att notera att kloner med förmåga att modulera målfunktionen också ofta kan väljas. Detta bibliotek konstrueras med användning av en helt human ramverk, vilket gör dessa antikroppar mottaglig för potentiell terapeutisk tillämpning 25, således framhäver betydelsen av denna rörledning som en alternativ metod för generering av affinitetsreagens med bredvärde.
Sammanfattningsvis kommer robusthet och mångsidigheten hos strategi som presenteras i detta protokoll fortsätta att hjälpa till vid optimeringen, industrialisering och slutliga utbredd användning av denna teknik som ett hållbart sätt att uppnå det långsiktiga målet att generera affinitetsreagens för praktiskt taget alla medlemmar den mänskliga proteom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Vi vill tacka för NIH gemensamma fonden - Protein Fånga Reagens Program för att finansiera utvecklingen av rekombinant antikropp Val antikropp och karakterisering pipeline och den kanadensiska Stiftelsen för Innovation för finansiering köp av roboturvalsplattform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
